Pracoviště (1) Oddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy, Brno, Česká republika (2)Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodověde

Transkript

1 MALDI-TOF MS typizace γ-proteobakterií Matrix-assisted assisted laser desorption/ionization time of flight MS (Karas a Hillenkamp, 1987) Andrea Vávrová, 4roč. Oddělení mikrobiologie MU Vedoucí DP: RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. Školitel: RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. Analýza: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Tomáškovy dny mladých mikrobiologů, 7-9. června 2006

2 Pracoviště (1) Oddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy, Brno, Česká republika (2)Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (3) Oddělení informačních technologií, Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (4) Česká sbírka mikroorganismů, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika

3 Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice Ionizační metoda tvoří ionty v plynné fázi Aplikace: Detekce a analýza MML biologického původu Identifikace proteinů, struktury, protein.interakcí Podmínka: látky musí tvořit ionty v plynné fázi Rychlá chemotaxonomie založená na detekci biomarkerů

4 Význam metody pro taxonomii Potřeba jasných a rychlých výsledků identifikace neznámých vzorků zařazení do rodů, druhů a kmenů Výhoda při rozlišení dvou chemotaxonomicky a genotypicky podobných druhů (Př: B.anthracis a B.cereus) Rod Pseudomonas : častý izolát klinického materiálu etiologické agens (NI, SI) geochemické cykly, biodegradace heterogenita a genetická proměnlivost v rámci rodu

5 1. Vzorek pro analýzu Příprava vzorku 2. Uchovávání glycerolové konzervy Sterilita Optimalizace metodiky (konstantní media) Přesné časové intervaly

6 MALDI destička nerezová ocel

7

8 Vzorky: ~ buňky Analýza MALDI - prostředí, klinika, potraviny a) celobuněčné preparáty b) lyzáty buněk ~jednotlivé izolované MML - NK, lipidy, peptidy Matrice acetonitril rozpouští proteiny Okyselení NMK (trifluoroctová k.) Standard (lysozym) Destička, N laser 337nm excitace UV

9 Matrice V nadbytku vzhledem ke vzorku neměly by spolu reagovat, velké proteiny potřebují více matrice Rozpustná ve stejném rozpouštědle jako vzorek důležité pro krystalizaci vzorku Musí absorbovat vlnovou délku záření laseru Musí být fotostabilní

10 Matrice : je výhodné užít této jednoduché složky se známou absorbcí světla jako primární cíl pro laser než přizpůsobovat vlnovou délku pro analyt - vzorek krystalizuje v její mřížce - brání štěpení vzorku, oddělí mlk - převádí ionizační energii laseru na molekuly vzorku (rozkladem na ionty ionizuje vzorek - *ionty v plynné fázi) = Deriváty kys.benzoové:(typy dle Mr analytu) CHCA α-cyano-4-hydroxyskořicová (do Mr 10tis Da) SA sinapinová SDHB gentisová (pro VML) okyselení vyladí šum, potlačení salinity

11 Nanášení a analýza vzorku Matrice (SDHB, voda:acetonitril 1:1) + vzorek, standard Zaschnutí na vzduchu Technika charakterizuje biomarker poměrem Mm/Q částice, měření délky letu - ionty putují oblastí bez pole 1-3 metry (menší dorazí dříve) Měří se výskyt a intenzita signálu Pozitivní a negativní iontová analýza ( + a mod) Kombinovatelná technika Schéma metody MALDI TOF

12 Princip metody Energie laseru je aborbována organickou matricí Ionizace molekul Výsledky mnohonásobných laserových pulsů (až 150) jsou sbírány a převedeny z TOF měření na Mr/Q hodnoty Zobrazení jako spektrum ionizovatelných částic bakteriálních povrchů

13 Výstupní spektrum význam píků = hmotnostní spektrum = záznam četnosti iontů (3 jamky, 7 spotů, výstřelů) 90% signálů 500 Da - 10tis Da,, 1 pík = ± 5Da Výška píku = intenzita proteinu v místě odtřelu (relativní hustota proteinu, proto ne kvantitativ. metoda) Závisí na ionizačním chování vzorku struktura, výskyt konjugovaných systémů (protonové pasti)

14 Vliv experimentálních podmínek na analýzu Kultivační media a stáří kultury Vliv matrice, kyselin a rozpouštědel Koncentrace analytu vnitřní kontrola Obsah kovů, solí, látek s konjugovaným systémem vazeb

15 Optimalizace A testy reprodukovatelnosti u sbírkových kultur: V rámci jedné kultivace: Hustota vzorku Test konzervačních vlastností acetonitrilu alikvoty: vliv délky zamražení, nezamražení Test typu použité matrice výsledky dle Mr proteinů Test okyselení matrice Test náhodnosti různé umístění na desce Test oživení vzorku V rámci více kultivací reprodukovatelnost spekter Cíl: Zisk reprodukovatelných spekter s dostatečnou citlivostí detekce metoda odliší skupiny (groups) a druhy.

16 Cíle Ověřit diferenciační hodnotu MALDI pro bakterie rodu Pseudomonas Pomocí optimalizace metody na sbírkových kulturách rodu (typové a další izoláty) Výsledky : reprodukovatelná spektra -z různých kultivací za stejných podmínek --- stejná spektra charakteristické píky rodu pro skupiny (groups) a druhy odlišnosti mezi kmeny autentizace identifikace

17 Pseudomonas groups

18 Srovnání v rámci rodu Pseudomonas a.i P. chlororaphis CCM 1975 T P. fragi CCM P.aeruginosa CCM 1960 T P. fluorescens CCM 2115 T P. putida CCM 7156 T m/z

19 Srovnání spekter uvnitř druhu P.aeruginosa CCM 1961, CCM 1959, CCM 1960 a.i. P. aeruginosa CCM CCM CCM m/z

20 a.i. Srovnání spekter uvnitř druhu Pseudomonas putida CCM 3656, CCM 7156 T, CCM 1977 P. putida CCM CCM CCM m/z

21 Chlororaphis group P. taetrolens, P.fragi, P.lundensis, P. chlororaphis a.i Chlororaphis group 1400 CCM 1982 T CCM CCM 3503 T CCM 1975 T m/z

22 Fluorescens group P. fluorescens, P. rhodesiae a.i CCM 2115 T CCM CCM m/z

23 Stutzeri group P. luteola, P. balearica, P. stutzeri a.i. Stutzeri group CCM CCM 4563 T CCM m/z

24 Aeruginosa group typové kultury : P. mendocina, a.i. P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. aeruginosa CCM 3590 T CCM 3467 T CCM 2655 T 200 CCM 1960 T m/z

25 Aeruginosa group typové kultury : P. mendocina, a.i. P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. aeruginosa CCM 3590 T CCM 3467 T CCM 2655 T 200 CCM 1960 T m/z

26 Otázky Práce se spektry výskyt a kvalita píku? Je možné odlišit kmeny? Do jaké míry se liší mezi sebou jednotlivé kmeny jednoho druhu a do jaké míry příbuzné druhy? Proto: klastrování spekter pravděpodobnosti Software vstupní bod pro databázi

27 Závěr Optimalizace metody (jedna kultivace) na sbírkových kmenech pro identifikaci izolátů Zisk reprodukovatelných spekter z různých kultivací za stejných pomínek stejné výstupy Software: všechny druhy jsou navzájem odlišitelné (dominantní píky) a navíc se liší i v rámci kmenů, rozdíly mezi kmeny nezařadí jeden druh do jiného (Př: P. fluorescens asi 25 kmenů)

28 Výhody Srovnání s biochem., fenotypizač. a metodami MB: Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku Nízký objem vzorku Vysoká kapacita detekce, možnost nastavení rozsahu Mr (snížením rozpětí zvýšíme podíl signál/šum) Vysoce reprodukovatelný výstup Šetření chemikáliemi Široké spektrum analytů Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází Možnost srovnání s informacemi sekvencování genomu, proteinů Analýza nekultivovatelných mikroorganismů

29 Cíle Stanovit MS profil vybraných skupin γ-proteobakterií Shodnotit reprodukovatelnost spekter v rámci jedné a více kultivací Optimalizace metodiky na sbírkových kulturách Vyhledat druhově a rodově specifické markery pro taxonom.diferenciaci Tvorba proteinové databáze rodu Pseudomonas

30 Poděkování Mé poděkování patří RNDr. Ludmile Tvrzové, PhD. za odborné vedení a poskytnutí podkladů pro diplomovou práci RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr. a Mgr. Ondřeji Šedo, Ph.D. za analýzy vzorků

31 Děkuji za pozornost