substráty, ty, koenzymy, enzym,

Transkript

1 Enzymová stanovení kompletní konverze analytu na měřm ěřitelné produkty (barevné,, fluoreskující, ) - "end- point" " stanovení kinetická stanovení - rychlost enzymové reakce limituje analyt (funguje např.. jako substrát), t), ostatní komponenty reakční směsi si jsou v nadbytku (další substráty, ty, koenzymy, enzym, ) recyklační stanovení - účastní se dva komplementárn rní enzymy (např.. laktát dehydrogenasa a laktát t oxidasa) katalytická stanovení Následné reakce často nestačí pouze jedna (primárn rní,, měřm ěřená) ) reakce, ale je nutné zařadit adit následnn sledné indikační kroky (sekvence reakcí): E prim A B C X E ind t~0: [B] << K mb, v ind = V ind.[b]/k B - m reakce 1. řádu t>0: k[e prim ] = V ind v ind ind = V ind [B]/(K mb + [B]) = V ind /(K mb /[B] + 1) [B] 100K mb chyba kolem 1% Y je třeba 10 až 100-násobný nadbytek E ind vůči E prim 1

2 Klinická (potravinářsk ská, )) stanovení C- C CH 2 CH 2 C- 2-oxoglutarát C- HC NH glutamátdehydrogenasa 2 + NADH + NH + 4 CH 2 + NAD + + H 2 amoniak L-glutamát fosfoenolpyruvát fosfoenolpyruvát karboxylasa + C 2 + H - C 2 CH 2 C- C- C~ P CH 2 C- Cmalátdehydrogenasa C HC H CH 2 C- + NADH + H + CH 2 Coxalacetát L-malát + NAD + rg. kyseliny kys. mléčná laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + pyruvát + NADH + H + pyruvát + L-glutamát alaninaminotransferasa L-alanin + 2-oxoglutarát puruvát + NADH + H + L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + kys. pyrohroznová 2-oxoglutarát + NADH + NH 4 + glutamátdehydrogenasa kys. oxoglutarová L-glutamát + NAD + + H 2 kys. glutamová glutamátdehydrogenasa L-glutamát + NAD + + H 2 2-oxoglutarát + NADH + NH + 4 NADH + jodonitrotetrazolium.cl + H + diaforasa NAD + + formazan 2

3 kys. citronová pyruvát + C 2 citrát citrátlyasa oxalacetát + acetát malátdehydrogenasa oxalacetát + NADH + H + L-malát + NAD + L-laktátdehydrogenasa pyruvát + NADH + H + L-laktát + NAD + malátdehydrogenasa L-malát + NAD + oxalacetát + NADH + H+ kys. jablečná oxalacetát + L-glutamát aspartátaminotransferasa L-aspartát + 2-oxoglutarát - C CH C - + H 2 CH fumarasa L-malát kys. fumarová oxalát oxalátdekarboxylasa formiát + C 2 kys. šťavelová formiát + NAD + + H 2 formiátdehydrogenasa HC NADH + H + kys. mravenčí 3

4 Ethanol, acetaldehyd, kys. octová alkoholdehydrogenasa ethanol + NAD + acetaldehyd + NADH + H + aldehyddehydrogenasa acetaldehyd + NAD + + H 2 kys. octová + NADH + H + acetát + ATP + CoA acetát:coa-ligasa (tv. ADP) acetyl-coa + ADP + Pi acetyl-coa + oxalacetát + H 2 citrátsynthasa H CH 2 C - C - + CoA CH 2 malátdehydrogenasa malát + NAD + oxalacetát + NADH + H + C - citrát Monosacharidy β-d-glukosa + H glukosaoxidasa glukonolakton + H 2 2 C H 2 H + ATP hexokinasa C H 2 -P + ADP glukosa β-d-glukosa β-d-glukosa-6-fosfát β-d-glukosa-6-fosfát + NADP + G6PDH C H 2 -P + NADPH + H + β-d-fruktosa + ATP glukonolakton-6-fosfát hexokinasa β-d-fruktosa-6-fosfát + ADP fruktosa β-d-fruktosa-6-fosfát fosfoglukoisomerasa β-d-glukosa-6-fosfát 4

5 Glycerol, tuky, mastné kyseliny H 2 C HC C H 2 H H H + ATP glycerolkinasa L-glycerol-3-fosfát + ADP ADP + fosfoenolpyruvát pyruvátkinasa pyruvát + ATP pyruvát + NADH + H + L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + triacylglycerol + 3 H 2 lipasa, esterasa glycerol + 3 mastné kyseliny mastná kys. + CoA + ATP MK:CoA-ligasa (tv. AMP) AMP + acyl-coa + P-P acyl-coa + 2 acyl-coa-oxidasa enoyl-coa + H 2 2 Cholesterol H cholesteroloxidasa cholesterol cholestenon + H 2 2 5

6 AMP, ADP, ATP AMP + ATP myokinasa 2ADP AMP, ADP ADP + fosfoenolpyruvát pyruvátkinasa ATP + pyruvát pyruvát + NADH + H + L-laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD + ATP 3-fosfoglycerát + ATP 3-fosfoglycerátkinasa 3-fosfoglyceroylfosfát + ADP 3-fosfoglyceroylfosfát + NADH + H + glyceraldehyd-3-fosfát triosafosfátisomerasa glyceraldehyd-3-fosfát DH dihydroxyaceton-3-fosfát glyceraldehyd-3-fosfát + NAD + + P i dihydroxyaceton-3-fosfát + NADH + H + 3-fosfoglycerát DH 3-fosfoglycerát + NAD + Enzymové biosensory biosensor je analytický přístroj obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupiny) chemických látek ve vzorku. převodník (transducer) elektronická jednotka výstupní signál biorekogniční vrstva analyt = látka, která se stanovuje 6

7 Potenciometrické bioelektrody A - A - A - A - základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem K + K + převodníkem je iontově selektivní elektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvou měří se potenciál l pracovní elektrody proti referentní elektrodě,, přitom p v systému neteče e proud Potenciometrické enzymové elektrody potenciál l ISE pro sledovaný iont (aktivita a i ) v přítomnosti p rušiv ivého iontu (aktivita a j ) E = E 0 + RT zf ln( a + k a i ij z / y j skleněná elektroda - H + - měření ph, běžb ěžně dostupná pevné ISE - tenká vrstva iontového vodiče monokrystal nebo směs s krystalů precipitát homogenní nebo heterogenní (mnohonásobn sobně levnější ší,, vlastní materiál dispergován n v inertní matrici (PVC, silikon,...) ) 7

8 Příklady ph : penicilin (penicilin( penicilinasa), acetylcholin (cholinesterasa), esteras asy, nukleové kyseliny (nukle( nukleasy) NH 3 / NH 4+ : močovina ovina (ureas asa), a), aminokyseliny (oxidační deaminace - glutamát DH, oxidas asa L- / D-aminokyselin; α,γ- eliminace amoniaku L-methionin γ-lyáza) C 2 : močovina ovina (ureas asa), a), aminokyseliny (lysin dekarboxylas asa, tyrosin dekarboxylas asa), laktát t (laktát monooxygenas asa - dekarboxylující oxidas asa) a) CN - : amygdalin (β-glukosidasa) Měření kyslíku ku a H 2 2 Clarkův amperometrický sensor Au (Pt) elektroda absolutní specifita pouze ke zatavená ve skle kyslíku ku - rušiv ivé látky nemohou projít t předp edřazenou membránou Ag/AgCl elektroda elektroda pro stanovení peroxidu elektrolyt vodíku je podobná kyslíkov kové s tím rozdílem, že e není použita membrána plynopropustná membána a propustná pro 2 používá se pozitivní polarizace - anodická oxidace e peroxidu Elektrodová redukce kyslíku ku (-750( mv) je čtyřelektronový proces: H e - H e - 2 H - Elektrodová oxidace peroxidu vodíku (>( 600 mv): m H H - 2 H H e H + 8

9 Kyslíkov ková elektroda Enzymové elektrody s oxidasami tyto enzymy oxidují molekulu substrátu tu (analytu( analytu) ) za účasti kyslíku, ku, přitom vzniká buď peroxid vodíku nebo voda: substrát t + 2 produkt + H 2 2 substrát t + 2 produkt + H 2 detekce peroxidu je obecně citlivější (nulová výchozí hladina) Proud 0 2 analyt H 2 2 č as Rozsahy detektoru oxidace peroxidu vodíku je spojená s nebezpečím m interference ze strany jiných oxidabilních látek, l např.. v séru s mohou vadit kyseliny askorbová a močov ová či paracetamol specifita se dád zlepšit předp edřazením kontrolní membrány, která omezí přístup interferujících ch látekl 9

10 Přehled oxidas Substrát oxidasy Zkratka EC číslo koenzym H 2 2 Alkohol AD FAD ano L-Aminokyseliny FAD ano D-Aminokyseliny FAD ano Askorbát Cu ne Bilirubin BR ne Diaminy DA Cu ano Fenol (Tyrosinasa) Cu ne Galaktosa Cu ano Glukosa GD FAD ano L-Glutamát FAD ano Cholin FAD ano Cholesterol CD FAD ano p-difenoly (Lakasa) Cu ne L-Laktát LD FAD ano L-Laktát (dekarb.) LM FMN ne L-Lyzin ano Monoaminy MA FAD ano NADH ano xalát Fp ano Pyruvát FAD ano Sulfit Mo ano Urát(Urikasa) Cu ano Xanthin XD Mo ano Enzymové elektrody s dehydrogenasami největší skupinou oxidoreduktas jsou dehydrogenasy (250 NAD + a 150 NADP + dependentních enzymů) substrát + NAD(P) e - + H + produkt + NAD(P)H bioanalyticky významné druhy jsou shrnuty v tabulce: Přehled dehydrogenas Substrát Zkratka EC číslo Alkohol ADH Hydroxybutyrát 3-HBDH Aldehyd AlDH Hydroxysteroid 3-HSDH Alanin Ala-DH Isocitrát ICDH Formiát FDH Inositol IDH Galaktosa Gal-DH L-Laktát L-LDH Glycerol Gly-DH D-Laktát D-LDH Glukosa GDH L-Leucin L-LeDH Glukosa-6-fosfát G6P-DH L-Malát L-MDH Glutamát GlDH Sorbitol SDH

11 Detekce NAD(P)H elektrochemick N PMS Fenazin methosulfát N + CH CH 3 S 3 3 R: methyl Meldola Blue N H 2 N N + R 2 R: ethyl Nile Blue H 3 C N XHN S N + Me 2 X: H Toluidine Blue X: naphthoyl Naphthoyltoluidine Blue M ox + NADH CT M red + NAD + M red M ox + 2 e - + n + CT elektrochemická detekce NADH je možná amperometrickou reoxidací vznikajícího NADH (E -560 mv/sce); přímá oxidace vyžaduje vysoký potenciál l (přes 1 V na uhlíku), nastává dimerizace a adsorpce produktů na povrch elektrody reoxidace se můžm ůže e provést st lépe l prostřednictv ednictvím m modifikujících ch látek l vázaných na povrchu elektrody nejčast astěji se používaj vají fenaziny, fenoxaziny a fenothiaziny,, oxidace nastává již kolem 0 V/SCE lze užít u t také hexakyanoželezitan elezitan nebo TTF.TCNQ průběh h reakce je homogenní - vzniká charge transfer komplex CT, po rozpadu je pak reoxidován mediátor tor,, přitom p E > E lze pracovat při p i nižší ším m potenciálu Přenos elektronů z biomolekul substrát produkt E ox e - E red přímý přenos elektronů pro konstrukci biosensorů je atraktivní - zjednodušil by konstrukci bohužel, byl pozorován u malých redoxních bílkovin (cytochrom( cytochromy c a b, azurin, ferredoxin) ) a některn kterých enzymů (lakas asa, peroxidas asa). přímý reversibilní přenos elektronů z biomolekuly (bílkovina, nukleová kyselina) je obvykle ztížen řadou faktorů v enzymech se sice vyskytuje celá řada redoxně aktivních skupin (disulfidické můstky, Fe-S S skupiny, flaviny, hem, řada iontů kovů), ale nachází se obvykle uvnitř molekuly kontakt redoxní skupiny s povrchem elektrody je možný pouze pro orientované molekuly, což výrazně snižuje odezvy velikost molekuly vede k velmi pomalé difúzi biomolekuly se adsorbují pevně na povrch elektrod a dochází tím současn asně k jejich denaturaci 11

12 Přenos elektronů z biomolekul substrát produkt E ox E red M red e - M ox Požadavky na mediátor pro usnadnění výměny elektronů mezi enzymy a elektrodou se používaj vají nízkomolekulární redoxní látky mediátory použití mediátor torů urychluje a obvykle vůbec v umožň žňuje výměnu elektronů mezi aktivním m centrem enzymu a elektrodou. reaguje s biokomponentou a elektrodou dostatečně rychlý přenos p elektronů (známa stechiometrie a počet přenášených elektronů) stabilní formy (redukovaná i oxidovaná) ) za podmínek použit ití neúčastn astní se postranních reakcí vhodný redoxní potenciál bez vlivu ph na průběh h redoxní reakce netoxický (např.. pro aplikace in vivo) vhodný k imobilizaci (nerozpustný či i snadno adsorbovatelný) Mediátory Název E (V) tris-(2,2 -bipyridyl)ruthenium(iii) tris-(2,2 -bipyridyl)osmium(iii) ferrocen-1,1 -dikarboxylová kyselina ferrocenylmethyltrimethylamonium ,1 -bis(hydroxymethylferrocen] ferrokyanid K 4 [Fe(CN) 6 ] hydroxyethylferrocen N,N -dimethyl-p-fenylendiamin ferrocenoctová kyselina p-benzochinon N,N,N,N -tetramethyl-p-fenylendiamin ,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) ,2-naftochinon fenazin methosulfát (PMS) methylenová modř tetramethyl-p-benzochinon (durochinon) hydroxy-1,4-naftochinon fenosafranin NC NC Fe ferrocen Fc S S S S tetrathiafulvalen TTF C N C N tetrakyanochinodimethan TCNQ 12

13 Použit ití mediátor torů přímý přenos p v roztoku v micelách ch v elektrodě kovalentně na elektrodě 3D-polymern polymerní mediátor navázaný na enzym Biosensor pro glukosu Enzymová elektroda na jedno použití Měřící jednotka 13

14 Konduktometrické biosensory sledování změn n vodivosti - produkce či spotřeba iontů nebo změny velikosti nabitých částic vznik iontů je spojen s účinkem hydrolas (lipidy štěpené lipasou) a amidas,, změna velikosti nabitých částic probíhá u reakcí fosfatas, sulfatas či nukleas klasickým příkladem je reakce ureas asy y při p i stanovení močoviny: oviny: NH 2 CNH H 2 2 NH 4+ + HC 3- + H - problémem je vlastní vodivost pracovního prostřed edí (použit ití málo vodivých pufrů - organické,, např. imidazol) také změnu vodivosti vyvolanou samotným přídavkem p vzorku je třeba t odlišit, it, je žádoucí zanedbat změny ny vodivosti v celém m roztoku a sledovat především m těsnt sné okolí elektrod s imobilisovanými enzymy (vlastní signál v důsledkud bioreakce) proto se výhodně používá diferenční uspořádání. Konduktometrické převodníky kontakty izolace enzymová referentní vrstva detail elektrod interdigitated array ukázka dvojitého konduktometrického převodníku (sítotiskov totisková technologie, rozměry ry 7 x 25 mm) 14

15 Enzymové optody Přímé typy - opticky měřm ěřená látka (nejčast astěji fluorofor) ) se přímo p vyskytuje v biokatalytické reakci NADH - poměrn rně slabý fluofor (Φ f = 0.02), extinkční a emisní maxima jsou při p i 350 a 450 nm. Biorekogničním elementem jsou dehydrogenasy imobilisované před koncem optického vlákna. Aby se i koenzym dal zachytit v systému biosensoru,, používá se jeho konjugát s polyethylenglykolem,, který neprochází dialysační membránou. Výhodná je konstrukce sensoru pro alkohol, kde je vzorek oddělen mikroporézn zní teflonovou membránou, NADH se nachází ve vnitřním m roztoku sensoru Existuje řada pokusů využít t fluorescenci flavinových koenzymů (FADH 2, FMNH 2 ) vázaných v pevně v molekule mnoha oxidas.. Při P i vyšší koncentraci substrátu tu se zpomaluje zpětn tná oxidace redukované formy kyslíkem kem a intensita vnitřní (intrinsic)) fluorescence redukovaného koenzymu narůst stá.. Výhodou je reversibilita takového systém Enzymové optody Nepřímé ( mediované, extrinsic) ) optické biosensory využívaji vaji optické indikátory. Nejčast astější jsou optické sensory pro měřm ěření kyslíku ku a ph. sledování kyslíku ku využívá zháš ášení fluorescence indikační molekuly, pokles intensity fluorescence je dán d n Stern-Volmerovým vztahem: I f = I f 0 /(1 + K SV [ 2]) Indikátor se obvykle nachází v silikonové vrstvě před čelem optického vlákna. Nejčast astěji se používá kyselina pyrenmáseln selná (pyrenebutyric acid, PBA), excitace při p i 350 aža 400 nm; další možnosti jsou perylen a dekacyklen,, organokovové komplexy ruthenia lze výhodně excitovat při p 460 nm,, takže e jako zdroj může m e sloužit modrá LED. (CH 2 ) 3 CH PBA ph změny lze sledovat pomocí acidobasických indikátor torů.. Z fluorescenčních ch lze použít t např. 1-hydroxypyren-3,6,8-trisulfonovou kyselinu (HPTS, ph přechod p 5 aža 8) nebo 4-methyl4 methyl- umbelliferon. Absobčních indikátor torů je celá řada, kresolová zeleň a bromthymolová modř. 15