VÝVOJ ALTERNATIVNÍ SYNTÉZY ČINIDLA Sm-PDTA PRO CHIRÁLNÍ ROZLIŠENÍ AMINOKYSELIN POMOCÍ NMR

Transkript

1 UNIVERZITA KARLVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Studijní program: Klinická a toxikologická analýza Lucie Hrubá VÝVJ ALTERNATIVNÍ SYNTÉZY ČINIDLA Sm-PDTA PR CHIRÁLNÍ RZLIŠENÍ AMINKYSELIN PMCÍ NMR Development of an Alternative Synthesis of Sm-pdta, a Reagent for Chiral Resolution of Amino Acids by NMR Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Václav Vaněk, Ph.D. Konzultant: RNDr. Radomír Čabala, Ph.D. Praha 2013

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i. je možné jen po písemném souhlasu tohoto ústavu. V Praze dne 22. května 2013

3 Poděkování V první řadě bych chtěla poděkovat svému školiteli Mgr. Václavu Vaňkovi, Ph.D. za pomoc při vypracování této bakalářské práce. Dále bych ráda poděkovala celému kolektivu skupiny RNDr. Jiřího Jiráčka, Ph.D. z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR za příjemné pracovní podmínky, zvláště pak Ing. Janu Píchovi, Ph.D. za ochotu a pomoc při řešení některých úkolů. Nemalé poděkování patří též RNDr. Miloši Buděšínskému, CSc. za měření NMR spekter, pracovníkům analytické laboratoře za měření elementární analýzy, pracovníkům laboratoře hmotnostní spektrometrie za měření hmotnostních spekter a pracovníkům laboratoře molekulární spektroskopie za měření infračervených spekter. Mé poděkování patří také mé rodině a přátelům za všeobecnou podporu.

4 Seznam použitých zkratek NMR nukleární magnetická rezonance GC plynová chromatografie HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie CE kapilární elektroforéza CSR chirální posunové činidlo pdta kyselina 1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctová ACN acetonitril Bn benzyl Ph fenyl TLC tenkovrstevná chromatografie rt laboratorní teplota IPAV 2-propanol, voda, konc. vodný amoniak v poměru 7:1:2 T2 20% ethylacetát v toluenu UV ultrafialová oblast HRMS hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením ESI electrospray ionization EI electron impact Ac acetát RV rotační vakuová odparka δ chemický posun v ppm J interakční konstanta v jednotkách Hz s singlet d dublet dd dublet dubletu m multiplet bs široký singlet bm široký multiplet IR infračervená oblast Et ethyl Me methyl obj. objemových 3

5 konc. [α] D 20 (v/v) DMS-d6 CSY HSQC HMBC FTMS ν max /cm -1 koncentrace specifická rotace při 20 C a 589 nm v 10-1 cm 2 g -1 objemová procenta deuterovaný dimethylsulfoxid correlation spectroscopy heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy fourier transform mass spectrometry frekvence 4

6 bsah Seznam použitých zkratek... 3 becný úvod... 6 Cíle práce... 9 Teoretický úvod Dělení racemického 1,2-diaminopropanu na enantiomery Metody přípravy kyseliny 1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové a jejích enantiomerů.. 12 Metody přípravy komplexu kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové s lanthanoidy Výsledky a diskuze Dělení racemického 1,2-diaminopropanu na enantiomery Příprava tetrabenzylesteru kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové Příprava volné kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové Příprava komplexu kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové se samariem Experimentální část becné metody Dělení (RS)-1,2-diaminopropanu na enantiomery - původní postup Dělení (RS)-1,2-diaminopropanu na enantiomery - nový postup Závěr Seznam literatury

7 becný úvod V současné farmacii jsou racemická léčiva chápána jako zdroj potenciálního rizika pro humánní i veterinární medicínu a antipod účinné látky je považován z hlediska kontroly kvality za nečistotu. Farmaceutický průmysl proto vyvíjí většinu výrobních procesů tak, aby byly účinné látky získávány pouze ve formě žádoucího enantiomeru. Během několika minulých desetiletí se intenzivně rozvíjely analytické metody jako plynová chromatografie (GC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), kapilární elektroforéza (CE) a nukleární magnetická rezonance (NMR), které byly úspěšně aplikovány pro určování enantiomerické čistoty látek. Přestože většina analýz optické čistoty účinných látek je dnes prováděna pomocí HPLC nebo CE, použití NMR za přítomnosti chirálních rozlišovacích činidel (CSR) je užitečnou metodou mimo jiné z důvodů (a) snížení rizika racemizace při derivatizaci zkoumané látky, (b) komerční dostupnosti chirálních posunových činidel a (c) snadnosti a rychlosti provedení analýzy. 1 Enantiomerní molekuly se principiálně neliší ve svých fyzikálních vlastnostech, pokud nejsou vystaveny chirálnímu prostředí. Tímto prostředím může být například chirální rozpouštědlo nebo chirální molekula, která vytvoří diastereotopní komplex se zkoumanou látkou. Často jsou jako CSR využívány sloučeniny obsahující lanthanoid, protože interakce nepárového elektronu kovu s protony zkoumané látky vede k výrazným změnám v rezonanční frekvenci (paramagnetický příspěvek k chemickému posunu). Přestože je již dlouho známo mnoho CSR použitelných v organických rozpouštědlech, do roku 1984 byla dostupná pouze dvě činidla rozpustná ve vodě, která je vhodným rozpouštědlem pro mnoho přírodních chirálních látek. Tehdy popsal Kabuto et al. slibné nové činidlo, komplex europia s (R)-1,2- diaminopropantetraacetátem 1, které se ukázalo jako mnohem účinnější než dosud používaná činidla (obrázek 1). 6

8 Na H 3 C Eu 3+ N N (R) 1 brázek 1. Eu-(R)-pdta Tento komplex byl podle autorů první lanthanoidové CSR, které je schopno rozlišit NMR signály enantiomerů karboxylových kyselin. Substrát pravděpodobně intereaguje s činidlem v místech, na která se obvykle váží molekuly vody nebo hydroxylové ionty. 2 V následující práci Kabuto a Sasaki shrnuli poznatky z měření NMR spekter široké škály přírodních i uměle syntetizovaných aminokyselin za přítomnosti zmíněných činidel a uvedli, že existuje korelace mezi absolutní konfigurací aminokyseliny a lanthanoidem indukovaným posunem signálů α-protonů enantiomerů těchto aminokyselin. Autoři zjistili, že po přidání Eu-(R)-(pdta) k roztoku L- aminokyseliny v D 2 dojde vždy k většímu posunu H α signálu k vysokému poli než v případě D-aminokyseliny, přičemž při použití Eu-(S)-(pdta) je tomu naopak. Činidlo lze proto výhodně použít k určování absolutní konfigurace aminokyselin, a to s mnohem větší spolehlivostí než v případě dosud používaných činidel. Jedinou nevýhodou tohoto činidla je podle autorů omezená použitelnost pro analýzy směsí enantiomerů, protože v mnoha případech byly signály ve spektrech nedostatečně rozlišeny (90 MHz NMR) a často docházelo k výraznému rozšiřování signálů, 3 zvláště při měření na NMR aparaturách s vysokým magnetickým polem. 4 Proto byla později Kabutem et al. vyvinuta činidla [(R)-1,2-diaminopropan- N,N,N,N -tetraacetáto]samarát sodný 2 a [(S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N tetraacetáto]samarát sodný 3, zkráceně Sm-(S)-pdta a Sm-(R)-pdta (obrázek 2). Na Sm 3+ N N. ~2 H 2 Na N Sm 3+ N. ~2 H 2 H 3 C (R) H 3 C (S) 2 3 brázek 2. Sm-(R)-pdta a Sm-(S)-pdta 7

9 Tento komplex způsobuje menší rozšiřování signálů než původní komplex na bázi europia, protože samarium má nejmenší magnetický moment ze všech paramagnetických lanthanoidů. Autoři uvádějí, že Sm-pdta je tedy první vodorozpustné chirální činidlo, které nezpůsobuje závažné rozšiřování signálů v silném magnetickém poli. Toto činidlo může být používáno k přiřazování absolutní konfigurace α- aminokyselin (obrázek 3). 5 brázek 3. Relativní pozice signálů protonů α-aminokyselin v NMR spektru za přítomnosti Sm-(R)-pdta. 4 Později bylo ověřeno, že toto posunové činidlo lze úspěšně aplikovat nejen pro rozlišení enantiomerů aminokyselin, ale například též α-alkyl-α-aminokyselin 6 α- 2 1 hydroxykyselin nebo acetylkarnitinu. Sm-(S)-pdta i Sm-( R)-pdta jsou sice v současné době v omezeném množství komerčně dostupné (firma TCI Europe N.V.), avšak finančně značně nákladné (240,75 /100 mg, údaj z května 2013). 8

10 Cíle práce Hlavním cílem této bakalářské práce je vyvinout efektivní, jednoduchou a levnou metodu přípravy chirálních posunových činidel Sm-(S)-pdta a Sm-(R)-pdta pro rutinní použití v laboratorní praxi organické a biochemické laboratoře. Jednotlivé cíle lze shrnout do následujících bodů: - pokusit se optimalizovat dělení racemického (RS)-1,2-diaminopropanu na jednotlivé enantiomery - vypracovat jednodušší a efektivní metodu syntézy opticky čisté kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové. 9

11 Teoretický úvod Dělení racemického 1,2-diaminopropanu na enantiomery Dělení 1,2-diaminopropanu na enantiomery poprvé popsal G. Baumann roku Desetinásobnou rekrystalizací hydrogenvínan (R)-1,2-diaminopropanu a následnou konverzí získal čistý dihydrochlorid (R)-1,2-diaminopropanu Identický postup použili Tschugaeff a Sokoloff 8 v roce V roce 1952 uvedl ve své práci J. C. Bailar 9 metodu navazující na výše uvedené postupy. Bailar hydrogenvínan rozpustil v malém množství vroucí vody a za stálého míchání do něj přidával roztok obsahující KCl. Po ochlazení v ledové lázni byl sražený vínan draselný odfiltrován a roztok obsahující dihydrochlorid (S)-1,2-diaminopropanu (7) odpařen. Do roztoku přidával KH až do silně alkalické reakce. Poté byl roztok destilován, ve frakci destilující mezi C byl získán 80% vodný (S)-1,2- diaminopropan. Bailarův postup zásadně přepracoval Francis P. Dwyer 10 v roce 1959, který uvádí, že z předchozích postupů není jasné, jak a kolikrát se má rekrystalizace provádět. Dwyer dále uvádí, že z publikovaných popisů nevyplývá, zda byly předchozími autory opticky čisté izomery vůbec připraveny a také že odchylky dosud publikovaných specifických rotací jsou zřejmě způsobeny hygroskopickou povahou látky. Dle Dwyera byl technický (S)-1,2-diaminopropan přidáván pomalu za stálého míchání k roztoku kyseliny vinné ve vodě. Směs byla přivedena k varu, a poté byla nechána pomalu chladnout na 40 C. Dále byla rychle ochlazena na 5 C a tato teplota udržována po dobu 45 minut. Krystalický diastereoizomerní hydrogenvínan (S)-1,2- diaminopropanu byl zfiltrován a promyt ledovou vodou. Další krystaly byly získány přidáním ledové kyseliny octové do horkého filtrátu, promyty ledovou vodou, a ponechány chladnout přes noc. Rekrystalizace byla prováděna rozpuštěním krystalů ve vroucí vodě a přidáním ledové kyseliny octové, následně byla směs ochlazena na 10 C. Při každé následné rekrystalizaci byl objem vody a kyseliny snižován. Postupným testováním optické rotace volné báze (která byla ze soli uvolněna hydroxidem sodným, extrahována vroucím benzenem po dobu 45 minut a poté 3 dny sušena s hydroxidem draselným) bylo zjištěno, že desetinásobná krystalizace je dostatečná. Filtrát byl po separaci druhé frakce krystalů odpařen na tuhý sirup. Byl přidáván hydroxid sodný, poté 10

12 byla směs destilována. Výtěžek po konverzi na dihydrochlorid (S)-1,2-diaminopropanu byl 29 %. V roce 1976 A. J. Repta uvádí alternativní metodu separace enantiomerů. 11 Při přípravě dihydrochloridu (S)-1,2-diaminopropanu vychází z Dwyerovy metody, ale považoval za dostatečné pouze 5 rekrystalizací. Dihydrochlorid suspendoval v methanolu, kterým poté probublával proud chlorovodíku 30 minut; během 5 minut se pevné látky úplně rozpustily. Po 7 minutách se objevily bílé krystaly dihydrochloridu (S)-1,2-diaminopropanu. Přebytek kyseliny chlorovodíkové byl odstraněn probubláváním plynného dusíku po 20 minut. Sraženina byla separována filtrací s výtěžkem 35 %. Nověji byl (S)-enantiomer syntetizován přímo z (S)-alaninu ve výtěžku %, 12, 13, 14 jak je uvedeno např. na obrázeku H H 3 C NH 2 H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 CH HCl NH 3 Cl H CH 3 H 3 C 1. NaH-CHCl 3 2. NH 3 -CH 3 H NH 2 H NH 2 H 3 C 1. B 2 H 6 -THF 2. HCl Cl H 3 N NH 3 H CH 3 Cl brázek 4. Syntéza opticky aktivního dihydrochloridu (S)-1,2-diaminopropanu z (S)- alaninu. Takto může být získán zcela čistý enantiomer, syntéza je však vícestupňová, vede ke vzniku pouze jednoho enantiomeru a vzhledem k použití drahých činidel je nevhodná pro přípravu větších množství látky. Dwyerův postup byl s drobnými modifikacemi použit také v některých novějších pracích. 15 V japonském patentu z roku 1992 je popsán alternativní postup dělení racemického 1,2-diaminopropanu pomocí krystalizace jeho distereomerních solí s N-4- toluensulfonyl-l-fenylglycinem. 16 Zcela bezvodá báze může být získána podle postupu Fowlese, McGregora a Symonse, kteří uvádějí, že příprava zcela bezvodého 1,2-diaminopropanu vyžaduje poměrně drastické a náročné destilace se sodíkem nebo draslíkem

13 Metody přípravy kyseliny 1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové a jejích enantiomerů První publikované metody přípravy solí racemické kyseliny 1,2-diaminopropan- N,N,N,N -tetraoctové (9) spočívaly v oxidaci alkoholů v alkalickém prostředí, jak je uvedeno v patentech z roku Další možností výroby těchto kyselin je reakce alkalického kyanidu, formaldehydu a primárního alifatického aminu, jak uvádějí patenty z let , a První syntézu opticky čisté kyseliny publikovali v roce 1959 Francis P. Dwyer a Francis L. Garvan. 22 Ve své práci týkající se přípravy 1,2-diaminopropantetraoctové kyseliny uvádějí, že 1,2-diaminopropan 8 snadno kondenzuje s chloroacetátem sodným v silně alkalickém prostředí za laboratorní teploty, ale s nízkými výtěžky při zahřívání směsi. Podle Dwyerova postupu byl roztok monochloroctové kyseliny ve vodě ochlazen na 10 C a ledový vodný roztok NaH byl přidán pomalu a za stálého míchání tak, aby teplota nepřekročila 20 C. Poté byl přidán (RS)-1,2-diaminopropan a směs se nechala 6 dní stát při 20 C. Po filtraci a ochlazení byla do směsi za stálého míchání přidávána kyselina sírová. Směs byla ponechána krystalizovat po 16 hodin při 8 až 10 C. Získaný jemný krystalický prášek, částečně kontaminovaný síranem sodným, byl pročištěn suspendováním v ledové vodě a poté zfiltrován a promyt vodou, ethanolem a etherem a sušen při 100 C. ph matečného louhu bylo upraveno koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou do silně kyselé reakce a roztok byl ponechán krystalizovat přes noc v chladu, přičemž se vyloučily další frakce krystalů. Racemická pdta byla získána ve vysokém výtěžku 82 % (obrázek 5). H 2 N CH 3 NH 2 ClCH 2 CH NaH, rt, 6 d HC HC N H 3 C N CH CH 8 9 brázek 5. Syntéza racemické pdta z racemického 1,2-diaminopropanu. 12

14 Na rozdíl od racemické směsi jsou čisté optické formy pdta dobře rozpustné ve vodě a nekrystalizují po okyselování směsi. Proto byly zaznamenány velké obtíže při separaci aktivní kyseliny od balastních solí. Dwyer vyvinul pro přípravu a separaci opticky čisté pdta následný postup: Alkylace (S)-1,2-diaminopropanu byla provedena stejně jako v případě racemického 1,2-diaminopropanu. kyselení reakční směsi však bylo provedeno kyselinou chlorovodíkovou a roztok zakoncentrován, přičemž se část chloridu sodného vyloučila a byla odstraněna. Po odstranění pevného chloridu sodného byl filtrát přidán za stálého míchání do ethanolu. Vzniklá gumovitá sraženina přes noc zkrystalizovala a byla filtrována a promyta ethanolem, etherem a vysušena. Poté byla suspendována v ledové kyselině octové při 40 C a směs byla míchána do rozpuštění sodné soli tetrakyseliny. Nerozpuštěný chlorid sodný byl odstraněn a promyt další dávkou ledové kyseliny octové. Spojený filtrát byl vlit do benzenu, přičemž vzniklá gumovitá sraženina zkrystalizovala po odlití benzenu a přidání acetonu. Aceton byl po dekantaci odlit, pevná látka rozdrcena na prášek a zbavena zbytků kyseliny octové extrakcí acetonem. Směs byla ponechána stát přes noc. Pevná látka byla zfiltrována, vysušena, rozpuštěna ve vodě a roztok odpařena na menší objem. Tímto způsobem se odstranily poslední stopy acetonu a kyseliny octové. Finální purifikace byla provedena pomocí silného katexového iontoměniče, který byl před vlastní separací promyt kyselinou chlorovodíkovou při 70 C k odstranění železitých iontů, přebytek kyseliny byl poté vymyt vodou. Roztok surového produktu byl prolit přes kolonu s pročištěným iontoměničem. Kolona byla promyta studenou vodou, zahřívána na 70 C vnějším zdrojem tepla a pdta byla vymývána vodou o teplotě 95 C. Získaný vodný roztok kyseliny byl zahuštěn, ochlazen a ponechán krystalizovat při 8 C přes noc. První frakce krystalů byla promyta ledovou vodou, etanolem, acetonem a vysušena. Filtrát byl odpařen, přičemž se vyloučily další krystaly. Konečný výtěžek činil 52 %. Richard Wing a Kenneth Callahan 23 předchozí metodu poněkud vylepšili. Snažili se o zjednodušení postupu a dosažení vyšších výtěžků. Po přidání dihydrochloridu (S)-1,2-diaminopropanu do směsi chloroctové kyseliny a hydroxidu sodného se nechala směs stát při laboratorní teplotě. Poté byla směs okyselena kyselinou chlorovodíkovou, odpařena a vzniklá pevná látka odfiltrována. Filtrát byl nasazen na kationtový iontoměnič a eluován 3 litry vroucí vody za současného zahřívání 13

15 kolony. Levotočivý eluát byl odpařením zakoncentrován na malý objem a byl přidán aceton. Stáním přes noc při 4 C se vyloučil hydrát pdta jako bílá pevná látka. Prakticky stejný postup použil roku 1976 i A. J. Repta, M. J. Baltezor a P. C. Bansal. 24 Kyselinu (S)-1,2-diaminopropantetraoctovou 13 syntetizovali podle metody Winga a Callahana. proti původním postupům však reakční směs po 7 dnech zakoncentrovali a zfiltrovali. Izolace produktu z filtrátu byla provedena pomocí katexového iontoměniče. Kolona byla promyta studenou vodou, a pak byla kyselina vymyta horkou vodou a kolona udržována na teplotě 90 C. pticky aktivní eluát byl zahuštěn zahřátím. Krystaly, které se vytvořily při stání, byly odfiltrovány, vysušeny a identifikovány jako (S)-1,2-diaminopropantetraoctová kyselina ve výtěžku údajně 67 %. Patent Petera MacDonalda 25 z roku 1997 na výrobu léčiva dexrazoxanu uvádí negativa dřívějších postupů, jako jsou náklady na kationtový iontoměnič, udržování vysoké teploty iontoměniče a extrémně zředěné roztoky. Tento krok tak může vést ke ztrátě produktu kvůli nevratné absorpci. McDonald dále uvádí, že výtěžek tetrakyseliny při pokusu o reprodukci Reptova postupu byl pouze 51 %, zatímco Repta uvádí 67 %. Podle McDonalda jsou nízké výtěžky způsobeny trvalým záchytem na kationtovém iontoměniči. Reptova metoda navíc vede k získání kyseliny v hydratované formě namísto bezvodé formy, která by byla efektivnější v následné cyklizaci na dexrazoxan. Podstatou McDonaldova patentu je zjištění, že při cyklizaci není kontaminace chloridem sodným na závadu, pokud je směs dobře vysušena. Toto zjištění využil k výraznému zjednodušení celého postupu. McDonaldem navržený postup se shoduje s předešlým až do chvíle, kdy je směs po ukončení reakce okyselena koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Tímto se směs zahřála, byla zakoncentrována a ochlazena na 40 C. Suspenze byla odfiltrována a sraženina promyta ledovou vodou. Tato opticky neaktivní sraženina obsahovala hlavně chlorid sodný. Filtrát byl nalit do methanolu a vzniklý gel byl míchán přes noc. Vytvořená sraženina byla zfiltrována, sušena a výtěžek (S)-pdta činil 54 % a produkt obsahoval 13,4 % chloridu sodného. bdobný postup jako McDonald uvádí Koch 26 v roce 2010, ten ale opět zahrnuje poměrně komplikované odstraňování balastních solí. Přípravu tetrakyseliny ve formě dihydrochloridu (11) popsal Nicola Florini 27 a jeho spolupracovníci v roce Byl připraven roztok dihydrochloridu (S)-1,2- diaminopropanu a fosforečnanu draselného v acetonitrilu. Za stálého míchání byl přidán ethylbromoacetát a reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 6 dní. Poté byl 14

16 přebytečný ester oddestilován. K pevnému produktu byla přidána 3M kyselina chlorovodíková, díky které se rozpustila všechna pevná látka. Roztok byl dvakrát extrahován diethyletherem. Do ochlazené vodné fáze byl přidáván hydroxid sodný dokud ph roztoku nedosáhlo hodnoty 14. Poté byla vodná fáze dvakrát extrahována diethyletherem. Extrakty byly spojeny, vysušeny síranem sodným, filtrovány a odpařeny. Byl získán tetraethylester (S)-pdta 10 jako žlutý olej (86 %). Tento produkt byl suspendován v methanolu s přídavkem 2M roztoku hydroxidu sodného a zahříván na olejové lázni po dobu 6 hodin. Poté byl roztok odpařen a byla přidána 3M kyseliny chlorovodíková, roztok byl znovu odpařen, třikrát promyt izopropanolem, filtrován a znovu promyt izopropanolem. Podle autorů byl získán dihydrochlorid jako bílá pevná látka ve výtěžku 84 % přes 2 kroky (obrázek 6). H 3 C Cl CEt H CH N NH N 3 Cl BrCH 2 CEt 1. CH CEt 3 H/H 2, 2M NaH, reflux, 6 h CH 6d,rt CEt CH NH 3 Cl H 3 C N 2. 3M HCl H 3 C N CEt H CH Cl brázek 6. Syntéza (S)-pdta podle Floriniho 27. Metody přípravy komplexu kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N tetraoctové s lanthanoidy V roce 1984 připravoval Kuninobu Kabuto 2 a spol. komplex s europiem. Tento komplex byl připraven z Eu 2 3 a (S)-1,2-diaminopropantetraoctové kyseliny za stejných podmínek jako se již dříve připravoval ethylendiamintetraacetát. V roce 1993 byl v publikaci Chizuka Kabuta et al. 28 uveden přesnější postup pro získání europitého komplexu. Směs Eu 2 3 a 1,2-diaminopropantetraoctové kyseliny ve vodě byla zahřívána a míchána po dobu 1,5 hodiny. Poté byl roztok zfiltrován a kyselý filtrát zneutralizován hydroxidem sodným. dpařením vody byl získán cílový komplex Na[Eu ΙΙΙ -pdta] ve formě sklovité pevné látky. V japonském patentu 29 z roku 2002 autoři uvádějí metodu přípravy komplexu pdta se samariem. Směs oxidu samaritého, 1,2-diaminopropantetraoctové kyseliny a vody byla zahřívána k varu po dobu 30 minut. Pevné nečistoty byly odfiltrovány a filtrát 15

17 byl zneutralizován roztokem hydroxidu sodného. Produkt byl vysušen a výtěžek činil 99 % (obrázek 7). HC CH 1. Sm 2 3 Sm 3+ HC N N CH 2. NaH Na N N. ~2 H 2 R 1 R H 2 2, reflux, 1,5 h R 1 R 2 12,R 1 =CH 3 ;R 2 =H 13,R 1 =H; R 2 =CH 3 2, R 1 =CH 3 ;R 2 =H 3, R 1 =H; R 2 =CH 3 brázek 7. Příprava Sm-pdta z pdta. V další práci 30 z roku 2008 byl pro přípravu částečně deuterovaného samaritého komplexu 14 autory použit obdobný postup jako pro přípravu předchozích komplexů (obrázek 8). Na Sm 3+ X N N X X X R 1 R 2. ~2 H 2 X=CD 2 14 brázek 8. Deuterovaný analog Sm-pdta. 16

18 Výsledky a diskuze Dělení racemického 1,2-diaminopropanu na enantiomery Z dosavadních publikovaných metod přípravy opticky čistých enantiomerů dihydrochloridu (RS)-1,2-diaminopropanu 8 je zjevné, že nejčastěji je v současné době dihydrochlorid (S)-1,2-diaminopropanu 7 připravován vícestupňovou syntézou z (S)- alaninu (4), tato syntéza je ale drahá a lze tak získat jen jeden enantiomer. Proto jsme se rozhodli ověřit použitelnost starší Dwyerovy metody 10, která popisuje přípravu enantiomerů přes krystalizaci diastereomerních solí racemického 1,2-diaminopropanu s kyselinou L-vinnou z vody, konkrétně hydrogenvínanu. Dwyer uvádí, že k získání jednotlivých enantiomerů o vysoké čistotě je nutno provést až 10 následných rekrystalizací diastereomerní soli. Při pokusu o reprodukování tohoto postupu jsme však díky průběžnému ověřování optické čistoty * zjistili, že pro praktické účely jsou dvě po sobě následující rekrystalizace zcela dostačující. Při optimalizaci postupu jsme poněkud zvětšili objem vody, ve které probíhá prvotní neutralizace, čímž byl částečně zlepšen výtěžek (S)-enantiomeru. Po smíchání všech reagencií (kyselina L-vinná, voda a (RS)-1,2-diaminopropan) se přes noc při 4 C vytvořily krystaly hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu 16, které byly následně vysušeny. Matečný louh byl použit k izolaci dihydrochloridu (S)-1,2-diaminopropanu. První rekrystalizace byla provedena rozpuštěním krystalů ve vodě, zahuštěním roztoku za současného přídavku kyseliny octové a ponecháním přes noc při 4 C, obdobně i druhá rekrystalizace. Finální konverze hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu na dihydrochlorid 17 byla provedena smísením jeho nasyceného roztoku s nasyceným roztokem chloridu draselného za varu a ochlazením. Přes noc vyloučené krystaly hydrogenvínanu draselného byly odfiltrovány, filtrát odpařen a byl získán dihydrochlorid (R)-1,2-diaminopropanu 17 ve výtěžku 99 %. Dihydrochlorid (S)-1,2-diaminopropanu 7 byl izolován z matečného louhu zmiňovaného výše. Matečný louh byl ponechán krystalizovat přes noc, vyloučené krystaly kontaminované malým množstvím (R)-enantiomeru byly odstraněny a roztok zakoncentrován. Poté byl přidán roztok NaH a vodná fáze byla oddestilována na * Čistota produktu byla ověřována pomocí 1 H NMR, a to tak, že k malému množství krystalů (20 30 mg) diastereoizomerní soli byl přidán přebytek 50% vodného NaH, uvolněná báze byla extrahována do CDCl 3 a k roztoku bylo před měřením přidáno chirální rozlišovací činidlo (R)-(-)-2,2,2-trifluoro-1-(9- anthryl)ethanol; u výsledného produktu byl obsah nežádoucího antipodu pod detekčním limitem. 17

19 RV; tímto krokem byl diamin zbaven většiny nečistot. Vodný destilát byl zneutralizován kyselinou chlorovodíkovou, roztok byl odpařen do sucha a byly získány krystaly dihydrochloridu (S)-1,2-diaminopropanu 7 ve výtěžku 52 % (obrázek 9). (S)-enantiomer byl získán ve výrazně nižším výtěžku než (R)-enantiomer. Krok, ve kterém bylo zřejmě ztraceno až 17 % (S)-enantiomeru, byl při druhém získání krystalů hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu, které jsme odstranili, protože dle NMR byly kontaminovány (S)-enantiomerem. Dalším krokem, kde se mohl výtěžek snížit, byla destilace na RV. CH 3 kys. L-(+)-vinná NH H 2 N 2 8 (RS)-1,2-diaminopropan CH 3 H H 2 N (S) NH 2.2 HC (R) (R) CH CH 3 H 2 N (R) NH H.2HC(R) (R) CH 16 H H 1. NaH, destilace 2. HCl KCl CH 3 H 2 N (S) NH 2.2HCl 7 CH 3 NH H 2 N (R) 2.2HCl 17 brázek 9. Dělení racemického 1,2-diaminopropanu na opticky aktivní dihydrochloridy 1,2-diaminopropanu. Příprava tetrabenzylesteru kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N tetraoctové Údajně nejefektivnější metodu přípravy opticky čisté pdta (ovšem ve formě dihydrochloridu 11) publikoval Florini et al., který zvolil postup přes tetraethylester kyseliny (R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové. 27 Jako alkylační činidlo byl použit ethylbromacetát. Vzniklý tetraethylester pdta (10) bylo nutné odchránit alkalickou hydrolýzou, čímž byly do reakční směsi opět zavedeny cizí ionty, a počáteční výhoda plynoucí z izolace lipofilního meziproduktu byla ztracena. Pdta měla být získána ve formě dihydrochloridu ve výtěžku 84 % přes dva kroky. Při pokusu o reprodukování Floriniho postupu jsme však opakovaně získali pouze znečištěný produkt obsahující méně než 50 % cílové látky. Jelikož jsme chtěli zabránit kontaminaci produktu cizími ionty, navrhli jsme syntetickou cestu přes tetrabenzylester 18, resp 19. Je vysoce lipofilní a dá se snadno deblokovat hydrogenolýzou, čímž se do reakce nezavádí žádné cizí ionty. Reakční podmínky použité Florinim pro přípravu tetraethylesteru jsme se pokoušeli optimalizovat změnami reakční teploty i báze, pokoušeli jsme se též o nahrazení 18

20 poměrně drahého benzylbromoacetátu levnějším benzylchloroacetátem za katalýzy NaI, dosáhli jsme ale většinou nižších výtěžků. Činidla, báze a výtěžky jsou shrnuty v tabulce č. 1. Po neúspěšných pokusech o nahrazení benzylbromoacetátu jsme toto činidlo zvolili jako vyhovující, ovšem podařilo se nám minimalizovat jeho množství, a tak zvýšit efektivitu celé syntézy. Tabulka č. 1 Přehled příprav tertabenzylesteru kyseliny (RS)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové v ACN Číslo reakce Činidlo a počet ekvivalentů na 1 CH Báze a počet ekvivalentů na 1 CH Doba reakce Teplota reakce Výtěžek (%)* 1. BrCH 2 CBn [4] K 2 C 3 [2,5] 4 dny rt >72 2. BrCH 2 CBn [1,5] K 2 C 3 [2,5] 7 dní rt <3 3. BrCH 2 CBn [1,5] K 3 P 4 [2,5] 7 dní rt ClCH 2 CBn [1,5] K 3 P 4 [2,5] 4 dny rt ClCH 2 CBn [1,5] K 3 P 4 [2,5] 4 dny 50 C BrCH 2 CBn [3] K 3 P 4 [2,5] 7 dní rt > ClCH 2 CBn [1,5] + NaI K 3 P 4 [2,5] 7 dní 50 C ClCH 2 CBn [1,5] + NaI K 3 P 4 [2,5] 7 dní reflux BrCH 2 CBn [1,5] K 3 P 4 [2,5] 7 dní rt > BrCH 2 CBn [1,5] K 3 P 4 [2,5] 7 dní rt > BrCH 2 CBn [1,5] K 3 P 4 [2,5] 15 dní rt 95 *rientační výtěžek - hmotnost surového produktu o obsahu % látky. V optimální nalezené variantě byl hydrochlorid 17 rozpuštěn v acetonitrilu, přidán K 3 P 4 a BrCH 2 CBn a reakční směs byla míchána po dobu 7 dní. Průběh reakce byl monitorován TLC. Po oddestilování acetonitrilu byla organická fáze extrahována do směsi diethyletheru a ethylacetátu a vodná fáze byla ještě dvakrát extrahována diethyletherem. rganická fáze byla vysušena síranem sodným, zfiltrována a odpařena. Poté byla provedena chromatografie na silikagelové koloně a byl získán tetrabenzylester kyseliny (R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové 18. Elementární analýza získaného produktu neodpovídala vypočteným hodnotám, sloučenina byla zřejmě kontaminována neidentifikovanou balastní látkou, nicméně NMR spektra produktu nebyla zásadněji ovlivněna a tato balastní látka kompletně vymizela v následujícím kroku, takže nebylo nutné postup izolace tetraethylesteru dále optimalizovat. Postup pro získání tetrabenzylesteru kyseliny (S)-1,2-diaminopropan- N,N,N,N -tetraoctové 19 byl stejný jako v předchozím případě (obrázek 10). 19

21 R 1 R 2 NH 2. 2 HCl H 2 N BrCH 2 CBn K 3 P 4,ACN,7d,rt BnC BnC N R 1 R 2 N CBn CBn 7, R 1 =CH 3 ;R 2 =H 18, R 1 =CH 3 ;R 2 =H 17, R 1 =H; R 2 =CH 3 19, R 1 =H; R 2 =CH 3 brázek 10. Příprava tetrabanzylesteru pdta z dihydrochloridu 1,2-diaminopropanu. Příprava volné kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové Deprotekce tetrabenzylesteru pdta (18) byla provedena standardním postupem užívaným pro deblokaci benzylesterů karboxylových kyselin, a to hydrogenolýzou za katalýzy 10% palladiem na aktivním uhlí. Tetrabenzylester byl rozpuštěn ve směsi ethylacetátu a methanolu, bylo přidáno 10% palladium na aktivním uhlí a roztok byl intenzivně míchán za mírného přetlaku vodíku; průběh reakce byl monitorován pomocí TLC. Po skončení reakce byla směs naředěna vodou, katalyzátor odfiltrován přes křemelinu a filtrát byl odpařen. Pevný odparek byl zbaven mechanických nečistot rozpuštěním v malém množství vody a přefiltrováním přes hydrofilní filtr. Filtrát byl opět odpařen a odparek důkladně vysušen kodestilací s methanolem a poté s ethanolem. Jelikož se jako jediná praktická metoda přečištění produktu jevila krystalizace, vyzkoušeli jsme postupně řadu různých podmínek. Rozpouštění v ethanolu, tetrahydrofuranu a methanolu při 70 C nevedlo k výsledku pro nízkou až téměř nulovou rozpustnost pdta v těchto rozpouštědlech. Pokusy o krystalizaci z vody byly naopak neúspěšné následkem příliš vysoké vodorozpustnosti látky. Proto jsme přešli k testování různých směsí organických rozpouštědel s vodou. Mimo jiné jsme zkusili směs voda-methanol 1:19 (obj./obj.) při 70 C, která se ukázala jako perspektivní, ale protože k úplnému rozpuštění by bylo třeba příliš velkých objemů rozpouštědla, zvýšili jsme obsah vody na 1:9. dparek byl rozpouštěn ve směsi voda-methanol 1:9 při 70 C na nasycený roztok, a ten byl ponechán krystalizovat přes noc při 4 C. Vzniklé krystaly kyseliny (R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové 12 byly odfiltrovány a vysušeny ve vakuu nad P 2 5. (S)-tetrakyselina 13 byla připravena stejným způsobem. Analýza prokázala, že tímto postupem se podařilo získat produkt o vyšší čistotě než uvádí dosavadní literatura, a navíc ve vysokém výtěžku (až 63 %). Podle dostupné literatury 20

22 se také jedná o první případ, kdy byla pdta přímo izolována krystalizací ve zcela bezvodé formě (obrázek 11). BnC CBn HC H 2,10%Pd/C BnC N N CBn HC N EtAc-MeH,12h,rt R 1 R 2 R 1 R 2 N CH CH 18,R 1 =CH 3 ;R 2 =H 19,R 1 =H; R 2 =CH 3 12, R 1 =CH 3 ;R 2 =H 13, R 1 =H; R 2 =CH 3 brázek 11. Hydrogenolýza tetrabenzylesteru na (R)- nebo (S)-pdta. Příprava komplexu kyseliny (R)- a (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové se samariem Finální fáze syntézy byla provedena postupem dle japonského patentu z roku K suspenzi Sm 2 3 ve vodě byla přidána příslušná tetrakyselina a reakční směs byla zahřívána k reflexu po dobu 30 minut. Po vyčeření a zchladnutí reakční směsi bylo ph upraveno roztokem hydroxidu sodného na přibližně 8. Vzniklý roztok byl odpařením zahuštěn a zbaven mechanických nečistot přefiltrováním přes hydrofilní filtr Rotilabo 0,22 μm. Pro tyto komplexy se nepodařilo nalézt vhodné podmínky krystalizace, protože v polárních soustavách obsahujících vodu byla rozpustnost komplexů příliš vysoká, zatímco použití méně polárních soustav založených na organických rozpouštědlech vedlo k tvorbě gelovitých fází. Vzhledem k tomu, že však reakční směs neobsahovala prakticky žádné detekovatelné nečistoty, bylo možné produkt izolovat její přímou lyofilizací. Cílový [(R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N tetraacetáto]samarát sodný dihydrát (2) a [(S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N tetraacetáto]samarát sodný dihydrát (3) byly získány ve výtěžku okolo 90 % ve formě lehkého bílého prášku vysoce rozpustného ve vodě. 21

23 Experimentální část becné metody Pokud není uvedeno jinak, činidla a rozpouštědla používaná v této práci byla zakoupena od komerčních dodavatelů (Sigma-Aldrich, Fluka, Merck) a použita bez dalšího čištění. Rozpouštědla byla odpařována při 55 C a 2 kpa a produkty byly sušeny nad P 2 5 při 13 Pa za laboratorní teploty. Tenkovrstevná chromatografie (TLC) na hliníkových destičkách potažených silikagelem (Fluka) byla prováděna v následujících systémech (v/v): 2-propanol, voda, konc. vodný amoniak 7:1:2 (IPAV) a 20% ethylacetát v toluenu (T2). Sloučeniny byly zviditelňovány pomocí UV záření (254 nm), sprejováním roztokem ninhydrinu (tmavomodré zbarvení aminů po ohřevu), 1% vodným roztokem KMn 4 (odbarvení oxidujícími se sloučeninami), a sprejováním 1% ethanolickým roztokem 4-(4-nitrobenzyl)pyridinu následovaným ohřevem a vystavením plynnému amoniaku (modrá barva esterů a alkylujících sloučenin). Chromatografické čištění látek bylo prováděno na silikagelu (40-63 µm, Fluka). Body tání byly stanoveny pomocí Boetiova bloku a jsou nekorigovány. Pro filtrace vodných roztoků byl používán hydrofilní filtr Rotilabo 0,22 μm, PVDF (Carl Roth GmbH). 1 H a 13 C NMR spektra byla měřena na spektrometru Bruker AVANCE-600 ( 1 H při MHz, 13 C při MHz) v CDCl 3, DMS-d 6, CD 3 D nebo D 2 roztoku při 300 K. 2D-H,H-CSY, 2D- H,C-HSQC a 2D-H,C-HMBC spektra byla měřena a použita pro strukturní přiřazení protonových a uhlíkových signálů. HRMS spektra byla měřena na FTMS hmotnostním spektrometru LTQ-orbitrap XL (Thermo Fisher, Bremen, Germany) s iontovým zdrojem ESI nebo v případě HRMS (EI) na spektrometru GCT Premier (Waters). Čistota cílových látek byla potvrzena elementární analýzou (C, H, N, Sm, Na). ptická rotace byla měřena na přístroji AUTPL IV (Rudolph Research Analytical, USA). Dělení (RS)-1,2-diaminopropanu na enantiomery - původní postup 10 Dihydrochlorid (R)-(+)-1,2-diaminopropanu (17) Kyselina L-(+)-vinná (700,0 g, 4,66 mol, 2 ekv.) byla rozpuštěna v 750 ml H 2 a za intenzivního míchání na magnetickém míchadle byl pozvolna přidáván (RS)-1,2- diaminopropan 8 (200 ml, 2,33 mol) z přikapávací nálevky za silného vývoje tepla. Po vychladnutí na laboratorní teplotu se začaly vylučovat krystaly a roztok byl dále 22

24 ponechán krystalizovat přes noc při 4 C. Krystaly byly odfiltrovány a promyty postupně 500 ml ledové vody a 300 ml ethanolu, po vysušení ve vakuu bylo získáno 525,89 g surového hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu. Získaný nažloutlý matečný louh byl použit k izolaci (S)-enantiomeru, viz dále. 1. rekrystalizace: 525,89 g hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu bylo rozpuštěno za varu v 721 ml vody, k roztoku bylo přidáno 42,5 ml AcH, a po vychladnutí na laboratorní teplotu byl ponechán krystalizovat přes noc při 4 C. Vyloučené krystaly byly odfiltrovány, filtrační koláč byl promyt 200 ml ledové vody a 300 ml ethanolu. Po vysušení v exsikátoru získáno 457,08 g hydrogenvínanu (R)-1,2- diaminopropanu. 2. rekrystalizace: K 457,08 g hydrogenvínanu bylo přidáno 500 ml vody, roztok byl přiveden k varu, a po rozpuštění krystalů bylo přidáno 30 ml AcH. Po vychladnutí na laboratorní teplotu se začaly vylučovat krystaly a roztok byl dále ponechán krystalizovat přes noc při 4 C. Vyloučené krystaly byly odfiltrovány a promyty postupně 400 ml ledové vody, 300 ml ethanolu a 2x 100 ml etheru. Po vysušení v exsikátoru získáno 434,38 g čistého hydrogenvínanu (R)-1,2- diaminopropanu ve formě bílé krystalické látky. Konverze na hydrochlorid: 434,38 g hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu bylo rozpuštěno v 470 ml H 2 a roztok přiveden k varu. Současně byl k varu přiveden i nasycený roztok 178 g KCl v 319 ml H 2. Roztok KCl byl pomalu a velmi opatrně za míchání přiléván k roztoku hydrogenvínanu (po krátké indukční periodě dojde k prudkému varu). Vzápětí se začaly vylučovat krystaly hydrogenvínanu draselného, po vychladnutí na laboratorní teplotu ponecháno krystalizovat při 4 C přes noc. dfiltrované krystaly hydrogenvínanu byly promyty 150 ml ledové H 2 a filtrát na RV odpařen při 65 C do sucha. Krystalický odparek byl 3x kodestilován s cca 150 ml ethanolu a vysušen v exsikátoru za vakua nad P 2 5. Byl získán dihydrochlorid (R)- diaminopropanu 17 jako bílá krystalická látka (170,04 g, 99,0 %). 1 H NMR (600 MHz, D 2 ): δ = 3.76 (m, J = 7.1, 6.8(3x) a 6.1 Hz, 1H, N-CH<), 3.37 (dd, J = 13.6 a 6.1 Hz, 1H, N-CHaHb-), 3.24 (dd, J = 13.6 a 7.1 Hz, 1H, N-CHaHb-), 1.44 (d, J = 6.8 Hz, 3H, -CH 3 ). 13 C NMR (150.9 MHz, D 2 ): δ = (N-CH<), (N-CH 2 -), (-CH 3 ). IR max /cm -1 (KBr): 1606 (NH 2 ); 1531, 1529 (NH + 3 ) 23

25 HRMS (ESI) vypočítáno pro C 3 H 11 N 2, m/z 75,09167, nalezeno 75,09163 (M+H) +. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 24,50; H 8,23; Cl 48,22; N 19,05. Nalezeno (%): C 22,01; H 7,30; Cl 47,77; N 16,46. [α] 20 D = +3,62 (c 14,91 g/100 ml H 2, lit. 8 : -4,04 ) Bod tání: C (lit. 8 : 240 C) Dihydrochlorid (S)-(-)-1,2-diaminopropanu (7) Prvotní matečný louh z předchozí neutralizace (RS)-1,2-diaminopropanu kyselinou vinnou byl znovu ponechán krystalizovat přes noc při 4 C, vyloučené malé množství krystalů kontaminovaných zbylým hydrogenvínanem (R)-diaminopropanu bylo odfiltrováno a roztok zakoncentrován na objem cca 800 ml. Za chlazení v ledové lázni byl opatrně přilit vodný roztok obsahující 186,7 g (4 ekvivalenty) NaH v cca 400 ml H 2, kapalná fáze byla poté kompletně oddestilována. Vodný destilát obsahující (S)- 1,2-diaminopropan byl zneutralizován pomocí 176,6 ml 35% HCl (kyselina byla přikapávána až do dosažení ph 3). Roztok byl odpařen do sucha na RV při 65 C a vzniklé krystaly 3x kodestilovány s cca 150 ml ethanolu. Po vysušení v exsikátoru za vakua nad P 2 5 byl získán dihydrochlorid 7 jako bílá krystalická látka (72,20 g, 42,0 %). 1 H NMR (600 MHz, D 2 ): δ = 3.75 (m, J = 7.1, 6.8(3x) a 6.1 Hz, 1H, N-CH<), 3.36 (dd, J = 13.6 a 6.1 Hz, 1H, N-CHaHb-), 3.24 (dd, J = 13.6 a 7.1 Hz, 1H, N-CHaHb-), 1.44 (d, J = 6.8 Hz, 3H, -CH 3 ). 13 C NMR (150.9 MHz, D 2 ): δ = (N-CH<), (N-CH 2 -), (-CH 3 ). IR max /cm -1 (KBr) 1606, 1561, 1529, 1489 (NH + 3 ) HRMS (ESI) vypočítáno pro C 3 H 11 N 2, m/z 75,09167, nalezeno 75,09159 (M+H) +. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 24,50; H 8,23; Cl 48,22; N 19,05. Nalezeno (%): C 24,58; H 8,34; Cl 48,08; N 18,77. [α] 20 D = -3,61 (c 12,39 g/100 ml H 2 ) Bod tání: C 24

26 Dělení (RS)-1,2-diaminopropanu na enantiomery - nový postup Dihydrochlorid (R)-(+)-1,2-diaminopropanu (17) Kyselina L-(+)-vinná (87,50 g, 0,583 mol, 2 ekv.) byla rozpuštěna v 204 ml H 2, za intenzivního míchání na magnetickém míchadle byl pozvolna přidáván z přikapávací nálevky (RS)-1,2-diaminopropan 8 (25 ml, 0,292 mol) za silného vývoje tepla. Po vychladnutí na laboratorní teplotu se začaly vylučovat krystaly, ponecháno krystalizovat přes noc při 4 C. Krystaly byly odfiltrovány a promyty postupně 500 ml ledové H 2, 200 ml ethanolu a 150 ml etheru; získáno 65,19 g surového hydrogenvínanu (R)-1,2- diaminopropanu. Získaný nažloutlý matečný louh byl použit k izolaci (S)-enantiomeru, viz dále. Rekrystalizace: 65,19 g surového hydrogenvínanu (R)-1,2-diaminopropanu bylo rozpuštěno v 80 ml H 2 za varu, bylo přidáno 5 ml AcH, a po vychladnutí na laboratorní teplotu byl roztok ponechán krystalizovat přes noc při 4 C. Krystaly byly odfiltrovány, filtrační koláč byl promyt 150 ml ledové H 2, 200 ml ethanolu a 150 ml etheru. Po vysušení krystalů v exsikátoru bylo získáno 55,88 g hydrogenvínanu (R)-1,2- diaminopropanu. Toto množství bylo rozpuštěno v 60 ml H 2 a přivedeno k varu, současně byl přiveden k varu i roztok 22,9 g KCl v 41 ml H 2. Roztok KCl byl pomalu a velmi opatrně za míchání přiléván k roztoku hydrogenvínanu (po krátké indukční periodě dojde k prudkému varu). Po vychladnutí na laboratorní teplotu ponecháno krystalizovat při 4 C přes noc. dfiltrované krystaly hydrogenvínanu draselného byly promyty 150 ml ledové H 2 a filtrát na RV odpařen při 65 C do sucha. Krystalický odparek byl 3x kodestilován s cca 150 ml ethanolu a vysušen v exsikátoru za vakua nad P 2 5. Získán dihydrochlorid 17 jako bílá krystalická látka (20,02 g, 93,4 %). Dihydrochlorid (S)-(-)-1,2-diaminopropanu (7) Prvotní matečný louh z předchozí neutralizace (RS)-1,2-diaminopropanu kyselinou vinnou byl znovu ponechán krystalizovat přes noc při 4 C, vyloučené malé množství krystalů kontaminovaných (R)-enantiomerem odfiltrováno a roztok zakoncentrován na objem cca 200 ml. Za chlazení v ledové lázni byl opatrně přilit vodný roztok obsahující 23,33 g NaH (4 ekvivalenty) v 50 ml H 2. Kapalná kapalná fáze byla poté kompletně oddestilována, vodný destilát obsahující (S)-1,2-diaminopropan byl zneutralizován pomocí 14,7 ml 35% HCl (kyselina přikapávána až do dosažení ph=3). Reakční směs 25

27 byla odpařena do sucha při 65 C na RV a byla provedena 3x kodestilace krystalů s cca 150 ml ethanolu. Po vysušení v exsikátoru získán dihydrochlorid 7 jako bílá krystalická látka (11,26 g, 52,5 %). Tetrabenzylester kyseliny (R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové (18), optimalizovaný postup K roztoku dihydrochloridu 17 (2,000 g, 13,6 mmol) v ACN (100 ml) byl přidán K 3 P 4 (28,80 g, 136 mmol, 10 ekv.) a BrCH 2 CBn (17 ml, 107 mmol, 8 ekv.). Reakční směs byla intenzivně míchána za laboratorní teploty na magnetickém míchadle. Po 7 dnech byl ověřen průběh reakce pomocí TLC (soustava T2). ACN byl nejdříve odpařen na RV, poté byla reakční směs rozdělena mezi 500 ml H 2 a 350 ml diethyletheru/100 ml EtAc. Vodná fáze byla ještě extrahována 2x150 ml diethyletheru. Spojená organická fáze byla vysušena Na 2 S 4, přefiltrována a odpařena na RV. Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu EtAc v toluenu. Po odpaření na RV byl odparek kodestilován s cca 20 ml CH 2 Cl 2 a vysušen ve vakuu nad P 2 5. Bylo získáno 10,23 g surového tetrabenzylesteru 18 ve formě světle žluté olejovité kapaliny. 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ): δ = (m, 20H, 4x C 6 H 5 ), 5.09 a 5.08 (2x d, J = 12.5 Hz, 4H, H-9), 5.08 (s, 4H, H-8), 3.65 (bs, 4H, H-5), 3.62 a 3.58 (2x d, J = 17.5 Hz, 4H, H-4), 3.09 (m, 1H, H-2), 2.92 (dd, J = 13.5 a 6.9 Hz, 1H, H-1a), 2.58 (m, 1H, H- 1b), 0.99 (d, J = 6.7, 3H, H-3). 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl 3 ): δ = (2C, C-6), (2C, C-7), (2C), (2C), (4C), (4C), (10C) a (2C, 4x C 6 H 5 ), (2C, C-9), (2C, C-8), (C-1), (C-2), (2C, C-5), (2C, C-4), (C-3). IR max /cm -1 (CCl 4 ): 1751, 1160 (CBn); 1456, 1001 (Ph). HRMS (ESI) vypočítáno pro C 39 H 42 8 N 2 Na, m/z 689,28334, nalezeno 689,28321 (M+Na) +. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 70,25; H 6,35; N 4,20; 19,20. Nalezeno (%): C 70,22; H 6,25; N 3,47. 26

28 Tetrabenzylester kyseliny (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctové (19), optimalizovaný postup K roztoku dihydrochloridu 7 (4,000 g, 27,2 mmol) v ACN (200 ml) byl přidán K 3 P 4 (57,60 g, 272 mmol, 10 ekv.) a BrCH 2 CBn (34 ml, 214 mmol, 8 ekv.). Postup byl analogický jako v případě látky 18. Bylo získáno 22,25 g surového tetrabenzylesteru 19 ve formě světle žluté olejovité kapaliny. 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ): δ = (m, 20H, 4x C 6 H 5 ), 5.10 a 5.08 (2x d, J = 12.5 Hz, 4H, H-9), 5.08 (s, 4H, H-8), 3.63 (bs, 4H, H-5), 3.62 a 3.58 (2x d, J = 17.5 Hz, 4H, H-4), 3.08 (m, 1H, H-2), 2.92 (dd, J = 13.5 a 7.0 Hz, 1H, H-1a), 2.55 (m, 1H, H- 1b), 0.99 (d, J = 6.7, 3H, H-3). 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl 3 ): δ = (2C, C-6), (2C, C-7), (2C), (2C), (4C), (4C), (8C), (2C) a (2C, 4x C 6 H 5 ), (2C, C-9), (2C, C-8), (C-1), (C-2), (2C, C-5), (2C, C-4), (C-3). IR max /cm -1 (CCl 4 ): 1751(C=); 1139(C-); 1184, 696 (Ph). Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 70,25; H 6,35; N 4,20; 19,20. Nalezeno (%): C 69,10; H 6,32; N 2,35. Kyselina (R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctová (12) Tetrabenzylester 18 (17,20 g, 25,8 mmol) byl rozpuštěn ve směsi 60 ml EtAc a 240 ml MeH. Po přidání 450 mg 10% Pd/C byla za intenzivního míchání na magnetické míchačce provedena hydrogenolýza za tlaku vodíku kpa (15 psi). Po 12 hodinách dle TLC (soustava T2) výchozí látka kompletně vymizela. Reakční směs byla naředěna 100 ml H 2, přefiltrována přes křemelinu a odpařena na RV. dparek byl rozpuštěn v malém množství vody a zfiltrován přes hydrofilní filtr. Filtrát byl odpařen na RV a následně 2x kodestilován s malým množstvím MeH a 2x s EtH. dparek byl rozpuštěn ve směsi H 2 -MeH 1:9 (obj./obj., cca 250 ml) při 70 C. Ponecháno krystalizovat při 4 C přes noc. Vzniklé krystaly byly odfiltrovány na fritě, promyty malým množstvím MeH a diethyletheru a vysušeny v exsikátoru za vakua nad P 2 5 ; byla získána tetrakyselina 12 ve formě čistě bílých krystalů (4,391 g, 55,6 %). 27

29 1 H NMR (600 MHz, D 2 ): δ = 3.92 (d, J = 17.1 Hz, 2H, H-5a), 3.83 (s, 4H, H-4), 3.80 (d, J = 17.1 Hz, 2H, H-5b), 3.72 (m, 1H, H-2), 3.26 (dd, J = 14.8 a 3.8 Hz, 1H, H-1a), 3.09 (dd, J = 14.8 a 11.8 Hz, 1H, H-1b), 1.23 (d, J = 6.7 Hz, 3H, H-3). 13 C NMR (150.9 MHz, D 2 ): δ = (2C, C-6), (2C, C-7), (C-2), (2C, C-4), (C-1), (2C, C-5), (C-3). IR max /cm -1 (KBr): 1739 (C-); 1399 (C 2 ); 3018 (CH 2 ). HRMS (ESI) vypočítáno pro C 11 H 17 8 N 2, m/z 305,09904, nalezeno 305,09912 (M-H) -. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 43,14; H 5,92; N 9,15; 41,79. Nalezeno (%): C 42,86; H 5,82; N 8,99. [α] 20 D = -48,86 (c 7,81 g/100 ml H 2, lit. 22 : -50,00 ) Bod tání: C, (lit. 22 : 198 C) Kyselina (S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraoctová (13) (S)-tetrabenzylester 19 (22,95 g, 34,4 mmol) byl rozpuštěn ve směsi 60 ml EtAc a 240 ml MeH, přidáno 450 mg 10% Pd/C. Postup byl analogický jako v případě látky 12. Byla získána tetrakyselina 13 ve formě čistě bílých krystalů (5,248 g, 63,0 %). 1 H NMR (600 MHz, D 2 ): δ = 3.92 (d, J = 17.1 Hz, 2H, H-5a), 3.83 (s, 4H, H-4), 3.81 (d, J = 17.1 Hz, 2H, H-5b), 3.71 (m, 1H, H-2), 3.26 (dd, J = 14.8 a 3.8 Hz, 1H, H-1a), 3.09 (dd, J = 14.8 a 11.8 Hz, 1H, H-1b), 1.22 (d, J = 6.7 Hz, 3H, H-3). 13 C NMR (150.9 MHz, D 2 ): δ = (2C, C-6), (2C, C-7), (C-2), (4C, C-1 a C-4), (2C, C-5), (C-3). IR max /cm -1 (KBr): 3419 (CH); 1738 (C-); 3017, 2977 (CH 2 ); 1218 (CH). HRMS (ESI) vypočítáno pro C 11 H 18 8 N 2 Na, m/z 329,09554, nalezeno 329,09549 (M+Na) +. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 43,14; H 5,92; N 9,15; 41,79. Nalezeno (%): C 43,05; H 5,99; N 8,85. [α] 20 D = +50,42 (c 7,00 g/100 ml H 2 ) Bod tání: C [(R)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraacetát] samarát sodný dihydrát (2) Do suspenze Sm 2 3 (4,700 g, 13,5 mmol) v 270 ml H 2 byla přidána tetrakyselina 12 (8,256 g, 27,0 mmol, 2 ekv.) a reakční směs byla zahřívána na olejové lázni pod 28

30 zpětným chladičem k varu za intenzivního míchání magnetickým míchadlem. Po 90 minutách se suspenze vyčeřila, po zchlazení na laboratorní teplotu bylo ph upraveno na 8 pomocí 1M vodného NaH (cca 27 ml). Roztok byl na RV zahuštěn na objem cca 200 ml a zfiltrován přes hydrofilní filtr. Lyofilizací filtrátu byl získán cílový komplex 2 ve formě lehké bílé látky (12,953 g, 93,9 %). 1 H NMR (600 MHz, D 2 ): δ = 4.01 a 2.84 (2x d, J = 17.0 Hz, 2H, H-4), 3.91 a 3.02 (2x d, J = 16.0 Hz, 2H, H-4), 3.10 a 2.67 (2x d, J = 16.3 Hz, 2H, H-5), 2.03 a 1.72 (d, J = 16.6 Hz, 2H, H-5), 0.95 (bm, 1H, H-2), 0.76 (dd, J = 14.1 a 1.7 Hz, 1H, H-1a), 0.11 (bt, J = 14.1 a ~12 Hz, 1H, H-1b), 0.08 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-3). 13 C NMR (150.9 MHz, D 2 ): δ = (C-6), (C-7), (C-6), (C- 7), (C-4), (C-5), (C-4), (C-1), (C-2), (C-5), (C-3). IR max /cm -1 (KBr): 1606, 1406 (-C - 2 ). HRMS (ESI) vypočítáno pro C 11 H 14 8 N 2 Sm, m/z 453,99529, nalezeno 453,99523 (M- Na) -. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 25,82; H 3,55; N 5,48; Na 4,49; 31,27; Sm 29,39. Nalezeno (%):C 26,16; H 3,24; N 5,31; Na 4,50; Sm 30,99. [α] 20 D = -11,99 (c 6,07 g/100 ml H 2, lit. 31 : -4,00-6,00 ) [(S)-1,2-diaminopropan-N,N,N,N -tetraacetát] samarát sodný dihydrát (3) Do suspenze Sm 2 3 (2,846 g, 8,16 mmol) a 164 ml H 2 byla přidána tetrakyselina 13 (5,000 g, 16,3 mmol, 2 ekv.) a reakce provedena shodně s postupem pro opačný enantiomer. Byl získán cílový komplex 3 jako jemný bílý prášek (7,351 g, 88,0 %). 1 H NMR (600 MHz, D 2 ): δ = 3.99 a 2.85 (2x d, J = 17.0 Hz, 2H, H-4), 3.87 a 3.00 (2x d, J = 16.0 Hz, 2H, H-4), 3.10 a 2.66 (2x d, J = 16.4 Hz, 2H, H-5), 2.05 a 1.78 (2x d, J = 16.7 Hz, 2H, H-5), 0.99 (m, 1H, H-2), 0.78 (bd, J = 14.0, 1H, H-1a), 0.15 (bt, J ~ 14 a ~12 Hz, 1H, H-1b), 0.10 (d, J = 6.4 Hz, 3H, H-3). 13 C NMR (150.9 MHz, D 2 ): δ = (C-6), (C-7), (C-6), (C- 7), (C-4), (C-5), (C-4), (C-1), (C-2), (C-5), (C-3). IR max /cm -1 (KBr): 1605, 1405 (-C - 2 ). 29

31 HRMS (ESI) vypočítáno pro C 11 H 14 8 N 2 Na 2 Sm, m/z 499,97373, nalezeno 499,97380 (M+Na) +. Elementární analýza: Teoretické složení (%): C 25,82; H 3,55; N 5,48; Na 4,49; 31,27; Sm 29,39. Nalezeno (%):C 26,28; H 3,08; N 5,35; Na 4,57; Sm 31,13. [α] 20 D = (c 7,90 g/100 ml H 2 ) 30