bioelektroda,, nejčast enzymovou elektrodu potenciometrické biosensory amperometrické biosensory konduktometrické biosensory

Transkript

1 Elektrochemické převodníky elektrochemický měřící systém tvoří nejméně dvě elektrody - pracovní (měř ěřící) ) a referentní imobilizací biorekogniční vrstvy vzniká bioelektroda,, nejčast astěji se jedná o enzymovou elektrodu potenciometrické biosensory amperometrické biosensory konduktometrické biosensory Pracovní elektrody pro biosensory zahrnují velmi širokou škálu materiálů i konfigurací: : ušlechtilu lechtilé kovy (Pt( Pt,, Au), skelný uhlík, grafit a nejrůzn znější kompozitní směsi, si, vodivé polymery a organické vodivé soli. Rozsah pracovního potenciálu je třeba t volit tak, aby nedošlo k elektrochemickému mu rozkladu materiálu elektrody nebo k interferenčním m reakcím m (rozklad vody nebo jiných složek pracovního roztoku, redukce rozpuštěného kyslíku). ku). Důležitá je příprava p prava povrchu elektrody před p vlastním měřením m nebo imobilizací biomolekul.. Provádí se leštění povrchu brusnými práš ášky (diaman( diaman-tový nebo oxid hlinitý), následuje opláchnut chnutí a případnp padně ozvučen ení ultrazvukem. Někdy je třeba t od-stranit povrchové nečistoty (oxidy kovů) buď pomocí kyselin nebo anodizací. Pomocné elektrody musí být tvořeny dobrého vodiče e s dostatečnou plochou a elektrochemicky neaktivní.. Používá se platina (drátek, plíš íšku, síťka), s uhlíkov ková tyčinka, mnohdy stačí i nerezový drát. 1

2 Referentní elektrody slouží jako srovnávac vací bod k měření nebo nastavení potenciálu pracovních ch elektrod. Jejich potenciál l je přesnp esně definovaný a pokud možno časově stálý. Typ Zkratka E NHE (V) E SCE (V) Normální vodíková elektroda Pt, H 2 (1 atm) H + (a=1) NHE Kalomelové elektrody Hg Hg 2Cl 2 KCl (...) nasycená (sat.) SCE normální (1 M) NCE nasycená NaCl (sat.) SSCE Argentchloridové elektrody Ag AgCl KCl (...) nasycená (sat.) (3 M) normální (1 M) Ag AgCl LiCl (sat. v EtOH) Merkurosulfátová elektroda Hg HgSO 4 K 2O 4 (sat.) Referentní elektrody Miniaturní Ag/AgCl AgCl 2

3 Potenciometrické bioelektrody A - A - A - A - základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem K + K + převodníkem je iontově selektivní elektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvou. Rozsah měřm ěřitelných koncentrací je dán d ISE: 10 µm M aža 0.1 M, pro konečné biosensory typicky 0.1 aža 10 mm, odezva je logaritmická.. MěřM ěří se potenciál l pracovní elektrody proti referentní elektrodě - ta musí být kvalitní (časově stálá), přitom p v systému neteče e proud - je třeba t měřm ěřící přístroj s velkým vstupním m odporem (operační zesilovač). Potenciometrické enzymové elektrody Potenciál l ISE pro sledovaný iont (aktivita a i ) v přítomnosti p rušiv ivého iontu (aktivita a j ) E = E 0 + RT zf ln( a + k a i ij z / y j skleněná elektroda - H+ - měření ph, běžb ěžně dostupná pevné ISE (solid state) - tenká vrstva iontového vodiče: monokrystal nebo směs s krystalů,, precipitát; t; homogenní nebo heterogenní (mnohonásobn sobně levnější ší,, vlastní materiál dispergován n v inertní matrici (PVC, silikon,...) na bázi b oxidů kovů pro měřm ěření ph: M x O y + 2y(e - + H + ) xm + yh 2 O nebo dva oxidační stavy: 2MO y + 2H + +2e - (2y-1)M 2 O + H 2 O antimonová elektroda Sb/Sb 2 O 3, dále Ir/IrO IrO 2 nebo Pd/PdO PdO 2 ) 3

4 ISE ukázka ph,, NH 3 a CO 2 ISE Crytur Příklady potenciometrických enzymových elektrod ph : penicilin (penicilin( penicilinasa), acetylcholin (cholinesterasa), esteras asy, nukleové kyseliny (nukleas asy) NH 3 / NH 4+ : močovina ovina (ureas asa), a), aminokyseliny (oxidační deaminace - glutamát DH, oxidas asa L- / D-aminokyselin; α,γ- eliminace amoniaku L-methionin γ-lyáza), nitrát t a nitrit (bakterie) CO 2 : močovina ovina (ureas asa), a), aminokyseliny (lysin dekarboxylas asa, tyrosin dekarboxylas asa), laktát t (laktát monooxygenas asa - dekarboxylující oxidas I - : potenciometrická detekce peroxidu vodíku v přítomnosti p peroxidas asy F - : peroxid vodíku (peroxid( peroxidasa - oxidace fluorofenolu) CN - : amygdalin (β-glukosidasa) 4

5 Polovodičov ové sensory výhodou jsou miniaturní rozměry, ry, masová produkce a tudíž nízká cena ve srovnání s klasickými ISE. základním m konstrukčním m materiálem je křemk emík. Jeho vodivost je velmi nízkn zká, avšak ak přídavkem p vhodných stopových příměsíp lze jeho vodivost zvýšit - získá se polovodič.. Podmínkou vodivosti je možnost volného pohybu elektronů. E C 1.1 ev Energetické hladiny elektronů u čistého křemk emíku (nevodivý) E V u křemk emíku je základnz kladní valenční hladina E V plně obsazena, ale elektrony se na ní nemohou pohybovat. Na vodivostní hladině E C je místo m pro pohyb, ale nejsou zde elektrony. Kinetická energie elektronů na E V je za běžb ěžných podmínek kolem 0.04 ev, takže e nemohou přeskop eskočit na vodivostní hladinu E C Zvýšení vodivosti se dosáhne dopováním - přídavkem atomů z V. (P, As, negativní - n) nebo ze III. (B, Al,, pozitivní - p) skupiny periodické tabulky. Tak při p i n dopování se vytvoří donorová hladina elektronů E D těsně pod vodivostní hladinou, takže e přenos p elektronů z E D na E C je snadný. Opačně působí přidání atomů s volnými pozice elektronů (díry, pozitivní dopování), vytvoří se tak akceptorová hladina E A. e - e - E C E D E A Energetické hladiny elektronů po přidp idání příměsí E V U polovodičových ových materiálů se pak hladina, na které je pravděpodobnost podobnost obsazení elektrony 50%, nazývá Fermiho (E F ). Nachází se mezi E V a E C, její poloha odpovídá množstv ství dopujících ch atomů. 5

6 ISFET ion-sensitive field effect transistor R e f Membrána SiO 2 V G N- S source G gate N- D drain Křemík P- izolace - epoxypryskyřice Schéma zapojení ISFETu V D Odpor mezi S (source( source) ) a D (drain( drain) ) se změní,, když se na hradlo G (gate( gate) ) přivede p napětí (změní se elektrické pole). Povrch ISFETu mimo S a D je pokryt oxidem křemik emičitým, itým, oblast hradla G (gate)) je potažena selektivní membránou, která je v kontaktu s okolním m roztokem; ostatní části jsou izolovány epoxypryskyřic icí.. Potenciál l hradla se určuje uje vzhledem k referentní elektrodě. Jako iontově-selektivn selektivní membrány lze použít řadu materiálů. Nejběž ěžnější jsou solid-state state membrány pro sledování změn ph, materiál l Si 3 N, Al O, Ta O 2 5. Odezva těchto t ISFETů je logaritmická ( mv/ph ph), masová produkce vede k nízkn zké ceně. Polymerní membrány mohou být např. valinomycin/pvc pro stanovení draslíku. Heterogenní membrány tvoří AgCl, AgI, AgCN krystalky v PNF (polyfluorovaný( fosfazin). Při P i výrobě ISFETů se používá litografie - postupné nanáš ášení jednotlivých vrstev, vytvářen ení struktury pomocí masek. 6

7 ISFET ukázka LAPS biosensory Tento polovodičový ový převodnp evodník k je konstrukčně jednodušší než ISFETy,, navíc c je možné připojení kontaktů ze strany která není v kontaktu s roztokem. Základem je křemk emíkový čip potažený vrstvami oxidu křemičitého a nitridu křemk emíku. Navíc c je na povrchu rozdělen na několik n aktivních oblastí pomocí další vrstvy SiO 2. Celý čip mám pouze jeden kontakt. V neosvětlen tleném m stavu je sensor neaktivní.. Pokud se z druhé strany osvětl tlí (infračerven ervená LED, při p i 940 nm pronikne světlo do křemk emíku 50 nm hluboko), dojde k lokáln lní aktivaci a získz ská se signál l odpovídaj dající změnám ph v aktivované ( adresované é ) ) zóně. z Výhodou je jednoduchá možnost vícekanv cekanálového měřm ěření. 7

8 LAPS potenciostat referenční a pomocná electroda light addressable potentiometric sensor LAPS struktura Výměnný páskový sensor s biovrstvou přítlak pracovní roztok se substrátem tem LEDky pro adresování biomembrána LAPS biosensor Threshold Cytosensor křemík (P nebo N) Cytosensor microphysiometer (Molecular Devices) ) se používá pro testování toxicity nebo fyziologických účinků léčiv. Do komůrek se imobilizují buňky (bakteriáln lní nebo tkáňov ová kultura - fibroblasty, keratinocyty,, rakovinné buňky, 10 4 až 10 6 ). Při i mírnm rném m průtoku médía se část buněk zachytí na povrch a v přítomnosti p substrátu tu vyvolávaj vají určitou změnu ph, která je úměrná metabolické aktivitě; např.. respirací glukózy vzniká kyselina mléčná a oxid uhličitý. itý. Po přídavku p testované látky se pak zaznamená odezva jako časová změna dph/dt dt.. Na konci pokusu se rychlým ( průtokem buňky z komůrek vypláchnou a lze začít t další cyklus. Vhodné účinek růstových r regulátor torů, hormonů, lymfokinů,, virů nebo virostatik. 8

9 Amperometrické sensory jsou založeny na heterogenním m přenosu p elektronů mezi elektrodou a redoxním párem molekul poskytují jako signál l proud, který je úměrný koncentraci analytu.. Proud I se obvykle měřm ěří při konstantním m napětí (potenciál l E) pracovní e - elektrody velikost proudu prošlá za daný čas t v systému udává náboj Q, který odpovídá molárn rnímu množstv ství látky přemp eměněné na elektrodách: X red X ox Q = I t = n F m / M r F = C/mol značí Faradayovu konstantu k elektrochemické oxidaci látek l dochází na anodě (I > 0), redukční děje (I < 0) probíhaj hají na katodě. směr r proudu je totožný se směrem toku pozitivních ekvivalentů (náboj bojů) Amperometrické měření je možné provádět t v dvou- nebo tříelektrodovt elektrodovém m uspořádání; pro první systém m se napětí na pracovní elektrodě W (working( working) ) nastavuje proti pomocné elektrodě A (auxiliary( auxiliary,, resp. counter) v tříelektrodovt elektrodovém m uspořádání se navíc c použije referenční elektroda R, vůči i které se nastavuje potenciál l pracovní 2-E E 3-E3 A - + V A Ref - + V Aux Work 9

10 Potenciostat je zařízen zení,, které udržuje uje konstantní potenciál l pracovní elektrody vůčv ůči referentní nezávisle na procházej zejícím m proudu rozsah - R M _ + I _ + _ + U out = R M I U in _ + Příklad konstrukce potenciostatu zpracování měřených signálů lze provádět t pomocí zapisovače, nebo lépe l použit itím m počíta tače e vybaveného analogově-digit digitálním m převodnp evodníkem (A/D); pomocí digitáln lně-analogového převodnp evodníku (D/A) lze řídit pracovní napětí. Potenciostat moderní digitáln lní konstrukce - analogový obvod řízený A/D (sběr r dat) a D/A (nastavení excitačního potenciálu) převodníky W R A POTENCIOSTAT D/A A/D POČÍTAČ Měřící uspořádání obr. - mikroprocesorem řízený osmikanálový potenciostat, výstup dat na externí počíta tač přes RS232 rozhraní 10

11 E Měřící techniky dle Amperometrie chronoamp. pulsní čas Voltametrie lineární cyklická normální square diferenciální pulsní wave pulsní Technikyzaloženéna měření proudu dle časového průběhu potenciálu na pracovní elektrodě nejjednodušší je amperometrie chronoamperometrie umožň žňuje získat z informace o přechodných elektrodových jevech po skokové změně potenciálu pulsní amperometrie zvyšuje podíl l signálu vůčv ůči šumu lineárn rní a zejména cyklická voltametrie mají důležitou úlohu při p i vývoji amperometrických biosensorů pulsní voltametrické techniky již vyžaduj adují poměrn rně drahé přístrojové vybavení,, i když potřebn ebné pulsy lze relativně snadno generovat pomocí počíta tače e s D/A převodnp evodníkem. Elektrochemické měřící zařízen zení laboratorní verze enzymová elektroda v míchanm chané nádobce potenciostat s LCD a zapisovačem jednoúčelový elový systém v biochemickém praktiku 11

12 Analyzátory Metrohm Polarecord EGG PAR 173 EGG PAR 263 Autolab Amperometrické detektory ABD (Universal( Sensors) ADLC2 (Lab( Lab.. Přístroje) P 12

13 Ruční systémy PalmSens Univ.. Florence MEB (MU) istat Kapesní systémy spolehlivost a robustnost velmi jednoduché ovládání 13

14 Konektory opravdu různorodr znorodé Měření kyslíku ku a H 2 O 2 Clarkův sensor Au (Pt) elektroda Velkou výhodou tohoto sensoru je zatavená ve skle prakticky absolutní specifita pouze ke kyslíku ku - rušiv ivé látky nemohou projít Ag/AgCl elektroda předřazenou membránou. Konstrukce elektrody pro stanovení elektrolyt peroxidu vodíku je podobná kyslíkov kové s tím m rozdílem, že e není použita membrána plynopropustná membána na a používá propustná pro O 2 se pozitivní polarizace, při i které nastává anodická oxidace e peroxidu Elektrodová redukce kyslíku ku (-750( mv) je čtyřelektronový proces: O H 2 O + 2 e - H 2 O e - 2 OH - Elektrodová oxidace peroxidu vodíku (>( 600 mv): m H 2 O OH - 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O e H + 14

15 Kyslíkov ková elektroda Enzymové elektrody s oxidasami tyto enzymy oxidují molekulu substrátu tu (analytu( analytu) ) za účasti kyslíku, ku, přitom p vzniká buď peroxid vodíku nebo voda: substrát t + O 2 produkt + H 2 O 2 substrát t + O 2 produkt + H 2 O detekce peroxidu je obecně citlivější (nulová výchozí hladina) Proud 0 O 2 analyt H 2 O 2 č as Rozsahy detektoru oxidace peroxidu vodíku je spojená s nebezpečím m interference ze strany jiných oxidabilních látek, l např.. v séru s mohou vadit kyseliny askorbová a močov ová či paracetamol specifita se dád zlepšit předp edřazením kontrolní membrány, která omezí přístup interferujících ch látekl 15

16 Přehled oxidas Substrát oxidasy Zkratka EC číslo koenzym H 2 O 2 Alkohol AOD FAD ano L-Aminokyseliny FAD ano D-Aminokyseliny FAD ano Askorbát Cu ne Bilirubin BRO ne Diaminy DAO Cu ano Fenol (Tyrosinasa) Cu ne Galaktosa Cu ano Glukosa GOD FAD ano L-Glutamát FAD ano Cholin FAD ano Cholesterol COD FAD ano p-difenoly (Lakasa) Cu ne L-Laktát LOD FAD ano L-Laktát (dekarb.) LMO FMN ne L-Lyzin ano Monoaminy MAO FAD ano NADH ano Oxalát Fp ano Pyruvát FAD ano Sulfit Mo ano Urát(Urikasa) Cu ano Xanthin XOD Mo ano Enzymové elektrody s dehydrogenasami největší skupinou oxidoreduktas jsou dehydrogenasy (existuje přes p 250 NAD + a 150 NADP + dependentních enzymů), analyticky významné druhy jsou shrnuty v tabulce katalyzující redoxní reakce s účastí NAD(P) + / NAD(P)H: Přehled dehydrogenas Substrát Zkratka EC číslo Alkohol ADH Hydroxybutyrát 3-HBDH Aldehyd AlDH Hydroxysteroid 3-HSDH Alanin Ala-DH Isocitrát ICDH Formiát FDH Inositol IDH Galaktosa Gal-DH L-Laktát L-LDH Glycerol Gly-DH D-Laktát D-LDH Glukosa GDH L-Leucin L-LeDH Glukosa-6-fosfát G6P-DH L-Malát L-MDH Glutamát GlDH Sorbitol SDH

17 Detekce NAD(P)H elektrochemick N PMS Fenazin methosulfát N + CH CH 3 OSO 3 3 R: methyl Meldola Blue N H 2 N O N + R 2 R: ethyl Nile Blue H 3 C N XHN S N + Me 2 X: H Toluidine Blue O X: naphthoyl Naphthoyltoluidine Blue O M ox + NADH CT M red + NAD + M red M ox + 2 e - + n + CT elektrochemická detekce NADH je možná amperometrickou reoxidací vznikajícího NADH (E -560 mv/sce); přímá oxidace vyžaduje vysoký potenciál l (přes 1 V na uhlíku), nastává dimerizace a adsorpce produktů na povrch elektrody reoxidace se můžm ůže e provést lépe l prostřednictv ednictvím m modifikujících ch látek l (E -200 aža -50 mv) ) vázaných v na povrchu elektrody nejčast astěji se používaj vají fenaziny, fenoxaziny a fenothiaziny,, oxidace nastává již kolem 0 V/SCE lze užít u t také hexakyanoželezitan elezitan nebo TTF.TCNQ průběh h reakce je homogenní - vzniká charge transfer komplex CT, po rozpadu je pak reoxidován mediátor tor, přitom E > E E lze pracovat při p i nižší ším m potenciálu Přenos elektronů z biomolekul substrát produkt E ox e - E red Přímý přenos p elektronů pro konstrukci biosensorů je tento proces atraktivní - zjednodušil by konstrukci; bohužel, přímý p přenos elektronů z biomolekul na a elektrody byl pozorován u malých redoxních bílkovin (cytochromy c a b, azurin, ferredoxin) ) a některých enzymů (lakáza, peroxidáza za). Přímý reversibilní přenos elektronů z biomolekuly (bílkovina, nukleová kyselina) je obvykle ztížen řadou faktorů.. V bílkovinb lkovinách se sice vyskytuje celá řada redoxně aktivních skupin (disulfidické můstky, Fe-S skupiny, flaviny, hem, řada iontů kovů), ale nachází se obvykle uvnitř molekuly. Kontakt redoxní skupiny s povrchem elektrody je možný pouze pro určitým způsobem orientované molekuly, coý výrazně snižuje proudové odezvy. Velikost molekuly zase vede k velmi pomalé difúzi. Navíc c se biomolekuly často adsorbují pevně na povrch elektrod a dochází tím m současn asně k jejich denaturaci. 17

18 Přenos elektronů z biomolekul substrát produkt E ox E red M red e - M ox Požadavky na mediátor pro usnadnění výměny elektronů mezi enzymy a elektrodou se používaj vají nízkomolekulární redoxní látky mediátory použití mediátor torů urychluje a obvykle vůbec v umožň žňuje výměnu elektronů mezi aktivním m centrem enzymu a elektrodou. reaguje s biokomponentou a elektrodou dostatečně rychlý přenos p elektronů (měla by být známa stechiometrie a počet přenp enášených elektronů) stabilní formy (redukovaná i oxidovaná) ) za podmínek použit ití neúčastn astní se postranních reakcí (např.. s kyslíkem) kem) vhodný redoxní potenciál l (větší rozdíl l redoxních potenciálů E mezi enzymem a mediátorem sice zvětší užitečný proud, současn asně však naroste také šum, nebezpečí interferencí a doba ustalování pozadí) bez vlivu ph na průběh h redoxní reakce netoxický (např.. pro aplikace in vivo) vhodný k imobilisaci (nerozpustný či i snadno adsorbovatelný) Mediátory Název E (V) tris-(2,2 -bipyridyl)ruthenium(iii) tris-(2,2 -bipyridyl)osmium(iii) ferrocen-1,1 -dikarboxylová kyselina ferrocenylmethyltrimethylamonium ,1 -bis(hydroxymethylferrocen] ferrokyanid K 4 [Fe(CN) 6 ] hydroxyethylferrocen N,N -dimethyl-p-fenylendiamin ferrocenoctová kyselina p-benzochinon N,N,N,N -tetramethyl-p-fenylendiamin ,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) ,2-naftochinon fenazin methosulfát (PMS) methylenová modř tetramethyl-p-benzochinon (durochinon) hydroxy-1,4-naftochinon fenosafranin NC NC Fe ferrocen Fc S S S S tetrathiafulvalen TTF C N C N tetrakyanochinodimethan TCNQ 18

19 Použit ití mediátor torů přímý přenos p v roztoku v micelách ch v elektrodě kovalentně na elektrodě 3D-polymern polymerní mediátor navázaný na enzym Biosensor pro glukosu Enzymová elektroda na jedno použití Měřící jednotka 19

20 Konduktometrie čas ω θ V m I m střídav davé napětí (sinusoidální vlnění) ) se přivp ivádí na dvouelektrodový systém neuplatní se faradaické procesy, konc.. polarizace, nabíjen jení dvoj-vrstvy vrstvy mimo velikosti napětí Vm (běž ěžně kolem 100 mv) ) lze měnit i frekvenci f (ω=2( =2πf "spektroskopie") studuje se odezva systému (elektrody a prostřed edí mezi nimi), měřm ěří se proud i a jeho fázový posun θ. Impedance Impedance Z je vektorová veličina ina charakterisující chování systému v přítomnosti střídav davého napětí.. Jako komplexní veličina ina mám velikost Z a úhel θ,, nebo složky reálnou R (resistance) a imaginárn rní X (reaktance). Platí pro ni následujn sledující vztahy: Z = R + jx tgθ = X/R Z = (R 2 +X 2 ) 1/2 Z = V m /i m Konduktometrické biosensory sledování změn n vodivosti při p i biochemických reakcích ch vyžaduje produkci či i spotřebu iontů nebo změny velikosti nabitých částic. Produkce iontů je spojena s účinkem hydrolas a amidas,, změna velikosti nabitých částic probíhá u reakcí fosfatas, sulfatas či nukleas. Velmi pohodlně tak lze např.. provádět t stanovení neutráln lních lipidů,, které po naštěpen pení lipas asou poskytují ionty. Klasickým příkladem p je však v reakce ureas asy y při p stanovení močoviny: oviny: NH 2 CONH H 2 O 2 NH HCO OH - problémem je vlastní vodivost pracovního prostřed edí (použit ití málo vodivých pufrů - organické,, např. imidazol); také změnu vodivosti vyvolanou samotným přídavkem p vzorku je třeba t odlišit, it, je žádoucí zanedbat změny vodivosti v celém m roztoku a sledovat předevp edevším m těsnt sné okolí elektrod s imobilisovanými enzymy (vlastní signál l v důsledkud bioreakce), proto se výhodně používá diferenční uspořádání. 20

21 Konduktometrické převodníky kontakty izolace enzymová referentní vrstva detail elektrod interdigitated array ukázka dvojitého konduktometrického převodníku (sítotiskov totisková technologie, rozměry ry 7 x 25 mm) Optické převodníky zdroje světla: lasery světloemituj tloemitující diody (LED) výbojky (pro UV oblast - Xe) lampy (halogenové, deuteriové) detektory pro měřm ěření intenzity světla: fotonásobi sobiče - jsou nejcitivější ší,, nevýhodou je potřeba vysokého napětí fotodiody avalanche - o něco n méněm citlivé,, většív šum obyčejn ejné fotodiody (1000x méněm než fotonásobi sobiče), vykazují větší šum (malý vnitřní odpor), velmi levné,, mechanicky stabilní a vhodné zejména pro přenosnp enosná zařízen zení fotodiodová pole - DAD diode array detector - lineárn rní řada fotodiod vedle sebe ( ), profil intenzity v závislosti z na úhlu dopadu (spektrum) CCD prvky (videokamery) - plošný profil intenzity, image techniky 21

22 Princip laseru Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation ('zesilování světla pomocí stimulované emise zářenz ení') světlo ve formě úzkého svazku, je polarizované, koherentní a monochromatické složky: aktivní prostředn ední,, rezonátore, zdroj energie funkce: zdrojem energie je do aktivního média m pumpována energie, vybudí elektrony, ty při p i pádu p na nižší energetickou He-Ne hladinu vyzáří fotony. Fotony následnn sledně vrážej ejí do další ších elektronů,, zase je vybudí laser = zesilování toku fotonů,, jestliže e tok dopadne na zrcadlo s odrazivostí 100% je zpátky odražen do zesilovacího ho procesu, nebo narazí na polopropustné zrcadlo, které paprsek propustí aktivní prostřed edí - oddělen lené kvantové energetické hladiny elektronů plyn nebo směs s plynů (plynové lasery) monokrystal - hladiny vznikají dopováním m (pevnol( pevnolátkové) polovodič s p-n p n přechodem p (diodových laserů) polovodičov ové multivrstvy jsou základem z kvantových kaskádn dních laserů přechod elektronů z vyšší ššího do nižší šího stavu při p i současn asném m vyzářen ení fotonu: spontánn nní emise (při i nízkn zkém m stupni obsazení vyšší hladiny) stimulovaná emise (generace laserového zářenz ení) - je třeba t čerpáním m dosáhnout tzv. populační inverze, kdy vyšší hladina je obsazena více v elektrony než nižší ší Lasery 22

23 Fotonásobi sobič PMT, Photo Multiplier Tube citlivá el. součástka stka k registraci slabého zářenz ení princip: záření dopadající na fotokatodu z nín uvolní několik primárn rních elektronů v el. poli jsou tyto elektrony urychlovány k další ším m elektrodám m (dynodám), na každé z nich uvolní další sekundárn rní elektrony vzniká stále silnější proud elektronů,, který vyvolá v měřm ěřicích ch obvodech fotonásobi sobiče elektrický impulz kanálov lová konstrukce Další fotodetektory Fotorezistor princip - vnitřní fotoelektrický jev, nelineárn rní,, pomalý (závis visí na osvětlen tlení), snižuje odpor s rostoucím m ozářen ením monokrystal polovodiče e nebo polykrystalická tenká vrstva (CdS( CdS) ) nanesená na nosné destičce, dva kontakty, hermetické pouzdro zaručuj ujícím m přístup p záření Fotodioda PN a PIN, foton vstupující do polovodiče e s dostatečnou energií může e být absorpován,, přičemp emž vzniklý volný elektron a díra d vytváří v polovodiči napětí (fotovoltaický jev) nebo zvětšuj ují jeho vodivost (fotovodivostn( fotovodivostní jev) lavinové (avalanche)) PIN fotodiody - vykazují vlastní zesílen lení.. Toto zesílen lení fotoproudu je způsobeno přilop iložením m napětí,, které urychluje dopadajícími fotony vzniklé nosiče e náboje n natolik, že e při p i srážce s mřížkou m krystalu polovodiče e dojde k vyražen ení další ších (sekundárn rních) elektronů Fototranzistor místo báze b dopadá světlo, zesílen lení 10 aža 100x 23

24 CCD detektor AvaSpec Focussing mirror Collimating mirror Grating Slit, mode stripper Detector SMA connector Porovnání detekčních elementů Detector TAOS 102 HAM256 HAM1024 SONY2048 Type Photo diode array CMOS linear array CMOS linear array CCD linear array # Pixels, pitch 102, 85 µm 256, 25 µm 1024, 25 µm 2048, 14 µm pixel width/height Sensitivity (HL2000, 8 µm fiber) 77 x 85 µm 25 x 500 µm 25 x 500 µm 14 x 56 µm ms int. time (AvaSpec-102) ms int. time ms int. time ms int. time Peak wavelength 750 nm 500 nm 500 nm 500 nm Signal/Noise 1000: : : :1 Dark noise Ca. 11 counts Ca. 22 counts Wavelength range nm nm nm 200*-1100 nm Frequency 2 MHz 330 khz 330 khz 2 MHz 24

25 Optické převodníky pomocné prvky zrcadla (normáln lní,, polopropustná), hranoly mřížky, filtry štěrbiny, závěrkyz polarizátory, depolarizátory lampy (halogenové, deuteriové) světlovodn tlovodné prvky planárn rní (vrstvy) cylindrické (optická vlákna) přesná výroba, nákladné Optická vlákna kritická mez šířen ení paprsku ve světlovodu jádro (core) - index lomu n 1 pláš ášť (cladding) - n 2, n 2 <n 1 mechanický ý obal úhel dopadu většív než kritická mez - paprsek se šíří úhel dopadu menší než kritická mez - paprsek se tlumí numerická apertura - úhel dopadu menší než kritická mez 25

26 Měřící konfigurace nejběž ěžněji se optická vlákna v oblasti biosensorů používaj vají pro přímép ozařov ování vzorků (extrinsic sensing), interakce se tedy uskutečň čňují na konci vlákna: S D dual fibre D beam splitter vzorek S S bifurcated D M vlákna Fotometrie optická kyveta intenzita I 0 c I I = I 0 exp( εcl) D detektor ln( I 0 / I )= A = εcl tloušťka l Lambert-Beerův zákon pokles intenzity (absorbce( absorbce) ) světeln telného paprsku po průchodu kyvetou s barevnou látkou l je úměrný koncentraci stanovované látky v praxi se používá absorbance A,, která je přímo p úměrná koncentraci c (extinkční koeficient ε při i dané vlnové délce je konstantou úměrnosti) a velikosti l kyvety absorbance je bezrozměrn rná veličina ina (rozptyl světla se obvykle zanedbává ) 26

27 Fluorescence I f = kφεcl intenzita I 0 fluorescence (kolmo na excitační paprsek) zdroj světla D detektor I 0 >> I f je využívána velmi často z důvodu vysoké citlivosti absorbcí energie přechp echází molekula do excitovaného stavu, návrat n do základnz kladního stavu je provázen emisí záření fluorescence intenzita fluorescence I f závisí na absorbanci a kvantovém m výtěž ěžku Φ emisní spektrum látky l je oproti excitačnímu posunuto k vyšší šším vlnovým délkd lkám m (Stokes( Stokesův posuv) pro budící záření se často používá světlo laseru, je také výhodné používat polarizované záření c I f Měřící konfigurace při tzv. intrinsic sensing optický vodič neslouží jen pasivně pro vedení světla, ale chemické změny v těsnt sném m okolí světlovodu se sledují na základz kladě vyvolaných změněných ných podmínek pro vedení uvnitř světlovodu tlovodu Při i vedení světla uvnitř světlovodu dochází k interferenci mezi dopadajícím m a odraženým světelným paprskem a tím t vzniká elektromagnetické stojaté vlnění kolmé k odrážej ejícímu povrchu (tlumen( tlumená vlna, evanescent wave) V tenkém m světlovodu připadp ipadá na jednotku délky d mnohem více v odrazů. Světlo se začíná šířit pouze v určitých diskrétn tních modech, daných pouze určitými úhly dopadu. Mody lze určit na základz kladě průměru ru světlovodu, indexů lomu a vlnové délky světla. Za těchto t podmínek se mimo jiné zachovává fázová koherence laserového paprsku. 27

28 Exponenciáln lní vlna z E mod: elektromagnetická vlna se šíří do okolí mimo světlovod tlovod,, přitom p její intenzita klesá exponenciáln lně se vzdálenost leností od rozhraní ( exponenciální vlna ) na vnější ším m povrchu světlovodu může e docházet k interakcím m s přítomnými p látkamil energetické profily exponenciáln lní vlny jsou pro tři t i základnz kladní mody ukázány na obrázku pro vyšší mody narůst stá podíl vnější energie a zvětšuje se penetrační hloubka. Enzymové optody Přímé typy - opticky měřm ěřená látka (nejčast astěji fluorofor) ) se přímo p vyskytuje v biokatalytické reakci. NADH - poměrn rně slabý fluofor (Φ f = 0.02), extinkční a emisní maxima jsou při i 350 a 450 nm. Biorekogničním elementem jsou dehydrogenasy imobilisované před koncem optického vlákna. Aby se i koenzym dal zachytit v systému biosensoru,, používá se jeho konjugát s polyethylenglykolem,, který neprochází dialysační membránou. Výhodná je konstrukce sensoru pro alkohol, kde je vzorek oddělen mikroporézn zní teflonovou membránou, NADH se nachází ve vnitřním m roztoku sensoru. Existuje řada pokusů využít t fluorescenci flavinových koenzymů (FADH 2, FMNH 2 ) vázaných v pevně v molekule mnoha oxidas.. Při P i vyšší koncentraci substrátu tu se zpomaluje zpětn tná oxidace redukované formy kyslíkem kem a intensita vnitřní (intrinsic)) fluorescence redukovaného koenzymu narůst stá.. Výhodou je reversibilita takového systém U sensorů využívaj vajících ch celé buňky se sleduje vnitřní fluorescence NADH (je úměrná metabolické aktivitě). Chlorofylové optické sensory se konstruují pro detekci toxicity působenp sobené látkami inhibujícími fotosystém u rostlin. 28

29 Enzymové optody Nepřímé ( mediované, extrinsic) ) optické biosensory využívaji vaji optické indikátory. Nejčast astější jsou optické sensory pro měřm ěření kyslíku ku a ph. sledování kyslíku ku využívá zháš ášení fluorescence indikační molekuly, pokles intensity fluorescence je dán d n Stern-Volmerovým vztahem: I f = I f 0 /(1 + K SV [ O 2]) Indikátor se obvykle nachází v silikonové vrstvě před čelem optického vlákna. Nejčast astěji se používá kyselina pyrenmáseln selná (pyrenebutyric acid,, PBA), excitace při p i 350 aža 400 nm; další možnosti nosti jsou perylen a dekacyklen, organokovové komplexy ruthenia lze výhodně excitovat při p i 460 nm,, takže e jako zdroj může m e sloužit modrá LED. (CH 2 ) 3 COOH ph změny lze sledovat pomocí acidobasických indikátor torů.. Z fluorescenčních ch lze použít t např. 1-hydroxypyren-3,6,8-trisulfonovou kyselinu (HPTS, ph přechod p 5 aža 8) nebo 4-methyl4 methyl- umbelliferon. Absobčních indikátor torů je celá PBA řada, kresolová zeleň a bromthymolová modř. Luminiscence k A 1 2 B * k X + hν aktivace rozpad je to emise světla z molekuly v excitovaném m stavu, který vznikl jako důsledek d chemických reakcí kvantový výtěž ěžek luminiscence odpovídá podílu počtu vyzářených fotonů a excitovaných molekul,, u přírodních systémů může e dosahovat aža 90% intenzita I vyzařovan ovaného světla je závislz vislá na čase, v určit itém okamžiku prochází maximem (t( max ) k2 ln k1k k 2 1 I [ A0] [exp( k1t) exp( k2t) tmax = k k k k vztah mezi luminiscencí a látkovým l množstv stvím analytu se určí kalibrací 29

30 Chemiluminiscence účinnost luminiscence závisz visí na chemickém m výtěž ěžku reakce poskytující aktivovaný meziprodukt (B*), podílu excitovaných molekul a konečně na fluorescenčním výtěž ěžku (ten by se měl m l blížit 1) aktivovaný meziprodukt je výhodnější v singletovém stavu; delší životnost tripletového stavu zvyšuje pravděpodobnost podobnost zhasnutí ve vedlejší reakci. pro citlivou detekci peroxidu vodíku se používá luminol (5-amino amino-2,3- dihydroftalazin-1,4 1,4-dion); intensita světla je úměrná koncentraci H 2 O 2, jako katalyzátor tor se můžm ůže e uplatnit ferrikyanid, hemin nebo v neutráln lním m prostřed edí peroxidasa,, v nevodném prostřed edí vyvolá luminiscenci jen kyslík k a bázeb celkový výtěž ěžek je pouze 0.01 (špatn( patná fluorescence) O N H N H +H 2 O 2 +OH - katalyzátor COO * - N 2 hν + 3-aminoftalát C O O - -N 2 N H 2 O N H 2 Bioluminiscence emise světla při p i (bio)chemické reakci v živém m organismu (cca 1000 druhů) ) se účastní enzymy luciferasy; ; tyto enzymy štěpí substrát t luciferin (různ zné druhy dle organismu), přičemp emž dochází k emisi světla světlu tluška (firefly, Photinus pyralis) Luciferin COOH luciferasa (EC ) oxiduje N N příslušný luciferin za účasti ATP, H emise při p i 560 nm,, výtěž ěžek asi 0.88!: HO S S ATP + luciferin + O 2 AMP + PP + oxyluciferin + CO 2 + hν mořsk ské bakterie (Vibrio fischeri, V. harveyi, Photobact. phosphoreum) luciferasa (EC ) aža 5% obsahu buňky, oxiduje aldehydy (>C( 8, dekanal, tetradekanal); v buňce obsahují i NAD(P)H:FMN oxidoreduktasu: NAD(P)H + FMN + H + NADH oxidoreduktasa NAD(P) + + FMNH 2 Luciferasa FMNH 2 + R-CHO + O 2 FMN + R-COOH + H 2 O + hν což umožň žňuje napojení na dehydrogenasy - spolu s bakt. luciferasou jsou imobilisovány na konec optického vlákn 30

31 Aplikace bioluminiscence citlivá detekce ATP M, stanovení biomasy stanovení s účastí ATP (kreatin kinasa, ATPasa, pyruvát kinasa,...) specifická detekce druhu mikroorganismů pomocí bakteriofágů nesoucích ch lux gen (z Vibria, u světlu tlušek luc geny) citlivá detekce těžt ěžkých kovů (rtuť,, arsen): genový konjugát mer- lux (mer je promotor aktivovaný Hg) ) je vpraven do plasmidů v E. coli,, v přítomnosti p rtuti se aktivuje, proběhne exprese luciferasy a následuje luminiscence, citlivost 200 nm rtuti stanovení Ca 2+ - působí rozpad a luminiscenci fotoproteinu (peroxoforma luciferinu vázánáv v komplexu s luciferasou, Aequorea) Zhodnocení optod Výhody: není třeba referentní prvek imobilizovaná fáze nemusí být ve fyzikáln lním m kontaktu s optickým systémem (snadná výměna biovrstvy) stabilní kalibrace (zvláš áště při i použit ití dvou vlnových délek) d současn asně mohou reagovat na několik n analytů (různ zné reagenty,, různr zné vlnové délky) - vysoká hus-tota přenosu informací nemají vliv interference elektromagnetické povahy (lze provádět t měřm ěření na velké vzdálenosti) při i použit ití v živém m organismu nehrozí elektrický šok (při i zkratu) Nevýhody: není reference při p i měřm ěření intenzity světla (svítivost zdroje kolísá), proto je třeba kalibrace ve dvou bodech dynamický rozsah je omezený (pro ph 2 aža 6 řádů,, elektrochemicky 12!) odezvy jsou často pomalé dlouhodobá stabilita je limitována vyčerp erpáním m indikátoru (fotorozklad( fotorozklad, raději "svítit" méněm intenzivně) vadí světlo z okolí 31

32 Kalorimetrické biosensory využívaj vají změny teploty v průběhu enzymových reakcí (někter které typické příklady jsou uvedeny v tabulce). Při P i konstrukci biosensorů to je spíš íše okrajová záležitost, ale existují některé analyty,, pro které mohou být kalorimetrické převodníky zvláš áště výhodné.. Meze detekce bývají do 10 µm, rozlišen ení C; vývoj tepla při p i biochemických reakcích ch ( kj( kj/mol): Katalasa GOD Hexokinasa Laktát t DH Ureasa Urikasa H 2 O 2 glukosa glukosa pyruvát močovina ovina kys.. močov ová pokud vlastní reakce s analytem neuvolňuje uje teplo, lze zařadit adit následný n krok uvolňuj ující teplo: oxidasa H 2 O 2 kataláza hydrolasy anion + H + hydratace na H 3 O + hydratační teplo protonu činí v Tris pufru H = 48 kj/mol, ve fosfátu je H = 4.7 kj/mol recyklační pochody umožň žňují produkci tepla několikann kolikanásobně zvýšit převodn Termistor Enzymový reaktor s termistorem evodníkem je obvykle termistor, jeho odpor R závisz visí na teplotě T: 1/T = a + b ln R + c (ln( R) 2 často se pracuje v průto točném m sytému s enzymovým reaktorem tepelně izolovaným od okolí použit ití diferenciáln lního uspořádání umožň žňuje pracovat při p i teplotě místnosti měření odporu termistoru se provádí pomocí Wheatstoneova můstku jiný převodnp evodník k můžm ůže e být termočlánek (CMOS) Výhodou je, že e nevadí částice ve vzorku, interferující látky nebo zbarvení. Někdy také jiné metody mohou být dost těžt ěžkopádné,, např.. stanovení triglyceridů lipázou se sleduje kalorimetricky velmi výhodně 32