MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2014 JAROSLAVA KLECLOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Stanovení vybraných kovů pomocí kapilárních elektroforetických technik Diplomová práce Vedoucí práce: Doc. Ing. Jan Pospíchal, CSc. Vypracovala: Bc. Jaroslava Kleclová Brno 2014

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci Stanovení vybraných kovů pomocí kapilárních elektroforetických technik vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

4 PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu práce panu doc. Ing. Janu Pospíchalovi, CSc. a paní Ing. Elišce Glovinové, PhD. za velmi cenné rady a pomoc při realizaci a zpracování mé diplomové práce. V neposlední řadě děkuji také svým rodičům za veškerou podporu během studia.

5 ABSTRAKT V diplomové práci je popsána metoda pro stanovení nízkých koncentrací mědi s možností detekce Wilsonovy choroby. Byla vyvinuta metodika a vhodné elektrolytové systémy, které umožňují předkoncentrovat měď před vlastní on-line izotachoforetickou analýzou. Navržený elektrolytový systém pro analýzu měl toto složení: LE 1 ( M CH 3 COOH, M CH 3 COONH 4, M SPADNS), LE 2 ( M CH 3 COONH 4, M NH 4 OH, M BKP, M PAR, M C 6 H 17 N 3 O 7 ) a DE ( M Cu(CH 3 COO) 2, M CH 3 COONH 4 a M CH 3 COOH). S navrženým elektrolytem bylo experimentálně dosaženo téměř sedmdesátinásobného naakumulování mědi během 42 minut, přičemž celá analýza i s detekcí trvala zhruba 98 minut. Akumulace po dobu 42 minut umožnila řádově snížit koncentrační limit metody tak, aby byl dostatečný pro detekci Wilsonovy choroby. V práci byla provedena konduktometrická detekce mědi, nicméně navržený elektrolytový systém umožňuje rovněž detekci fotometrickou, která je citlivější. Klíčová slova měď, Wilsonova choroba, elektromigrační metody, CAF-IEF, ligand step gradient ABSTRACT There is described a electromigration separation method for the analysis of low concentrations of copper with the possibility to detect a Wilson disease in my thesis. There were developed a methodology and propitious electrolyte systems, which can pre-concentrate copper prior to its on-line analysis. The developed electrolyte system for analysis had the following composition: LE 1 ( M CH 3 COOH, M CH 3 COONH 4, M SPADNS), LE 2 ( M CH 3 COONH 4, M NH 4 OH, M BKP, M PAR, M C 6 H 17 N 3 O 7 ) and DE ( M Cu(CH 3 COO) 2, M CH 3 COONH 4 a M CH 3 COOH). With a suggested electrolyte was achieved almost seventyfold accumulation of copper during 42 minutes, which lowered the concentration detection limit on the level convenient for the detection of Wilson disease. Complete analysis took about 98 minutes. There was accomplished a conductometric detection of copper in my thesis, however the developed electrolyte system can also analyze a copper by photometric detection, which is more sensitive. Key words: copper, Wilson disease, electromigration methods, CAF-IEF, ligand step gradient

6 OBSAH 1 Úvod Cíl práce Literární přehled Měď Výskyt mědi v lidském těle Biochemické funkce Metabolismus mědi Výživa a výskyt v potravinách Porucha metabolismu mědi Úvod Wilsonova choroba Elektromigrační separační metody Princip Elektroforetická pohyblivost Elektroosmotický tok Kapilární elektroforéza Princip, využití Instrumentace Kapilára Regulace teploty Dávkování vzorku Detektory Uspořádání pro CE Rozdělení kapilárních metod Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Princip... 22

7 3.5.2 Instrumentace Kapilární elektrochromatografie (CEC) Princip a využití Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Princip a využití Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Princip a využití Elektroforéza pohyblivého rozhraní (MBE) Princip Kapilární izotachoforéza (CITP) Princip Instrumentace Kapilára Dávkování vzorku Detektor Vyhodnocovací zařízení Jevy provázející separaci Difúze Samozaostřovací efekt Gravitace Jouleovo teplo Praktické využití CITP Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Princip Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů (CAF-IEF) Princip Praktická aplikace CAF-IEF... 32

8 4 Experimentální část Použité přístrojové vybavení CS Isotachophoretic Analyser Počítačové zařízení Chemikálie Vývoj metodiky Výběr fokusačního elektrolytu Podmínky pro výběr fokusačního elektrolytu Experimentální řešení Nalezení optimálního dávkovacího elektrolytu (DE) pro akumulaci zón mědi Podmínky měření Experimentální měření Výběr analytického elektrolytu Experimentální řešení výběru analytického elektrolytu (LE 1 ) Postup analytické procedury Podmínky měření Experimentální měření Výpočet akumulačního faktoru Diskuze Závěr Použitá literatura Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam použitých zkratek... 62

9 1 ÚVOD Měď patří mezi stopové prvky, které jsou pro člověka esenciální, tedy nepostradatelné. Je součástí několika metabolických procesů a přispívá ke správnému fungování celého organismu. Wilsonova choroba patří mezi vzácné dědičné onemocnění, které se vyznačuje metabolickou poruchou s nemožností vylučovat měď. Ta se nevylučuje játry do žlučových cest a hromadí se v různých orgánech. Onemocnění se projevuje zejména jaterními a neurologickými příznaky. Při pozdní diagnostice má neléčená choroba fatální následky. Z tohoto důvodu, je stanovení mědi v tělních tekutinách důležitou diagnostickou pomůckou. Měď se nejčastěji stanovuje pomocí metody atomové absorpční spektrometrie (AAS). Toto stanovení je finančně náročné, navíc zde dochází k manipulaci se vzorkem a může tak dojít ke ztrátě analytu. Předpříprava vzorku pro stanovení mědi metodou AAS spočívá k extrakčním kroku, který nemusí být 100%. Další možností stanovení mědi je využití elektromigračních metod, kterých se však k diagnostice Wilsonovy choroby zatím nepoužívá. Přičemž využití elektromigračních metod pro stanovení mědi by bylo ekonomicky méně náročné z pohledu pořízení instrumentace. K základním elektromigračním metodám patří zónová elektroforéza, izotachoforéza, izoelektrická fokusace, micelární elektrochromatografie aj. Ovšem pro stanovení mědi bylo třeba vyvinout novou metodiku on-line kombinace několika elektromigračních principů. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce Stanovení vybraných kovů pomocí kapilárních elektroforetických technik bylo využití elektromigračních metod pro stanovení vybraných kovů v životním prostředí. Vybraným kovem byla zvolena měď, vzhledem k jejímu diagnostickému významu a jejímu obtížnému stanovení v biologických vzorcích. Ke stanovení mědi byla použita kombinace elektromigračních metod. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Měď Výskyt mědi v lidském těle Pro člověka je měď důležitým esenciálním prvkem. Průměrná koncentrace mědi v těle dospělého člověka je asi 1,7 mg.kg -1 tělesné hmotnosti. Nejvíce mědi se vyskytuje v játrech (15 mg.kg -1 ), v mozku (5,6 mg.kg -1 ), v plicích (2,2 mg.kg -1 ) a v ledvinách (2,1 mg.kg -1 ). Údaje jsou uvedeny v mg.kg -1 čerstvé tkáně. Průměrná koncentrace mědi v krvi je 1,23 mg.dm -3 u žen a 1,10 mg.dm -3 u mužů. (VELÍŠEK, 2002). Dále se měď vyskytuje v molekule ceruloplasminu v krevní plasmě a v molekule proteinu erythrokupreinu, který se nachází v erythrocytech. V jaterních buňkách je měď navázána na enzym superoxiddismutázu a v mozkové tkáni se nachází metaloprotein cerebrokuprein (VELÍŠEK, 2002) Biochemické funkce Měď jako stopový prvek lze nalézt ve všech živých buňkách, a to buď v oxidovaném stavu (Cu 2+ ) nebo ve stavu redukovaném (Cu + ). Měď je strukturální součástí několika enzymů např. superoxiddismutasy, cytochromoxidasy, tyrosinasy a některých aminooxidáz (XU et al., 2005). Enzym superoxiddismutasa chrání vnitřní prostředí buněk před oxidačními procesy a jejich následným poškozením. Aminooxidasy obsahující měď ovlivňují pigmentaci vlasů a kůže (VELÍŠEK, 2002). Nejvíce mědi obsahuje metaloprotein ceruloplasmin, který v krevní plasmě katalyzuje oxidaci vstřebaných iontů Fe 2+ na Fe 3+. Protein transferin pak může Fe 3+ přenést v krevním oběhu do potřebných tkání (BELITZ, 2008). Proto nedostatek mědi vede stejně jako nedostatek železa k anémii (VELÍŠEK, 2002) Metabolismus mědi Měď se vstřebává ve dvanáctníku. Stupeň resorpce mědi závisí na nasycení (saturaci) organismu prvkem, při nedostatku může být stupeň resorpce až 70 %. Měď se vstřebává do těla buď na základě aktivního transportu (při jejím nedostatku) nebo prostou difuzí (VELÍŠEK, 2002). Z těla je měď vylučována stolicí a žlučí. 11

12 3.1.4 Výživa a výskyt v potravinách Průměrný denní přísun mědi u dospělého člověka by měl být okolo 1,5 3 mg. Nedostatek mědi u člověka je velmi vzácný. Pokud však dojde k dlouhodobému nízkému příjmu mědi, dostaví se u člověka srdeční arytmie, vyšší hladina cholesterolu a snížená tolerance glukózy. Vážný nedostatek mědi způsobí poruchu metabolismu železa a následně tzv. hypochromní mikrocytární anémii (VELÍŠEK, 2002). Deficit mědi je obvykle způsoben nízkou hladinou mědi během narození, zvýšeným požadavkem přísunu mědi během růstu dětí, dále nedostatečným přísunem mědi v potravě nebo špatnou absorpcí mědi. Nadbytek mědi je způsoben poruchou vylučování mědi nebo nadměrnou absorpcí mědi. K onemocněním spjatým s poruchou metabolismu mědi patří tzv. Wilsonova choroba (podrobnosti viz níže). Nadměrné hromadění mědi v organismu se vyskytuje také u osob s poruchou činnosti ledvin. V neposlední řadě je dobré zmínit nadměrné užívání doplňků stravy obsahující měď. Toxikóza z mědi se projevuje nevolností, zvracením, anémií, bolestí břicha a průjmem (XU et al., 2005). Následující tabulka číslo 1 uvádí vyšší obsah mědi ve vybraných potravinách. Tab. 1 Vybrané potraviny s vyšším obsahem mědi (VELÍŠEK, 2002) Potravina Obsah mědi v mg.kg -1 potraviny čaj černý 11,0 33,0 vepřová játra 10,0 23,0 sója 8,0 20,0 sýry 0,3 19,0 pšenice 4,0 14,0 fazole 6,0 13,0 čočka 5,8 8,9 hrách 4,9 8,5 káva pražená 8,2 mouka pšeničná 2,0 6,5 čokoláda mléčná 4,9 chléb celozrnný 3,5 Vyšší koncentrace mědi v potravinách může být způsobena např. použitím měděných nádob během zpracování nebo aplikací pesticidů s obsahem mědi na zemědělské plodiny. Využitelnost mědi se zvyšuje s přítomností bílkovin a 12

13 aminokyselin ve stravě. Naopak vyšší příjem vitaminu C, fruktosy, zinku, sirných sloučenin a molybdenu využitelnost mědi snižují (VELÍŠEK, 2002). 3.2 Porucha metabolismu mědi Úvod V diplomové práci jsem se pokusila vyvinout metodu pro stanovení nízkých koncentrací mědi pomocí kapilární elektromigrační metody využívající fokusaci a předkoncentraci komplexů mědi na reakčním rozhraní. S využitím dalších poznatků by se tato metoda mohla do budoucna použít i k diagnostickému účelu Wilsonovy choroby, pro kterou je charakteristická porucha metabolismu mědi Wilsonova choroba Wilsonova choroba patří mezi vzácné dědičné onemocnění, které se vyznačuje metabolickou poruchou s nemožností vylučovat měď, která se pak hromadí ve tkáních. Onemocnění postihuje asi jednoho člověka z lidí. Měď se nevylučuje játry do žlučových cest, ale hromadí se v různých orgánech. Onemocnění se projevuje zejména jaterními a neurologickými příznaky. K jaterním příznakům se připisují například ztukovatění jater, chronická hepatitida a cirhóza jater. Mezi neurologické příznaky patří například třes, křeče, poruchy řeči a koordinace (LUKÁŠ, 2005). Nemoc se projevuje obvykle u dětí školního věku. Pokud zůstane neléčena, rozvinou se v dospívání nebo dospělosti u poloviny nemocných s jaterním poškozením také neurologické příznaky. Jasným znakem onemocnění je zjištění Keyserova-Fleischerova prstence na vnitřním okraji rohovky. Prstenec je pigmentován šedozeleně až červenozlatě a lze jej při očním vyšetření snadno odhalit. Přítomnost Wilsonovy choroby se potvrzuje molekulární a biochemickou diagnostikou. Molekulární diagnostika sice není dosud klinicky dostupná, tzn. nelze nalézt mutace v genu, ale jakmile je diagnóza stanovena, měli by být vyšetřeni všichni členové rodiny. Nutná je včasná diagnóza, jelikož nejlepší prognózu mají asymptomatičtí pacienti s včasnou léčbou. Laboratorní diagnostika zahrnuje analýzu hladiny mědi a ceruloplasminu. Snížená hladina ceruloplasminu (< 0,1 g.l -1 ) v séru a zvýšený výskyt mědi v játrech (1,6 31,4 μmol.g -1 suché tkáně) a moči (> 1,6 μmol.den -1 ) diagnostikuje přítomnost Wilsonovy choroby (HOFFMANN et al., 2002). Právě aplikace elektromigrační metody pro analýzu moči na přítomnost mědi by se mohla v budoucnu uplatnit. 13

14 Cílem léčby Wilsonovy choroby je snižovat obsah mědi v těle. Při léčbě se podává D-penicilamin, který zvyšuje vylučování mědi močí. Pacient může také užívat acetát zinku, který brání vstřebávání mědi. U těžkých případů, v případě jaterního selhání, je nutná transplantace jater. Při včasné a efektivní léčbě je prognóza dobrá. (LUKÁŠ, 2005). 3.3 Elektromigrační separační metody Princip Mezi analytické separační metody patří metody elektromigrační. Základním principem je separace nabitých částic na základě jejich rozdílné pohyblivosti v stejnosměrném elektrickém poli. Pohyblivost nabitých částic závisí na: síle elektrického pole, podmínkách prostředí, velikosti náboje a velikosti a tvaru molekuly. Velikost náboje závisí na: iontové síle, ph prostředí a stupni ionizace (CHURÁČEK et al., 1990). Elektromigračními metodami nazýváme soubor technik, které pracují na principu pohybu ionizovaných částic v elektrickém poli (KÁŠ, et al., 2006). Separační prostředí obsahuje roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy (stěny kapiláry, povrchy přítomných částic) stýkající se s tímto roztokem, které mohou nést elektrické náboje. V tomto prostředí se vytvářejí elektrické dvouvrstvy a později vzniká rovnovážné rozdělení nábojů. Během separace je na toto prostředí připojeno stejnosměrné elektrické pole, které rozruší rovnováhu rozdělených nábojů a vyvolá jejich pohyb. Stejnosměrné elektrické pole se vytvoří tak, že aplikujeme stejnosměrné napětí mezi elektrodami (KLOUDA, 2003). U elektromigračních metod se využívá dvou elektrokinetických jevů, elektroforézy a elektroosmózy. Během elektroforézy se nabité částice po aplikaci napětí pohybují směrem k opačně nabité elektrodě. U elektroosmózy se po aplikaci napětí pohybuje v kapiláře voda směrem k záporné elektrodě (KLOUDA, 2003). Elektroforézu jako separační metodu lze použít jak pro nízkomolekulární, tak pro vysokomolekulární látky (KÁŠ, et al., 2006). Elektroforézu nelze provést pouze ve volném roztoku, jelikož se bude roztok prostřednictvím difuze vždy vyrovnávat v celém objemu koncentrace složek. Proto je tedy nutné složky během separace zafixovat. Existuje plošné a kapilární uspořádání. Na obrázku s číslem 1 je zobrazeno plošné uspořádání elektroforézy. 14

15 Obr. 1 Schematické uspořádání pro papírovou/gelovou elektroforézu (KLOUDA, 2003) Plošný nosič (filtrační papír, tenka vrstva gelu) je napuštěn základním elektrolytem, který je umístěn v elektroforetické komoře nasycené parami rozpouštědla. Vzorek se dávkuje doprostřed nosiče. Po spuštění zdroje stejnosměrného napětí se jednotlivé zóny složek odseparují na základě rozdílné elektroforetické pohyblivosti. Porézní přepážka (frita) zabraňuje průniku produktů elektrolýzy do nosiče. Po vysušení plošného nosiče se zóny detekují a vyhodnocují. Nevýhodou je manipulační a časová náročnost (KLOUDA, 2003). Princip a uspořádání kapilární elektroforézy (včetně rozdělení) je popsán v kapitole 3.4 Kapilární elektroforéza Elektroforetická pohyblivost Základní veličinou elektromigračních separačních metod je elektroforetická pohyblivost. Je definovaná jako rychlost pohybu nabitých částic v kapalném prostředí ve stejnosměrném elektrickém poli o jednotkové intenzitě (KAŠIČKA, 1997). Látky nesoucí náboj jsou rozpuštěny v elektrolytu a umístěny v elektrickém poli. Pohybují se konstantní rychlostí, která je úměrná velikosti jejich nábojů. Anionty putují k anodě a kationty ke katodě. Rychlost pohybu iontů v elektrickém poli je vyjádřena následujícím vztahem: Rovnice č. 1: (KRÁLOVÁ, 2008) Ve výše uvedené rovnici č. 1 jsou značeny tyto veličiny: rychlost iontu υ, elektroforetická pohyblivost μ eo a intenzita elektrického pole E. Ze vztahu vyplývá, že čím je větší μ eo během separace, tím více se nabité částice dostávají dopředu. Naopak, částice s malou μ eo se zpožďují a probíhá tak separace (KRÁLOVÁ, 2008). Na pohyblivosti částic má vliv několik faktorů: 15

16 a) fyzikálně-chemické vlastnosti nabitých částic (jejich celkový náboj, velikost, tvar, schopnost povrchových skupin disociovat, tvorba komplexů aj.) b) vlastnosti prostředí (koncentrace, ph, vodivost, teplota, permitivita a iontová síla elektrolytů) c) vlastnosti nosiče (adsorpce, prostorové vlivy nosiče aj.) d) vlastnosti elektrického pole (jeho síla, stabilita, homogenita aj.) (CHURÁČEK et al., 1990) V elektrickém poli na nabitou částici o náboji Q působí o intenzitě elektrického pole E síly F 1 a F 2. Elektrická síla F 1 uvádí částici do pohybu a odporová síla F 2 částici brzdí. Na obrázku číslo 2 jsou zobrazeny síly F 1 a F 2 působící na nabitou částici. Obr. 2 Síly F 1 a F 2 působící na nabitou částici (KLOUDA, 2003) S rostoucí rychlostí υ eo se síla F 2 zvětšuje do doby, než dojde k vyrovnání sil F 1 a F 2. Poté nastane ustálený stav, ve kterém se nabité částice pohybují stále stejnou rychlostí. Koeficient k závisí na velikosti částice, tvaru částice a na viskozitě prostředí (KLOUDA, 2003). Pro síly F 1 a F 2 a pro výpočet elektroforetické pohyblivosti částice μ e platí následující vztahy: Rovnice č. 2: Rovnice č. 3: Rovnice č. 4: Rovnice č. 5: (KRÁLOVÁ, 2008) (KRÁLOVÁ, 2008) (KRÁLOVÁ, 2008) (KRÁLOVÁ, 2008) Ve výše uvedených rovnicích číslo 2 5 jsou značeny tyto veličiny: elektrická síla F 1, odporová síla F 2, náboj iontu Q, rychlost iontu υ, poloměr iontu r a viskozita roztoku 16

17 η. Z rovnice tedy vyplývá, že pohyblivost iontu je přímo úměrná jeho náboji a nepřímo úměrná koeficientu. Malé částice s velkým nábojem budou mít pohyblivost velkou (KRÁLOVÁ, 2008). U silných elektrolytů je elektroforetická pohyblivost iontů vztažena k dané iontové síle a teplotě. Nazývá se aktuální pohyblivost. Při nekonečném zředění se nazývá limitní pohyblivost. U slabých elektrolytů je pohyblivost iontů závislá na stupni jejich disociace, tedy na ph. Pohyblivost slabých elektrolytů vzhledem k danému ph, teplotě a iontové síle pufru se nazývá efektivní. Elektromigrační separace slabých elektrolytů se provádějí při takovém ph, při kterém jsou rozdíly v efektivních pohyblivostech separovaných látek maximální (KAŠIČKA, 1997) Elektroosmotický tok U kapilárních elektromigračních metod je dalším transportním jevem elektroosmotický tok (Elektroosmotic flow (EOF)). Je to spontánní tok kapaliny uvnitř kapiláry v důsledku náboje na vnitřní stěně kapiláry. Vlivem disociace povrchových skupin má většina pevných povrchů ve vodném prostředí záporný náboj. Kapilára je z křemenného skla a obsahuje silanové skupiny ( SiOH). Ty mohou při ph > 4 deprotonizovat na SiO -. K zápornému náboji se shromažďují protionty (kationty) a vytváří dvouvrstvu. Vzniká potenciální rozdíl označovaný jako zeta potenciál (KRÁLOVÁ, 2008). Působením stejnosměrného elektrického pole na difuzní část elektrické dvouvrstvy na rozhraní kapalné a pevné fáze vzniká EOF. Uvádí do pohybu nejen difuzní část elektrické dvouvrstvy, ale prostřednictvím vnitřního tření i veškerou kapalinu přítomnou v kapiláře (KAŠIČKA, 1997). Velikost EOF se vyjadřuje jako elektroforetická pohyblivost μ eo nebo jako rychlost elektroosmotického toku υ eo, tj. rychlost iontu υ. Na velikosti elektrického pole závisí pouze rychlost. Pohyblivost je závislá na zeta potenciálu ξ, který je dán velikostí náboje na stěně kapiláry. Jelikož je náboj závislý na ph, bude EOF na ph závislé také. Čím vyšší bude ph, tím více budou silanové skupiny disociovány a tím vyšší bude hodnota EOF. Při nízkém ph není EOF tak výrazný, protože většina silanových skupin je protonizována tzn. nenesou žádný náboj (KRÁLOVÁ, 2008). Pro rychlost EOF a pro elektroosmotickou pohyblivost platí: Rovnice č. 6: Rovnice č. 7: (KRÁLOVÁ, 2008) (KRÁLOVÁ, 2008) 17

18 Ve výše uvedených rovnicích číslo 6 7 jsou značeny tyto veličiny: rychlost elektroosmotického toku υ eo, elektroosmotická pohyblivost μ eo, intenzita elektrického pole E, dielektrická konstanta roztoku ε, zeta (elektrokinetický) potenciál ξ a viskozita roztoku η. Účinkem EOF dochází nakonec k jednosměrnému pohybu všech iontů bez ohledu na jejich náboj. Nejrychleji se budou pohybovat kationty, protože elektroosmotická mobilita i mobilita vlivem EOF působí ve stejném směru. Neutrální molekuly se budou pohybovat stejnou rychlostí jako EOF a nebudou separovány. Anionty se budou pohybovat nejpomaleji, jelikož se pohybují směrem ke katodě a jejich výsledná mobilita je dána rozdílem mobility EOF a mobility elektroforetické (KRÁLOVÁ, 2008). Zeta potenciál,a tudíž i EOF, lze regulovat jednak úpravou vnitřního povrchu kapiláry (povlaky) a jednak změnou složení nosného elektrolytu (změnou ph a iontové síly). V kyselém ph se povrch kapiláry protonuje a EOF se potlačí. Ve slabě zásaditém prostředí je EOF silný a přetlačí většinu aniontů, které pak můžeme za zónami kationtů detekovat. Iontová síla elektrolytu je tím větší, čím více se stlačuje dvouvrstva, klesá jak zeta potenciál tak i EOF (KAŠIČKA, 1997). Uplatňuje se pístový profil toku tzn. rychlost EOF je stejná u stěny i uprostřed kapiláry a dochází tak k menšímu rozmývání zón. Je třeba podotknout, že samotným působením EOF se analyzované ionty nedělí, protože EOF pouze čerpá roztok elektrolytu z jedné nádobky do druhé. Shrnutím lze tedy říci, že na rozdíl od elektroforézy, kde se pohybují pouze nabité ionty a zbytek roztoku je v klidu, se během EOF celý roztok pohybuje najednou (GAŠ, 2001). 3.4 Kapilární elektroforéza Princip, využití Kapilární elektroforéza (Capillary electrophoresis (CE)) je moderní analytická metoda, která umožňuje rychlou a účinnou separaci elektricky nabitých částic přítomných ve vzorku. Separace je založena na rozdílné elektroforetické pohyblivosti iontů v elektroforetickém médiu (elektrolytu) uvnitř kapiláry. Metoda je hojně využívána v chemickém, biochemickém a farmaceutickém průmyslu. Od roku 1980 rapidně vzrostl počet publikací, vědeckých konferencí, komerčních přístrojů i zdokonalených separačních postupů týkajících se kapilární elektroforézy. V současné době je CE čím dál tím více využívána jako vysoce účinná alternativa separační 18

19 metody. CE se také využívá jako doplňková technika k HPLC, abychom získali více informací o dané analýze (LI, 1992) Instrumentace Kapilára Je vyrobena z taveného křemene a jako ochranná vrstva se používá polyamidový povlak. Z důvodu co nejcitlivější detekce je polyamidový povlak kapiláry v místě detektoru odstraněn. Vnitřní povrch kapiláry lze upravit kovalentním navázáním různých chemických látek. Úprava povrchu kapiláry se využívá pro nejrůznější účely např. ke změně iontového náboje na kapiláře nebo ke snížení adsorpce vzorku. Křemenná kapilára je dlouhá cca cm a její vnitřní průměr je cca μm (KLOUDA, 2003) Regulace teploty K zajištění stálých podmínek separace je nutné regulovat teplotu. Regulace se provádí buď vzduchem nebo kapalnou chladicí směsí (KLOUDA, 2003) Dávkování vzorku Vzorek je dávkován do konce kapiláry, který je vzdálenější od detektoru. V kapiláře tvoří nástřik (zóna) vzorku asi 2 % z celkové délky kapiláry. Objem vzorku dávkovaný do kapiláry je ηl. Existují celkem tři typy dávkování vzorku. První typ je tzv. dávkování tlakem. Provede se tak, že se konec kapiláry ponoří do nádobky se vzorkem a přivede se zvýšený tlak. V kapiláře začne působit hydrodynamický tok kapaliny. Tento způsob dávkování je nejpoužívanější. Druhým způsobem je dávkování rozdílem hladin. Je založen na principu spojených nádob. Třetím způsobem dávkování je elektrokinetické dávkování. Sestaví se tak, že konec kapiláry ponoříme do nádobky se vzorkem a přivedeme napětí. Jelikož však pohyblivější částice začnou putovat do kapiláry více než částice méně pohyblivé, kapilára je pak oproti původnímu složení vzorku naplněna nepoměrně (KLOUDA, 2003) Detektory V praxi se používají různé způsoby detekce. Nejběžnějším způsobem je detekce sledováním absorpce ultrafialového záření. Nevýhodou detektorů je menší citlivost, která je cca 10-6 mol.dm -3. Dále je používána detekce s využitím fluorescence. Výhodou je jeho vysoká citlivost a nevýhodou vysoká cena. V současné době je trendem spojení kapilární elektroforézy a hmotnostního spektrometru. Kromě identifikace samotných 19

20 složek se získají i informace o podrobné struktuře analyzovaných látek (KLOUDA, 2003) Uspořádání pro CE Oba konce kapilár jsou ponořeny do nádobek s elektrolytem a vedle nich je umístěna nádobka se vzorkem. Platinové elektrody jsou rovněž ponořeny do nádobek s elektrolytem. Na katodovém konci kapiláry je umístěn detektor. Vzdálenost mezi anodovým a katodovým koncem kapiláry se nazývá efektivní délka kapiláry (KRÁLOVÁ, 2008). Nejprve dojde k nasátí elektrolytu kapilárou, poté se nadávkuje vzorek a nakonec je kapilára umístěna zpět do původní polohy do nádobky s elektrolytem. Mezi elektrody se zapne zdroj napětí (10 30 kv). Kapilárou naplněnou elektrolytem protéká elektrický proud. Obsah kapiláry prochází přes detektor a vyhodnocovací zařízení. Závislost odezvy detektoru na čase se zaznamenává na elektroforegram. Poloha píků určuje kvalitativní údaj a plocha/výška píků údaj kvantitativní. Výhodou oproti plošnému uspořádání elektroforézy je kratší doba analýzy. Jednak kapilára přímo prochází detektorem, jednak je vzniklé teplo během analýzy odváděno stěnami kapiláry pryč (lze použít vyšší napětí) a také se vedle elektroforézy uplatňuje elektroosmotický tok (KLOUDA, 2003). Na obrázku číslo 3 je znázorněno schematické uspořádání CE. Obr. 3 Schematické uspořádání pro CE (KRÁLOVÁ, 2008) Rozdělení kapilárních metod Kapilární elektromigrační metody patří mezi moderní separační metody, které se postupně vyvíjely v průběhu 20 let. K výhodám metod patří vysoká citlivost, rychlost a schopnost oddělit nejrůznější analyty od jednoduchých iontů po složité makromolekuly (ŠTOHL et al., 2005). Jednotlivé kapilární techniky jsou převážně používány pro analýzu jednoduchých matric. V případě směsí složitých matric nastává problém, 20

21 jelikož vzorky často obsahují velké množství nejrůznějších balastních látek, které brání samotné analýze. Před zahájením analýzy se proto aplikují předkoncetrační a předčistící techniky (extrakce pevným sorbentem, kapalinová extrakce aj.). Vzhledem k jejich časové náročnosti je však efektivnější aplikovat kombinaci dvou a více kapilárních elektromigračních technik jako takových (ŠIŠPEROVÁ et al., 2011). Mezi kapilární elektromigrační metody patří: kapilární zónová elektroforéza (Capillary zone electrophoresis (CZE)) kapilární elektrochromatografie (Capillary electrochromatography (CEC)) micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (Micellar electrokinetic chromatography (MEKC)) kapilární gelová elektroforéza (Capillary gel electrophoresis (CGE)) kapilární isoelektrická fokusace (Capillary isoelectric focusing (CIEF)) kapilární izotachoforéza (Capillary isotachophoresis (CITP)) Elektroforetická separace může být provedena v kontinuálním nebo diskontinuálním elektrolytovém systému. U kontinuálního systému se používá jeden základní elektrolyt (Background elektrolyte (BGE)), který tvoří kontinuum podél migrační cesty. Kontinuum vytváří elektricky vodivé médium pro průchod elektrického proudu a vznik elektrického pole. Elektroforetická separace může probíhat buď v kinetickém nebo ustáleném procesu. U kinetického procesu se složení BGE podél migrační cesty nemění. Konstantní proud prochází systémem a separované částice migrují s konstantní, ale rozdílnou rychlostí. Příkladem tohoto typu separace je CZE, MEKC, CGE a CEC. V ustáleném procesu se složení BGE podél migrační cesty mění (není konstantní). V důsledku toho se během migrace může měnit jak elektrické pole, tak pohyblivost separovaných částic. Podél migrační cesty se vytvoří ph gradient a po daném časovém intervalu přestanou určité separované částice (amfolyty) migrovat a zakoncentrují se na charakteristických pozicích, které odpovídají jejich isoelektrickému bodu. Příkladem tohoto typu separace je CIEF. V diskontinuální elektrolytickém systému vzorek putuje mezi dvěma rozdílnými elektrolyty (vedoucí a koncový elektrolyt). Tento systém je typický pro CITP (LI, 1992). Separační principy jednotlivých technik jsou dosti odlišné. V podstatě se rozlišují čtyři základní varianty elektroforézy: 21

22 elektroforéza s pohyblivými hranicemi zónová elektroforéza izotachoforéza izoelektrická fokusace (KRÁLOVÁ, 2008) 3.5 Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Princip V současné době patří CZE mezi nejpoužívanější kapilární elektromigrační metodu díky rychlé a snadné separaci (LI, 1992). K separaci dochází v kapiláře naplněné pouze základním (nosným) elektrolytem BGE. Molekuly se separují v zónách, které se pohybují různou rychlostí. Kladně nabité ionty putují směrem k záporné elektrodě (katodě) a záporně nabité ionty k elektrodě nabité kladně (anodě). Touto metodou je tedy možné separovat anionty i kationty. Neutrální látky se pohybují stejnou rychlostí jako EOF, proto nedojde k jejich rozdělení (KRÁLOVÁ, 2008). Princip separace dvousložkového analytu u CZE jsem uvedla v obrázku číslo 4. Počáteční stav separace jsem označila časem t = 0. Následující separaci dvousložkového analytu pak časem t = t a t = 2t. Obr. 4 Princip dělení dvou látek v CZE Jedním z důležitých faktů je, že lze změnit hmotnostní nebo iontový poměr mnohých iontů úpravou ph BGE, a tím ovlivnit jejich ionizaci a elektroforetickou pohyblivost. Čím větší je náboj kationtů nebo aniontů, tím rychleji ionty putují k elektrodám, ionty Cu 2+ tak budou rychlejší než ionty Cu +. Rovněž viskozitou, iontovou silou a napětím lze pohyblivost měnit (LI, 1992). 22

23 3.5.2 Instrumentace V praxi je CZE uspořádaná tak, že oba konce duté křemenné kapiláry jsou ponořeny do elektrodových nádobek naplněných základním elektrolytem. Křemenná kapilára je potažena polyimidovou vrstvou, která slouží k bezpečné manipulaci s křehkou kapilárou. Vnitřní průměr kapiláry je < 100 μm a délka činí cm. Po naplnění kapiláry elektrolytem je vstupní konec kapiláry ponořen do nádobky se vzorkem. Po určité době je vytvořen rozdíl hladin Δh mezi základním elektrolytem a vzorkem. Po zavedení zóny vzorku do kapiláry je konec kapiláry ponořen zpět do elektrodové nádobky a k systému je přivedeno stejnosměrné elektrické pole ze zdroje vysokého napětí. Jednotlivé složky vzorku se separují na základě jejich rozdílné pohyblivosti, elektroforetické rychlosti a rychlosti EOF v kapiláře. Pohyb jednotlivých zón v kapiláře je sledována pomocí UV-VIS absorpčního detektoru, který měří absorpci záření pohybujícího se nosného elektrolytu a zón analytů. Ze získaného elektroforegramu (časová závislost absorpce) se získají kvalitativní a kvantitativní údaje o složení analytu. Kvalitativní údaj je daný časem migrace a kvantitativní plochou píku (KAŠIČKA, 1997). 3.6 Kapilární elektrochromatografie (CEC) Princip a využití Technika kombinuje principy kapilární elektroforézy a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (High-performance liquid chromatography (HPLC)). Separace probíhá na silikagelu, který představuje stacionární fázi (KLOUDA, 2003). Analyty se separují v prostoru kapilární kolony, kde je umístěna stacionární fáze. Na rozdíl od HPLC se mobilní fáze nepohybuje tlakově vyvolaným hydrodynamickým tokem. Pohyb mobilní fáze je realizován pomocí EOF vyvolaného stejnosměrným elektrickým polem. Díky absenci zpětného tlaku kolony lze použít menší částice sorbentu než u HPLC, z čehož vyplývá také vyšší účinnost separace (KAŠIČKA, 1997). Metoda je využitelná jak pro neutrální látky, tak i pro nabité látky různé chemické povahy (pro jednoduché molekuly i makromolekuly). Je využívána v řadě odvětví např. biochemii, farmakologii a chemii životního prostředí (KLOUDA, 2003). 23

24 3.7 Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Princip a využití Metodu lze použít jak pro separaci látek nesoucích náboj, tak pro separaci látek elektroneutrálních. Do základního pufru se jako aditivum přidává surfaktant. Nejčastěji se používá dodecylsulfát sodný. Různým výběrem surfaktantu lze pozměnit selektivitu MEKC (odlišná velikost micel, různý náboj a tvar micel apod.). Koncentrace surfaktantu musí být vyšší než kritická micelární koncentrace. Při této koncentraci se totiž molekuly surfaktantu začnou shlukovat v micely. Micely se dle náboje, který nesou, pohybují ve směru nebo proti směru EOF. Výsledný pohyb však bude vždy ve směru toku EOF, jelikož je rychlejší než pohyb částic. Micely se skládají z hydrofobních částí molekuly surfaktantu, které směřují dovnitř micely a dále z nabitých částí, které jsou orientovány směrem na povrch micely. Interakce s analyty v pufru je tak zprostředkována pomocí elektrostatických a hydrofobních interakcí. Při separaci neutrálních látek je elektroneutrální analyt unášen EOF. Až se setká s nabitou micelou, interaguje s ní a dle síly interakce je s micelou unášen kapilárou k detektoru. Síla interakce závisí na hydrofobním charakteru molekuly analytu. Čím je analyt hydrofobnější, tím je interakce s micelou větší (KRÁLOVÁ, 2008). Princip separace je zobrazen na obrázku číslo 5. Obr. 5 Princip separace analytů u MEKC (OTSUKA & TERABE, 1998) Hlavní předností je pravoúhlý profil elektroosmotického toku na rozdíl od parabolického profilu hydrodynamického toku. Tato skutečnost přispívá k vyšší separační účinnosti metody na rozdíl od klasické chromatografie (KLOUDA, 2003). 24

25 3.8 Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Princip a využití Metoda využívá tzv. molekulově sítového efektu, který dle velikosti separuje unášené molekuly přes gel k detektoru. Čím je nabitá molekula analytu větší, tím je více zpomalována. Separace je provedena v kapilárách, které se před separací naplní roztokem gelu (KLOUDA, 2003). Gely, které se používají u CGE jsou buď vázané vodíkovými vazbami (agarosa), prokřížené (bis-polyakrylamid) nebo jsou to lineární polymerní roztoky (polyakrylamid, methylcelulosa). Stěny kapiláry jsou často před naplněním potaženy, aby separace složek směsi nebyla závislá na EOF, ale jen na elektroforetickém pohybu nabitých molekul. Separace tedy závisí zejména na porositě gelu, velikosti molekul analytu, poměru velikosti molekul a jejich náboje, dále na napětí, ph, iontové síle elektrolytu, délce a průměru kapiláry. Metoda se využívá i k separaci makromolekul, které mají stejný náboj, ale odlišnou velikost např. k separaci DNA (KRÁLOVÁ, 2008). 3.9 Elektroforéza pohyblivého rozhraní (MBE) Princip Moving boundary electrophoresis (MBE) je zvláštní elektroforetická technika, která může rovněž probíhat v kapilárním uspořádání. V kapiláře je vytvořeno rozhraní mezi dvěma elektrolyty. První elektrolyt obsahuje separovaný vzorek a druhý elektrolyt je tzv. vedoucím elektrolytem. Vedoucí iont z tohoto elektrolytu musí být vybrán tak, aby měl se separovanými ionty shodný náboj, ale vyšší mobilitu. Naopak protiiont z vedoucího elektrolytu musí mít znaménko opačné, aby mohl migrovat opačným směrem, tj. proti separovaným látkám, a zajistil tak elektroneutralitu systému. Po spuštění elektrického proudu se vedoucí iont začne pohybovat do kapiláry v koloně a za ním se začnou řadit zóny vzorku. Jednotlivé zóny vytváří mezi sebou, díky samozaostřovacímu efektu (viz kapitola Samozaostřovací efekt), ostrou hranici. Pořadí jednotlivých zón je dáno složením vzorku, složením vedoucího elektrolytu a rychlostmi pohybu daných složek ve vzorku. Počet látek v zónách se však od vedoucího elektrolytu směrem ke vzorku zvětšuje díky podmývání zón. Z toho vyplývá nevýhoda této metody odseparovat lze pouze první nejrychlejší zónu, která obsahuje nejrychlejší složku vzorku. Ostatní zóny již budou obsahovat, kromě svých složek, ještě složky 25

26 rychlejší, které budou touto zónou neustále procházet do svých vlastních zón (ŠIŠPEROVÁ, 2011) Kapilární izotachoforéza (CITP) Princip Kapilární izotachoforéza se využívá k analýze jednodušších směsí iontů např. v hnojivech, nápojích, půdě, vodě i vzorcích biologického původu (KLOUDA, 2003). Základní rozdíl CITP a elektroforézy je uveden v tabulce 2. Tab. 2 Základní rozdíly kapilární izotachoforézy a elektroforézy (KLOUDA, 2003) Kapilární izotachoforézy aplikace konstantního proudu rychlost pohybu zón je konstantní zóny na sebe navazují zóny se nemísí (samozaostřovací efekt) potenciálový spád zón se liší Elektroforézy aplikace konstantního napětí rychlost pohybu zón je různá zóny jsou odděleny zóny se mísí a rozšiřují (vliv difuze) potenciálový spád zón je rovnoměrný Metoda využívá aplikaci vzorku mezi tzv. vedoucí (Leading elektrolyte (LE)) a koncový elektrolyt (Terminating electrolyte (TE)). Po připojení stejnosměrného elektrického pole k systému se začnou jednotlivé ionty (kationty nebo anionty) pohybovat k opačně nabitým elektrodám a začnou se řadit podle svých pohyblivostí. Po určitém čase se dosáhne rovnovážného stavu, kdy se všechny ionty budou pohybovat stejnou elektroforetickou rychlostí, seřazené dle klesající pohyblivosti v sousedících zónách s ostrými rozhraními. Rychlost pohybu nabitých částic vzorku je dána rychlostí vedoucího aniontu nebo kationtu (KAŠIČKA, 1997). Protože má každá zóna v rovnovážném stavu jinou pohyblivost, musí se mezi zónami měnit i potenciálový gradient. To znamená, že fyzikální vlastnosti iontů v zónách jsou sice konstantní, ale na rozhraní zón se mění skokem (CHURÁČEK et al., 1990). Princip separace dvousložkového analytu u CITP jsem uvedla v obrázku číslo 6. Počáteční stav separace jsem označila časem t = 0. Následující separaci dvousložkového analytu pak časem t = t a t = 2t. 26

27 Obr. 6 Princip dělení dvou látek v CITP Dávkovaný vzorek obsahuje jednak směs iontů jednoho druhu náboje (anionty nebo kationty), které mají být odděleny, a jednak téměř libovolné protionty (opačně nabité ionty), které musí být přítomny z důvodu zachování elektroneutrality v zónách (KAŠIČKA, 1997). Je vhodné, aby vedoucí, separovaný i koncový elektrolyt obsahoval stejné protiionty. Na separaci závisí ph jednotlivých elektrolytů. Protiiont vedoucího elektrolytu se zvolí tak, aby měl pufrační kapacitu při daném ph separace. U koncového elektrolytu se protiiont volí většinou libovolně. Pokud separujeme kationty, vzorek se nadávkuje mezi vedoucí elektrolyt, který obsahuje kationty s vyšší elektroforetickou pohyblivostí, a koncový elektrolyt, jehož kationty mají pohyblivost nižší než jakýkoliv kationt vzorku. Na počátku separace je vedoucí elektrolyt obsažen v katodovém prostoru a v koloně. Koncový elektrolyt se nachází v prostoru anodovém. V případě separace aniontů je postup analogický (KLOUDA, 2003) Instrumentace Kapilára teflonová kapilára průměr: cca 0,5 mm délka: cca 50 cm Dávkování vzorku v katodovém nebo anodovém prostoru elektrodové prostory jsou ohraničeny fritou, aby nedošlo k proniknutí produktů elektrolýzy do kapiláry Detektor Existují dva typy detektorů, univerzální a specifický detektor. Odezva univerzálního detektoru je určena elektroforetickou pohyblivostí iontů v zóně. Mezi univerzální detektory patří vodivostní a teplotní detektor. Vodivostní detektor měří vodivost zóny, 27

28 která prochází detektorem. Čidlem u tohoto typu detektoru jsou dva platinové drátky, kdy platí, že napětí mezi drátky je úměrné gradientu potenciálu zóny. Teplotní detektor měří teplotu v daném místě kapiláry. Čím je v zóně vyšší potenciálový spád, tím vyšší je teplota zóny, jelikož v ní vzniká vyšší Jouleovo teplo. Odezva specifického detektoru je určena jinou vlastností látky v zóně např. absorpcí UV-záření u fotometrického detektoru Vyhodnocovací zařízení Vyhodnocovacím zařízením je počítač s příslušným softwarem. Záznam průběhu izotachoforézy zobrazuje izotachoforegram. Na obrázku je zobrazen izotachoforegram a způsob jeho vyhodnocování. Kvalitativní údaj poskytuje výška zóny h a kvantitativní údaj šířka zóny l. Čím je tedy zóna širší, tím je vyšší koncentrace detekované složky (KLOUDA, 2003). Na obrázku číslo 7 je zobrazen izotachoforegram. Obr. 7 Grafické zobrazení průběhu CITP (KLOUDA, 2003) Jevy provázející separaci Difúze Koncentrace látek na rozhranní mezi jednotlivými zónami se mění skokem, tzn. ve vlastních zónách je koncentrace látek přizpůsobená a v sousedních zónách je koncentrace látek nulová. Tímto stavem vzniká difuzní tok ve směru klesající koncentrace. Proti difúzi působí samozaostřovací efekt (BOČEK, 1993) Samozaostřovací efekt Všechny nabité částice se budou pohybovat v oddělených zónách, avšak stejnou rychlostí. U CITP se uplatňuje automatický děj samozaostřovací efekt. K dosažení rovnováhy je třeba, aby mělo elektrické pole v jednotlivých zónách různou intenzitu. Ze vztahu, kde rychlost se rovná součinu mobility a intenzity elektrického pole vyplývá, že má-li být rychlost stejná, musí systém v zónách s odlišnou mobilitou měnit intenzitu 28

29 elektrického pole (gradient potenciálu). To znamená, že iont, který vlivem větší rychlosti předběhne svou vlastní zónu, se dostane do zóny o menší intenzitě elektrického pole. Tím se sníží jeho rychlost, bude mít menší mobilitu oproti jiným iontům v nové zóně a vrátí se zpět do původní zóny. Naopak, pokud iont opustí vlivem difúze svou zónu a dostane se do zóny méně pohyblivých iontů, působí na něj větší gradient potenciálu a zvýšením hnací síly je popohnán zpět do své původní zóny (KRÁLOVÁ, 2008). Výsledkem difúze a samozaostřovacího efektu je to, že má rozhraní mezi izotachoforetickými zónami podélný rozměr. Podélný rozměr zón se nazývá šířka rozhraní, kterou lze ovlivnit např. koncentrací elektrolytů a proudem (BOČEK et al., 1987) Gravitace Vlivem gravitace dochází k proudění elektrolytu, ale také k deformaci izotachoforetických zón a rozhraní mezi nimi. Nežádoucí vliv lze nejčastěji potlačit separací např. v gelech, inertních nosičích nebo kapilárách. V tenké kapiláře jsou zóny stabilizovány efektem stěny. Podmínkou však je nižší hustota analytu než vedoucího elektrolytu. V opačném případě se vlivem gravitace těžší vzorek propadá kapilárou a dojde k znehodnocení analýzy (BOČEK, 1993) Jouleovo teplo Po spuštění elektrického proudu se v kapiláře začne vytvářet Jouleovo teplo. Způsobuje odpařování rozpouštědla a roztok z okolí elektrod začne vzlínat. Jedná se o knotový efekt. Teplem se zahřeje i nosič se separovanou látkou, která se účinkem tepla může termicky změnit (BOČEK, 1993). Jouleovo teplo má při izotachoforetické separaci vliv na: velikost hnacího proudu, iontovou pohyblivost vzhledem k teplotní závislosti iontů, vznik teplotních gradientů vlivem tepla (kvůli nim pak vznikají teplotní a jiné změny fyzikálně-chemických vlastností elektrolytu např. změny ph a vodivosti). Dále má vliv na disociaci slabých kyselin a zásad, protože ovlivňuje efektivní pohyblivost látek, a na zvýšení teploty elektrolytu, což může vyústit k poškození termolabilních složek vzorků (při denaturaci bílkovin). Působení Jouleova tepla lze omezit chlazením. Účinnost chlazení je závislá na velikosti plochy, která odvádí teplo, a na tepelné vodivosti stěny kapiláry. V současné době se pro CITP používají kapiláry kruhového průřezu vyrobené např. z teflonu. Ač je kruhový průřez méně vhodný a má horší tepelnou vodivost, je 29

30 kruhová kapilára chemicky i mechanicky velmi odolná a technologicky snadno vyrobitelná (BOČEK et al., 1987) Praktické využití CITP V potravinářství se CITP aplikuje při analýze konzervačních látek (kyseliny sorbové, propionové, benzoové) v nápojích a konzervovaných potravinách. Dále při analýze dochucovadel a přirozeně se vyskytujících látek v potravinách (zejména organických kyselin). Příkladem může být např. stanovení kyseliny askorbové (v citrusových koncentrátech), kyseliny mléčné (v láku z kysaného zelí), kyseliny mravenčí (v kávě), kyseliny octové (ve víně). Další možné, potravinářsky významné analýzy s využitím CITP jsou např. stanovení histaminu v rybách a stanovení toxických látek v potravinách. CITP se využívá také při analýze tělních tekutin, léčiv, složek životního prostředí, siláží, krmných směsí a průmyslových vzorků (BOČEK et al., 1987) Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Princip Metoda umožňuje dělit amfolytické látky na základě distribuce kladných a záporných nábojů v jejich molekulách, tj. dle jejich izoelektrických bodů pi (KAŠIČKA, 1997). Mezi amfolyty patří aminokyseliny, peptidy, proteiny, některá barviva a pesticidy. Tyto látky se vyskytují např. v biologických materiálech a jejich metabolických cestách. Dále jsou součástí polutantů životního prostředí a v potravinářském průmyslu je najdeme v přídatných látkách (POSPÍCHAL & GLOVINOVÁ, 2001). Amfolyty obsahují kladnou i zápornou skupinu. Jejich molekuly mohou být ve formě kladné, neutrální i záporné částice. Na podobu molekuly má vliv ph prostředí. Pro amfolyt v elektricky neutrální formě platí, že ph prostředí je rovno isoelektrickému bodu pi příslušného amfolytu. Pokud je ph prostředí vyšší než pi, převládá záporná forma amfolytu. V případě nižšího ph oproti pi převláda kladná forma amfolytu (KLOUDA, 2003). Dělené látky migrují v prostředí gradientu ph, který se v kapiláře vytvoří pomocí pufrů obsahujících amfolyty. Kyselé skupiny se budou v elektrickém poli migrovat směrem k anodě a bazické skupiny směrem ke katodě (KRÁLOVÁ, 2008). Elektromigrace probíhá do té části separačního prostředí, kde se ph rovná jejich pi. 30

31 Následuje ustálení fokusované zóny, kde molekuly ztratí náboj a přestanou se pohybovat (KAŠIČKA, 1997). V tomto okamžiku vytvoří molekuly ostrou zónu bez ohledu na to, kde se nacházely na začátku pokusu (CHURÁČEK et al., 1990). Princip separace dvousložkového analytu u CIEF jsem uvedla v obrázku číslo 8. Počáteční stav separace jsem označila časem t = 0. Následující separaci dvousložkového analytu pak časem t = t a t = 2t. Obr. 8 Princip separace dvousložkového analytu u CIEF Pokud se vlivem difuze dostanou molekuly do sousedních zón, získají opačný náboj a začnou se pohybovat zpět do oblasti svého pi. Molekuly stejně nabité jsou tedy v kapiláře v zaostřené (fokusované) zóně (KRÁLOVÁ, 2008). Mobilizace jednotlivých zón k detektoru se provádí buď hydrodynamickým tokem, který se vyvolá podtlakem či přetlakem u konců kapiláry, nebo tzv. elektroelucí. Její princip je založen na vyvolání změny složení katolytu (elektrodový roztok u katody) nebo anolytu (elektrodový roztok u anody) náhradou kyseliny bází nebo přídavkem soli, které způsobí katodický nebo anodický pohyb ph gradientu a tím i pohyb fokusovaných zón k detektoru (KAŠIČKA, 1997). Nevýhodou je vliv EOF na pohyb amfolytu kapilárou, který jej zrychluje. Ten se dá eliminovat tím, že stěnu kapiláry chemicky potáhneme a zamezíme tím jednak vlivu EOF a jednak adsorpci analytu na stěnu kapiláry Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů (CAF-IEF) Princip Separační metoda CAF-IEF (Carrier ampholyte free-isoelectric focusing) spojuje výhodné vlastnosti CITP a CIEF. Metoda byla navržena a ověřena v publikovaných pracích POSPÍCHAL et al. (1993), DEML & POSPÍCHAL (1994) a POSPÍCHAL et al. (1995). Metoda CAF-IEF, stejně jako CIEF, zvyšuje koncentrace amfolytů, odstraňuje 31

32 přebytek neamfolytů, separuje látky podle jejich pi, má většinou dostatečný objem separovaného vzorku a zóny po ukončení separace neopouští separační kapiláru. Stejně jako CITP tato metoda vytváří ostře ohraničené zóny o stejném, tj. konstantním složení a koncentraci v celém objemu každé zóny. Každá ze zón obsahuje mimo jedné složky vzorku jen jednoduchý pomocný elektrolyt. Metoda CAF-IEF využívá elektricky regulovanou oboustranně modifikovanou iontovou matrici. Kolona je naplněna elektrolytem s rozpuštěným vzorkem. Po spuštění proudu a vlivem modifikačních toků dochází v koloně ke vzniku ostrého skoku ph, do kterého jsou amfolyty fokusovány. V průběhu vlastní fokusace lze měnit nejen velikost tohoto skoku ph, ale i rychlost a směr jeho pohybu. Lze tak dosáhnout výborných separačních vlastností (DEML & POSPÍCHAL, 1994) Praktická aplikace CAF-IEF V práci DEML et al. (1995) poukazují na to, že jednou z možných užití metody CAF-IEF je kontinuální dávkovací proces, při němž je vzorek kontinuálně dávkován do separačního prostoru a zde je selektivně předkoncentrován vhodnou volbou ph pracovních elektrolytů. V práci POSPÍCHAL & GLOVINOVÁ (2001) je poukázáno na efektivnost tohoto kontinuálního dávkovacího procesu. Na obrázku číslo 9 je zobrazeno schéma toku iontů v koloně, tvořících neutralizační rozhraní v základním elektrolytu KCl. Na pravé straně je katoda, na levé anoda. Obr. 9 Princip metody CAF-IEF (POSPÍCHAL et al. 1995) Na obrázku číslo 10 je zobrazeno schéma toků iontů na neutralizačním rozhraní v pufrovaném elektrolytovém systému, který je vhodný k použití v komerčních přístrojích, kde není ph elektricky regulováno. 32

33 Obr. 10 Schéma toků iontů na neutralizačním rozhraní (GLOVINOVÁ & POSPÍCHAL, 2013) Selektivní koncentrační charakter neutralizačního rozhraní umožňuje separaci a mikropreparaci trapování minoritních amfolytů ze směsi. Trapování lze dosáhnout kontinuálním dávkováním směsi analytů do kolony, kdy je tato směs rozpuštěna v jednom nebo obou částech fokusačního elektrolytu. Pokud se zvolí okrajové hodnoty ph, vytvoří se v koloně stabilní neutralizační rozhraní. Zde dojde k selektivnímu zachycení žádané látky, ostatní analyty se pak do kolony vůbec nedostanou nebo projdou přes kolonu a rozhraní do elektrodových komor na opačné straně. Množství zachyceného analytu na rozhraní v průběhu fokusace stoupá. Množství akumulované látky je úměrné době dávkování. Jelikož je koncentrace minoritního amfolytu po analýze řádově vyšší, lze tento postup využít pro selektivní předkoncentraci amfolytu, který pochází z málo koncentrovaných směsí, kde ostatní látky jsou ve velkém nadbytku. Takové rozložení látek se nachází v biologické matrici (GLOVINOVÁ & POSPÍCHAL, 2001). Na obrázku číslo 11 je zobrazen princip trapování. Směs amfolytů se nachází v levé části kolony. Z této směsi je však jen jeden amfolyt (vhodnou volbou okrajového ph) zachycen v koloně. Druhý amfolyt odchází do waste zóny. Nejspodnější část obrázku zobrazuje časový průběh v t = 0 minut, prostřední část t = 150 minut a horní část obrázku t = 900 minut. Obr. 11 Princip trapování (DEML & POSPÍCHAL, 1994) 33

34 Při použití kontinuálního dávkovacího systému je množství zakoncentrovaného analytu (amfolytu) funkcí dávkovacího času. Amfolyt je na rozhraní fokusován do stabilní zóny o ph = pi a z této zóny, díky oboustranně zaostřujícímu efektu, nemůže uniknout (GLOVINOVÁ & POSPÍCHAL, 2001). Pro zakoncentrování kovů alkalických zemin (Ca, Ba, Sr a Mg) byl v práci ŠIŠPEROVÁ et al. (2011) vyvinut nový typ rozhraní ligand step gradient. Jeho princip spočívá v tom, že přídavkem komplexačního činidla do elektrolytu je možno dosáhnout fokusace kovů ve formě nabitých a neutrálních komplexů. V kyselém prostředí převažují kladně nabité kationty volných kovů či komplexů, které migrují směrem k rozhraní. V alkalické prostředí převažují záporně nabité aniontové komplexy, které rovněž migrují směrem k rozhraní. Ve vlastní fokusované zóně je kov přítomen ve formě komplexů nenabitých, tj. elektricky neutrálních. Na základě těchto teoretických předpokladů bylo možné uskutečnit fokusaci mědi v mnou navrženém a experimentálně ověřeném elektrolytovém systému. 34

35 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Použité přístrojové vybavení CS Isotachophoretic Analyser Měření probíhalo na klasickém komerčním izotachoforetickém analyzátoru (CS Isotachophoretic Analyser, Villa Labeco, Slovensko), určeného přímo pro chemickou analýzu látek ionogenní povahy. Přístroj byl vyroben ve Spišské Nové Vsi. Měřicí zařízení se skládá z předseparační a analytické kolony, nástřikového zařízení, dělicího bloku, dvou vodivostních detektorů a jednoho UV detektoru. Analytická kolona je doplněna o UV spektrofotometrický detektor s vláknovou optikou firmy Knauer (Rakousko). Popsané přístrojové vybavení a jeho použití je podrobně uvedeno v kapitole Postup analytické procedury Počítačové zařízení Jako přídatné zařízení byl napojen počítač. Pro sběr dat byl použit IBM PC 486 personální počítač s CSW softwarem. Vyhodnocování dat probíhalo v systému Clarity (chromatografická datová stanice) od firmy Labicom s.r.o. Na obrázku číslo 20 je zobrazeno použité přístrojové vybavení Chemikálie Všechny chemikálie byly p.a. čistoty a pocházely od firmy Sigma-Aldrich spol. s.r.o. 4.2 Vývoj metodiky Výběr fokusačního elektrolytu Podmínky pro výběr fokusačního elektrolytu Výběr fokusačního elektrolytu byl podřízen následujícím požadavkům: A./ Elektrolyty musí splňovat podmínky stojícího neutralizačního rozhraní. B./ Komplexující iont musí vytvářet viditelné, tedy barevné komplexy, aby byla umožněna případná fotometrická detekce. 35

36 C./ Konstanty stability komplexů ve fokusačním elektrolytu musí být takové, aby se v zásaditém prostředí tvořily aniontové komplexy a v kyselém komplexy kationtové, čímž je zároveň splněna podmínka fokusace. D./ Komplexační činidlo, které je součástí fokusačního elektrolytu, nesmí obsahovat nečistoty, které by ireverzibilně vázaly stanovovanou látku Experimentální řešení V této kapitole jsou uvedena experimentálně zjištěná řešení výše uvedených podmínek. ad A./ Podmínka stojícího neutralizačního rozhraní byla splněna použitím CH 3 COONH 4 vytitrovaného buď NH 4 OH nebo CH 3 COOH do požadovaného ph. ad B. + D./ Podmínku vytváření viditelných komplexů s mědí splňují obecně metalochromní indikátory: xylenolová oranž (XO), methylthymolová modř (MTM), murexid, eriochromová čerň T, pyrogalová červeň (PGČ), bromkresolový purpur (BKP) a 4-(2- pyridylazo)rezorcinol (PAR). Experimentem se zjistilo, že indikátory XO a MTM obsahovaly značné množství nečistot, které se ireverzibilně vázaly na měď. Indikátory murexid a eriochromová čerň T nebyly dostatečně stabilní. PGČ neposkytovala dostatečně intenzivní zbarvení. Nejvhodnější, z pohledu použitých kompletačních činidel, byl PAR, který v neutrálním a alkalickém prostředí poskytoval intenzivně červené komplexy. Jistou nevýhodou se však ukázala být nízká rozpustnost této látky a jejích komplexů v kyselém prostředí, což vedlo až ke srážení komplexů přímo v kapiláře. Proto bylo nutné přidat další bezbarvé komplexační činidlo citrátový iont. Ten vytvářel komplex, který již zajišťoval dostatečnou rozpustnost při přijatelném snížení intenzity zbarvení komplexu. BKP ve směsi s PARem se ukázala jako vhodné činidlo k identifikaci neutralizačního rozhraní. Optimalizace výběru kompletačního činidla byla prováděna přímým pozorováním migrujících zón v kapiláře. ad C./ Zajištění podmínek stability komplexů vychází z podmínek toků na rozhraní v ligandovém skoku (Ligand step gradient (LSG)). Na obrázku číslo 12 je zobrazeno schéma toků na rozhraní LSG. Jak je z obrázku patrné, OH - a H + ionty jsou na rozhraní neutralizovány a společně vytváří vodu. Jakmile dojde k vyrovnání obou iontů, rozhraní se zastaví. Acetátové, amoniové a citrát-ligandové ionty rozhraní vždy překračují. V alkalické prostředí záporně nabité citrátové ionty komplexují měď. Pokud tedy 36

37 vstoupí nenabitý komplex mědi do této oblasti, dojde k deprotonizaci, udělení záporného náboje a k zpětné migraci směrem k rozhraní (obecně značeno jako MeCit - ). Naopak, pokud nenabitý komplex mědi vstoupí do kyselé oblasti, rozloží se a vytvoří se kladně nabitý iont. Ten pak opět putuje směrem k neutrálnímu rozhraní. Na rozhraní LSG se tedy komplexy mědi kumulují v zóně nenabitých komplexů (obecně značeno jako MeHCit 0 ). Obr. 12 Schéma toků iontů na rozhraní LSG (GLOVINOVÁ & POSPÍCHAL, 2013) Jelikož musela být měď kontinuálně dávkována, byla kromě samotného nástřiku přítomna také v zásobníku TE společně s CH 3 COOH. Po splnění všech výše uvedených požadavků bylo navrhnuto finální složení elektrolytového systému. Tabulka číslo 3 zobrazuje složení LE a TE. Tab. 3 Složení LE a TE M CH 3 COONH M NH 4 OH Složení vedoucího elektrolytu (LE) M BKP M PAR M C 6 H 17 N 3 O 7 (citrát amonný) ph vedoucího elektrolytu (LE) 8, M Cu(CH 3 COO) 2 Složení koncového elektrolytu (TE) M CH 3 COOH ph koncového elektrolytu (TE) 3,61 Všechna měření musela být provedena za optimálního elektrickém proudu. Jednak se v něm zóny v kapiláře musely pohybovat směrem k detektoru a jednak musely být 37

38 rozpoznatelné ke kvantifikaci. Dále se roztok uvnitř kapiláry vlivem Joulova tepla nesměl příliš zahřívat, aby nevznikaly bublinky a nevzniklo přepětí, které by znemožnilo měření. Ukázalo se, že nejvhodnějším proudem pro daný elektrolytový systém je 350 μa Nalezení optimálního dávkovacího elektrolytu (DE) pro akumulaci zón mědi Podmínky měření Separace probíhala za pokojové teploty (25 C) v teflonové kapiláře o průměru 0,8 mm a délce 90 mm. Vzorek byl dávkován manuálně injekční stříkačkou do kohoutu. Objem dávkovaného vzorku byl 30 μl. Pro elektrolytový systém byl nastaven konstantní proud 350 μa. Napětí v systému se pohybovalo v rozmezí 2 4 kv. Separace probíhala v izotachoforetickém analyzátoru složeného pouze z jedné (separační) kolony, nástřikového zařízení, dělicího bloku a vodivostního detektoru Experimentální měření Po vyladění elektrolytového systému byla zahájena akumulace mědi. Pro vlastní akumulaci bylo nutné v kapiláře vytvořit takové rozhraní pomocí řízení toků iontů H + a OH -, aby za určitou reálnou dobu byla naakumulována dostatečně dlouhá zóna mědi. Do zásobníku pro TE a do místa nástřiku vzorku byla aplikována směs M Cu(CH 3 COO) 2 v M CH 3 COOH (dohromady značeno jako DE). Po spuštění elektrického proudu (350 μa) se v elektrickém poli začala postupně pohybovat zóna mědi směrem k detektoru. Na obrázku číslo 13 je zobrazena migrace zóny mědi v kapiláře. Obr. 13 Migrace zóny mědi v kapiláře Nejprve byla analýza provedena bez přídavku CH 3 COONH 4 do TE. Poté byly provedeny analýzy s přídavkem M, M, M a M CH 3 COONH 4 38

39 do roztoku TE. Jako LE byl použit roztok o tomto složení: M CH 3 COONH 4, M NH 4 OH, M BKP, M PAR a M citrát amonný. Naměřená data jsou uvedeny v tabulce číslo 4. Ke každému přídavku CH 3 COONH 4 byla provedena tři opakování. Tab. 4 Přídavky CH 3 COONH 4 výsledky měření c CH 3 COONH 4 Počet měření Začátek zóny mědi [min] Konec zóny mědi [min] Délka zóny mědi [min] 0 M 1. 16,12 17,68 1, ,26 18,16 1, ,70 18,29 1,59 průměr 16,36 18,04 1,68 směrodatná odchylka 0,25 0,26 0, M 1. 18,21 21,97 3, ,15 22,06 3, ,24 21,97 3,73 průměr 18,20 22,00 3,8 směrodatná odchylka 0,04 0,04 0, M 1. 26,70 33,59 6, ,04 32,38 6, ,88 37,03 9,15 průměr 26,87 34,33 7,46 směrodatná odchylka 0,76 1,99 1, M 1. 31,25 41,02 9, ,54 40,82 9, ,01 40,99 8,98 průměr 31,60 40,94 9,34 směrodatná odchylka 0,31 0,09 0, M 1. 38,69 47,21 8, ,64 50,17 11, ,79 54,00 12,21 průměr 39,71 50,46 10,75 směrodatná odchylka 1,47 2,78 1,60 39

40 Na obrázku číslo 14 je pro názornost zobrazen záznam průběhu 4 analýz. Obr. 14 Záznam čtyř analýz akumulace délky zóny mědi Na obrázku číslo 15 je zobrazena závislost délky zóny mědi na přídavku CH 3 COONH 4. Vzniklá závislost se proložila polynomem druhého stupně. Jak je z grafu patrné, s rostoucí koncentrací CH 3 COONH 4 se délka zóny mědi prodlužovala. Čím více se zpožďovalo rozhranní, tím více narůstala délka zóny mědi. Bez přídavku CH 3 COONH 4 trvala průměrná analýza 18,04 minut. S přídavkem M CH 3 COONH 4 byla průměrná délka analýzy 22,00 minut, s přídavkem M CH 3 COONH 4 34,33 minut, s přídavkem M CH 3 COONH 4 40,94 minut a s přídavkem M CH 3 COONH 4 50,46 minut. Po zjištění závislosti byl proveden výpočet redukované délky zóny (RDZ) vůči rychlosti pohybu zóny v kapiláře, aby se zjistilo, jak konkrétní přídavek určité koncentrace CH 3 COONH 4 umožňuje dosažení vyššího množství zafokusované mědi. 40

41 Délka zóny mědi [min] Závislost délky zóny mědi na koncentraci CH 3 COONH 4 y = -5E+06x x + 1,9926 R² = 0, ,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 c CH 3 COONH 4 Obr. 15 Grafická závislost délky zóny mědi na koncentraci CH 3 COONH 4 Data uvedená v tabulce číslo 5 jsou brána z průměrných hodnot časů (t 0, t 1 ) a délky zóny mědi zobrazených v tabulce číslo 4. V tabulce číslo 5 jsou zobrazena data pro výpočet RDZ, která se vypočítá jako poměr délky zóny mědi ku poměru časů t 1 /t 0. První měření, tj. bez přídavku CH 3 COONH 4 do roztoku TE, bylo bráno jako jednotkové. Tab. 5 Výpočet redukované délky zóny c CH 3 COONH 4 t 0 [min] t 1 [min] poměr (t 1 /t 0 ) délka zóny Rdz [min] [min] 0 M ,68 1, M 18,20 1,11 3,80 3, M 26,87 1,64 7,46 4,54 16, M 31,60 1,93 9,34 4, M 39,71 2,43 10,75 4,43 Čas t 0 vyjadřuje nejrychleji se pohybující izotachoforetické rozhraní a čas t 1 nejpomaleji se pohybující rozhraní. Hodnota poměru časů (t 1 /t 0 ) 2,43 u přídavku M CH 3 COONH 4 se sice v kapiláře jeví jako nejdelší zóna, ale ve skutečnosti je 2,43krát pomalejší. Naakumulovaná zóna mědi je fyzicky kratší a čas průběhu zóny mědi v kapiláře je detekován jako delší. Skutečný čas délky zóny se tedy musí přepočítat na skutečnou délku zóny. Ten se vypočítá pomocí RDZ, která vyjadřuje poměr mezi délkou zóny mědi a poměrem časů (t 1 /t 0 ). Na obrázku číslo 16 je zobrazena grafická závislost RDZ mědi na koncentraci CH 3 COONH 4. Grafickou závislost jsem opět proložila polynomem druhého stupně. Prokázala jsem, že přídavek M 41

42 RDZ mědi [min] CH 3 COONH 4 vede ke zpomalení izotachoforetické rychlosti, avšak dochází k podmytí zón mědi izotachoforéza přechází do módu označovaného jako moving boundary electrophoresis Závislost RDZ mědi na koncentraci CH 3 COONH 4 y = -6E+06x x + 2,0989 R² = 0, ,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 c CH 3 COONH 4 Obr. 16 Grafická závislost RDZ mědi na koncentraci CH 3 COONH 4 Princip putování zóny mědi mezi LE a TE při CITP a MBE jsem uvedla v obrázku číslo 17. Rozdíl mezi metodou CITP a MBE je ten, že u CITP se nástřik jakékoliv koncentrace mědi nakonec vyrovná (přizpůsobí) koncentraci LE. Obr. 17 Rozdíl mezi CITP a MBE Přídavek M CH 3 COONH 4 však již pozitivní vliv neměl a dávkování M CH 3 COONH 4 již ionty mědi dokonce zastavilo a nebylo tak vůbec možné je v reálném čase v kapiláře sledovat (ani po 120 minutách analýzy). Z grafu na obrázku číslo 16 tedy nelze vyčíst výrazné optimum přídavku CH 3 COONH 4 pro akumulaci mědi. Nelze z toho ovšem jednoduše vyvodit, že by přídavek CH 3 COONH 4 neměl vliv na fokusaci komplexů kovů v jakýchkoliv elektrolytických systémech, nebo že by všechny kovy vytvářely s přídavkem CH 3 COONH 4 stejné (koncentračně a homogenně) zóny. 42

43 Závěrem se dá říci, že vzhledem k složitosti vznikajících komplexů mědi nelze jednoznačné říci, která kombinace elektrolytu je optimální pro tento způsob naakumulování zón mědi. Jak je uvedeno i v článku Analysis of amino acids by combination of carrier ampholyte-free IEF with ITP (GLOVINOVA et al., 2007), v případě analýzy jiných vzorků, jako jsou např. aminokyseliny, které jsou svojí strukturou mnohem jednoduššími sloučeninami než vytvářené komplexy mědi, by se dalo očekávat, že vyzkoušený systém přídavků různých koncentrací CH 3 COONH 4 by vedl ke zjištění optima pro fokusaci. Právě z tohoto důvodu jsem se tento elektrolytický systém pokusila navrhnout a experimentálně ověřit Výběr analytického elektrolytu Experimentální řešení výběru analytického elektrolytu (LE 1 ) Při výběru analytického elektrolytu (LE 1 ) do analytické kolony jsem postupovala následovně: A./ Volba stejného elektrolytu jako v předseparační koloně, která obsahovala LE 2, nebyla vhodná. Díky PARu totiž vznikaly komplexy záporně nabité, tudíž se pohybovaly opačným směrem od analytického detektoru. Aniontová analýza nebyla možná z důvodu vznikajícího CO 2, který způsoboval technické problémy (byla by nutná práce v inertní atmosféře). B./ Přídavek SPADNS do LE 1 se ukázal jako nejvhodnějším řešením. SPADNS vytváří v kyselém prostředí stabilní rozpustné komplexy s mědí. Je tak zajištěna homogenita migrující zóny. Komplexy mědi jsou díky této látce barevné a je tak umožněno pozorování pohybující se zóny již v samotné kapiláře. LE 1 slouží jako analytický elektrolyt a LE 2 jako elektrolyt fokusační. V tabulce číslo 6 je zobrazeno konečné složení elektrolytického systému s 2 vedoucími elektrolyty. Tab. 6 Složení LE 1, LE 2 a TE M CH 3 COOH Složení vedoucího elektrolytu (LE 1 ) M CH 3 COONH M SPADNS ph vedoucího elektrolytu (LE 1 ) 5,34 43

44 M CH 3 COONH M NH 4 OH Složení vedoucího elektrolytu (LE 2 ) M BKP M PAR M C 6 H 17 N 3 O 7 (citrát amonný) ph vedoucího elektrolytu (LE 2 ) 8,93 Složení koncového elektrolytu (TE) M CH 3 COOH ph koncového elektrolytu (TE) 3,61 Na obrázku číslo 18 a 19 jsou pro názornost ve zkumavkách zobrazena zbarvení jednotlivých elektrolytů bez a s přídavkem mědi. Pro lépe viditelný rozdíl ve zkumavkách byl u LE 2 jako indikátor použit pouze PAR (nikoliv BKP). V samotné analýze však BKP byl použit. Obr. 18 LE 2 bez/s přídavkem mědi Obr. 19 LE 1 bez/s přídavkem mědi 44

45 Všechna měření musela být provedena opět za optimálního elektrickém proudu. Ukázalo se, že nejvhodnějším proudem pro předseparační kolonu je 250 μa a pro kolonu analytickou 75 μa Postup analytické procedury Podmínky měření Separace probíhala za pokojové teploty (25 C) na izotachoforetickém analyzátoru, složeném ze dvou kolon (předseparační a analytické), nástřikového zařízení, dělicího bloku, dvou vodivostních detektorů a jednoto UV detektoru, který však v analýze nebyl použit. Délka teflonové kapiláry v předseparační koloně byla 150 mm, šířka 0,8 mm. Délka teflonové kapiláry v analytické koloně byla 160 mm, šířka 0,3 mm. Vzorek byl dávkován manuálně injekční stříkačkou do kohoutu. Objem dávkovaného vzorku byl 30 μl. Pro elektrolytový systém byl nastaven konstantní proud 250 μa pro předseparační kolonu a 75 μa pro kolonu analytickou. Kompletní přístrojové vybavení je zobrazeno na obrázku číslo Obr. 20 CS Isotachophoretic Analyser 1...řídící jednotka 2...konduktometrická jed. 3...zdroj vysokého napětí 4...zásobník pro TE 5...zásobník pro LE zásobník pro LE nástřik vzorku 8...předseparační kolona 9...analytická kolona 10...UV-VIS detektor 11...cela vodivostního detekt PC-vybavení 45