Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Imunoelektroforéza Obvykle dvourozměrná elektroforéza na agarózových gelech V prvním rozměru probíhá dělení podle rozdílných pohyblivostí analytů v elektrickém poli, tj. zónová elektroforéza V druhém rozměru se uplatňuje imunoprecipitační reakce, interakce protilátka/antigen Příklady aplikace techniky: Zjišťování čistoty proteinů Analýza složení směsí proteinů Určení přítomnosti protilátky proti určitému antigenu v antiséru Kontrola identity/neidentity dvou antigenů Používá se řada různých metod

3 1. Imunoelektroforetická analýza (Immunoelectrophoretic analysis) Směs proteinů (např. sérum) je rozdělena elektroforézou na agarózovém gelu Pak je mechanicky vytvořen kanálek paralelně ke směru migrace proteinů Kanálek je naplněna směsí protilátek proti látkám děleným elektroforézou Protilátky postupují difúzí k elektroforézou rozdělenému séru a vysráží se za vzniku komplexu protilátka/antigen Komplexy jsou vizualizovány jako oblouky sraženin charakteristických tvarů, šířky a vzdáleností od místa, kde se nachází antigen

4

5 2. Cross-over elektroforéza (Cross-over electrophoresis) Tato technika využívá skutečnosti, že během elektroforézy za ph=8.2 migrují gamaglobuliny (zahrnují většinu protilátek) ke katodě, zatímco ostatní proteiny obvykle k anodě Protilátky se pohybují proti antigenům a pokud v místě setkání dojde ke specifické interakci a vytvoří se komplex protilátka/antigen, je pozorována sraženina ve formě oblouku

6 3. Rocket imunoelektroforéza (Immunoelectrodiffusion, rocket immunoelectrophoresis) Imunoelektroforéza je modifikována tak, aby umožnila kvantifikaci antigenu Dělení probíhá na agarózovém gelu obsahujícím protilátku Při aplikaci elektrického pole se většina antigenů pohybuje směrem k anodě a většina protilátek ke katodě, tak jako v případě cross-over techniky V okamžiku, kdy se setká odpovídající antigen s protilátkou, vytvoří se komplex Při přebytku protilátky nebo antigenu je tento komplex rozpustný, ale pokud se vzájemné koncentrace změní tak, že jsou blízké ekvivalenci, dojde ke vzniku precipitátu ve tvaru rakety Další množství migrujícího antigenu vede k rozpuštění sraženiny a k pohybu rakety směrem k anodě tak dlouho, pokud je elektroforeticky dodáván další antigen, jakmile již není k dispozici antigen, pohyb sraženiny se zastaví Plocha pod raketou je úměrná množství antigenu

7 Agarose gel with antibody

8 4. Fused rocket imunoelektroforéza (Fused rocket immunoelectrophoresis) Používá se např. k zjištění přítomnosti antigenu ve frakcích z kapalinové chromatografie

9 5. Dvourozměrná imunoelektroforéza (Two-dimensional immunoelectrophoresis, Crossed immunoelectrophoresis) Modifikace rocket imunoelektroforézy Antigeny jsou děleny v prvním rozměru elektroforézou na agarózovém gelu Následně jsou podrobeny další elektroforéze na gelu obsahujícím protiláky ve směru kolmém vzhledem k první elektroforéze

10 Tandemová dvourozměrná imunoelektroforéza (Tandem crossed immunoelectrophoresis) Použití pro zjištění identity antigenů

11

12 Cross-line imunoelektroforéza (Cross-line immunoelectrophoresis)

13 Izoelektrická fokusace Princip metody spočívá ve faktu, že amfoterní makromolekuly vykazují nulovou pohyblivost v elektrickém poli v jejich izoelektrickém bodě-pi a mají tendenci se koncentrovat do úzké zóny v místech, kde je hodnota ph okolního média rovna jejich izoelektrickému bodu Proces izoelektrické fokusace probíhá ve dvou krocích: 1. Vznik stabilního gradientu ph s tím, že hodnota ph vzrůstá od anody ke katodě 2. Amfoterní makromolekuly analytů se pohybují do zón ph odpovídající jejich pi s následným dosažením stabilního stavu, anlyty jsou v zónách značně koncentrovány a vliv difúze je zásadně omezen Lze dělit proteiny lišící se hodnotou pi o 0,0025 Katoda je ponořena do roztoku silné báze a anoda do roztoku silné kyseliny, tím je zabezpečeno, že proteiny ponesou v blízkosti katody záporný náboj a v blízkosti anody kladný náboj Vzorek proteinů může být nanesen kamkoli mezi elektrody a jednotlivé proteiny se budou pohybovat do zón s odpovídajícími hodnotami pi

14 Gradient ph je vytvořen aplikováním stejnosměrného elektrického pole na směs amfoterních látek, amfolytů, které musí splňovat podmínku, že pi hodnoty složek amfolytu jsou si blízké a pokrývají určitou vybranou škálu hodnot ph, to je podmínkou pro vznik spojitého ph gradientu ph gradient je stabilizován antikonvekčním médiem matricí gelu, hustotním gradientem Detekce dělených makromolekul je založena na běžných postupech, barvení a UV absorpci

15 Při elektrofokusaci je počáteční proud I vysoký a postupně klesá v průběhu formování ph gradientu. Obvykle se pracuje za konstantního výkonu P, který je kompatibilní s chladící kapacitou elektrofokusačního systému, tzn. že v průběhu analýzy je postupně zvyšováno napětí, tak jak klesá proud. V okamžiku vytvoření gradientu ph mohou vzniknout zóny s vysokým odporem, to by mohlo mít za následek lokální přehřátí, pokud by napětí bylo příliš vysoké. Proto se nastavuje maximální povolené napětí, při jeho dosažení se automaticky sníží výkon systému.

16 Užívané amfolyty Složité směsi homologických polyamino polykarboxylových nebo polysulfonových kyselin s blízkými hodnotami pi a pk a Pokrývají vymezené oblasti ph, např , atd. Vykazují dobrou rozpustnost ve vodě a nízkou absorpci při 280 nm Pufrační kapacita a vodivost se liší v závislosti na ph (nežádoucí efekt), je největší při extrémních hodnotách ph a nejnižší při ph 5-8 Nejrušivější vlivy na separaci analytů: 1.Změny vodivosti podél separačního média 2.Změny koncentrací složek amfolytu 3.Změny viskozity 4.Změny pufrační kapacity 5.Nelinearita gradientu ph 6.Nestabilita gradientu ph (v závislosti na čase), drift gradientu Relativní molekulové hmotnosti amfolytů pokývají oblast od ~300 do 1000 (malý podíl amfolytů do 5000)

17 1. Izoelekrická fokusace na polyakrylamidovém gelu Nejrozšířenější verze metody Amfolyty (2% w/w) jsou zabudovány do matrice gelu před polymerací Tyčovité i deskové gely se užívají pro izoelektrickou fokusaci Klíčovou úlohu má koncentrace gelu, je volena tak, aby vliv sítového efektu byl minimalizován 3.75% gel s 3.33% zesítěním je vhodný pro izoelekrickou fokusaci proteinů do relativní molekulové hmotnosti Pro proteiny s nižší molekulovou hmotností se používají koncentrovanější gely, které jsou mechanicky odolnější a poskytují ostřejší zóny dělených makromolekul

18 2. Izoelekrická fokusace na agarózovém gelu Vhodná metoda pro izoelektrickou fokusaci velkých molekul nad ~ Da, např. IgM Nevýhodou agarózového gelu je skutečnost, že ve srovnání s polyakrylamidovým gelem vykazuje obvykle větší elektroosmotický tok, jenž vede k nestabilitě gradientu ph Elektroosmotický tok na agarózovém gelu je zapříčiněn přítomností limitovaného množství negativně nabitých funkčních skupin přítomných na gelu Elektroosmotický tok je ovlivněn ph hodnotou prostředí a je přímo závislý na intenzitě elektrického pole, ta se zvyšuje v průběhu experimentu v důsledku formování gradientu ph, a tím dochází k nárůstu elektroosmotického toku během analýzy Elektroosmotický tok je snižován důsledným čištěním agarózy a kovalentní modifikací povrchu pozitivně nabitými skupinami 3. Tenkovrstvá izoelektrická fokusace Jako stabilizační prostředí je užit vhodný nosič (např. sorbent Sephadex G 75) Metoda je provedena na desce pokryté suspenzí nosiče v 1% roztoku amfolytů

19 4. Izoelektrická fokusace v hustotním gradientu Stabilizace média vůči konvekci je dosažena gradientem sacharózy, 0-50%, (užívají se i jiné látky, např. ethylenglykol) Základní vlastnosti stabilizačního média: 1. Nesmí být ionogenní 2. Vysoká rozpust ve vodě při nízké viskozitě 3. Rozdíl hustoty musí být větší než 0.12 g/cm 3 4. Nemá interagovat s dělenými látkami a ovlivňovat jejich biologickou aktivitu 5. Má být snadno oddělitelné od separovaných analytů Příprava hustotního gelu se realizuje pomocí zařízení na tvorbu gradientů nebo ručně Vzorek proteinů je buď smíchán s celým gradientem nebo je nanesen do zóny blízké hlavní fokusační zóně pi (zrychlení dělení) Anoda je většinou umístěna dole v roztoku kyseliny fosforečné a katoda nahoře ve roztoku ethanolaminu

20 Srovnání zónové elektroforézy s elektrofokusací Elektroforéza Dělení založeno na náboji proteinu, molekulové hmotnosti, tvaru a čase Výsledné látky jsou obvykle zředěné Vzorek musí být aplikován v tenké vrstvě (kontinuální systémy) Separace je kontinuální, je třeba ji v určitém čase zastavit Difúze limituje výsledné rozlišení Elektrofokusace Dělení založeno jen na pi proteinu Výsledné látky jsou obvykle aktivně zkoncentrovány Vzorek lze aplikovat kamkoli v ph gradientu Separace je ukončena v okamžiku dosažení zóny s odpovídající hodnotou ph Difúze je neustále potlačována koncentračním efektem

21 Dvourozměrné techniky V prvním rozměru se pracuje většinou na tyčinkovém gelu a ve druhém ortogonálním rozměru na deskovém gelu Příklady kombinací: 1. Velmi důležitá je metoda kombinující izoelektrickou fokusaci v prvním rozměru s SDS-PAGE v rozměru druhém (Isodalt system) V prvním rozměru dělení proběhne podle pi hodnot, ve druhém podle molekulových hmotností 2. Elektroforéza na gelu v prvním rozměru a SDS-PAGE ve druhém rozměru 3. Elektroforéza na gelu v prvním rozměru, následovaná modifikační reakcí proteinů a další elektroforézou na gelu 4. Izoelektrická fokusace kombinovaná s imunodetekcí nebo imunoektroforézou

22 Izotachoforéza Vzorek je umístěn mezi dva různé elektrolyty vedoucí (leading, L) a koncový (terminating T) V jednom experimentu lze dělit jen ionty stejného znaménka, např. anionty Vedoucí elektrolyt obsahuje anionty pohyblivější, než je efektivní pohyblivost (µ i ) ef kteréhokoliv aniontu vzorku, a kationty, u kterých se využívá jejich pufračních schopností Koncový elektrolyt obsahuje anionty o menší efektivní pohyblivosti než je efektivní pohyblivost kteréhokoliv aniontu ve vzorku Základní podmínkou pro izotachoforetickou separaci je splnění vztahu: (µ L ) ef >(µ i ) ef >(µ T ) ef Po vložení elektrického pole se jednotlivé látky vzorku vydělují, přitom anionty vedoucího elektrolytu stále zůstávají před složkami vzorku a anionty koncového elektrolytu za nimi

23 Po úplném oddělení látek dojde ke vzniku ustáleného stavu, který je chataktrizován tím, že jednotlivé látky jsou rozděleny do samostatných, ostře oddělených, ale na sebe přímo navazujících zón Na rozdíl od předcházejících metod v zónách látek vzorku nejsou anionty základního elektrolytu Separace se obvykle provádí v úzké skleněné nebo plastové kapiláře bez stabilizujících komponent Pro dělení proteinů lze také užít separace na acetát celulózovém proužku nebo na polyakrylamidovém gelu s potlačeným sítovým efektem, výsledky jsou obvykle srovnatelné s izoelektrickou fokusací, protože proteiny jsou separovány podle hodnot pi, avšak výhoda izotachoforézy spočíva v tom, že při ní nedochází k případnému srážení proteinů

24 Srovnání elektroforetických metod

25 Izotachoforetický děj Průběh izotachoforézy lze rozdělit do dvou částí: 1.Nejprve probíhá separace složek a rychlost pohybu složek ve směsných zónách je rozdílná 2.Ve druhém kroku, tj. po ustavení ustáleného stavu, jsou už složky od sebe odděleny a pohybují se všechny stejnou rychlostí Dynamika izotachoforetického děje Pokud má vzorek dvě složky A a B, s odlišnými efektivními pohyblivostmi a současně platí: (µ L ) ef >(µ A ) ef >(µ B ) ef >(µ T ) ef pak je splněna základní izotachoforetická podmínka. Vzorek je umístěn mezi vedoucí a koncový elektrolyt. V průběhu separace se z předního rozhraní směsné zóny vzorku vyděluje rychlejší složka a vytváří mezi směsnou zónou a vedoucím elektrolytem L čistou zónu složky A. Za zadním rozhraním směsné zóny vzorku se opožďuje pomalejší složka a vytváří mezi směsnou zónou a koncovým elektrolytem zónu čisté složky B. V průběhu separace se čisté zóny A i B prodlužují a směsná zóna zkracuje, až po určité době dojde k úplnému rozdělení složek A a B. Tento stav, kdy mezi vedoucím a koncovým elektrolytem jsou jen zóny čistých složek A a B, se nazývá ustálený stav. Od tohoto okamžiku se všechny zóny pohybují stejnou rychlostí a nemění se jejich délka

26

27 Ustálený izotachoforetický stav V ustáleném stavu platí: v = (µ L ) ef E L = (µ A ) ef E A = (µ B ) ef E B = (µ T ) ef E T = konst (1) kde v je rychlost pohybu zón, E intenzita elektrického pole Splnění této podmínky vede k upravování koncentrací. Koncentrace kterékoliv složky je v separačním prostoru upravena na hodnotu plynoucí z regulační funkce, bez zřetele k tomu, jaká byla její původní koncentrace. Kohlrauschova regulační funkce se zjednoduší v ustáleném stavu do tvaru: c i = c L µ L + µ µ L R µ i µ i + µ R z z L i c i je koncentrace i-té složky vzorku, c L je koncentrace vedoucího elektrolytu, µ R je pohyblivost protiiontu R, z L a z i jsou náboje vedoucího elektrolytu a složky i Ze vztahu plyne, že v ustáleném stavu je koncentrace i-té složky vždy závislá jen na koncentraci vedoucího elektrolytu c L a na pohyblivosti iontů i, L a R

28 Látka, která byla v původním vzorku koncentrovanější, se během separace zředí, látka původně příliš zředěná se zkoncentruje Skutečnost, že látka je při daných experimentálních podmínkách v ustáleném stavu vždy ve stejné koncentraci, se užívá ke kvalitativní charakterizaci látek Pro kvantitativní stanovení látek se využívá faktu, že délka zóny v ustáleném stavu je závislá na množství látky Rozložení potenciálového spádu a teploty v ustáleném stavu Potenciálový spád podél separačního prostoru je závislý na rozložení měrné vodivosti, a tedy koncentrace a vodivosti jednotlivých složek v zónách a) S klesající efektivní pohyblivostí látek v jednotlivých zónách klesá elektrická vodivost (roste odpor) těchto zón, a tedy roste potenciálový spád Velikost potenciálového spádu v zónách je taková, aby byla v souladu se vztahem (1) Při průchodu proudu zónou o větším odporu se produkuje více tepla Rozložení potenciálového spádu (odporu, teploty, hodnot efektivní pohyblivosti) podél kapiláry je schodovité b) Uplatní se samozaostřující efekt elektrického pole, který vytváří a stabilizuje ostré zóny

29

30 Instrumentace kapilární izotachoforézy Do nádobek s vedoucím a koncovým elektrolytem zasahují elektrody, většinou platinové, na které se vkládá vysoké stejnosměrné napětí Používají se elektrické zdroje s nastavitelným konstantním proudem, tím je zajištěno, že rychlost pohybu zón v ustáleném stavu je konstantní Elektrodový prostor pro vedoucí elektrolyt je obvykle oddělen semipermeabilní membránou od kapiláry, aby se zamezilo pronikání produktů elektrolýzy do kapiláry a vyloučily nežádoucí hydrodynamické toky Do místa rozhraní mezi vedoucím a koncovým elektrolytem se dávkuje vzorek injekční stříkačkou nebo dávkovacími zařízeními Dělící prostor je obvykle realizován PTFE kapilárou o vnitřním průměru mm

31

32 Užívané detektory Detektory mohou být umístěny vně kapiláry, bezkontaktní detektory, což má výhodu v tom, že elektrolyt není v kontaktu s detekčním čidlem a nedochází k nežádoucím jevům, nebo uvnitř kapiláry, kontaktní detektory, které jsou citlivější a mají lepší rozlišení, ale reprodukovatelnost odezvy je většinou nižší Podle toho, jaké veličině je odezva detektoru úměrná, se rozlišují univerzální a specifické detektory Univerzální detektory měří některou vlastnost zóny-měrnou vodivost, gradient elektrického pole, množství tepla uvolněného v zóně-která je úměrná efektivní pohyblivosti látky v zóně Poskytují izotachoforeogram, který má schodovitý průběh Používají se bezkontaktní detektory a) termický detektor (termočlánky, termistory) b) vysokofrekvenční kontaktní detektory a) vodivostní (pomocí střídavého proudu se měří vodivost roztoku) b) gradientový (pomocí stejnosměrného proudu se měří potenciálový spád)

33 Specifické detektory měří danou vlastnost zóny, která nesouvisí s efektivní pohyblivostí látky v zóně, ale je pro látku charakteristická Odezva nemá schodovitý průběh, může mít zcela různé hodnoty v jednotlivých zónách Nejrozšířenější je ultrafialový fotometrický detektor Polarimetrický detektor se užívá při dělení enantiomerů

34 Vyhodnocování výsledků separace Kvalitativní charakteristiky K určování kvality se zpravidla užívá charakteristika spojená s efektivní pohyblivostí Takovou charakteristikou je pro i-tou látku například velikost odezvy h i univerzálního detektoru v okamžiku průchodu zóny. Pokud není známa výška zóny, ale jen její přírůstek, zavádí se pojem relativní výška zóny (h i ) rel : (h i ) rel = (h i h L )/(h S h L ) Indexem S je označen srovnávací elektrolyt, kterým bývá koncový elektrolyt Obdobně je definována fotometrická výška f i a relativní fotometrická výška (f i ) rel při měření specifickým fotometrickým detektorem Současné užití dvou na sobě nezávislých kvalitativních charakteristik h i a f i zlepšuje spolehlivost identifikace neznámé i-té látky Pro analýzu složitých látek je vhodné použít spektrofotometrický detektor

35

36 Kvantitativní charakteristiky V ustáleném stavu je i-tá látka přítomna vždy v adaptované koncentraci c i. Každému množství i-té látky ve vzorku přísluší určitý objem tohoto roztoku obsahujícího i-tou látku, který lze charakterizovat délkou zóny l i v kapiláře nebo délkou L i zóny na izotachoforeogramu Ke kvantifikaci se využívá metoda externího i interního standardu

37

38 Velmi rychlé, resp. velmi pomalé, složky ve vzorku V případě, že je ve vzorku složka, jejíž efektivní pohyblivost je větší než efektivní pohyblivost vedoucího iontu, nebo složka jejíž efektivní pohyblivost je naopak menší než efektivní pohyblivost koncového iontu, je porušena základní podmínka izotachoforézy Tato složka při vydělování ze směsné zóny nevytváří samostatnou zónu, ale prochází postupně do vedoucího, resp. koncového elektrolytu, ve kterém se pohybuje na základě principu zónové elektroforézy Nečistoty ve vedoucím nebo koncovém elektrolytu Malé množství nečistoty v koncovém elektrolytu, která má vyšší efektivní pohyblivost než koncový iont, se pohybuje rychleji, prochází zónami a může vytvořit zónu nečistoty, tato zóna se s časem prodlužuje Podobná situace nastává, pokud je ve vedoucím elektrolytu nečistota s menší efektivní pohyblivostí než je efektivní pohyblivost vedoucího iontu Pokud je ve vedoucím elektrolytu nečistota s větší efektivní pohyblivostí, než má vedoucí iont, nebo je-li v koncovém elektrolytu nečistota s menší efektivní pohyblivostí, než má koncový iont, není dělení ovlivněno

39 Ovlivňování efektivní pohyblivosti 1. Změnou ph roztoku U slabých elektrolytů se změnou ph ovlivní disociace příslušné látky, tím také hodnota efektivní pohyblivosti Hodnota ph potřebná pro dělení je dosažena pomocí vhodného protiiontu ve vedoucím elektrolytu 2. Účastí složky na komplexotvorných rovnováhách Speciálně upravené aparatury Protiproud elektrolytu Ke zvýšení efektivní dělící schopnosti aparatur nebo pro preparativní separace se používá hydrodynamický tok vedoucího elektrolytu, nasměrovaný proti pohybu dělených iontů Na základě tohoto uspořádání, pak lze provádět velmi náročná dělení v aparatuře s poměrně krátkou kapilárou za nepříliš vysokého napětí

40

41 Dvoukolonová aparatura Používá se k dělení směsí s velmi rozdílným obsahem jednotlivých složek Aparatura se skládá ze dvou kapilár o různém vnitřním průměru. Nejprve proběhne předseparace v první kapiláře s větším vnitřním průměrem, která má velkou separační kapacitu. Předseparační kapilára je T-spojkou napojena na separační kapiláru. T-spojka umožňuje oddělení nežádoucích majoritních složek, zatímco minoritní složky jsou převedeny do separační kapiláry s malým vnitřním průměrem. Minoritní složky, které v předseparační kapiláře tvořily jen velmi úzké zóny, poskytují v separační kapiláře dostatečně dlouhé zóny vhodné pro vyhodnocení

42

43 Aplikace izotachoforézy Dělení anorganických i organických kationtů, aniontů, komplexů, aminokyselin, peptidů, proteinů, nukleotidů, sacharidů atd. Metoda je zejména vhodná pro elektricky nabité látky s poměrem mezi molekulovou hmotností a efektivním nábojem do 3000

44