ení pufru, ph, teplota, tlak) rychlost reakce limituje enzym (ostatní reagencie v nadbytku)

Transkript

1 Měření enzymové aktivity optické elektrochemické manometrické vhodné substráty ty příklady stanovení nejdůle ležitějších enzymů Měření aktivity podmínky konstantní (složen ení pufru, p, teplota, tlak) rychlost reakce limituje enzym (ostatní reagencie v nadbytku) rychlost změny signálu v čase by měla m být konstantní (lineárn rní oblast, saturace enzymu substráty, ty, tj. [S] >> K M,S protože pak platí v V lim )

2 Fotometrie optická kyveta intenzita I 0 c I I = I 0 exp( εcl) D detektor ln( I 0 / I )= A = εcl tloušťka l Lambert-Beerův zákon pokles intenzity (absorbce) světeln telného paprsku po průchodu kyvetou s barevnou látkou l je úměrný koncentraci stanovované látky v praxi se používá absorbance A,, která je přímo p úměrná koncentraci c (extinkční koeficient ε při i dané vlnové délce je konstantou úměrnosti) a velikosti l kyvety absorbance je bezrozměrn rná veličina ina (rozptyl světla se obvykle zanedbává ) Výpočet aktivity a = dn dt V da = εl dt V A ε l t da/dt u přístrojp strojů s kontinuáln lním m záznamemz znamem A změna absorbance při p i ručním m odečtu ( A=A konec -A počátek tek) ) za dobu inkubace t V objem reakční směsi si v kyvetě při i měřm ěření (celkový, včetnv etně všech přídavkp davků) l délka optické dráhy v kyvetě (obvykle 1 cm) ε extinkční koeficient, udává se obvykle při p i určit ité vlnové délce (např. ε 280 ) pozor na jeho jednotky

3 Ukázka záznamuz znamu směrnice da/dt A konec A startovací přídavek nastartování reakce, inkubace po dobu t, zastavení reakce čas A počátek kontinuáln lní a diskontinuáln lní měření absorbance Fluorescence I f = kφεcl intenzita I 0 fluorescence (kolmo na excitační paprsek) zdroj světla I f I 0 >> I f D je využívána velmi často z důvodu detektor vysoké citlivosti absorbcí energie přechp echází molekula do excitovaného stavu, návrat n do základního stavu je provázen emisí záření fluorescence intenzita fluorescence I f závisí na absorbanci a kvantovém m výtěž ěžku Φ emisní spektrum látky l je oproti excitačnímu posunuto k vyšší šším vlnovým délkd lkám m (Stokesův v posuv) pro budící záření se často používá světlo laseru, je také výhodné používat polarizované záření vztah mezi fluorescencí a látkovým l množstv stvím m substrátu tu či i produktu se určí kalibrací (není extinkční koeficient - podmínky měřm ěření málo lo reprodukovatelné) c

4 Luminiscence k A 1 2 B * k X + hν aktivace rozpad je to emise světla z molekuly v excitovaném m stavu, který vznikl jako důsledek d chemických reakcí kvantový výtěž ěžek luminiscence odpovídá podílu počtu vyzářených fotonů a excitovaných molekul,, u přírodních systémů může e dosahovat aža 90% intenzita I vyzařovan ovaného světla je závislz vislá na čase, v určit itém okamžiku prochází maximem (t( max ) k1k2 I [ A0] [exp( k1t) exp( k2t) k k 1 2 t max k2 ln k1 = k k 2 1 vztah mezi luminiscencí a látkovým l množstv stvím m substrátu tu či i produktu se určí kalibrací Měření kyslíku ku provádí se elektrochemicky pomocí Clarkova článku elektrodová redukce kyslíku ku (-750 mv,, katoda) ) je 4-elektronový proces: Au (Pt) elektroda zatavená ve skle Ag/AgCl elektroda elektrolyt membrána propustná pro e e - 2 -

5 Ukázka záznamuz znamu startovací přídavek I sat siřičitan propláchnutí, probublání vzduchem nebo kyslíkem I směrnice di/dt čas I zb I = 0 nejprve se provede jednorázov zová kalibrace sensoru, pak vlastní měření měřící nádobka uzavřen ená - aby tam nešel el kyslík k z okolí Výpočet aktivity a dn c V = 2 = 0, 2 dt I I sat zb di dt c 0,2 výchozí koncentrace kyslíku ku v roztoku za daných podmínek (typ pufru, teplota, tlak) - určí se z tabulek di/dt rychlost úbytku proudu v přítomnosti p enzymové reakce I sat - maximáln lní velikost proudu při p i saturující koncentraci kyslíku ku I zb - zbytkový proud sensoru v mediu bez kyslíku ku (vyčerp erpá se chemickou reakcí se siřičitanem itanem - kalibrace) někdy sensor přímo p měřm ěří koncentraci kyslíku ku

6 Acidobazické titrace enzymové reakce zahrnující změnu p - zejména hydrolasy (štěpen( pení konjugátů poskytuje kyselinu jako jeden z produktů) oxidace substrátů pomocí AD + vznikající kyselina (báze( ze) ) je průběž ěžně titrována standardním m roztokem báze b (kyseliny( kyseliny) ) o známé koncentraci tak, aby p roztoku bylo pořád stejné jako při p i zahájen jení reakce - zařízen zení p-stat rychlost "odebírání" " ("dod( "dodávání")) iontů + pak určuje uje aktivitu enzymu Výpočet aktivity a = dn dt = c titr dv dt titr c titr koncentrace standardního roztoku titračního činidla; pozor na stechiometrii, např. c titr = [[ + ] = 2[2 2 S 4 ] dv titr /dt rychlost přítoku p titračního činidla do měřm ěřící nádobky

7 Princip p-statu výchozí p signál = dv titr /dt p elektroda mikroprocesor nádobka s míchadlem elektronická byreta s titračním činidlem udržov ování konstantního p v pracovní nádobce zpětn tná vazba řídí rychlost přidp idávání titračního činidla to kompenzuje změny p vyvolané enzymovou reakcí Ukázka p statu

8 Manometrické metody měří se objem plynu vyvinutého (nebo spotřebovan ebovaného) v enzymové reakci za normáln lních podmínek (25 C, 101 kpa) konstanta úměrnosti - molárn rní objem plynu, V m =22,4 dm 3 /mol Výpočet aktivity a dn dt 1 = V dv dt nejsou-li normáln lní podmínky, určí se látkovl tkové množstv ství plynného produktu ze stavové rovnice: p V n = RT = m AD(P) + / AD(P) - Wartburgův v optický test dehydrogenasa A 2 + AD + A + AD + + přirozený substrát, t, který při p enzymové reakci měním barvu (chromogenní) - při i 340 nm univerzáln lní pro stanovení dehydrogenas (xd) často funguje jako koncový krok "zviditelňuj ující" " předchp edcházející "nebarevné" " enzymové reakce E1 E2 En (D) S P... AD AD +

9 Tetrazoliové soli R'' R + R' + 2e - R'' R R' bezbarvá tetrazoliová sůl barevný formazan umožň žňuje napojení na reakce produkující AD - měření probíhá ve viditelné oblasti spektra přenos elektronů z AD na tetrazolium probíhá pomocí další šího enzymu diaforasy nebo pomocí mediátoru fenazinmethosulfátu tu (PMS) AD diaforasa(fad) formazan AD + diaforasa(fad 2 ) tetrazolium e - PMS S Peroxid vodíku, peroxidasa obecná reakce peroxidasy: D D bezbarvý barevný široká řada substrátů ABTS, kyselina 2,2 -azino azino-bis(ethylbenzothiazolin) bis(ethylbenzothiazolin)-6-sulfonová S S S S peroxidasa C2 C 2 ABTS S + C 2

10 TMB 3,5,3,5 -tetramethylbenzidin 4-aminoantipyrin fenol 4-aminoantipyrin 4 chinonimin (510 nm)

11 ydrolasy použit ití derivátů 4- nebo 2-nitrofenolu 2 a 4-nitroanilidu po hydrolyse vzniká intenzivní žluté zbarvení 2 2 R 2 2 R bromo-4-chloro-indolyl (X-) Br Cl X- R 2 - R indoxyl -2e - Br Cl indigo Cl Br hydrolytickou reakcí vzniká indoxyl, který po oxidaci (např.. tetrazolium) přechp echází na modré indigo

12 Fluorogenní substráty ty oxidoreduktas rhodamin 123 dihydrorhodamin oxiduje superoxidový radikál l na rhodamin 123, zelená fluorescence, λ ex / λ em = 505 / 534nm) Fluorogenní substráty ty hydrolas P MUP 2-3 P 4 4-methylumbelliferylfosfát t (MUP( MUP), po hydrolyse fosfatasou vzniká 4-methyl-7-hydroxykumarin (methylumbelliferol), modrá fluorescence, λ ex / λ em = 360 / 450 nm) Z-X- deriváty 7-amino7 amino-4-methylumbelliferolu (Z-X-AMC( nebo Z-X-MCA), Z AMC produkt λ ex / λ em při 342 / 441 nm,, např. 7-amino-4-methylkumarin -CBZ-L- fenylalanyl-l-argininamid argininamid (Z-FR( FR-AMC) ) pro stanovení serinových proteinas a plasminu, kalikreinu, katepsinu), nebo 7-amino-4-methylkumarin, umarin, -CBZ- L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparagylamidamid (Z-DEVD-AMC)) pro kaspasu 3 alternativně deriváty 7-amino-4-trifluoromethylkumarinu, u, např. Z-DEVD-AFC -CBZ- je -benzyloxykarbonyl-

13 Fluorogenní substráty ty hydrolas P P R FDP deriváty resorufinu deriváty fluoresceinu, např. fluoresceindifosfát pro ALP Z-R BZAR R-Z rhodamin 110, bis-(-cbz-l-argininamid) (BZAR), pro serinové proteinasy, (496 / 520 nm) cca 100x citlivější než sloučeniny založené na AMC jiný příklad - rhodamin 110, bis-(-cbz-lfenylalanyl-l-arginin amid) (Z-FR-R110) pro cysteinové proteinasy katepsin B a L Srovnání spektráln lních vlastností 4-methyl-7-hydroxykumarin excitace emise rhodamin 110 excitace emise λ λ

14 FRET fluorescence energy resonance transfer fluorescenční skupina (fluorofor) zhášející skupina (quencher) excitace hydrolysa vhodné skupiny ve spojovacím můstku oddálení - není přenos energie nezářivý resonanční přenos energie na blízkou skupinu akceptoru nástup fluorescence ŽÁDÁ FLURESCECE citlivá detekce hydrolas, např.. proteinas - v můstku m je peptidová vazba FRET - vhodné skupiny R S fluorofory (donory, R značí napojení na další část molekuly) FAM R dansyl 3 C R 2 ( ) 2 2 DP TMR ( ) 2 ( ) 2 DABSYL S R zháš ášeče e (akceptory) R

15 Luminogenní substráty ty pro citlivou detekci peroxidu vodíku se používá luminol (5-amino amino-2,3- dihydroftalazin-1,4 1,4-dion), celkový výtěž ěžek je pouze 0.01 (špatn( patná fluorescence) intensita světla je úměrná koncentraci 2 2, katalyzuje peroxidasa katalyzátor C * - 2 hν + 3-aminoftalát C luminol 2 alternativa - akridanové luminogeny F F PS-3 F F F F F (akridan) * F F C 2 hν (akridinium) + Měření superoxidového radikálu hν + lucigenin

16 Fosfatasy C P i + hν Lumigen PPD P Cl Lumigen PPD (chloro-4-methoxy methoxy-4-(3-fosfátophenyl)spiro[1,2-dioxetan- 3,2'-adamantan]) - vhodný luminogenní substrát t pro měřm ěření alkalické fosfatasy (ALP) Luciferasy (ATP resp. AD(P) štěpí substrát t luciferin (různ zné dle organismu), přičemp emž dochází k emisi světla světlu tluška (firefly, Photinus pyralis) luciferin C luciferasa (EC ) oxiduje příslušný luciferin za účasti ATP, emise při p i 560 nm,, výtěž ěžek asi 0.88! měření enzymů produkujících ch ATP S S ATP + luciferin + 2 AMP + PP + oxyluciferin + C 2 + hν mořsk ské bakterie (Vibrio fischeri, V. harveyi, Photobact. phosphoreum) luciferasa (EC ) aža 5% obsahu buňky, oxiduje aldehydy (>C( 8, dekanal, tetradekanal); v buňce obsahují i AD(P):FM oxidoreduktasu: AD(P) + FM + + AD oxidoreduktasa AD(P) + + FM 2 Luciferasa FM 2 + R-C + 2 FM + R-C hν měření dehydrogenas

17 Radiometrie sledování radioaktivně označeného substrátu nebo produktu používané sloučeniny: jednoduché - 14 C 2, 3 2, 35 S 2-4 uniformě značené - [ 14 C] alanin, [ 14 C] ethanol specificky značené L-[methyl- 14 C] methionin, [methyl- 3 ] thymin jednotky: Bequerel ~ s -1 (dle SI), Curie ~ 1 g 226 Ra, (µci mci v praxi) detektory ionizační (Geiger-Mullerova trubice) scintilační polovodičov ové skenery fotografický materiál separace rad. produktu precipitací,, extrakce vývoj nebo inkorporace rad. plynu nebo těkavt kavé látky elektroforesa, papírov rová nebo tenkovrstevná chromatografie výhody přesnost, chemická identita, měřm ěření radioaktivity nezávis visí na formě a podmínk nkách problémy nákladné vybavení i reagencie, pracovní rizika Microarrays screening enzymů použit itím m mnoha různých r substrátů (array) zakotvených na nosiči

18 Screening kinas radioaktivní značen ení

19 Průběh h reakce - "závady" [P] start normální zpomalování reakce - málo substrátu, vznik rovnováhy - inhibice produktem - nestabilní enzym - inhibice s pomalou rovnováhou - nedokonalá metoda - změněné podmínky stanovení čas reaguje i bez enzymu (či substrátu) - precipitace - usazování částic - kontaminace substrátu enzymem (enzymu substrátem) - neenzymový rozklad substrátu - usazování na stěny reakčních nádob lag fáze / rychlejší počátek - špatná regulace teploty - usazování částic - špatné promíchání - pomalý ustálený stav - pomalá odezva detektoru - inhibice substrátem - aktivace produktem Rychlost vs. enzym normální přítomen kovalentní inhibitor d[p] dt zpomalování rychlosti - neměří se počáteční rychlost - pomalá spřažená reakce - přítomen nekovaletní inhibitor [enzym] přítomen aktivátor