Magisterská diplomová práce

Transkript

1 Jihočeská universita v Českých Budějovicích Biologická fakulta Magisterská diplomová práce Nukleotidová variabilita genů Idgf5 a Chit-like u Drosophila melanogaster Vypracovala: Milena Nováková Vedoucí práce: PaeDr. Martina Žurovcová PhD. České Budějovice 2006

2 Nováková M., 2006: Nukleotidová variabilita genů Idgf5 a Chit-like u Drosophila melanogaster. [Nucleotide variation in Idgf5 and Chit-like genes of Drosophila melanogaster. Mgr. Thesis, in Czech]-42p., Faculty of Biological Sciences, The University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic. Anotace: Demography and selection have been recognized for their important roles in shaping patterns of nucleotide variability in all living organisms. To investigate the relative effects of these forces in Idfg5 and Chit-like genes of Drosophila melanogaster, we prepared 40 isogenic lines of Drosophila melanogaster from putatively ancestral African (20 lines) and derived European populations (20 lines), from which the genes of interest were sequenced and subsequently analysed statistically. In spite of that the neutrality tests failed to reject a neutral model of evolution, several other characteristics of those loci revealed that their evolution was more complex. Tato práce je součástí grantového projektu GA ČR číslo 204/03/1383. Prohlašuji, že jsem tuto magisterskou diplomovou práci vypracovala samostatně, pouze s použitím uvedené literatury. V Českých Budějovicích

3 Na tomto místě bych především ráda poděkovala své školitelce Martině Žurovcové za poskytnutí cenných rad a veliké pomoci při sepisování této magisterské práce. Dále bych ráda poděkovala Františku Marecovi za poskytnutí drozofil a za pomoc při vyhodnocování preparátů a celé laboratoři Michala Žurovce za obrovskou pomoc v začátcích této práce.

4 OBSAH 1. ÚVOD CÍLE PRÁCE MATERIÁL A METODY Pokusné organismy Křížení homozygotních linií Vyšetření homozygotních linií na přítomnost inverzí Cytogenetické vyšetření inverzí Vyšetření inverzí pomocí PCR Izolace genomové DNA Příprava templátů pro sekvenování D. melanogaster Amplifikace genu Idgf5 a Chit-like pomocí PCR Analýza a přečištění PCR produktů Příprava templátů pro sekvenování D. simulans Amplifikace genu Idgf5 a Chit-like pomocí PCR Analýza a přečištění PCR produktů Ligace fragmentů Idgf5 a Chit-like u D. simulans Transformace bakterií a testování přítomnosti inzertu Izolace plazmidů z pozitivních klonů Sekvenování produktů Příprava sekvenační reakce Přečištění sekvenační reakce Statistické analýzy a výpočet rekombinačního parametru VÝSLEDKY Křížení homozygotních linií Inverzní smyčky Nukleotidová variabilita Evropská populace...16

5 Africká populace Distribuce polymorfismu a divergence Testy neutrality Haplotypová struktura Vazebná nerovnováha a rekombinační rychlost Genetický tok a migrace DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY... 27

6 1. Úvod Drosophila melanogaster je významným genetickým modelovým organizmem. Díky svým přednostem, jako je kosmopolitní rozšíření, nenáročnost chovu, velké množství potomstva, krátká generační doba, dostupnost balancerových linií a v poslední době i přístup ke kompletnímu genomu, si octomilka získala své čestné místo také na poli populační genetiky. Studie na drozofile pomohly například lépe pochopit některé evoluční jevy jako jsou korelace mezi rekombinační rychlostí a genetickým polymorfizmem (Begun, Aquadro 1992) nebo mechanizmy balancované (Kreitman, Hudson 1991) a direktivní selekce (selective sweep) (Hudson et al. 1994). S nástupem molekulárních metod byla prozkoumána řada drozofilých genů s cílem objasnit rozsah jejich nukleotidové variability a evoluční procesy, které se na udržení této variability podílejí. Do dnešní doby bylo námětem mnoha prací zejména studium genů účastnících se buněčného metabolizmu, naopak pouze malá část výzkumu byla zaměřena na geny exprimované v časných vývojových stádiích drozofily. Mezi tyto studie můžeme počítat například výzkumy provedené na genu transformer (Walthour, Schaeffer 1994), genu dpp (Richter et al. 1997) nebo na jednom z hlavních vývojových genů drozofily lokusu runt (Labate et al. 1999). V předložené magisterské práci jsem se zaměřila na podrobnější prozkoumání úrovně nukleotidové variability dvou drozofilých vývojových genů, Idgf5 a Chit-like. Oba tyto geny jsou součástí multigenové rodiny, která je zajímavá mimo jiné tím, že neobsahuje žádné pseudogeny a tudíž vyhovuje modelu vývoje multigenových rodin subfunkcionalizací. Navíc je díky svým charakteristikám jako jsou podobné uspořádání intronů a exonů, malá velikost a odlišná cytologická lokalizace jednotlivých členů, výborným kandidátem pro studium recentní evoluce. Multigenová rodina Idgf (Imaginal Disc Growth Factors) byla identifikována u Drosophily melanogaster Kirpatrickem et al. (1995) a Kawamurou (1999). Název této rodiny je odvozen od schopnosti proteinových produktů podporovat buněčnou proliferaci v imaginálních discích drozofily. Jedná se o vůbec první polypeptidické růstové faktory objevené u bezobratlých živočichů. Překvapivé je, že homologie s aminokyselinovými sekvencemi dosud známých růstových faktorů nebyla nalezena. 1

7 Zjistilo se však, že proteiny vykazují strukturní podobnost s chitinázou, enzymem katalyzujícím v kutikule členovců hydrolýzu β-1,4-n-acetyl-d-glukózaminových vazeb chitinových polymerů (Hakala et al. 1993). Je tedy pravděpodobné, že geny Idgf vznikly duplikací z chitinázy a v průběhu evoluce došlo jednak ke ztrátě katalytické aktivity enzymu a jednak k zisku nové funkce-podpory růstu. Další funkce drozofilých Idgf genů není zatím přesně známá, ale pravděpodobně se jedná o potenciální imunitní faktory (Kirpatrick et al. 1995). Homology těchto genů byly nalezeny nejen u hmyzu (Shi, Paskewitz 2004), ale také u savců, člověka nevyjímaje. Lidský homolog HC gp-39 byl například identifikován jako hlavní sekreční produkt kloubních chondrocytů a synoviálních buněk u pacientů s artritidou (Hakala et al. 1993). Genová rodina Idgf má celkem šest členů, z nichž pět je rozmístěných na chromozómu 2 a jeden gen se nachází na pohlavním chromozómu X (rozmístění genů na chromozómech je znázorněno v příloze č.2). Jako první z rodiny byl identifikován glykoprotein DS47 (Kirpatrick et al. 1995). DS47 je kódován genem Chit-like lokalizovaným na pravém raménku chromozómu 2 v cytologické oblasti 53D. V blízkosti lokusu Chit-like se nachází gen Idgf5 (55C), který byl objeven jako poslední a to pouze na základě podobností DNA sekvencí v genomové databázi. Kawamura et al. (1999) zjistil, že na levém raménku druhého chromozómu se v oblasti 36A nacházejí v těsném klastru další tři geny Idgf1, Idgf2 a Idgf3 a že poslední člen rodiny, gen Idgf4 jako jediný neleží na autozómu, ale v oblasti 9A pohlavního chromozómu X. Kromě studie zabývající se krystalovou strukturou genu Idgf2 (Varela et al. 2002) a pilotních prací Kirpatricka et al. (1995) a Kawamury et al. (1999) nebyly do dnešní doby téměř žádné další výzkumy na těchto genech u drozofily provedeny. Mým úkolem bylo navázat na předchozí práci Žurovcová, Ayala (2002) pojednávající o variabilitě genů Idgf1 a Idgf3 ve španělské populaci D. melanogaster a přispět tak k lepšímu pochopení toho, jaké evoluční mechanizmy formují další dva z genů této zajímavé multigenové rodiny. Práce je součástí grantového projektu č. 204/03/1383, který se zabývá studiem evoluce celé genové rodiny Idgf. 2

8 2. Cíle práce 1. Připravit linie homozygotní pro chromozómy 2 a X z africké (20 linií) a z evropské (20 linií) populace D. melanogaster. 2. Vyšetřit homozygotní linie na přítomnost dvou kosmopolitních inverzí In(2R)NS a In(2L)t. 3. Vyizolovat z obou populací geny Idgf5 a Chit-like a na základě zjištěné nukleotidové variability odhadnout jejich možný model evoluce. 4. Srovnat míru variability mezi ancestrální (africkou) a odvozenou (evropskou) populací D. melanogaster a porovnat se stávajícími hypotézami o jejich demografickém vývoji. 3

9 3. Materiál a metody 3.1. Pokusné organismy Drosophila melanogaster K analýzám byly použity vzorky dvou populací D. melanogaster. Africké, která je považována za původní (ancestrální) a odvozené evropské. Toto schéma je důležité pro možnost srovnání, do jaké míry mohly variabilitu genu ovlivnit demografické procesy související s případným bottleneckem (tj. poklesem velikosti populace) při rozšiřování do nové oblasti, případně zda zůstal zachován možný vliv selekce. Africký vzorek tvořilo 20 izogenních samičích linií z populace odchycené v Keňi (udržované od roku 2002 v laboratorním chovu), které jsme získali od Dr. Penelope Haddrill (University of Edinburgh, UK). Obdobný vzorek evropské populace (tj. 20 izogenních samičích linií) jsme získali z čerstvého odchytu provedeného prof. F. Marecem na Moravě v r Drosophila simulans Drosophila simulans je fylogeneticky nejbližší příbuzný D. melanogaster (tzv. sibling species), z tohoto důvodu byla vybrána jako outgroup pro populačně genetické testy vyžadující odhad mezidruhové divergence Křížení homozygotních linií Pro získání sekvence genu lokalizovaného na jiném než pohlavním chromozómu drozofily můžeme gen buď zaklonovat nebo vytvořit pro daný chromozóm homozygotní linie. Vzhledem k tomu, že by klonování 80 fragmentů bylo jednak velmi náročné a navíc by mohlo vnést další chyby způsobené nepřesnou PCR amplifikací, připravila jsem z obou populací linie homozygotní současně pro oba zájmové chromozómy (2. a X). Příprava těchto linií byla založena na použití balancerových drozofilých stoků s markery FM7 (X chromozóm; bar oko, heterozygot ledvinovité oko), CurlyRoi ( heterozygoti curly křídla, drsné oko; homozygoti letální) a CurlyGFP 4

10 ( heterozygoti curly křídla, GFP exprese v celém těle; homozygoti letální) (použité markery viz. příloha č. 4). Křížení probíhalo celkem ve čtyřech krocích. (schéma křížení viz. příloha č. 3). V každém kroku byla do skleněné kultivační nádoby s agarovým médiem (1.2 L vody, 120 g kukuřičného šrotu, 15 g agaru, 75 g cukru, 60 g kvasnic, 25 ml 10% methylparabenu) umístěna vždy jedna virginelní (celkem 80, z každé linie 2) a jeden s příslušnými balancery (příprava se dvěma balancery viz. příloha č. 3). Kultivace probíhala v termostatu při teplotě 26 C, jednak kvůli rychlejšímu vývoji drozofily a jednak kvůli lepší expresi markeru curly. Po vykřížení homozygotních linií byla odebrána část samčího potomstva a uchována v -70 C Vyšetření homozygotních linií na přítomnost inverzí Homozygotní linie byly testovány na přítomnost dvou kosmopolitních inverzí In(2R)NS (cytogenetická metoda) a In(2L)t (cytogenetická metoda, PCR) Cytogenetické vyšetření inverzí Homozygotní byli zkříženi se OregonR (inverze nelze v homozygotním stavu detekovat). Z larev 3. instaru byly v kapce fyziologického roztoku (1000 ml ddh 2 O, 9 g NaCl, 0.42 g KCl, 0.25 g CaCl 2, 0.2 g NaHCO 3 ) vypitvány slinné žlázy a přeneseny do 2.5% lakto-aceto-orceinu, kde probíhalo barvení po dobu 35 min. Po obarvení byly žlázy přeneseny na čisté podložní sklíčko do kapky 50% acetátu (20 ml kyseliny octové, 20 ml dest. vody). Po přiklopení krycím sklíčkem byl proveden roztlak preparátu. Polytenní chromozómy byly pozorovány ve světelném mikroskopu Zeiss Axioplan 2 microscope ( Carl Zeiss Jena, Germany) při zvětšení 40x, 60x a 100x. Preparáty byly nasnímány a zaznamenány pomocí CCD kamery (LM-View, Soft Imagin System GmbH, Germany). 5

11 Vyšetření inverzí pomocí PCR Izolace DNA pomocí chelexu Z linie drozofily obsahující inverzi In(2L)t byla pomocí 5% chelexu (BioRad) vyizolována genomová DNA. Tato linie byla použita jako pozitivní kontrola při testování inverzí metodou PCR. Izolace DNA: V O.5 ml 10% chelexu (0.05 g chelexu, 450 ml ddh 2 O) byla rozmačkána pomocí sterilní zatavené špičky 1 drozofila a k homogenátu bylo přidáno 0.5 ml ddh 2 O. Vzorek byl inkubován na suchém bloku 45 min. při 65 C. Po krátkém zvortexování následovala opět inkubace při 95 C 10 min. Před každou PCR byl vzorek centrifugován 5 min při rpm (Eppendorf, Minispin) pro oddělení chelexu a supernatantu (DNA). Amplifikace inverze pomocí PCR Způsob detekce inverze In(2L)t byl navržen Andolfattem et al. (1999) a spočívá v použití tří primerů. Primery STD545/STD18 jsou navrženy tak aby v případě nepřítomnosti inverze překlenuly potenciální zlomové místo a naamplifikovaly tak delší produkt (~ 500 bp). Kombinací primerů STD545/IUA157 je v přítomnosti inverze naamplifikována pouze polovina zlomového místa a velikost produktu je tedy ~ 250 bp. PCR reakce (V=10 µl): 5.1 µl ddh 2 O 1 µl 10x PCR pufru (TopBio) 1.6 µl dntp (1.25 mm, Takara) 0.1 µl MgCl 2 (5 mm, TopBio) 0.75 µl primeru forward (5 µm) 0.75 µl primeru reverse (5 µm) 0.5 µl Taq purple polymerázy (1 U/µl, TopBio) 1 µl DNA genomové (sekvence primerů viz. příloha č.5) Amplifikační reakce proběhla ve 35 cyklech při teplotách: 94 C 15 sek., 57 C 25 sek. (STD545/IUA157) a 65 C 25 sek. (STD545/STD18), 72 C 50 sek.; s úvodní denaturací 94 C 1 min. a závěrečnou extenzí 72 C 10 min. (Eppendorf Master cycler). Velikost 6

12 fragmentů byla po provedení elektroforézy (1.5 % agarózový gel, 120V) porovnána se standardem molekulových hmotností λ ( EcoRI+HindIII) Izolace genomové DNA V 1.5 mililitrových zkumavkách bylo ve 180 µl ATL pufru pomocí zatavené špičky rozdrceno 20 zamražených drozofilých z každé linie. Dále bylo postupováno dle návodu kitu: Dneasy Tissue Kit Handbook (Qiagen). Stejným postupem byla získána také genomová DNA z D. simulans Příprava templátů pro sekvenování D. melanogaster Amplifikace genu Idgf5 a Chit-like pomocí PCR PCR směs (převzato z návodu výrobce ExTaq), (V = 25 µl): µl ddh 2 O 2.82 µl 10x PCR pufru (Takara) 1.69 µl primeru forward (5 µm) 1.69 µl primeru reverse (5 µm) 2.26 µl dntp (2.5 mm, Takara) 0.11 µl ExTaq polymerázy (5 U/µl, Takara) 2 µl genomové DNA (sekvence primerů viz. příloha č. 5) Amplifikační reakce proběhla ve 35 cyklech při teplotách: 94 C 15 sek., 55.5 C 25 sek. (Idgf5) a 59.5 C 25 sek. (Chit-like), 72 C 1 min. 30 sek.; s úvodní denaturací 94 C 1 min. a závěrečnou extenzí 72 C 10 min. (Eppendorf Master cycler). Velikost fragmentů byla po provedení elektroforézy (1.5 % agarózový gel, 120V) porovnána se standardem molekulových hmotností λ (EcoRI+HindIII). 7

13 Analýza a přečištění PCR produktů 25 µl PCR reakce bylo přečištěno pomocí kitu: QIAquick PCR purification Kit (Qiagen). DNA byla vyeluována o 30 µl ddh 2 O a uchovávána v -20 C Příprava templátů pro sekvenování D. simulans Amplifikace genu Idgf5 a Chit-like pomocí PCR Amplifikace probíhala stejným způsobem jako v bodě Analýza a přečištění PCR produktů 25 µl PCR reakce bylo naneseno na 1.5 % agarósový gel a po proběhnutí elektroforézy zanalyzováno pod UV zářičem. Příslušné fragmenty byly pod UV světlem vyříznuty a přečištěny na kolonce pomocí kitu: QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) Ligace fragmentů Idgf5 a Chit-like u D. simulans Ligace byla provedena pomocí kitu firmy Promega: pgem-teasy Vector System II. Ligační směs: 1 µl pgem Teasy plazmidu (50 ng/µl) 7 µl DNA přečištěné na kolonce firmy Qiagen 1 µl enzymu ligázy (3 U/µl) 1 µl 10x ligačního pufru Ligace proběhla přes noc při 14 C Transformace bakterií a testování přítomnosti inzertu Ligační směs byla přidána do kompetentních buněk DH5α (5 µl ligační směsi na 200 µl bakterií) a inkubována 15 min. na ledu. Poté byl proveden tepelný šok (50 sek. při teplotě 42 C a rychlý přenos na led). Ke směsi bylo přidáno 0.5 ml tekutého LB média a vše bylo inkubováno 50 min. při 37 C na třepačce. Na předem připravené agarové misky (LB médium s přidaným ampicilinem, konečná koncentrace 100 mg/ml) bylo naneseno 50 µl X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galaktozid, 20 mg/ml v dimethylformamidu) 8

14 a 10 µl IPTG (Izopropyl-thio-D-galaktozid 200 mg/ml). Po zaschnutí bylo na misky rozetřeno po 100 µl bakteriální směsi. Inkubace proběhla přes noc při 37 C. Druhý den bylo možné detekovat kolonie s integrovaným inzertem v plazmidech pomocí modrobílé selekce na utilizaci galaktózy. Ověření zaklonování správného fragmentu bylo provedeno pomocí PCR. Nejprve byla část bakteriální kolonie resuspendována ve 20 µl ddh 2 O a inkubována při 94 C 5 min. na suchém bločku. Takto připravená DNA byla použita do PCR reakce. PCR směs byla připravena stejným způsobem jako v bodě Amplifikační reakce proběhla za stejných podmínek jako v bodě Pouze počáteční denaturace probíhala 4 min. a závěrečná extenze 7 min. Velikost fragmentů byla po provedení elektroforézy (1.5 % agarózový gel, 120V) porovnána se standardem molekulových hmotností λ (EcoRI+HindIII) Izolace plazmidů z pozitivních klonů Kolonie byly přeneseny do 3 ml LB média s ampicilinem (konečná koncentrace 100 mg/ml) a kultivovány přes noc v 37 C za stálého míchání. Po kultivaci byl 1 ml bakterií odebrán do 1.5 ml zkumavky a centrifugován 2 min. při 600 rpm (Eppendorf, Minispin). Tento krok byl opakován celkem třikrát. Vždy po centrifugaci byl odsán supernatant a k peletce přidán další 1 ml bakterií. Dále bylo postupováno dle návodu kitu firmy Qiagen : QIA prep Spin Miniprep Kit. Plazmidy byly vyeluovány do 30 µl ddh 2 O a uchovávány v - 20 C Koncentrace plazmidů byla stanovena pomocí spektrofotometru (Helios, ChromSpec) Sekvenování produktů Příprava sekvenační reakce Na přípravu sekvenační reakce byl použit kit od firmy Applied biosystems: Big Dye Terminator v 1.1, cycle sequencing Kit Sekvenační reakce (V=20 µl; 1/4): 10 µl ddh 2 O 6 µl 2.5x sekvenačního pufru 9

15 2 µl sekvenačního mixu 1 µl primeru 1 µl DNA (200 ng/µl) (seznam primerů viz. příloha č. 5) Pro sekvenování plazmidové DNA bylo do reakce přidáno 7 µl DNA (105.7 ng/µl) a 4 µl ddh 2 O Přečištění sekvenační reakce pomocí izopropanolu (ABI PRISM protocol) Sekvenační reakce byla smíchána s 80 µl 75% izopropanolu a krátce zvortexována. Vzorek byl poté srážen po dobu 15 min. ve tmě při pokojové teplotě a následně centrifugován 20 min. v předchlazené centrifuze při teplotě 4 C a rpm. Po odsátí supernatantu bylo ke vzorku přidáno 250 µl 75% izopropanolu a vše bylo zvortexováno. Vzorek byl centrifugován při podmínkách viz. výše po dobu 5 min. Supernatant byl pečlivě odsán a vzorek dosušen na suchém bloku při 90 C po dobu 1 min. pomocí Sephadexu a aerosolových špiček (De Fillippis V.R., ústní sdělení) Hydratace Sephadexu: Roztok Sephadexu byl připraven z 5g Sephadexu TM G50Superfine (Amersham Biosciences) a 75 ml ddh 2 O (100 kolonek). Před použitím bylo třeba nechat roztok odstát nejméně 45 min. při 4 C. Příprava kolonek: Sterilní aerosolová špička (1000 µl) byla uříznuta ~ 5 mm pod filtrem a vložena do 1.5 ml zkumavky. Na filtr bylo naneseno 400 µl Sephadexu a pomocí dudlíku z 1 ml Pasteurovy pipety byla protlačena přebytečná voda skrz kolonku. Proteklá voda byla odstraněna a na filtr bylo naneseno znova 400 µl Sephadexu. Kolonka byla centrifugována 2 min. při 1000 g a vložena do nové zkumavky. Přečištění reakce: Sekvenační reakce byla nanesena na sloupek Sephadexu a centrifugována za podmínek viz. výše. Přečištěná reakce byla vysušena ve vakuové centrifuze (Eppendorf) (20-60 min.). K analýze sekvencí byl použit automatický sekvenátor ABI Prism 310 od firmy Perkin Elmer (Applied biosystem). 10

16 3.8. Statistické analýzy a výpočet rekombinačního parametru Sekvence byly spojeny pomocí programu SeqMan (DNASTAR), pro srovnání sekvencí byl použit program MEGA verze 3.1 (Kumar et al. 2004). Pomocí programu DnaSP verze 4.1 (Rozas et al. 2003) byly spočteny následující parametry a testy: počet haplotypů, h (Nei 1987) haplotypová diverzita, Hd (Nei 1987) Strobeckovo S (Strobeck 1987) nukleotidová diverzita, π (Nei 1987) nukleotidový polymorfizmus, θ (Nei 1987) nukleotidová divergence, K (Nei 1987) D podle Tajimy (Tajima 1989) test McDonalda a Kreitmana (MacDonald and Kreitman 1991) D* podle Fu a Li (Fu and Li 1993) D (s outgroupem) podle Fu a Li (Fu and Li 1993) K st * statistika (Hudson et al. 1992) počet migrantů, Nm (Hudson et al. 1992) rekombinační parametr, Rh (Hudson 1987) Kellyho statistika, ZnS (Kelly 1997) Podobnost mezi jednotlivými haplotypy byla vyšetřena a znázorněna klastrovou analýzou pomocí metody Neighbor-Joining (NJ) na základě Kimurova 2 parametrového modelu v programu MEGA verze 3.1 (Kumar et al. 2004). Bootstrapové hodnoty byly generovány z opakování. Program DNA Slider (McDonald 1998) byl použit pro testování distribuce polymorfizmu a divergence. Program Recomb-Rate (Comeron et al 1999) pro zjištění hodnoty rekombinace c lab. Zadáním rekombinačního parametru C lab (rekombinace/lokus/generaci) do koalescentní simulace lze přesněji stanovit konfidenční intervaly pro Tajimův D test (Tajima 1989), Fu a Li D, D* statistiku (Fu and Li 1993), haplotypovou diverzitu Hd a počet haplotypů h (Nei 1987). 11

17 Výpočet hodnoty C lab : C lab = 2 x c lab x bp x N e (Przeworski et al. 2001) c lab ( rekombinace/ bp/ generaci) rekombinační rychlost; hodnota stanovená na základě laboratorních měření (Comeron et al. 1999) N e efektivní velikost populace N e = 3 x 10 5 (Aquadro et al. 2001) Hodnoty c lab (Idgf5) = x 10-8 ( rekombinací/ bp/ generaci) Hodnoty c lab (Chit-like) = x 10-8 ( rekombinací/ bp/ generaci) 12

18 4. Výsledky 4.1. Křížení homozygotních linií Pro přípravu homozygotních linií bylo vybráno ~ 40 z každé populace (2 jedinci od každé linie). Po dokončení křížení přežívalo v homozygotním stavu v moravské populaci 23 linií, v africké populaci 20 linií. Z každé ze 40 homozygotních linií (20 linií africká populace, 20 linií evropská populace) D. melanogaster a 1 linie D. simulans byla vyizolována genomová DNA, ze které pak byly pomocí navržených primerů naamplifikovány templáty o velikostech ~ 1.5 Kb (Idgf5) a ~ 2.5 Kb (Chit-like). Oba geny byly osekvenovány z obou řetězců, seřazeny a variabilita jejich sekvencí vyhodnocena pomocí populačně genetických programů Inverzní smyčky Součástí mojí práce bylo také vyšetření 20 larev D. melanogaster z každé populace na přítomnost inverzních smyček. Detekce inverzí je velmi důležitá, jelikož přítomnost těchto chromozomálních mutací ve vzorku může značně ovlivnit úroveň polymorfizmu. Geny, které se nacházejí přímo v inverzi nebo v její blízkosti, nemají totiž s výjimkou vzácného dvojitého crossing overu schopnost rekombinace (Dobzhansky 1950). Ve své práci jsem se zaměřila na detekci dvou kosmopolitních inverzí, In(2R)NS a In(2L)t. Inverze In(2R)NS se nachází na pravém raménku druhého chromozómu a přímo pokrývá oblast, ve které jsou lokalizovány geny Idgf5 a Chit-like (viz. příloha č. 2). Inverze In(2L)t se nachází na levém raménku druhého chromozómu v blízkosti oblasti 36A, místa, kde jsou v klastru geny Idgf1,2 a 3 (viz. příloha č. 2). Inverzi In(2L)t je možno detekovat jak pomocí PCR, tak cytogeneticky, inverzi In(2R)NS pouze vyšetřením polytenních chromozómů. Po prozkoumání obou populací byla objevena pouze inverze In(2L)t a to jen u 1 linie v moravské populaci (což je frekvence 5%). Přítomnost této inverze byla zjištěna jak pomocí PCR (viz. obr. č.1), tak i cytogenetickým vyšetřením (viz. obr. č. 2). Inverze 13

19 In(2R)NS, která by mohla přímo ovlivnit geny Idgf5 a Chit-like, nebyla přítomna ani v jedné populaci K+ K+ λ(e+h) 564 bp Obr. č. 1 Detekce inverze In(2L)t pomocí PCR. Linie č. 1- inverze přítomná v homozygotním stavu Line č. 2 -inverze není přítomná Linie č. 3 - pozitivní kontrola (heterozygot) Obr. č. 2 Kosmopolitlní inverze In(2L)t nalezená u evropské linie D. melanogaster. Zvětšení 100x Nukleotidová variabilita Evropská populace V sekvencích genu Idgf5 bylo nalezeno celkem 46 nukleotidových polymorfizmů, z toho 36 polymorfizmů v kódující sekvenci, 4 v intronech a 6 v oblasti terminátoru. (viz. příloha č. 6). 16 mutací (nesynonymních) mělo za následek změnu aminokyseliny, naopak 20 mutací aminokyselinové složení neovlivnilo. Gen Chit-like vykazoval oproti genu Idgf5 o něco nižší míru polymorfizmu. Celkový počet mutací byl spočten na mutací, z toho 2 nesynonymní, bylo nalezeno v kódující oblasti a celkem 11 mutací v oblastech intronů, promotoru a terminátoru (viz. příloha č. 6). 14

20 Ukazatel nukleotidové diverzity, parametr π, vyjadřující průměrný podíl nukleotidových rozdílů mezi haplotypy (Nei 1987), byl v případě genu Idgf5 mnohonásobně vyšší (viz. tab. č. 1), než je průměrná hodnota pozorovaná u D. melanogaster (π Tot. = ) (Moriyama, Powell 1996). Stejně tak druhý ukazatel genetické variability θ, vyjadřující pravděpodobnost, že konkrétní místo bude polymorfní (Nei 1987), byl o polovinu vyšší (viz. tab. č.1), než je průměr (θ Tot. = ). Obě hodnoty jak π, tak θ se v případě genu Chit-like pohybovaly naopak okolo průměrné hodnoty (viz. tab. č.1). U obou genů bylo zjišťováno také množství fixních rozdílů (divergence) mezi sekvencemi D. melanogaster a D. simulans. U genu Idgf5 bylo pozorováno 48 synonymních substitucí a 16 substitucí nesynonymních. Naproti tomu u genu Chit-like bylo zjištěno synonymních substitucí celkem 70 a nesynonymních pouze Africká populace Africká populace vykazovala u obou genů mnohem vyšší stupeň variability (viz. příloha č. 6). Gen Idgf5 obsahoval celkem 93 mutací, což je o polovinu více než v případě evropské populace. 71 změn bylo obsaženo v kódující sekvenci, 13 změn v intronech a 9 mutací v oblasti terminátoru. Z celkového množství polymorfizmů jich 26 mělo vliv na změnu aminokyseliny. V porovnání s genem Idgf5 vykazoval gen Chit-like opět o něco nižší míru polymorfizmu. V celé sekvenci bylo nalezeno 96 mutací, z toho 43 v kódující oblasti, 11 v oblastech promotoru a terminátoru a introny obsahovaly 42 mutací. Pouze 5 mutací způsobilo změnu aminokyseliny. Oba ukazatele genetické variability, π a θ, v obou případech výrazně překračovaly průměrnou hodnotu stanovenou pro D. melanogaster. (viz.tab.č.1). Množství fixních rozdílů (divergence) nalezených mezi sekvencemi genu Idgf5 D. melanogaster a D. simulans bylo celkem 48, z toho 14 mutací bylo synonymních a 7 nesynonymních. 58 synonymních a 7 nesynonymních mutací obsahoval gen Chit-like. Hodnoty celkové divergence (K), vyjadřující průměrnou hodnotu nukleotidových rozdílů na 1 bázi mezi druhy D. melanogaster a D. simulans, byly u obou populací pro oba geny 15

21 téměř shodné, v případě genu Chit-like byly opět o něco nižší než u genu Idgf5. (viz. tab. č. 1). Tabulka č. 1 Nukleotidová diverzita genů Idgf5 a Chit-like. π-nukleotidová diverzita. θ-nukleotidový polymorfismus. K-hodnota celkové divergence mezi druhy D.melanogaster a D.simulans. gen π θ K Idgf5 Evropa Chit-like Evropa Idgf5 Afrika Chit-like Afrika Distribuce polymorfismu a divergence Analýza rozložení polymorfismu a divergence v délce celého genu byla provedena metodou posunovaného intervalu ( sliding window ) (viz. příloha č. 8 a 9). Z grafů na obr. č. 3 a 5 je patrné, že distribuce polymorfismu je u genu Chit-like poměrně homogenní. V případě africké populace byly hodnoty polymorfismu vyšší a křivka kopírovala divergenci přesněji. (obr. č. 5). Rozložení polymorfismu podél genu Idgf5 se zdá být také homogenní s výjimkou oblasti 1. exonu a terminátoru, kde křivky nabývají vyšších hodnot (viz. obr. č. 4 a 6). Křivky divergence vykazovaly naproti tomu vysoce heterogenní charakter.(viz. příloha č. 8 a 9) Zejména v případě genu Chit-like byly u obou populací zaznamenány velmi vysoké hodnoty divergence a to zejména v oblasti 1. exonu a 1. intronu.(obr. 3 a 5). U obou genů (Idgf5 a Chit-like) byl přibližně ve stejném místě (1000bp) zaznamenán pokles divergence a to až na úroveň hodnoty polymorfismu (viz. příloha č. 8 a 9). Pokles byl opět výraznější v případě africké populace. Přesnějším způsobem jak zjistit zda je variabilita v genu rozložena rovnoměrně je použitím McDonaldových testů (McDonald 1996, 1998). (Grafický výstup je zobrazen v přílohách č. 10 a 11). Křivka znázorňuje poměr vnitrodruhového polymorfizmu k mezidruhové divergenci. Druhou formou výstupu je tab. č. 2 zobrazující hodnoty jednotlivých statistik. Každá z uvedených statistik je citlivá vůči jinému typu 16

22 heterogenity. K-S statistika (Kolmogorov-Smirnov) zachytí typ heterogenity při kterém jeden konec genu vykazuje nízké a druhý konec vysoké hodnoty polymorfizmu. Max.G a Gmean statistiky uvažují heterogenitu způsobenou výskytem vysokého lokálního maxima polymorfizmu v oblasti s nízkými hodnotami polymorfizmu. Run statistika je nejlépe schopná detekovat oblasti, kde se nachází několik lokálních maxim polymorfizmu pohromadě. Heterogenita v distribuci variability byla signifikantní pouze u genů v evropské populaci, a to na 5% hladině významnosti v případě genu Idgf5 a na 1% hladině významnosti u genu Chit-like (viz. tab. č.2). Obě průkazné hodnoty byly získány na základě statistiky max.g. U genu Idgf5 byla prokázána heterogenita také na základě Run statistiky a to na 5% hladině významnosti (viz. tab. č. 2). Tabulka č. 2 Testy heterogenity Uvedeny hodnoty nejvyšší dosažené pravděpodobnosti. Nebylo možné stanovit hodnotu pravděpodobnosti. P*<0.05; P**<0.01 gen max.g runs K-S avg.g Idgf5 Evropa 0.037* 0.017* Chit-like Evropa 0.006** Idgf5 Afrika Chit-like Afrika Testy neutrality Vzhledem k tomu, že neexistuje žádný univerzální test neutrality (Watterson 1977), používá se pro zjištění zda na geny působí nějaká forma selekce několik standardních testů, z nichž každý je jinak citlivý vůči určitému modelu: a) test podle MacDonalda a Kreitmana (MacDonald and Kreitman 1991) pro porovnání vnitro a mezi druhové variability; za předpokladu neutrality by měl být poměr nesynonymních mutací k synonymním mutacím pro fixní diference shodný s poměrem pro vnitrodruhový polymorfizmus. 17

23 b) Tajimův D test (Tajima 1989) porovnává hodnoty dvou ukazatelů nukleotidové diverzity π a θ; podle neutrálního modelu by se měli oba parametry rovnat. c) Fu and Li statistiky D a D * (Fu and Li 1993) založené na výskytu singletonů (tj. polymorfizmů vyskytujících se ve vzorku jen jednou); jejich očekávaný výskyt by se měl za předpokladu neutrality rovnat parametru θ. Po provedení všech testů nebyl ani v jednom případě zaznamenán odklon od neutrálního stavu (viz. příloha č. 7) Haplotypová struktura Pomocí programu DNAsp bylo stanoveno pro každý lokus množství haplotypů h obsažených ve vzorku populace. Současně byla spočtena také hodnota Strobeckovy statistiky (Strobeck 1987), na jejíž základě jsme schopni zhruba odhadnout, jak vypadá konkrétní struktura populace, tzn., jestli je populace panmiktická nebo jestli došlo k jejímu rozdělení na subpopulace. Pro oba geny byla také stanovena hodnota haplotypové diverzity Hd. Přesto, že se kromě genu Idgf5 z africké populace pohybovaly hodnoty v rámci stanoveného 95% konfidenčního intervalu, byly jak počty haplotypů tak hodnoty haplotypové diverzity poměrně vysoké, tzn. v horní polovině konfidenčního intervalu (viz. tab. č. 3). Stejně tak byly velmi vysoké i hodnoty Strobeckovy statistiky (viz. tab. č. 3), která vyjadřuje pravděpodobnost, že množství haplotypů v náhodně vybraném vzorku bude menší nebo rovno pozorované hodnotě. Tabulka č. 3 Přehled počtu haplotypů h, haplotypové diverzity Hd a hodnot Strobeckovy statistiky St. N- velikost vzorku, h-počet haplotypů, Hd-haplotypová diverzita. Hodnoty v závorkách znázorňují 95% konfidenční interval stanovený na základě koalescentní simulace. P*<0.05 Gen N h Hd St Idgf5 Evropa <11; 18> 0.989<0.889; 0.989> Chit-like Evropa <11; 18> 0.974<0.894;0.989> Idgf5 Afrika <13; 19>* 1.0<0.931;0.994>* 1.0 Chit-like Afrika <13; 20> 0.979<0.942;0.994>

24 Pomocí programu MEGA verze 3.1 (Kumar et al. 2004) byla provedena klastrová analýza, která umožňuje posoudit, zda jsou haplotypy nějakým způsobem strukturovány. V případě genu Chit-like byly u obou populací haplotypy rozděleny do dvou hlavních a přibližně stejně velkých klastrů. Stejnou topologii stromu vykazoval také gen Idgf5 v evropské populaci. U genu Idgf5 z africké populace tvořily haplotypy opět dva výrazně oddělené klastry, avšak rozložení haplotypů do jednotlivých klastrů nebylo rovnoměrné jako v ostatních případech. I v tomto případě však rozdělení mělo vysokou průkaznost na základě opakování (bootstrapu). (výstup klastrové analýzy viz. příloha č. 12) Vazebná nerovnováha a rekombinační rychlost Počet rekombinačních událostí v konkrétním lokusu byl spočten jednak na základě laboratorně stanovené hodnoty c lab (viz. metodika) a jednak pomocí programu DNAsp z parametrů daného genu ( Rh.) (Hudson 1987). Z výsledků je patrné, že se hodnoty rekombinace vypočtené na základě obou parametrů značně liší (viz. tab. č. 4). Obecně však lze říct, že gen Chit-like vykazuje oproti genu Idgf5 o něco nižší rekombinační rychlost. Pro oba geny byla také stanovena hodnota vazebné nerovnováhy ZnS (Kelly 1997). Tato statistika nám říká, jak silná je vazba mezi nukleotidy jednotlivých polymorfních míst. V případě obou genů z evropské populace a genu Chit-like z populace africké, se hodnoty vazebné nerovnováhy pohybovaly v rozmezí daného intervalu. Signifikantní hodnoty této statistiky byly nalezeny pouze v případě genu Idgf5 z africké populace (viz. tab. č. 4) Tabulka č. 4 Přehled rekombinačních rychlostí a vazebné nerovnováhy genů Idgf5 a Chit-like. Clab.-rekombinační parametr (rekombinace/lokus/generaci), Rh- Hudsonův rekombinační parametr (rekombinace/lokus/generaci), ZnS- Kellyho statistika vazebné nerovnováhy Hodnoty v závorkách znázorňují 95% konfidenční interval stanovený na základě koalescentní simulace. P*<0.05 gen Clab. Rh ZnS Idgf5 Evropa <0.095;0.275> Chit-like Evropa <0.084;0.219> Idgf5 Afrika <0.101;0.269>* Chit-like Afrika <0.092;0.203> 19

25 4.8. Genetický tok a migrace Pomocí K st * statistiky (obdoba F st statistiky; Hudson et al. 1992) jsme schopni určit, do jaké míry si jsou dvě populace geneticky navzájem podobné. Vysoce průkazné hodnoty zjištěné u genů Idgf5 [K st *=0.032, P(K st *)=0.000] a Chit-like [K st *=0.059, P(K st *)=0.000] vypovídají o značné diferenciaci obou populací. Hodnoty pravděpodobnosti byly získány permutačním testem s opakováním x. Pro oba geny byla stanovena také frekvence migrací mezi jednotlivými populacemi. V případě genu Idgf5 bylo zjištěno, že rychlost migrace (Nm) je mezi africkou a evropskou populací 1.6 migrantů za generaci. V případě genu Chit-like byla migrace o něco nižší a to 1.2 migrantů za generaci. 20

26 5. Diskuze Za místo původního výskytu D.melanogaster je považována tropická Afrika (David and Cappy 1988). Z této oblasti se drozofila během několika tisíciletí rozšířila po celém světě (viz. příloha č.1), přičemž oblast Euroasie byla osídlena jako jedna z prvních a to po poslední době ledové zhruba před lety (Lachaise et al. 1988). Po provedení analýzy evropské a africké části populace D.melanogaster jsem zjistila, že jak v případě genu Idgf5 tak u genu Chit-like je velké procento mutací obsažené v evropské populaci shodné s mutacemi v populaci africké (75% mutací u genu Idgf5 a 81% mutací u genu Chit-like), což odpovídá výše zmíněnému původu evropské populace drozofily na africkém kontinentě. Na druhou stranu vysoce signifikantní hodnoty Kst* statistiky spočtené pro oba geny společně s nízkým počtem migrantů svědčí o značné diferenciaci obou populací. K odlišnosti obou populací přispívá zejména veliký rozdíl v jejich nukleotidové variabilitě, který však ani u jedné z populací není, jak jsem zjistila, způsoben přítomností inverzních smyček. Africká populace Až do nedávné doby se předpokládalo, že se africká populace D. melanogaster nachází v rovnováze a že u ní nedochází k žádným výrazným selekčním nebo demografickým procesům. Poslední studie provedené na afrických populacích drozofily však dokazují, že v průběhu její historie sehrály určitou roli právě demografické procesy (Haddrill 2005, Glinka et al. 2003). Tito autoři shodně uvádějí, že jedním z možných demografických procesů formujících africkou populaci mohl být dávný bottleneck, který je datován do doby přibližně před lety. Projevy dávného bottlenecku jsou například záporné hodnoty Tajimova D, které v případě uvedených studií nabývaly signifikantních hodnot. Záporné hodnoty Tajimova D vykazovaly také oba geny jak Chitlike tak Idgf5. Negativní Tajimovo D však může být, kromě již zmíněného kompletního bottlenecku, také důsledkem selektivního sweepu nebo populačního růstu. První možnost, selektivní sweep, můžeme však zamítnout vzhledem k velmi vysoké variabilitě obou genů. Naproti tomu populační růst je v africké populaci velmi pravděpodobný a 21

27 následoval zřejmě po již zmíněném bottlenecku. Vzhledem k tomu, že nebyly dosažené hodnoty Tajimova D ani u jedno ze zkoumaných genů signifikantní, bylo třeba najít ještě nějaký další důkaz, který by teorii dávného bottlenecku podpořil. Po provedení klastrové analýzy vyšlo najevo, že topologie stromu u obou genů vykazuje stejné uspořádání jako v případě populace evropské (viz. příloha č.12), o které je známo, že u ní bottleneck nastal. Haplotypový dimorfizmus stromu však může být způsoben nejen demografickými, ale také selekčními vlivy jako jsou např. direktivní a balancovaná selekce. Model direktivní selekce jakožto důsledek přizpůsobování se novému prostředí však není v případě africké populace, která se vyvíjela v relativně stabilních podmínkách, pravděpodobný. Vliv balancované selekce můžeme také zamítnout vzhledem k tomu, že tento typ selekce je u drozofily velmi vzácný a tudíž je nepravděpodobné, že by ovlivňoval najednou oba geny. To, že by topologie stromu byla v případě africké populace ovlivňována selekcí, je málo pravděpodobné také z toho důvodu, že ani u jedno ze zkoumaných genů nebyl na základě testů neutrality pozorován odklon od neutrálního stavu. Neutrální hypotéza nemohla být zamítnuta ani na základě testů heterogenity, které vyšly u obou genů taktéž neprůkazně. Průkazně vysoká hodnota jak haplotypové diverzity, tak počtu haplotypů byla s největší pravděpodobností v případě genu Idgf5 způsobena velmi vysokou rychlostí rekombinace (Rh.=305) a velmi nízkou vazebnou nerovnováhou (ZnS= 0,0854) v daném lokusu. Evropská populace Evropská populace drozofily vykazovala o polovinu nižší míru variability než populace africká. Podobná redukce variability pozorovaná u mimoafrických populací byla popsána také Begunem, Aquadrem (1993) a P. Haddrill et al.(2005). Tento trend může být způsoben jak poklesem populační velikosti, (populační bottleneck) ke které došlo při expanzi drozofily z Afriky na ostatní kontinenty, tak adaptací na lokální klima nebo oběma jevy (Andolfatto 2001). Zkoumaná evropská populace se od africké odlišovala nejenom nižší nukleotidovou variabilitou, ale tak také vyššími hodnotami vazbové nerovnováhy. Harr et al.(2002) ve své práci uvádí oba tyto rysy jako důkaz selekce. Oba tyto jevy však mohou být vysvětleny také na základě demografických procesů. K tomuto modelu se ve své práci přiklání také Haddrill, která tvrdí, že u evropské populace došlo k nedávnému bottlnecku. 22

28 Ke stejnému závěru, došel také Baudry et al. (2004) a to na základě haplotypového dimorfizmu (rozdělení haplotypů do dvou tříd na základě klastrové analýzy) zjištěného u evropské populace. Stejný haplotypový dimorfizmus vykazovaly také oba geny Chit-like i Idgf5. Pro nedávný bottlneck jsou typické i pozitivní hodnoty Tajimova D, které byly zjištěny u obou zkoumaných genů. Pozitivní hodnoty Tajimova D však mohou svědčit také o vlivu balancované selekce. Tento případ byl zaznamenán u genu IdgfI ve španělské populaci (Žurovcová and Ayla 2002), avšak v tomto případě byla selekce na rozdíl od obou zkoumaných genů pozitivně potvrzena testy neutrality. Přesto, že stejně jako v případě africké populace nebyly testy neutrality ani u jednoho z genů v evropské populaci signifikantní, nemůžeme možný vliv selekce zcela zamítnout. Na to, že se geny nevyvíjejí zcela neutrálně poukazují také signifikantní hodnoty testů heterogenity a to u obou zkoumaných genů. V případě genu Idgf5 byla navíc heterogenita prokázána dokonce dvěma ze čtyř provedených statistik. Stejně tak se i hodnoty testů neutrality pohybovaly v případě genu Idgf5 téměř vždy na horní hranici stanoveného intervalu. Z výše uvedených pozorování se zdá, že na oba geny tedy zřejmě působily jak procesy demografické, tak i určitá forma mírné selekce, nicméně toto působení bylo zřejmě velice komplexní a stávajícími statistickými modely od sebe nelze oba vlivy přesněji odlišit. 23

29 6. Závěr V předložené práci se podařilo splnit vytyčené cíle, tj. vypěstovat adekvátní počet izogenních linií ze dvou přírodních populací D. melanogaster a provést analýzu vybraných genů. Cytogenetické vyšetření prokázalo, že se v daných vzorcích nevyskytují žádné inverzní smyčky, které by mohly zásadně ovlivnit nukleotidovou variabilitu zkoumaných genů. Provedené statistické analýzy dále ukázaly, že se na evoluci obou genů významně podílela demografická historie, jejíž model byl již dříve popsán jinými autory (v případě africké populace se jedná o dávný bottleneck, v případě evropské populace o bottleneck recentní). I přesto, že se vliv selekce nepodařilo prokázat, geny Idgf5 i Chit-like mají výrazně zvýšenou variabilitu, v evropské populaci navíc s nerovnoměrným rozdělením, což může být signálem, že jejich evoluce není zcela neutrální. Relativně nižší variabilita genů v evropské populaci je způsobena již zmíněným bottlneckem, ke kterému došlo při expanzi drozofily na evropský kontinent. 24

30 7. Seznam literatury ANDOLFATTO, P. (2001): Contrasting patterns of X-linked and autosomal nucleotide variation in Africa and non-africa populations of Drosophila melanogaster and Drosophila simulans. Mol. Biol. Evol. 18, ANDOLFATTO, P., J.D. WALL and M. KREITMAN. (1999): Unusual haplotype structure at the proximal breakpoint of In(2L)t in a natural population of Drosophila melanogaster. Genetics 153, AQUADRO, C.F., V. DUMONT and F.A. REED. (2001): Genome-wide variation in the human and fruitfly: a comparison. Curr. Opin. Genet. Dev. 11, BAUDRY, E., VIGINIER, B.and VEUILLE, M. (2004): Non-African populations of Drosophila melanogaster have a unique origin. Mol. Biol. Evol. 21, BEGUN, D.J. and C.F. AQUADRO. (1992): Levels of naturally occuring DNA polymorphism correlate with recombination rates in D. melanogaster. Nature 356, BEGUN, D.J. and C.F. AQUADRO. (1993): African and North American populations of Drosophila melanogaster are very different at the DNA level. Nature 365, COMERON, J.M., M. KREITMAN and M. AGUADE. (1999): Natural selection on synonymous sites in correlated with gene length and recombination in Drosophila. Genetics 151, DAVID, J.R., P. CAPPY. (1988): Genetic variation of Drosophila melanogaster natural populations. Trends Genet. 4, DOBZHANSKY, T. (1950): Genetics of natural populations. XIX. Origin of heterosis through natural selection. Genetics 35, FU, Y.-X., and W.-H. LI. (1993): Statistical tests of neutrality of mutations. Genetics 133, GLINKA, S., OMETTO, L., MOUSSET, S., STEPHAN, W. and DE LORENZO, D. (2003): Demography and natural selection have shaped genetic variation in Drosophila melanogaster: A multi locus approach. Genetics 165,

31 HADDRILL, P.R., THORNTON, K.R., CHARLESWORTH, B. and P. ANDOLFATTO. (2005): Multilocus patterns of nucleotide variability and demographic and selection history of Drosophila melanogaster populations. Genome. Res.15, HARR, B., KAUER, M. and SCHLOTTERER, C. (2002): Hitchhiking mapping: A population based fine - mapping strategy for adaptive mutations in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, HAKALA, B.E., WHITE, C. and RECKLIES, A.D. (1993): Human cartilage gp-39, a major secretory product of articular chondrocytes and synovial cells, is a mammalian member of chitinase protein family. J. Biol. Chem. 268, HUDSON, R.R. (1987): Estimating the recombination parametr of a finite population model without selection. Genet. Res. 50, HUDSON, R.R., BOOS, D.D. and KAPLAN, N.L. (1992): A statistical test for detecting geographic subdivision. Mol. Biol. Evol. 9, HUDSON, R.R., K. BAILEY, D. SKARECKY, J. KWIATOWSKI, and F.J. AYALA. (1994): Evidence for positive selection in the superoxide dismutase (Sod) region of Drosophila melanogaster. Genetics 136, KAWAMURA, K., T. SHIBATA, O. SAGET, D. PEEL and P.J. BRYANT. (1999): A new family of growth factors produced by the fat body and active on Drosophila imaginal disc cells. Development 126, KELLY, J.K. (1997): A test of neutrality based on intrerlocus associations. Genetics 146, KIRPATRICK, R.B., R.E. MATICO, D.E. McNULTY, J.E. STRICKLER and M. ROSENBERG. (1995): An abundantly secreted glycoprotein from Drosophila melanogaster is related to mammalian secretory proteins produced in rheumatoid tissue and by activated macrophages. Gene 153, KREITMAN, M. and R.R. HUDSON. (1991): Inferring the evolutionary histories of the Adh and Adh-dup loci in Drosophila melanogaster from patterns of polymorphism and divergence. Genetics 127, KUMAR, S., K. TAMURA and M. NEI. (2004): MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Bioinformatics 5,

32 LABATE, J.A., C.H. BIERMANN and W.E. EANES. (1999): Nucleotide variation at the runt locus in Drosophila melanogaster and Drosophila simulans. Mol. Biol. Evol. 16, LACHAISE, D., CARIOU, M. I., DAVID, J.R., LEMEUNIER, F., TSACAS, L. and ASHBURNER, M. (1988): Historical biogeoraphy of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evol. Biol. 22, MORIYAMA, E.N., J.R. POWELL. (1996): Intraspecific nuclear DNA variation in Drosophila. Mol. Biol. Evol. 13, McDONALD, J.H. (1996): Detecting non-neutral heterogeneity across a region of DNA sequence in the ratio of polymorphism to divergence. Mol. Biol. Evol. 13, McDONALD, J.H. (1998): Improved tests for heterogeneity across a region of DNA sequence in the ratio of polymorphism to divergence. Mol. Biol. Evol. 15, McDONALD, J.H., and M. KREITMAN. (1991): Adaptive protein evolution at the Adh locus in Drosophila. Nature 351, NEI, M. (1987): Molecular evolutionary genetics. Columbia university press, New York. PRZEWORSKI, M., J.D. WALL and P. ANDOLFATTO. (2001): Recombination and the frequency spectrum in Drosophila melanogaster and Drosophila simulans. Mol. Biol. Evol. 18, RICHTER, B., M. LONG, R.C. LEWONTIN and E. NITASAKA. (1997): Nucleotide variation and conservation at the dpp locus, a gene controlling early development in Drosophila. Genetics 145, ROZAS, J., J.C. SÁNCHEZ-DelBARRIO, X. MESSEGUER and R. ROZAS. (2003): DnaSP, DNA polymorphism analysis by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19, SHI, L. and S.M. PASKEWITZ. (2004): Identification and molecular characterization of two immune-responsive chitinase-like proteins from Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 13, STROBECK, C. (1987): Average number of nucleotide differences in a sample from a single subpopulation: a test for subpopulation subdivision. Genetics 117, TAJIMA, F. (1989): Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics 123,

33 VARELA, P.F., LLERA, A.S., R. A. MARIUZZA and J. TORMO. (2002): Crystal structure of imaginal disc growth factor-2 a member of a new family of growth-promoting glycoproteins from Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem. 277, WALTHOUR, C.S. and S.W. SCHAEFFER. (1994): Molecular population genetics of sex determination genes: the transformer gene of Drosophila melanogaster. Genetics 135, WATTERSON, G.A. (1977): Heterosis or neutrality? Genetics 85, ŽUROVCOVÁ, M. and F.J. AYALA (2002): Polymorphism pattern in two tightly linked developmental genes, Idgf1 and Idgf3, of Drosophila melanogaster. Genetics 162,

34 Příloha č. 1 Rozšíření jednotlivých populací Drosophila melanogaster

35 Příloha č. 2 Rozmístění inverzí a genů Idgf na chromozómech In(2L)t In(2R)NS

36 Příloha č. 3 Příprava homozygotních linií FM7 wt wt wt ; ; wt wt CyRoi wt wt FM7 wt ; ; wt wt CyRoi X 1 (wt) 2 1 (wt) FM7 wt ; X 2 (wt) 2 2 (wt) ; CyRoi FM7 wt ; CyRoi X 1 (wt) 2 1 (wt) FM7 wt ; ; FM7 CyRoi CyGFP FM7 wt wt wt ; ; wt wt CyGFP X 1 (wt) 2 1 (wt) ; X 1 (wt) 2 1 (wt) ; wt wt FM7 wt FM7 CyGFP CyGFP ; ; wt wt CyGFP + + FM7 + FM7 + FM7 wt ; CyGFP

37 Příloha č. 4 Fenotypové markery použité při křížení homozygotních linií FM7( ) FM7,GFP ( ) Roi Roi( ) Curly 32

38 Příloha č. 5 Seznam a sekvence použitých primerů Primery použité při amplifikaci genu Idgf5 F5: 5`- GTT GTG AAT CTA ACT TGA AGC -3` R5: 5`- TGA AAT TTA TTG CAA TCC ATG C -3` Primery použité při amplifikaci genu Chit-like FCH: 5`- CGT CTC AAC CTT CGA CAA GC -3` RCH: 5`- TAA ATT AAC CCG AGC ATA TTT CC -3` Primery použité při sekvenování genu Idgf5 5F1: 5`- CGA TCG GGA TGT GAA CAG C -3` 5F2: 5`- AAC GTG GAC TTC GTC AAC C -3` 5F3: 5`- GGA GAT TTG TGA TTT GCT GC -3` 5R1: 5`- GCA GCA AAT CAC AAA TCT CC -3` 5R2: 5`- TTG GCG AGA TTC TCA ATG G -3` 5R3: 5`- ACA TGC GGA TAT TTT TTG CG -3` Primery použité při sekvenování genu Chit-like CHF1: 5`- TTG GGT CGA GTG TGG AAG C -3` CHF2: 5`- AAG ATC CTG CTG AGT GTG GG -3` CHF3: 5`- GTT CTA CGA CAT TCC CGC TG -3` CHF4: 5`- TTA TGC CTA CAG GGC AGC C -3` CHR1: 5`- ATA GGC GTT GTT CTG GTT GG -3` CHR2: 5`- GTT CAC ATT GGG CAG AAC AG -3` CHR3: 5`- TGC TGG TTC AGA CTC ACC G -3` CHR4: 5`- CTA GTC GTT GTT TTC GAT TTC G -3` Primery použité při amplifikaci inverze In(2L)t STC545: 5`- GAC TCA TTC TGC TTC GAT CAC TAA G -3` STD18: 5`- CTG TTC CCA CCG CAC AGA GTT GCC TGT C -3` InA157: 5`- TAT TTT GGT GGC CTG TTT CAG -3`