MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno 2013 Kateřina Tejkalová

2 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie CANNABIS SATIVA V ÉŘE GENOMIKY A BIOLOGICKÉ LÉČBY Bakalářská práce Kateřina Tejkalová VEDOUCÍ PRÁCE: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc. Brno 2013

3 Bibliografický záznam Autor: Kateřina Tejkalová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Cannabis sativa v éře genomiky a biologické léčby Studijní program: bakalářský Studijní obor: Molekulární biologie a genetika Vedoucí práce: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 55 Klíčová slova: Cannabis sativa; kanabinoidy; THC; genom; léčba

4 Bibliographic Entry Author: Kateřina Tejkalová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Cannabis sativa in the age of genomics and biological therapy Degree Programme: bachelor Field of Study: Molecular Biology and Genetics Supervisor: Assoc. Prof. RNDr. Jana Řepková, CSc. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 55 Keywords: Cannabis sativa; cannabinoids; THC; genome; therapy

5 Abstrakt Čeleď Cannabaceae je významnou skupinou kulturních rostlin, které produkují široce využitelné sekundární metabolity kanabinoidy. Práce se zaměřuje na druh Cannabis sativa L., která je producentem látky THC a dalších kanabinoidů s léčebnými účinky. Genom C. sativa byl v roce 2011 osekvenován s cílem identifikovat geny podílející se na biosyntéze sekundárních metabolitů a s cílem studia genetické variability. Byly identifikovány a klonovány tři enzymy podílející se na syntéze kanabinoidů. Bakalářská práce shrnuje dosavadní poznatky o genomu, genetice a metodách identifikace obsahu aktivních látek v rostlině C. sativa. Abstract The Cannabaceae family is an important group of cultivated plants, producing miscellaneous types of secondary metabolites cannabinoids with various useful properties. This thesis is focused on the species Cannabis sativa L., the main producer of THC (tetrahydrocannabinol) and other cannabinoids, which can be used as a medicine for the treatment of various diseases. The genome of C. sativa was sequenced in 2011 in order to both identify the genes involved in the biosynthesis of important cannabinoids and to study the variability of genotypes. Genes encoding the three main enzymes involved in biosynthesis of cannabinoids were cloned. The thesis reviews the knowledge about the Cannabis genome, genetics and methods of analysis of the chemical composition and content of active components in the plant.

6

7

8 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat své školitelce doc. RNDr. Janě Řepkové, CSc. za ochotu a odbornou pomoc, kterou mi poskytla během psaní této práce. 2

9 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno Kateřina Tejkalová 3

10 Obsah: Seznam zkratek Úvod Obecná charakteristika Cannabis sativa Původ a historie pěstování Taxonomické zařazení a biologická charakteristika Hlediska klasifikace Genetická charakteristika Možnosti biologické léčby Sekundární metabolity a endokanabinoidní systém Kanabinoidy Historie identifikace Charakteristika Biosyntéza Endokanabinoidní systém Terapeutické účinky kanabinoidů Mechanismus Účinky a oblasti využití Cannabis v éře genového inženýrství Genetická transformace Cannabis Explantátové kultury Metody genetické transformace Klonování genů pro klíčové enzymy Metody hodnocení obsahu aktivní látky Chemická analýza Genotypizace Nové přístupy chemické klasifikace zohledňující terapeutický přínos Závěr

11 6. Seznam použité literatury

12 Seznam zkratek AFLP amplified fragment length polymorphism polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů ATB antibiotics antibiotika BBE berberine bridge enzyme enzym berberinových můstků CBD cannabidiol kanabidiol CBDA cannabidiolic acid kyselina kanabidiolová CBDAS cannabidiolic acid synthase syntáza kyseliny kanabidiolové CBGA cannabigerolic acid kanabigerolová kyselina CBN cannabinol kanabinol cdna complementary DNA komplementární DNA (zpětným přepisem RNA) CNS central nervous system centrální nervová soustava ES endocannabinoid system endokanabinoidní systém EST expressed sequence tag sekvence s expresní adresou FAD flavine adenine dinucleotide flavin adenin dinukleotid GC-MS gas chromatography-mass spectrometry plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií HPLC high performance liquid chromatography vysoce účinná kapalinová chromatografie ISSR inter-simple sequence repeat polymorfismus sekvencí mezi dvěma mikrosatelity ITS internal transcribed spacer vnitřní přepisovaný mezerník MAS marker assisted selection asistovaná selekce na základě molekulárních markerů asociovaných s cílovým znakem (ve šlechtění) NCBI National Center for Biotechnology Information NK natural killer (cell) buňky imunitního systému, tzv. přirození zabíječi NMR nuclear magnetic resonance nukleární magnetická rezonance OLA olivetolic acid olivetová kyselina OLS olivetolic acid synthase syntáza kyseliny olivetové ORF open reading frame otevřený čtecí rámec PCR polymerase chain reaction polymerázová řetězová reakce 6

13 RAPD randomly amplified polymorphic DNA polymorfismus náhodně amplifikované DNA RFLP restriction fragment length polymorphism polymorfismus délek restrikčních fragmentů RT-PCR real time polymerase chain reaction polymerázová řetězová reakce v reálném čase SCAR sequence characterized amplified region sekvenčně specifická amplifikovaná oblast SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis elektroforéza v polyakrylamidovém gelu SNP single nucleotide polymorphism jednonukleotidový polymorfismus SSR simple sequence repeat opakování jednoduchých sekvencí, mikrosatelitů STR short tandem repetitions krátké tandemové repetice; mikrosatelity THC ( ) 9 -trans-tetrahydrokanabinol, podle alternativního číslování ( ) 1 -trans-tetrahydrokanabinol; jeho izomerem bez psychoaktivních vlastností je ( ) 8 -trans-tetrahydrokanabinol THCA tetrahydrocannabinolic acid kyselina tetrahydrokanabinolová THCAS tetrahydrocannabinolic acid synthase syntáza kyseliny tetrahydrokanabinolové 7

14 1. Úvod Cannabis sativa je člověkem využívána od počátků civilizace. V medicíně má historii starou tisíce let a člověku poskytuje široké spektrum svých rozmanitých vlastností. V práci jsou popsány hlavní aktivní látky konopí, což jsou kanabinoidy, základní mechanismus jejich biosyntézy a jejich účinky na lidský organismus se zaměřením na terapeutický potenciál. V České republice je podle 24 zákona č. 167/1998 Sb. (Zákon o návykových látkách a o změně některých dalších zákonů) Cannabis omamnou látkou a je zakázáno pěstovat druhy a odrůdy rostliny konopí (rod Cannabis), které mohou obsahovat více než 0,3 % látek ze skupiny tetrahydrokanabinolů. Podle 30 zákona č.200/1990sb. (Zákon o přestupcích) se ten, kdo v malém množství přechovává pro svoji potřebu omamnou či psychotropní látku, dopouští přestupku. Podle 187a zákona č. 412/2002 Sb. (Trestní zákon) se trestného činu dopouští ten, kdo přechovává pro svoji potřebu omamnou či psychotropní látku v množství větším než malém. Malé množství je definováno jako 0,3 g čisté hmoty THC. Zákon č. 167/1998 Sb. byl několikrát novelizován. Jako poslední byla schválena novela zákona, která legalizuje konopí k léčebným účelům, kterou 15. února 2013 podepsal prezident České republiky. Lékařské využití konopí by tedy od roku 2013 v České republice mělo být legální. Od roku 2011 jsou získávány poznatky o genomu Cannabis, což urychluje další rozvoj jejího výzkumu. Tyto poznatky přináší zásadní posun v možnostech identifikace a klonování klíčových genů biosyntézy kanabinoidů s perspektivním využitím při získání genotypů se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi. V tom může sehrát důležitou úlohu genové inženýrství, které umožní získání takových genotypů. Následné šlechtění léčebných kultivarů by mohlo znamenat efektivnější produkci léčivých látek a snížení rizika zneužití Cannabis jako drogy. Tato práce je zaměřena na současný stav aplikace metod genového inženýrství a základní metodiky hodnocení obsahu biologicky aktivních látek. Vývoj moderních biotechnologií a genomických přístupů, které umožní využívat Cannabis jako zdroj kvalitního, dostupného a bezpečného léčiva, se v současnosti stává velice aktuálním. 8

15 2. Obecná charakteristika Cannabis sativa 2.1 Původ a historie pěstování Cannabis sativa je jednou z prvních domestikovaných rostlin. Předpokládaným centrem jejího původu je oblast centrální a severovýchodní Asie, konkrétně dnešní Čína. Od neolitu je zde nepřetržitě pěstována více než 6000 let. Pro Číňany byla základní surovinou pro výrobu lan, textilu, sítí, papíru, oleje a léků (Li, 1974). Dnes patří mezi jednu z nejrozšířenějších kulturních rostlin na světě. K dosud nejstarším a nejzachovalejším důkazům o používání konopí pro lékařské účely patří nález starý 2800 let z pohřebiště šamana v poušti Gobi ve střední Asii. Rozbor těchto tajně skrytých vzorků potvrdil, že nešlo o rostliny sbírané ve volné přírodě, ale o cíleně pěstované kultivary. Navíc byly nalezeny pouze části samičích rostlin, což znamená, že lidé si již ve starověku všimli výrazně vyšší produkce THC v samičích částech rostliny (Russo et al., 2008). Další záznamy o nejstarším medicínském použití konopí pochází z Číny, Indie, Egypta, Sýrie, Persie a Tibetu (Fisar, 2009). Asyřané, jejichž kultura je stará 3000 let, zanechali farmaceutický odkaz na stovkách hliněných tabulek. Cannabis patřila k jejich hlavním léčivům (Russo, 2007; Mechoulam a Ben-Shabat, 1999). Antičtí Řekové a Římani používali konopí jako předivo a účinný lék a léčebné vlastnosti konopí zmiňují i arabští lékaři, jako např. ibn Sina (Avicenna) roku 1294 (Russo, 2011). V období středověku bylo konopí pěstováno nejen pro účely medicíny, ale i pro vysoké nutriční hodnoty semen. Koncem devatenáctého století se již v Evropě i USA vědělo mnoho o možnostech medicínského využití konopí (Zias et al., 1993). Větší farmaceutické společnosti tehdy prodávaly konopí ke tlumení bolesti, depresí, nechutenství, křečí, kašle, astmatu a jako sedativum. S příchodem moderních analytických metod se věda zaměřila na chemický rozbor aktivních látek konopí. Farmaceutické laboratoře se pokoušely vyvinout kanabinoidy, které by byly léčivé bez psychotropních účinků, ale nepodařilo se jim to dostatečně rychle. Obecně liberální přístup společnosti k používání konopí v medicíně se proto v polovině dvacátého století změnil na přísně konzervativní (Fisar, 2009) a medicínské užití do té doby oblíbeného konopí takřka vymýceno. Dnešní výzkum usiluje o stanovení pravidel a podmínek, za kterých bude možné kanabinoidy předepisovat na řadu zdravotních potíží. 9

16 2.2 Taxonomické zařazení a biologická charakteristika Konopí seté (C. sativa L.) je řazeno do třídy dvouděložné (Dicotyledonae) a čeledi konopovité (Cannabaceae). Kromě konopí zahrnuje tato čeleď ještě další hospodářsky významnou rostlinu chmel otáčivý (Humulus lupulus L.). Carl Linne označil konopí v knize Species plantarum jako monotypickou rostlinu zastoupenou právě jedním druhem C. sativa, který je dnes jediným platným druhem, všechny ostatní názvy jsou jeho pouhá synonyma ( Dnešní klasifikace druh dále dělí na variety sativa a spontanea Vavilov a křížence obou zmíněných, nothovarietu intersita (Soják) ined. C. spontanea (synonymum ruderalis) je plevelné konopí. Všechny kultivary (odrůdy vzniklé šlechtěním) jsou řazeny k var. sativa. Cannabis je často určována podle morfologie, čili fenotypu. Rozlišujeme dva morfotypy, C. sativa a C. indica. Druh indica je nižší se širšími listy, druh sativa je naopak vyšší a jeho listy jsou úzké a prstovité (Fischedick et al., 2010). C. indica kvete a plodí dříve než C. sativa pěstovaná za stejných podmínek. Liší mezi sebou také pachem, což je pravděpodobně dáno odlišným chemickým zastoupením terpenoidů (Hillig, 2004; Hillig a Mahlberg, 2004). Pozoruhodná morfologická rozmanitost konopí je dána tím, že se varianty mezi sebou volně kříží. Klasifikace kultivarů není jednotná (viz kapitola 2.2.1). Označení konopí (angl. hemp) se v USA a Kanadě používá pouze pro technické konopí. V Evropě tímto termínem označujeme veškeré varianty rodu Cannabis. Tato jednoletá cizosprašná rostlina patří mezi dvoudomé (dioecie). To znamená, že tyčinkové (samčí) a pestíkové (samičí) květy se nachází na oddělených rostlinách. Vzácně se objevují i jednodomé kultivary (van Bakel et al., 2011). Renner a Ricklefs (1995) uvádí, že dioecie se u kvetoucích krytosemenných rostlin (Angiospermae) vyvinula u zhruba 6 % druhů rostlin. Po tisíciletí je konopí v oblibě pro své široké spektrum využití. Jedná se o zemědělsky významnou plodinu pěstovanou jako zdroj potravy, celulózy a látek s farmakologickým účinkem, tzv. kanabinoidů (Russo, 2007). Zejména technické konopí s vysokým obsahem celulózy je důležité pro produkci tkanin, paliva, stavebního materiálu a papíru. Konopná semena (kterými jsou nažky) obsahují 30 % tuku, semena odrůdy oleifera obsahují dokonce 40 % (Small et al., 1975). Podle Kuhnt et al. (2012) jsou semena významným zdrojem omega-3-nenasycených mastných kyselin (tzv. PUFA; obsah až %), dále mononenasycených mastných kyselin (tzv. MUFA; obsah 53 %) a linolové kyseliny (omega-3-nenasycená mastná kyselina; obsah 57,1 %). Kromě tuků poskytují 10

17 semena všechny esenciální aminokyseliny a některé stopové prvky jako jod, chrom, stříbro a lithium Hlediska klasifikace Doposud bylo identifikováno 700 kultivarů, které se liší různými vlastnostmi, což je důsledek intenzivního neoficiálního pěstování pro rekreační a léčebné účely. Současná klasifikace pro posouzení variability není dostatečná. Řada studií byla zaměřena na kvantitativní rozbor chemického složení. Pro určení fenotypu byla porovnána koncentrace a poměr hlavních kanabinoidů (THC, CBD a CBN) (Rustichelli et al., 1998; Hazekamp a Fischedick, 2012). Fetterman et al. (1971) definovali dva typy konopí podle poměru (THC+CBN)/CBD v čerstvé rostlině. Rostliny typu drug mají poměr vyšší než 1 a jde o rostliny s vysokým obsahem THC a nízkým obsahem CBD. Rostliny typu fibre mají nízký obsah THC a vysoký obsah CBD. Small et al. (1975) měřili zastoupení nejvýznamnějších sekundárních metabolitů v rostlině a určili tři fenotypové kategorie (Obr. 1). Pro fentoyp I je typický obsah THC > 0,3 % a obsah CBD < 0,5 %, pro fenotyp II je obsah THC > 0,3 % a obsah CBD > 0,5 % a pro fenotyp III je obsah THC > 0,3 %. Small et al. (1975) poté objevili a popsali fenotyp IV, který obsahuje 0,05 % kanabinoidu s podobným retenčním časem jako kanabigerol monomethylether (CBGM). Turner et al. (1978) uvádí, že jedna rostlina může spadat do jakékoli z těchto kategorií v závislosti na věku rostliny. Obr. 1: Graf 3 hlavních fenotypů (Small et al., 1975) 11

18 Pro legislativní a kriminalistické účely je konopí nejčastěji rozdělováno na dvě základní skupiny: technické konopí (typ fibre ) a konopí vhodné pro léčebné a relaxační účely (marihuana, typ drug ). Hlavním kritériem je obsah THC v sušině apikální (květní) části rostlin (Rustichelli, 1998). Legálně pěstované technické konopí v EU zahrnuje kultivary C. sativa s maximální hladinou THC 0,2 % (Pellegrini et al., 2005; Pinarkara et al., 2009). Kultivary schválené pro oficiální medicínské projekty patří téměř bez výjimek ke kategorii konopí pro léčebné a relaxační účely (hladina THC je vyšší než 0,2 %) (Hazekamp a Fischedick, 2012). Avšak i technické konopí obsahuje poměrně vysoké koncentrace biologicky aktivního CBD a může být proto používáno pro léčení. Dědičnost chemického fenotypu zkoumal jako první de Meijer et al. (2003). Pomocí plynové chromatografie provedl rozbor chemického složení a obsahu kanabinoidů v rostlině a během křížení rostlin pozoroval tři chemotypy podle obsahu a zastoupení hlavních kanabinoidů v celkovém množství biomasy (CBD, CBD/THC a THC). Analýzou RAPD bylo zjištěno, že podstata těchto chemotypů je řízena monogenně a je determinována lokusem B s alelami B D a B T vykazujícími kodominanci. Chemotyp CBD je řízen alelami B D /B D a chemotyp THC má genotyp B T /B T. Chemotyp CBD/THC je klasický heterozygot s alelami B D /B T. Po křížení těchto dvou homozygotů vykazuje generace F2 mendelovský poměr 1 : 2 : 1 (CBD:CBD/THC:THC). 2.3 Genetická charakteristika C. sativa má v genomu dvě sady chromozomů (2n = 20), základní číslo x = 10, z toho devět autozomů a jeden pohlavní chromozom. Chromozomální určení pohlaví je typu Drosophila, kdy samičí rostliny mají homogametické pohlaví XX, samčí heterogametické XY. Jak uvádí Ming et al. (2011), determinace pohlaví je řízena poměrem počtu chromozomů X k počtu sad autozomů. Genom C. sativa byl poprvé osekvenován v roce 2011 (van Bakel et al., 2011). Do té doby se informace v databázi NCBI omezovaly na údaje o velikosti transkriptomu. Bylo zde uloženo EST a 23 neposkládaných sekvencí RNA. Ačkoli se jedná o zhruba dvacátý rostlinný genom, který byl osekvenován, jde o historicky první sekvenaci genomu léčebného druhu rostliny. Velikost haploidního genomu samičí rostliny je přibližně 818 Mb, samčí 843 Mb. Rozdíl je dán odlišnou velikostí chromozomu Y, neboť na jeho dlouhém raménku se v průběhu evoluce nakumulovaly stovky sekvencí retrotranspozonů bez dlouhých koncových repeticí (Ming et al., 2011). Fyzická ani genetická mapa genomu dnes zatím nejsou k dispozici. Znalost genomu a transkriptomu je nezbytná k hlubšímu pochopení 12

19 evoluce a funkcí jednotlivých genů. Sekvenování genomu konopí je omezeno přísnými opatřeními a podmínkami jeho pěstování a manipulacemi s touto rostlinou (van Bakel et al., 2011). 2.4 Možnosti biologické léčby Biologická léčba (biological therapy) se zaměřuje na tlumení chorobných procesů u člověka ovlivněním biologických procesů. Zaměřuje se na buňky postižené za současného neovlivňování buněk zdravých, proto je označována jako léčba cílená (targeted therapy). Cannabis je považována za nejvíce kontroverzní rostlinu na světě. Je významná svými farmakologickými vlastnostmi a současně je celosvětově nejčastěji užívanou nelegální drogou (De Backer et al., 2009). Výzkum jejích chemických a farmakologických vlastností ukázal, že skupina sekundárních metabolitů kanabinoidů má také léčebné účinky (Fischedick et al., 2010) a s rozvojem moderních molekulárně-biologických metod vzrůstá i potenciál jejího využití jako fytofarmaka v biologické léčbě. V Kanadě (od roku 2001) a Nizozemí (od roku 2003) fungují státem řízené programy zajišťující přístup k léčebným odrůdám Cannabis o vysoké kvalitě. V jiných státech jako např. Česká republika a Izrael jsou takovéto oficiální programy teprve zakládány. Projekty zajišťující dovážení konopí z Nizozemí fungují např. v Itálii, Finsku a Německu (Hazekamp et al., 2012). 13

20 3. Sekundární metabolity a endokanabinoidní systém Cannabis produkuje široké spektrum látek. Bylo identifikováno víc jak 489 sloučenin z různých chemických skupin (Fisar, 2009). Některé patří mezi primární metabolity, jako např. aminokyseliny, mastné kyseliny, sacharidy a nukleové kyseliny. Mezi sekundární metabolity Cannabis se řadí flavonoidy, stilbenoidy, terpenoidy, steroidy, lignany, alkaloidy a kanabinoidy. Sekundární metabolity se od primárních liší tím, že je rostlina může postrádat, tedy nejsou esenciální. Jejich koncentrace závisí na části rostliny (typu pletiva), kultivaru (biotypu), vývojové fázi (věku), podmínkách kultivace (výživě, vlhkosti, teplotě a osvětlení), době sklizně a způsobu skladování (Ross a ElSohly, 1996; Keller et al., 2001; Toonen et al., 2006; Potter a Duncombe, 2012). Obsah aktivních látek v rostlině závisí na příliš mnoha faktorech (Hazekamp a Fischedick, 2012) a zařadit rostlinu podle tohoto kritéria do jasně definované kategorie je proto velmi obtížné a sporné. 3.1 Kanabinoidy Historie identifikace Způsob extrakce farmakologicky aktivních látek konopí byl patentován v roce 1914 a následoval vývoj nových metod jejich izolace. V první polovině dvacátého století byly úspěšně izolovány látky kanabinol a kanabidiol a byla určena jejich struktura (Tab. 1). Pokusy s jejich deriváty potvrdily, že hlavní psychotropní látkou jsou tetrahydrokanabinoidy. Výzkum metabolitů C. sativa zaostával za výzkumem máku setého (Papaver somniferorum L.). Morfin byl z opia máku izolován začátkem devatenáctého století a přesnou chemickou strukturu THC popsali Gaoni a Mechoulam až v roce 1964 (Gaoni a Mechoulam, 1964). Také první receptory opiátů byly popsány již v sedmdesátých letech dvacátého století, zatímco existence kanabinoidních receptorů v CNS byla potvrzena v roce 1988 (Devane et al., 1988). Jak dále uvádí Mechoulam a Ben-Shabat (1999), první endogenní opiáty byly izolovány v sedmdesátých letech dvacátého století, zatímco první úspěšná izolace endokanabinoidů proběhla v devadesátých letech. Byla prokázána řada pozitivních účinků kanabinoidů v humánní terapii, avšak jejich léčebný potenciál je zkoumán teprve od začátku devadesátých let. 14

21 Tab. 1: Historický přehled výzkumu kanabinoidů (Fisar, 2008) Charakteristika Cannabis produkuje více než 70 terpeno-fenolických sloučenin (Mechoulam a Ben- Shabat, 1999), které tvoří dvacet dva uhlíků. Jejich neutrální forma má uhlíků dvacet jedna. Tyto látky, jejich deriváty a metabolické produkty jsou označovány jako fytokanabinoidy. Pojem kanabinoid obecně znamená jakoukoli látku, která se váže na kanabinoidní receptory, které jsou součástí endokanabinoidního systému (Howlett et al., 2002). Jsou rozlišovány tři základní skupiny kanabinoidů: syntetické, rostlinného původu (fytokanabinoidy) a produkované lidským organismem (endokanabinoidy) (Fisar, 2009). Hlavní psychoaktivní látkou je THC, konkrétně jeho forma ( ) trans- 9 -tetrahydrokanabinol (Mechoulam, 1970). Vzniká dekarboxylací kyseliny tetrahydrokanabinolové a je nestálý na světle. Při přímém osvětlení je THC oxidován na kanabinol (CBN) (Razdan et al., 1972). Kromě 9 -THC se v konopí vyskytují i jiné kanabinoidy. Patří mezi ně 8 -tetrahydrokanabinol ( 8 -THC), kanabidiol (CBD), kanabichromen (CBC), tetrahydrokanabivarin (THCV), kanabigerol (CBG), kanabinol (CBN) etc. (Hanus, 2009; van Bakel et al., 2011) (Obr. 2). Tyto metabolity vykazují slabé nebo žádné psychotropní účinky. 15

22 Obr. 2: Schéma syntézy hlavních kanabinoidů (upraveno podle Hill et al., 2012) Biosyntéza Fytokanabinoidy jsou v tucích rozpustné látky tvořící součást pryskyřice sekretované v nejvyšších koncentracích žlaznatými trichomy na samičích rostlinách (Turner et al., 1978). Skupina těchto látek nenese svůj název proto, že by měla místo účinku či reakční mechanismus stejné jako endokanabinoidy a syntetické kanabinoidy, nýbrž podle podobné chemické struktury. 16

23 Obr. 3: Základní schéma biosyntézy THC (Sirikantaramas et al., 2004) Prekurzorem hlavních fytokanabinoidů 9 -THC a CBD je kyselina kanabigerolová (CBGA) (Obr. 3). Vzniká kondenzací kyseliny olivetové (OLA) a geranylpyrofosfátu. Enzym katalyzující syntézu OLA je označován jako olivetol syntáza (OLS) (Taura et al., 2009). CBGA je substrátem syntázy kyseliny tetrahydrokanabinolové (THCAS) a syntázy kyseliny kanabidiolové (CBDAS) (Fellermeier a Zenk, 1998). Z CBGA vzniká THCA za přítomnosti THCAS oxidativní cyklizací. Koncentrace THCAS vypovídá o intenzitě psychotropních účinků rostliny a je proto klíčovým enzymem pro kontrolu psychoaktivity. Gen THCAS je významně exprimován v typu drug (van Bakel et al., 2011), zatímco gen CBDAS je exprimován převážně v typu fibre. Kanabinoidy jsou syntetizovány v nestabilní formě karboxylových kyselin, které se v rostlině nachází v daleko vyšších koncentracích oproti neutrálním kanabinoidům. Kyselina tetrahydrokanabinolová (THCA) dekarboxyluje na neutrální THC a analogicky z kyseliny kanabidiolové (CBDA) vzniká CBD (Mechoulam a Ben-Shabat, 1999). K této dekarboxylaci dochází neenzymatickými úpravami (zejména zahříváním) po sklizni, v živé rostlině proto kanabinoidy převažují ve formě kyselin. Míra exprese THCA je různá v jednotlivých části rostliny. Obsah THCA byl naměřen ve stoncích, pylu, semenech a v kořeni (Tanaka a Shoyama, 1999), avšak semena obsahují 17

24 téměř nulové množství THC (Fisar, 2009). Místem nejintenzivnější exprese a zároveň rezervoárem THCA jsou žláznaté trichomy neopylených květů. Významným přínosem pro identifikaci a charakteristiku genů je sekvenace genomu a transkriptomu. Transkriptom Cannabis byl poprvé osekvenován roku 2011 (van Bakel et al., 2011). Geny kódující biosyntézu kanabinoidů ani její mechanismus nejsou dostatečně prozkoumány. Identifikace genů pro klíčové enzymy jako THCAS a CBDAS metodami molekulární biologie jako je jejich klonování a cílené umlčování umožní selektivní přípravu léčebných kultivarů. 3.2 Endokanabinoidní systém Endogenní kanabinoidní systém v lidském těle se skládá z kanabinoidních receptorů, jejich endogenních ligandů endokanabinoidů a proteinů zodpovědných za jejich syntézu a následnou degradaci. Kanabinoidní receptory CB1 byly naklonovány v roce 1990 (Matsuda et al., 1990) a CB2 byly naklonovány v roce 1993 (Munro et al., 1993). Kanabinoidní receptory CB1 a CB2 patří do skupiny receptorů spojených s G-proteinem (Devane et al., 1988) se sekundární strukturou sedmi transmembránových alfa-helixů. Navázání ligandu (agonisty) způsobí konformační změnu cytosolové domény a vyvolá následnou reakci. Většina účinků kanabinoidů je zprostředkována kanabinoidními receptory v CNS (Howlett et al., 2004), jsou ovšem známy i účinky na receptorech částečně či zcela nezávislé. Některé kanabinoidní účinky jsou zprostředkovány jejich metabolity nebo prostřednictvím jiných na receptorech nezávislých mechanismů (Pertwee, 2000). Příklad uvádí Sanchez et al. (1998), kteří popsali, že THC může vyvolávat apoptózu buněk gliomu prostřednictvím mechanismů nezávislých na receptorech. Receptory CB1 se nachází zejména v mozku a mohou se vyskytovat i v páteřní míše a v periferních nervech (Pertwee, 1997). V nejvyšších koncentracích se receptory CB1 nachází na bazálních gangliích, v určitých oblastech mozkové kůry a v hipokampu. Leží zejména v oblasti synapsí a když jsou aktivovány, je jejich hlavní funkcí inhibovat vylévání neurotransmiterů (Pertwee, 1999). Protože kanabinoidní receptory se nachází v oblastech mozku, které kontrolují pohyb a emoce, ovlivňují kanabinoidy kontrolu nad těmito funkcemi. Fisar (2006) uvádí, že hlavní účinky kanabinoidů na nervový systém zprostředkovává receptor CB1, jelikož je nejvíce rozšířeným receptorem ve vazbě s G-proteinem v CNS. Fyziologická role receptorů CB2 není přesně objasněna. Nachází se primárně na povrchu buněk imunitního systému, zejména na povrchu B-lymfocytů, později také na NK buňkách a makrofázích (Howlett et al., 2002). V buňkách zdravého mozku nebyly receptory 18

25 CB2 nalezeny, byly popsány pouze v zanícené mozkové tkáni, kde je jejich exprese stimulována cytokiny. To ukazuje na roli CB2 receptorů v protizánětlivé odpovědi (Munro et al., 1993). Je pravděpodobné, že se uplatňují v imunitní odpovědi zdravých i oslabených jedinců. Ligandy receptorů CB2 by proto mohly být využívány např. nejen při léčbě projevů roztroušené sklerózy, ale i při léčbě jejích příčin (Pertwee, 1999). Ligandy CB2 stimulují uvolňování cytokinů (Newton et al., 2009) a migraci imunitních buněk (Pertwee, 2006). Terapeutický význam receptorů CB2 v souvislosti s imunitou je třeba dále testovat. Přirození agonisté těchto receptorů, které si živočišná tkáň sama syntetizuje, se nazývají endokanabinoidy. Jedná se o amidy kyseliny arachidonové, která je jednou z nejdůležitějších nenasycených mastných kyselin v mozku. Jejich funkcí je inhibovat vylévání neurotransmiterů z presynaptických zakončení. Nejznámějšími endokanabinoidy jsou 2-arachidonoylglycerol (2-AG), arachidonoylglycerylether (noladin ether) a anandamid (N-arachidonoyletanolamid, ANA) (Hanus, 2009; Pertwee et al., 2010). Název anandamid pochází ze sanskrtského výrazu blaženost, ananda. Anandamid se váže na stejné vazebné místo na receptoru CB1 (kompetitivní vazba) jako THC (Adams et al., 1998) a vykazuje i řadu podobných účinků nejen na psychiku (Solinas et al., 2007). Endokanabinoidy fungují jako neuromodulátory či neurotransmitery, neboť jsou syntetizovány v neuronech, z nichž se po depolarizaci membrány vylijí a z mimobuněčného prostoru jsou rychle odváděny a vstřebávány (Howlett et al., 2002). Právě tento mechanismus zpětného vstřebání (uptake) vylitých endokanabinoidů do buňky není objasněn. Anandamid i 2-AG jsou dále uvnitř buňky hydrolyticky rozkládány mikrosomálním enzymem hydrolázou amidu mastných kyselin (FAAH, fatty acid amin hydrolase) na kyselinu arachidonovou a etanolamin. Hydroláza amidu mastných kyselin byla prvním klonovaným enzymem odbourávání endokanabinoidů (Cravatt et al., 1996). Látky, které do endokanabinoidního systému zasahují nepřímo, by mohly sloužit k terapeutickým účelům, a to buď pomocí selektivní inhibice zpětného vstřebávání endokanabinoidů do buněk, nebo prostřednictvím ovlivnění metabolismu tak, aby došlo ke zvýšení koncentrací endokanabinoidů v okolí receptorů CB. Pertwee (1999) uvádí, že by šlo o velice selektivní typ farmak, neboť by zasahovaly pouze do míst, kde jsou endokanabinoidy aktuálně produkovány. 3.3 Terapeutické účinky kanabinoidů Po objevu endokanabinoidního systému bylo zjištěno, že jeho fyziologická funkce je velice rozsáhlá. Ovlivňuje chuť k jídlu, paměť, motoriku, imunitní systém, kardiovaskulární systém, rozmnožování, dýchání, kosterní systém a CNS celkově. Howlett et al. (2002) uvádí, 19

26 že většina účinků kanabinoidů je spojena s receptory CB1 a CB2 a některé působí i nezávisle na nich. Po objevu kanabinoidních receptorů a jejich funkcí byl zahájen výzkum jejich ligandů (agonistů i antagonistů), které by mohly mít terapeutické využití Mechanismus Podle Fisar (2009) se kanabinoidy jako částeční agonisté receptorů CB1 a CB2 pro svoji lipofilní povahu akumulují v lipidické vrstvě buněčných membrán a obsazují vazebná místa kanabinoidních receptorů (lokalizovaná na hydrofobních částech transmembránových proteinů). Ovlivněna může být i funkce membránových mastných kyselin. Farmakologické účinky fytokanabinoidů lze vysvětlit jejich interakcemi s kanabinoidními receptory na presynaptických zakončeních. Agonisté receptorů CB1 silně inhibují stimulační i inhibiční neurotransmitery v mozku i periferní nervové soustavě. Byla popsána inhibice vylévání acetylcholinu, dopaminu, GABA, histaminu, serotoninu, glutamátu, noradrenalinu, prostaglandinů a opioidních peptidů (Howlett et al., 2002). Inhibice uvolňování neurotransmiterů neznamená obecně snížení neuronální aktivity, protože některé neurotransmitery aktivují i receptory inhibující přenos signálu (Fisar, 2006). Mechanismus účinku na receptorech CB2 je třeba zkoumat hlouběji (viz kapitola 3.2.1) Účinky a oblasti využití Hlavními dvěma kanabinoidy, které jsou v některých státech schváleny pro terapeutické použití, jsou psychotropní THC a nepsychoaktivní CBD (Obr. 4, obr. 5). THC je farmakologicky a toxikologicky nejvýznamnější sloučenina, která se v Cannabis nachází. Má široké spektrum léčebných účinků, z nichž hlavní je tlumení nevolnosti a zvracení u onkologických pacientů (Sallan et al., 1975). Díky zvýšenému zájmu o THC byly do prodeje uvedeny jeho syntetické analogy, Marinol (legalizován v USA) a Cesamet (legalizován v UK). Marinol je syntetická forma sloučeniny dronabinol (mezinárodní nechráněný název pro 9 -THC) a prodává se rozpuštěný v sezamovém oleji v želatinových kapslích. Účinnou látkou Cesametu je nabilon (syntetický analog 9 -THC). Obě tyto syntetické formy THC pomáhají tlumit zvracení (často po chemoterapii), dronabinol navíc podporuje chuť k jídlu (např. při podvýživě, kachexii a nechutenství pacientů s AIDS) (Beal et al., 1995; Meiri et al., 2007; Hanus, 2009). Dále také mírní bolesti, snižují spasticitu, ataxii, katalepsii, svalovou slabost spojenou s roztroušenou sklerózou a působí příznivě na bronchodilataci u astmatiků (Varvel et al., 2005; Pertwee, 1997). Výzkum syntetických kanabinoidů usiluje o větší cílenost a účinnost bez vedlejších účinků a bude se nadále rozvíjet. 20

27 Endokanabinidní systém je totiž funkčně provázán s dopaminergním (French et al., 1997) a opiodním systémem (Navarro et al., 2001) při tišení bolesti, fyzické závislosti a vzniku tolerance při tzv. efektu odměny. 9 -THC zmírňuje abstinenční příznaky (Vela et al., 1995). Bylo zjištěno, že závislost na opiátech je spojena s kanálky receptoru CB1. 9 -THC a další agonisté receptoru CB1 (anandamid, 8 -THC) jsou tak potenciálním lékem vážných závislostí (Yamaguchi et al., 2001). Je tedy možné, že kanabinoidy budou využívány v léčení abstinenčních příznaků. 9 -THC snižuje nitrooční tlak (Jarvinen et al., 2002). Z tohoto důvodu je využíván pro léčbu zeleného zákalu (glaukomu). CBD působí proti psychózám a úzkostem vyvolaným užitím THC (Carlini et al., 1970). Byla popsána jeho funkce neuroprotektivního antioxidantu (Hampson et al., 1998) s účinky silnějšími než kyselina askorbová a tokoferol (Russo a Guy, 2006). CBD má protizánětlivý a imunosupresivní vliv a mírní artritidu (Malfait et al., 2000). Příznivě působí i při léčbě Alzheimerovy (Iuvone et al., 2004) a pravděpodobně i Parkinsonovy choroby (Venderova et al., 2004). CBD vykazuje cytostatické a cytotoxické účinky (Russo a Guy, 2006). Vaccani et al. (2005) popsali inhibici buněčné migrace lidských gliomových buněk působením CBD. Obr. 4: Vzorec THC Obr. 5: Vzorec CBD (Small et al., 1975) (Small et al., 1975) Kanabinoidy se dnes užívají jako galénika (léčiva připravená přímo z rostliny). Ačkoli vazba CBD k receptorům je slabá, vykazuje výrazný antagonistický účinek a pro léčbu je proto ideální v kombinaci s agonistou (jako THC) (Thomas et al., 2007). Přípravek Sativex (označovaný jako Nabiximols) je směs THC a CBD v poměru 1 : 1 s minimálním obsahem jiných kanabinoidů, připravený z plně standardizovaného chemotypu C. sativa. Kombinace THC a CBD zvyšuje účinnost a snižuje vedlejší účinky (Russo a Guy, 2006; Hazekamp et al., 2012). V některých zemích (např. Kanada) je předepisován zejména pro léčbu zvýšeného 21

28 svalového napětí (spasticity), chronických bolestí a dysfunkcí močového měchýře u roztroušené sklerózy (Novotna et al., 2011). Je téměř jisté, že i další kanabinoidy mají léčivé účinky. Je ovšem nejprve nezbytné jejich účinky ověřit preklinickými studiemi. Perspektivním kanabinoidem se pro své léčivé vlastnosti zdá THCV, který nebyl doposud uspokojivě prozkoumán. THCV je homolog THC a na rozdíl od něj má jeden propylový boční řetězec. THCV byl charakterizován jako kompetitivní antagonista receptoru CB1 a receptoru CB2 (Thomas et al., 2005). V budoucnosti by mohl být používán pro léčbu některých hyperexcitabilních poruch, jako např. dosud neléčitelné spinocerebelární ataxie (Paulson, 2009), nebo pro zmírňování projevů epilepsie (Hill et al., 2010). Bylo prokázáno, že THCV je velmi slibným léčivem pro zpomalení nástupu Parkinsonovy nemoci a pro zmírňování jejích motorických symptomů (Garcia et al., 2011). THCV podávaný samostatně či v kombinaci s CBD by proto mohl poskytnout zkvalitnění léčby Parkinsonovy choroby. Kanabinoidní kyseliny mají antibiotické účinky a před padesáti lety byly používány ve veterinárním lékařství v tehdejším Československu (Mechoulam, 2005) a podle Small et al. (1975) byly antibiotické účinky zaznamenány i při použití konopných semen. Bylo zjištěno, že extrakty mají větší účinnost než syntetické či izolované formy kanabinoidů. Na účincích kanabinoidů se totiž podílí i jiné sekundární metabolity rostliny, jako např. těkavé terpenoidy (Russo, 2011). Terpenoidy sdílí s kanabinoidy prekurzor geranylpyrofosfát a jsou také syntetizovány v žlaznatých trichomech. Russo a Guy (2006) popsali tzv. doprovodný účinek, kterým terpenoidy zesilují vlastnosti kanabinoidů. Podporují terapeutické účinky a zmírňují některé vedlejší účinky. Grinspoon a Bakalar (1995) uvádí, že pacienti a terapeuti, kteří mohou ze zkušenosti srovnávat syntetické analogy a rostlinný extrakt, shodně upřednostňují extrakt. Jeho dávkování je snadnější, lépe kontrolovatelné a účinky trvají déle, než u syntetického THC. Podle Grinspoon a Bakalar (1995) je nezpochybnitelnou výhodou konopí jako léku jeho bezpečnost. Hlavní fyziologické funkce jsou jím ovlivňovány pouze minimálně a nebyl zaznamenán žádný případ smrtelného předávkování. Cannabis je rovněž méně návyková než mnoho konvenčních léčiv typu svalových relaxantů, laxativ, hypnotik a sedativ. Nebezpečí spojená s užíváním Cannabis plynou z jejího statutu nelegální drogy. Lidé jsou nuceni shánět léčivo pochybné kvality na černém trhu, čímž se zároveň ocitají mimo zákon. Legalizace zpřístupní pacientům bezpečné kultivary s požadovaným účinkem a snadnější kontrolu přítomnosti plísní zejména rodu Aspergillus a dalších patogenů. 22

29 4. Cannabis v éře genového inženýrství Ve většině zemí jsou stanovena přísná právní omezení týkající se pěstování Cannabis, a to i pro následné experimentální účely. Sekvenování genomů a transkriptomů u organismů, na nichž není dovoleno provádět pokusy, se stává běžnou praxí. Možnou cestou jsou in silico analýzy spojené s modelováním regulačních mechanismů, které objasňují funkci genů a evoluci genomů. Základní srovnávací analýza genomů C. sativa a Arabidopsis thaliana, kterou uvedl van Bakel et al. (2011), svědčí o vysoké míře homologie, na jejímž základě je možné určit funkci řady transkripčních faktorů. Genové inženýrství a biotechnologie umožňují vytvářet kulturní rostliny se zlepšenými cílovými znaky. Je možné vnášet geny z jiných odrůd téhož druhu nebo nové geny z příbuzných druhů. 4.1 Genetická transformace Cannabis Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) až 80 % světové populace využívá při léčbě léčivé rostliny. Až 25 % předepsaných léků obsahuje jako léčivou látku přírodní rostlinné extrakty (Tripathi a Tripathi, 2003). Nejcennějšími produkty rostlin jsou jejich sekundární metabolity. Genetická transformace umožňuje biologům cíleně zvyšovat produkci určitých sekundárních metabolitů u některých rostlinných druhů, a to zejména prostřednictvím bakterie Agrobacterium tumefaciens. Prostřednictvím biotechnologických přístupů je tak umožněn vývoj nových kultivarů s požadovanými vlastnostmi. Pro vegetativní množení konopí slouží explantátové kultury, které dále umožňují transformaci buněk prostřednictvím agrobakteria a usnadňují klonování genotypů s požadovanými vlastnostmi. Stejně tak byla kromě C. sativa prostřednictvím agrobakteria transformována např. Atropa belladonna (Yun et al., 1992). Snahy šlechtitelů o vylepšování vlastností konopí, jako je jeho rezistence k patogenům, jsou poněkud komplikovány jeho dvoudomostí (Clarke, 1999) Explantátové kultury Explantátové kultury v rostlinných biotechnologiích slouží pro množení rostlin s požadovaným genotypem v podmínkách in vitro (tzv. mikropropagace), pro konzervaci genetického materiálu a genetické transformace. 23

30 Technika explantátových kultur je založena na vlastnosti totipotence somatických rostlinných buněk. Totipotence umožňuje regeneraci rostlin z jakýchkoli somatických buněk, tedy i z buněk modifikovaných. V rostlinných biotechnologiích se hojně využívá nediferencované pletivo, tzv. kalus, jehož homogenizací vzniká suspenzní buněčná kultura. Regenerace rostliny je možná cestou somatické embryogeneze, během níž je z jedné somatické buňky obnovena celá rostlina. Druhou možností je organogeneze, tedy indukce a diferenciace prýtových primordií (výhonů). Transformace somatických embryí umožňuje snadnou regeneraci rostlin, ale u C. sativa nebyla tato metoda úspěšná. Kultury kalusů a suspenzní kultury Cannabis mají tendenci formovat pouze kořeny. Vůči faktorům indukujícím regeneraci prýtů vykazují téměř naprostou necitlivost. Ranalli et al. (1999) jsou jediní, kteří dosáhli částečného úspěchu při regeneraci prýtů z kalusů. Z okrajů primárních explantátů rostliny (rostlinných segmentů) odvodili kalus, z něhož pomocí vhodných faktorů navodili tvorbu primordií prýtů. Takto získané prýty byly namnoženy, odděleny od sebe a přeneseny na nové zakořeňovací médium, na kterém celá rostlina regenerovala. Jako primárních explantátů využili dělohy, hypokotyl, listy, kořeny i embrya. Regenerace celé rostliny byla úspěšná pouze u děloh a hypokotylů, a to s nízkou četností. Tento postup regenerace je vhodný pro genetickou transformaci při vnášení cizích genů kódujících žádané znaky. Dalším typem kultur in vitro u konopí jsou dlouhodobé buněčné suspenzní kultury. Ve srovnání s výchozím materiálem mohou vykazovat značnou fenotypovou proměnlivost, která vzniká v průběhu vývojového cyklu explantátové kultury bez zásahu známých fyzikálních nebo chemických mutagenních faktorů, tzv. somaklonální variabilitu. Explantátová kultura se tak stává zdrojem nového typu genetické proměnlivosti, který je možné využít v biologii a následně pro šlechtění rostlin. Testováním lze identifikovat genotyp významný např. zvýšenou produkcí požadovaného metabolitu. Dlouhodobé buněčné kultury jsou využívány pro transformace a jako potencionální bioreaktory. Bioreaktory jsou buněčné kultury in vitro, které konstitutivně produkují sekundární metabolity (např. kanabinoidy) ve vysokých koncentracích (Ranalli et al., 1999). Bioreaktory z buněk C. sativa nebyly popsány. Většina studií o tkáňových kulturách C. sativa je zaměřena na produkci sekundárních metabolitů kanabinoidů (Turner et al., 1980). U Cannabis se daří zakládat stabilní buněčné kultury i kultury kalusů (Heitrich a Binder, 1982; Hartsel et al., 1983). 24

31 Pro konzervování genetického variability konopí byla použita kryoprezervace jeho suspenzních kultur (Jekkel et al., 1989). Alternativou kryoprezervace je konzervování klonů farmakologicky významných fenotypů in vitro (Lata et al., 2010). Podle Ranalli et al. (1999) je dále možné množení rostliny v kombinaci s vynuceným samosprášením (tzv. selfováním). Cílem je získání inbredních linií s vysokým stupněm homozygotnosti, která zaručuje genetickou stálost znaku. Postupuje se opakovaným samosprašováním po několik generací, až je určitý cílový znak stabilizován ve své homozygotní konstituci. Vynucené samosprášení se využívá v případě, že konkrétní genotyp je pro šlechtitele významný, například při fixování chemotypu Metody genetické transformace Metody genetických modifikací se dělí na přímé a nepřímé. Pro nepřímé transformace je využíváno bakterií rodu Agrobacterium. Jsou transformována semena, listové disky, kořeny, embrya a buňky. Mezi přímé postupy patří bombardování mikroprojektily (biolistika), elektroporace, transformace pomocí polyethylenglykolu a další. Metody přímé transformace nejsou u Cannabis běžně používány. Půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens je rostlinný patogen zodpovědný za přirozené transformace rostlinných buněk. K infekci dochází kontaktem bakterie s poraněnými rostlinnými pletivy. Bakterie nese Ti-plazmid (tumor inducing), který je schopný začlenit do genomu hostitelské buňky oblast T-DNA a předat jí tak část genetické informace. Tímto způsobem je rostlina přirozeně transformována. T-DNA je ohraničena specifickými sekvencemi o délce 25 bp, které jsou nezbytné pro začlenění do rostlinné jaderné DNA (Gelvin, 2003). Do genomu infikované rostliny může být přenesena jakákoli sekvence DNA mezi těmito hraničními úseky. Cílový gen je do T-DNA vložen pomocí restrikčních enzymů a ligace a poté je celý konstrukt vložen zpět do bakterie. Předtím je nutné připojit k cílovému genu (transgenu) vhodné regulační sekvence jako je promotor a terminátor a součástí konstruktu je také markerový gen. Promotor je regulační úsek před kódující sekvencí zodpovědný za interakci mezi svými specifickými boxy a transkripčními faktory. Pro transformace rostlin je používán promotor viru květákové mozaiky (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV35S) který vede ke konstitutivní expresi cílového genu, s nímž je spojen. Začleněním promotoru ve formě tetrameru se dosahuje jeho silné exprese. Terminační gen určuje zakončení sekvence transgenu na 3 konci. Markerový gen (selekční marker) je ke konstruktu přidáván pro snazší rozpoznání úspěšné transformace buněk a jejich snadné selekce. Jako selekční marker se nejčastěji užívá gen pro rezistenci k antibiotikům. 25

32 Metody in vitro napodobují podmínky přirozeného procesu infekce bakterií. Jako hostitel může být zvolena široká škála rostlinných druhů, jedinou podmínkou je schopnost regenerace z buněk explantátu po infekci a transformaci. Pro transformace konopí pomocí agrobakteria se používají převážně suspenzní buněčné kultury. Tyto kultury in vitro jsou náročné na udržování, neboť vyžadují optimální regenerační a transformační podmínky. Proto vznikly nové metody in planta nevyžadující umělé udržování kultury in vitro (Chang et al., 1994). Feldmann a Marks (1987) vyvinuli metodu kokultivace klíčících semen rostliny (A. thaliana) s roztokem agrobakteria. Bylo zjištěno, že efektivnější je pracovat s celou rostlinou namísto semen. Byla vyvinuta metoda odstranění květenství a inokulace bakteriálního roztoku do vzniklých jizev (Katavic et al., 1994; Bent, 2000). Velice oblíbenou technikou in planta se stala vakuová infiltrace (Bechtold et al., 1993), která byla ještě vylepšena méně náročným namáčením květenství do roztoku agrobakteria obsahujícího smáčedlo (Clough a Bent, 1998). Metoda in planta byla u Cannabis použita například při klonování THCAS (viz kapitola 4.1.3). Transformace tkáňových kultur probíhá v pořadí: 1) volba explantátové kultury, 2) kokultivace s roztokem agrobakteria a jeho eliminace vhodným antibiotikem, 3) selekce transformovaných buněk a následná regenerace celé rostliny. MacKinnon (2000) úspěšně transformoval prýt C. sativa prostřednictvím A. tumefaciens nesoucím transgen pro rezistenci k infekci houbovým patogenem Botrytis cinerea Klonování genů pro klíčové enzymy Klonování DNA (genové, molekulární klonování) je definováno jako vložení segmentu DNA do klonovacího vektoru za vzniku rekombinantní molekuly DNA a její přenos do hostitelského organismu. Nově vzniklí geneticky identičtí jedinci obsahují molekuly rekombinantní DNA. Tyto modifikované organismy je možné dále množit, pěstovat a využívat jejich produkty. Cílem je zvyšování počtu identických molekul rekombinantní DNA. Klonuje se postupy in vivo a in vitro. Při metodě in vivo je nejprve gen zabudován do samostatně se replikujícího chromozomu a poté je vložen do hostitelské buňky, kde se rekombinantní molekula množí. Klonování in vitro je možné, pokud jsou známy sekvence na obou koncích DNA. To umožní navržení primerů, které komplementárně nasedají, a následnou amplifikaci pomocí PCR. Výsledný produkt je ověřován in vivo. Primárním cílem genového inženýrství u C. sativa je studium klíčových enzymů syntézy kanabinoidů a jejich následná homologní či heterologní exprese, konkrétně jejich nadprodukce prostřednictvím zvýšené exprese genu. Pomocí homologní exprese jsou produkovány látky, které jsou v rostlině přirozeně obsaženy. Naproti tomu heterologní 26

33 exprese spočívá ve vložení genů kódujících proteiny cizí hostitelskému organismu. Heterologní exprese THCAS byla doposud provedena v buňkách tabáku, hmyzu (Sirikantaramas et al., 2004) a v kvasinkách (Taura et al., 2007). V případě C. sativa je zajímavá možnost vložení genu kódujícího THCAS do jiného vytrvalého druhu, aby nemusela být jednoletá bylina C. sativa každoročně vysévána. Dosud byly naklonovány geny THCAS, CBDAS a OLS, které kódují syntázy hlavních kanabinoidů. První zprávu o molekulární charakterizaci enzymu specifického pro biosyntézu kanabinoidů publikovali Sirikantaramas et al. (2004). Z rychle rostoucích listů typu drug C. sativa byla extrahována THCAS a byla analyzována její aminokyselinová sekvence. Dále byla klonována cdna genu THCA syntázy. Pro klonování a expresi genu THCAS byla zvolena rostlinná heterologní exprese v suspenzní kultuře kořenů Nicotiana tabacum, ze které byla izolována mrna a z ní následně reverzní transkripcí připravena cdna. Fragmenty cdna vzniklé pomocí odstupňované PCR byly následně klonovány do vektoru puc119, kterým byly transformovány chemokompetentní kolonie Escherichia coli Top10F. Produkty byly sekvenovány a srovnány mezi sebou pro potvrzení identity sekvence cdna se sekvencí aminokyselin v THCAS. Cílová sekvence byla vystřižena a znovu naklonována do nového vektoru pbi121 pod řízením promotoru CaMV35S. Plazmidový konstrukt byl zaveden do A. rhizogenes a bakteriální roztok byl in planta injikován do tabákových buněk. Transformanti vyrostli ve formě tabákových kořenů díky současnému začlenění bakteriálních genů zodpovědných za tvorbu kořenů. Tento pokus prokázal, že tabák může produkovat aktivní THCA syntázu. Pokud byl enzymu poskytnut substrát (CBGA), produkovaly kořeny THCA a tím bylo potvrzeno, že exprimovaný gen kóduje funkční enzym. Úspěšnost transformace může znamenat potenciální způsob syntézy THC a možnost řízené produkce THC rostlinou. Při nadprodukci genu by mohly vzniknout rostliny bohaté na THCA. Klonování enzymu THCAS je klíčovým krokem pro kontrolu a produkci rostlinných kanabinoidů pro medicínské účely. Otevřený čtecí rámec genu THCAS o délce 1635 nt kóduje peptid tvořený 545 aminokyselinami, z nichž prvních 28 tvoří signální sekvenci. Předpokládaná hmotnost polypeptidu složeného z 517 aminokyselin je 58,6 kda. Kromě charakteristiky nativní formy enzymu THCAS bylo také třeba určit, jaký kofaktor či koenzym je reakcí vyžadován. Srovnávací analýzy bioinformatickými nástroji ukázaly, že tato aminokyselinová sekvence má 40,2% homologii a je tedy blízce evolučně příbuzná s enzymem berberinových můstků (BBE) rostliny sluncovka kalifornská (Eschscholtzia californica) z čeledi Papaveraceae. Enzym BBE je součástí biosyntézy alkaloidů. Ačkoli se tedy jedná o enzymy odlišných 27