Biosenzory. Helena Uhrová

Transkript

1 Biosenzory Helena Uhrová

2 L.C.Clarc, článek o O 2 elektrodě, , symposium v New Yorku oxidoredukční enzym glukózooxidáza byl uchycen na dialyzační membránu a s ní na kyslíkovou elektrodu - enzymová elektroda

3 První biosenzor glukózooxidáza katalyzuje reakci glukóza + O 2 kyselina glukonová + H 2 O 2 Úbytek kyslíku - úměrný koncentraci glukózy byl měřen kyslíkovou elektrodou

4 První komerční senzor Stanovení glukózy přímo v krvi Na principu úbytku kyslíku první model Yellow Springa Instrument Company ampérometrické měření vzniklého peroxidu vodíku

5 Definice biosenzoru Citlivé analytické zařízení převádějící fyzikální nebo chemický signál na jiný, lépe měřitelný. Rozpoznávací část tvoří prvek biologického původu. Biosenzor je složen z bioreceptoru a převodníku. Obě složky integrovány v jednom senzoru.

6 Bioreceptory Biomolekuly rozpoznávají analytický cíl: Enzymy Protilátky Receptorové bílkoviny Mikroorganismy Nukleové kyseliny Rostlinné a zvířecí tkáně

7 enzymy Nejúčinnější katalyzátory s vysokou strukturní specifitou katalyzují přeměnu jedné látky, ostatní ignorují Vysoká enzymová aktivita - nutné udržení vhodné teploty a ph prostředí Z izolovaných enzymů je jen několik set je vhodných pro komerční užití v senzorech

8 Velmi často se užívají oxidoreduktázy, katalyzující oxidaci (odnímání elektronů) nebo redukci (dodávání elektronů) enzymového substrátu. Oxidoreduktázy jsou spojeny s elektrochemickými procesy, jejich přeměnu je snadnější sledovat elektrochemickou detekcí. Reálným problémem je ale přenos elektronů z/na aktivní místa.

9 protilátky tvoří okolo 20% veškerých bílkovin plasmy a jsou souhrnně označovány jako imunoglobiny Nejjednodušší protilátky- molekuly tvaru Y s dvěma identickými vazebnými místy pro antigen základní strukturní jednotka složena ze 4 řetězců 2 lehkých a 2 těžkých reversibilně se váží se specifickým antigenem

10 receptorové bílkoviny molekuly se specifickou afinitou k hormonům, protilátkám, enzymům a dalším biologicky aktivním látkám nejčastěji vázány na membrány chuťové receptory, čichové receptory i fotoreceptory očí

11 mikroorganismy Bakterie Kvasinky Plísně Rychlé rozmnožování Odolnost Přizpůsobivost Široká škála živin

12 nukleové kyseliny Využití k identifikaci : jiné DNA jiné RNA některých mutagenů Próba: obsahuje imobilizovanou jednovláknovou DNA s určité sekvenci hybridizace s komplementární sekvencí- hledaná DNA zůstane navázána

13 Nevýhody: rostlinné a zvířecí tkáně Buňky s omezenou funkcí Obtížná manipulace Nesnadná a drahá kultivace mimo mateřský organismus Nutnost dodržování životních podmínek Výhoda: biologická odpověď podobná jako u živého organismu

14 skladba biosenzorů analyt bioreakční (rozpoznávací)vrstva převodník elektronická jednotka výstupní signál

15 Konstrukce biosenzorů volba vhodné imobilizační techniky imobilizace biologického materiálu do pevného materiálu připojení detekčního zařízení (závisí na povaze signálu, který dává biologický materiál) připojení záznamového zařízení

16 membrány Slouží: k ochraně před usazeninami K eliminaci interferencí Ke kontrole operačního režimu biosenzorů

17 elektrochemické převodníky využívá je nejvíce senzorů - pro konstrukční jednoduchost - a dobrou cenu s úspěchem využívány pro stanovení organických látek v potravinách

18 Dělení převodníků i biosenzorů podle metody detekce Potenciometrické biosenzory Ampérometrické biosenzory Konduktometricko/impedimetrických biosenzory

19 Potenciometrické biosenzory vyžadují měření potenciálu při nulovém proudu potenciál je úměrný logartimu koncentrace stanovované látky Využívají např. iontově selektivních elektrod k stanovení změn koncentrace vybraných iontů (např.h + ).

20 složeny z ISE kombinované s imobilizovaným enzymem- v ISE je generovaný elektrodový potenciál úměrný logaritmu koncentrace analytu. koncentrace závisí na potenciálu E E RT nf a a ox = E0 + ln Nevýhody:velký odpor, redrozbitnost, erozivita a citlivost na kapacitu pufrů při měření roztoků.

21 Konduktometricko/impedimetrické Stanovují změny v konduktanci změny v impedanci biosenzory v důsledku změn vyvolaných v daném prostředí náboji Nevyžadují referenční eldu (tenkovrstvé technologie), jsou dobře kompatibilní s elektrickými obvody a počítačovým rozhraním

22 Využívají měření světla Optické biosenzory změn optických vlastností biomateriálů ( barva opticky nebo spektrofotometricky) fluorescenční spektroskopie luminiscence optická vlákna nanesená vrstva produkuje světelné signály nebo je mění

23 Piezoelektrické biosenzory Využívají vibrace v elektrickém poli které se mění s tloušťkou krystalu Výhody: nízká cena, rychlá odezva Nevýhody: vysoká citlivost na vnější podmínky (vlhkost vzdúchu) DNA čipy Si matrice v pravidelné mřížce imobilizovány různé sekvence DNA fluorescenčně vyfotografován analýzou lze určit sekvenci

24 imunosenzory Savčí buňky zdroj protilátek Senzory detekují i stopová množství Modifikované protilátky navěšená fluorescenční nebo enzymová značka Vymývací krok ELISA - o analyt soutěží volná a imobilizovaná protilátka kvantitativní stanovení analytu

25 Biosenzory s povrchovou plazmovou rezonancí na rozhraní kov - dielektrikum vzniká při totálním odrazu světla opticko-elektrický jev při určitém úhlu (max. přenos energie světla na plasmony - elektrony atomů kovu v povrchové vrstvě) klesne intenzita odraženého světla modifikace kovové vrstvy komplexem protilátka-antigen posun rezonančního maxima

26 Kalometrické biosenzory Změny teploty při biochemické reakci Přesná čidla nárůstu teploty nejsou častá

27 Analogově-číslicové převodníky

28 Charakteristiky převodníků Rozlišovací schopnost převodníku - dána počtem rozlišitelných úrovní analogového signálu. (Pro n-bitový binární převodník je to 2 n úrovní, pro m-místný dekadický převodník je to 10 m úrovní). Krok kvantování (citlivost převodníku) - nejmenší rozlišitelná velikost analogové veličiny - rozdíl dvou hodnot analogové veličiny, při kterých nastává přechod od jednoho kódového slova k druhému

29 Chyba kvantování je maximální rozdíl mezi hodnotou analogové veličiny a hodnotou odpovídající danému kódovému slovu -obvykle polovina kroku kvantování. Rychlost převodníku se určuje počtem převodů za jednotku času. Kód převodníku - v jakém kódu převodník pracuje (nejčastěji přímý binární kód a binárnědekadický tzv. BCD-kód)

30 Přesnost převodníku Součtová (aditivní) chyba je nezávislá na hodnotě analogového signálu a je pro celý rozsah konstantní. Je způsobená např. posunutím nuly, chybou kvantování apod. Součinová (multiplikativní) chyba závisí na hodnotě analogového signálu a je způsobená chybou zesílení analogových částí a nelinearitou převodníku.

31 Stabilita převodníku vyjadřuje stálost vlastností převodníku při působení různých rušivých vlivů, jako je teplota, čas, vlhkost apo

32 Číslicově-analogové převodníky převádí vstupní slovo na analogovou veličinu (napětí nebo proud), která je přímo úměrná vstupní informaci. Vstupní slovo je číslo, které vyjadřuje okamžitou hodnotu určité veličiny a sestává z určitého počtu bitů. Pro vyjádření tohoto čísla se používá nejčastěji přirozeného binárního kódu nebo kódu BCD.

33

34 Analogově-číslicové převodníky Analogově-číslicový převod lze rozdělit na tři základní fáze: vzorkování, kvantování a kódování. analogový signál výstupní slovo VZORKOVÁNÍ KVANTOVÁNÍ KÓDOVÁNÍ

35 vzorkování

36 Metody imobilizace K převodníku musí být připojen selektivní element. Existuje několik klasických metod: Adsorpce na povrchu Mikrozapouzdření záchyt v gelové matrici, pastě nebo polymeru mezi dvěma membránami

37 Záchyt selektivní element je zachycen v gelové matrici, pastě nebo polymeru velmi populární metoda. Kovalentní vazba jsou vytvořeny chemické kovalentní vazby mezi selektivní složkou a převodníkem. Příčné vazby selektivní složka je chemicky vázána dvojfunkčním činidlem k převodníku. Často se užívá v kombinaci s metodami adsorpce či mikrozapouzření.

38 CO OD SENZORŮ POŽADUJEME Selektivitu Citlivost Přesnost Dobu odpovědi Ralaxační čas Životnost Pracovní podmínky Cenová dostupnost

39 Uplatnění biosenzorů v praxi farmakologie a v medicína monitorování škodlivin životního prostředí Zemědělství armáda fermentační procesy Off-line: ve vzdálených laboratořích s významnou dobou zdržení Off-line: drobné kontroly s krátkou dobou zdržení On-line: monitorování i kontrola probíhající v reálním čase

40 Problémy není možná jejich sterilace pracují jen v limitovaném rozsahu koncentrace analytu při použití enzymů se obvykle liší optimální provozní ph enzymu od ph prostředí.