Mykoheterotrofie a mixotrofie orchidejí

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Oddělení fyziologie a anatomie rostlin Mykoheterotrofie a mixotrofie orchidejí bakalářská práce Šárka Svobodová VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Brno 2012

2 Bibliografický záznam Autor: Šárka Svobodová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Mykoheterotrofie a mixotrofie orchidejí Studijní program: Biologie Studijní obor: Obecná biologie, Fyziologie rostlin Vedoucí práce: RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Akademický rok: 2011/2012 Počet stran: 47 Klíčová slova: mykoheterotrofie; mixotrofie; mutualismus, epiparazitismus; Orchidaceae; 15 N; 13 C

3 Bibliographic Entry Author: Šárka Svobodová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Myco-heterotrophy and mixotrophy of orchids Degree Programme: Biology Field of Study: General Biology, Plant Physilogy Supervisor: RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Academic Year: 2011/2012 Namber of Pages: 47 Keywords: myco-heterotrophy; mixotrophy; mutualism; epiparasitism; Orchidaceae; 13 C; 15 N

4 Abstrakt V této bakalářské práci jsem se zabývala mykoheterotrofií, jako jedním z možných způsobů výživy nezelených rostlin. Zdá se, že mykoheterotrofie je evoluční adaptací na nepříznivé světelné podmínky a v průběhu evoluce se opakovaně vyvinula v širokém spektru rostlinných taxonů. Z hlediska uhlíkaté výživy a nutnosti asociace s mykorhizní houbou je nejdůležitější čeleď Orchidaceae, protože na vytvoření asociace s vhodným mykorhizním partnerem jsou v raných fázích svého životního cyklu závislí všichni příslušníci této čeledi. U dospělých orchidejí existuje z hlediska získávání energeticky bohatých uhlíkatých sloučenin velká variabilita. Patří sem přibližně 220 druhů achlorofylních a i v dospělosti plně mykoheterotrofních rostlin, dále druhy mixotrofní, které získávají část uhlíku od mykorhizního partnera a část vlastní fotosyntetickou asimilací vzdušného CO 2 a v neposlední řadě také druhy autotrofní, které si svoje potřeby uhlíku kryjí pouze fotosyntézou. V této práci jsem se tedy pokusila shrnout současné poznatky o výživě orchidejí a také možnosti studia látkových přenosů v orchideoidní mykorhize. Abstract In this thesis, I dealt with myco-heterotrophy, like one of the possible ways of nutrition of achlorophyllous plants. It seems like myco-heterotrophy is an evolutionary adaptation to unfavourable light conditions and has repeatedly evolved in the broad spectrum of plant taxa. From the point of view of carbonaceous nutrition and necessity of association with mycorrhizal fungi is the most important the family Orchidaceae, because in early developmental stages all members of this family are dependent on formation of association with the appropriate fungi. Among adult orchids there is a big variability of acquisition of the energetically rich carbon compounds. There are about 220 achlorophyllous orchid species which are fully myco-heterotropic also in adulthood, there are the mixotrophic species, which gain a part of carbon from their fungal partner and a part through photosynthetic assimilation of CO 2 from air and last, but not least there are many green species, which cover their costs of carbon through photosynthesis only. In this thesis, I tried to sum up current knowledge about nutrition of orchids as well as possibilities of study the nutrition transfers in orchid mycorrhiza.

5

6

7 MOTTO The strongest arguments prove nothing so long as the conclusions are not verified by experience. Experimental science is the queen of sciences and the goal of all speculation....roger Bacon Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat především vedoucímu mojí bakalářské práce RNDr. Milanu Balážovi, Ph.D. za cenné rady, vstřícný přístup a čas, který mi věnoval při psaní práce. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat mojí rodině a příteli za podporu a za trpělivost.

8 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 9. května Šárka Svobodová

9 Obsah 1 Definice mykoheterotrofie Taxony mykoheterotrofních rostlin Mykorhizní asociace mykoheterotrofních rostlin Arbutoidní mykorhiza Monotropoidní mykorhiza Arbuskulární mykorhiza Mykoheterotrofie a orchideoidní mykorhiza Orchideoidní mykorhizní symbióza Mykoheterotrofie klíčících orchidejí Orchideoidní mykorhiza plně mykoheterotrofních orchidejí Houby vytvářející mykorhizní asociace s plně MHT orchidejemi Způsob výživy plně MHT orchidejí Mixotrofní orchideje Autotrofní orchideje Seznam použité literatury

10 DEFINICE MYKOHETEROTROFIE 1 Definice mykoheterotrofie Mezi vyššími rostlinami můžeme nalézt malou, ale zajímavou skupinu nezelených (achlorofylních) rostlin, které se v průběhu evoluce dokonale adaptovaly na nepříznivé světelné podmínky. Vyskytují se většinou na částečně nebo plně zastíněných stanovištích napříč téměř všemi kontinenty a podnebnými pásy. Vzhledem k faktu, že tyto rostliny nemohou k získávání energie pro redukci uhlíku z CO 2 využívat sluneční záření, řadíme tyto achlorofylní druhy mezi heterotrofní organismy a podle strategie získávání živin je dělíme na dvě základní skupiny: na holoparazity, kteří jsou pomocí speciálně metamorfovaných kořenů, tzv. haustorií, napojeni na svého hostitele a odčerpávají živiny přímo z jeho cévních svazků (např. kokotice nebo záraza) a dále na druhy, které pro získávání potřebných živin tvoří asociace s jinými organismy konkrétně houbami. Pro tyto rostliny, dříve nesprávně označované jako saprofytické, používáme název mykoheterotrofní (MHT) (Leake 1994), protože zdrojem jejich výživy není rozklad mrtvé organické hmoty, jako u saprofytických hub, ale specifické mykorhizní asociace. V symbióze hub s nezelenými rostlinami chápeme mykorhizního symbionta jako organismus, který je tímto soužitím poškozovaný, tzn., že achlorofylní rostlina parazituje na svém houbovém partnerovi. Vztah mykoheterotrofní rostlina houba proto označujeme jako parazitickou symbiózu, v níž hostitel, v tomto případě nezelená rostlina, prospívá na úkor mykorhizní houby (Gryndler et al. 2004). Dlouho se nedařilo vyřešit otázku, jakým způsobem se vlastně mykorhizní houby v asociacích s achlorofylními rostlinami živí. Tok uhlíku z hostitelské rostliny do mycelia houbového symbionta, který je typický pro ostatní typy mykorhiz, není vzhledem k absenci fotosyntetického aparátu v tomto případě možný. Na základě řady pozorování existovala již ve 30. letech minulého století domněnka, že achlorofylní příslušníci podčeledi Monotropoideae sdílí houbové mycelium s okolními dřevinami, s jehož pomocí mohou od těchto zelených rostlin získávat potřebný uhlík (Romell 1939). Významný pokrok v objasnění fungování výživy MHT rostlin byl učiněn na základě experimentu s radioaktivně značenou glukózou ( 14 C) a fosforem ( 32 P) (Björkman 1960), který potvrdil existující přenos značených sloučenin z autotrofních dřevin Picea a Pinus do okolních achlorofylních rostlin Monotropa hypopithys a zároveň výraznou 10

11 DEFINICE MYKOHETEROTROFIE redukci růstu M. hypopithys při jeho fyzické separaci od kořenů autotrofní dřeviny. Björkman pro tento vztah poprvé použil označení epiparazitismus a experimentálně potvrdil výsledky předchozích pozorování, tzn., že achlorofylní rostlina parazituje na autotrofní prostřednictvím ektomykorhizní houby. V následujících letech byl hlavním problémem při studiu MHT rostlin zejména nedostatek informací o asociovaných houbách, který se podařilo vyřešit až s rozvojem molekulární biologie. Hypotézu epiparazitismu se definitivně podařilo prokázat na základě molekulárně-genetické analýzy izolátů hub z kořenů zástupců podčeledi Monotropoideae (Ericaceae) (Bidartondo & Bruns 2002, Leake 2005). Dnes tedy již poměrně přesně známe model jakési sdílené mykorhizy, kde nezelená mykoheterotrofní rostlina využívá uhlík odčerpaný ze sousedních autotrofních druhů, který získává prostřednictvím společné mykorhizní houby (Vohník 2010). Plně mykoheterotrofní (= holomykoheterotrofní) rostliny, tj. rostliny po celý život zcela závislé na MHT, jsou rozšířené téměř po celém světě, je známo více než 400 druhů v 87 rodech napříč nejrůznějšími taxony (Merckx & Freundstein. 2010), některými autory je uváděno až 500 druhů plně MHT rostlin (Smith & Read 2008). Dosahují značného velikostního rozpětí od několikacentimetrových jedinců až po 40m liány (Leake 1994). Přes velkou druhovou pestrost se mykoheterotrofové vyznačují několika společnými znaky. Jedním z nich je malá listová plocha a již zmíněná absence fotosyntetických barviv, dále pak částečně redukovaný, případně zcela chybějící kořenový systém. Zřejmě nejdůležitějším společným znakem mykoheterotrofních rostlin je redukce velikosti jejich semen, která je vlastně hlavním důvodem jejich závislosti na mykorhizní asociaci. Tyto druhy produkují velká množství tzv. prachových semen, která neobsahují prakticky žádné zásobní pletivo (endosperm) a jejich nediferencované embryo se obvykle skládá pouze z malého počtu buněk (4 200). Semena tak mají velice malou hmotnost a jsou vhodná k anemochorickému šíření na velké vzdálenosti. Pro jejich úspěšné vyklíčení a vývoj je však nezbytná brzká kolonizace mykorhizní houbou, bez níž by tyto rostliny vůbec nebyly schopné klíčení a růstu (Eriksson & Kainulainen 2011). Redukovaná listová plocha a chybějící fotosyntetický aparát jsou zřejmě evoluční odpovědí této skupiny nezelených rostlin na nepříznivé světelné podmínky - MHT rostliny nalézáme na trvale zastíněných až temných stanovištích, na kterých by autotrofní druhy již nepřežily. Jedná se tedy o vývojově pokročilou skupinu organismů a mykoheterotrofii můžeme chápat 11

12 DEFINICE MYKOHETEROTROFIE jako pokročilou evoluční adaptaci (Bidartondo 2005). Mykoheterotrofie však není vázaná pouze na nezelené druhy rostlin. Jak se ukázalo, je mykoheterotrofní způsob výživy alespoň po určité vývojové stádium nezbytný až pro 10 % rostlinných druhů (největší skupinu tvoří čeleď Orchidaceae s více než druhy). Přestože u některých rostlin dochází v dospělosti ke změně výživové strategie, zůstává pro ně v mnoha případech asociace s mykorhizní houbou jakýmsi záložním a bonusovým zdrojem uhlíku (tzv. mixotrofní druhy), což jim v případě nepříznivých podmínek poskytuje značnou kompetiční výhodu. 12

13 TAXONY MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN 2 Taxony mykoheterotrofních rostlin Jak již bylo uvedeno výše, lze achlorofylní druhy celoživotně závislé na mykoheterotrofii nalézt v celé řadě rostlinných taxonů (obr. 1), ve kterých se v průběhu evoluce tento způsob získávání energeticky bohatých sloučenin opakovaně vyvinul. Zástupci MHT rostlin se objevují i mezi prastarou skupinou mechorostů játrovkami. Konkrétně se jedná o druh Cryptothallus mirabilis, vyskytující se na rašeliništích především v severní Evropě, ale i v Rakousku a Německu (Bidartondo et al. 2003). Rovněž mezi kapraďorosty nacházíme druhy, které mají plně mykoheterotrofní gametofytická stádia (např. v čeledích Ophioglossaceae, Schizaeaceae, Psilotaceae). Některými autory je mezi MHT rostliny zařazován také vzácný nezelený nahosemenný keř Parasitaxus usta z Nové Kaledonie (čeleď Podocarpaceae, nahoplodovité), který získává uhlík pomocí mykorhizní houby a současně vodu a minerální látky od jehličnanu Falcatifolium taxoides, se kterým je paraziticky propojen pomocí haustorií. Jde tedy o unikátní přechodnou formu mezi holoparazitickým a mykoheterotrofním způsobem výživy (Feild & Brodribb 2005). U vyšších rostlin má obligátní mykoheterotrofie největší zastoupení mezi rostlinami jednoděložnými, mezi kterými se nevyskytuje žádný holoparazitický druh, tzn., že všechny jednoděložné achlorofylní rostliny jsou plně mykoheterotrofní (Leake 1994). Nejvíce MHT rodů ze všech rostlinných čeledí se nachází v čeledi Orchidaceae (vstavačovité), kam patří přibližně 220 druhů rozprostřených ve 30 různých rodech a jedná se tak o nejúspěšnější a zdaleka největší skupinu mykoheterotrofů (Mercx & Freundstein 2010). Centrem jejich rozšíření jsou v první řadě lesy tropických a subtropických oblastí, menší počet plně MHT orchidejí se objevuje i v mírném podnebném pásu. U nás můžeme nalézt čtyři zástupce této skupiny - poměrně hojný hlístník hnízdák (Neottia nidus-avis) nebo již vzácnější druhy sklenobýl bezlistý (Epipogium aphyllum), korálici trojklanou (Corallorhiza trifida) a hnědenec zvrhlý (Limodorum abortivum) (Gryndler et al. 2004). Další jednoděložné MHT rostliny jsou rozšířeny rovněž především v tropech a jsou zastoupeny např. v čeledích Triuridaceae (45 druhů), Corsiaceae (27 druhů), a Petrosaviaceae (2 druhy). Velký počet obligátních mykoheterotrofů se nachází mezi tropickými rostlinami z čeledí Burmanniaceae (56 druhů) a Thismiaceae (~60 druhů), které jsou řazeny do společného řádu Dioscoreales 13

14 TAXONY MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN (smldincotvaré) (Mercx & Freundstein 2010). Z hojného počtu plně MHT zástupců čeledi Burmanniaceae uveďme např. druhy Campylosiphon purpurascens, Burmannia championii, Apteria aphylla, Gymnosiphon longistylus a z čeledi Thismiaceae teprve nedávno objevený druh Afrothismia hydra nebo Thismia melanomitra (endemit v Ekvádoru). U dvouděložných rostlin se mykoheterotrofie vyvinula nezávisle ve třech čeledích a patří sem přibližně 12 % plně MHT rostlin. Jedná se především o čeleď Ericaceae a podčeleď Monotropoideae, jejíž všichni příslušníci jsou achlorofylní a nefotosyntetizující epiparazité (10 rodů se 13 druhy). Tyto rostliny jsou rozšířeny především v Severní Americe, výjimečně Asii, u nás je tento taxon zastoupen jediným ohroženým druhem Monotropa hypopitys (hnilák smrkový). Není bez zajímavosti, že právě u podčeledi Monotropoideae byla poprvé experimentálně potvrzena domněnka, že v případě nezelených rostlin se může jednat o epiparazitismus (Björkman 1960). Do čeledi Ericaceae rovněž patří achlorofylní druh Pyrola aphylla, který je jediným plně MHT zástupcem rodu Pyrola a zároveň jedinou známou MHT rostlinou s arbutoidní mykorhizní asociací. Další dvouděložné plně MHT rostliny se vyskytují nejčastěji v tropických deštných lesích Amazonie a patří do čeledi Polygalaceae (vítodovité) a rodu Epirixanthes (5 druhů) nebo do čeledi Gentianaceae (hořcovité), ve které se vyskytuje přibližně 25 plně MHT druhů (Leake 2004), v rodech Voyria, Voyriella a druh Sebaea oligantha. Až na výjimky patří všechny mykoheterotrofní rostliny mezi vzácné a ohrožené druhy, které jsou vzhledem k jejich způsobu života a specificitě mykorhizních asociací velmi citlivé na podmínky okolního prostředí. 14

15 TAXONY MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN Obrázek 1: Diagram znázorňující taxony rostlin, u nichž se v průběhu evoluce vyvinula mykoheterotrofie (přerušované čáry). Linie rostlin mykoheterotrofních po celý jejich život (přibližně 500 druhů) jsou podtrženy, u zbylých druhů se mykoheterotrofie vyskytuje alespoň v některém vývojovém stádiu (většinou na počátku vývoje cca druhů). Převzato ze Smith & Read (2008), upraveno. 15

16 MYKORHIZNÍ ASOCIACE MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN 3 Mykorhizní asociace mykoheterotrofních rostlin Existují důkazy, že u MHT rostlin nemusí být kolonizace mykorhizní houbou omezena pouze na kořeny. V minulosti byl rozvoj houbového mycelia u mykoheterotrofů pozorován rovněž v podzemních oddencích, hlízách a dalších modifikovaných orgánech (Leake 1994). Kolonizace houbami však nikdy nebyla pozorována v žádné nadzemní části rostlin, což ukazuje na to, že i MHT rostliny plně kontrolují rozvoj houbové kolonizace a mají účinné mechanismy k zabránění jejímu nadměrnému rozšíření. U achlorofylních MHT rostlin se vyskytují čtyři hlavní typy mykorhizní asociace. 3.1 Arbutoidní mykorhiza Tento druh mykorhizní symbiózy nalézáme pouze mezi zástupci čeledi Ericaceae, rodu Pyrola, z nějž pouze jediný druh, konkrétně P. aphylla je plně mykoheterotrofní (Hynson et al. 2009). Výskyt arbutoidní mykorhizy u této čeledi byl v minulosti některými autory zpochybňován a rostliny z rodu Pyrola, vzhledem ke strukturní podobnosti arbutoidní a monotropoidní mykorhizy, řazeny právě k rostlinám s mykorhizou monotropoidní (Harley 1959). Arbutoidní mykorhizní symbióza bývá typicky označována jako ektendomykorhiza, tzn., že u ní nalézáme struktury charakteristické jak pro ektomykorhizní, tak endomykorhizní symbiózy. Stejně jako u ektomykorhizy tvoří houby u této symbiózy husté hyfové pláště obalující kořeny, které mají často pozměněnou strukturu jsou zakrslé, více větvené, ale bez kořenových vlásků (tzv. filiformní (nitkovité) kořeny) (Leake 1994). Po čase dochází k průniku houbového mycelia do kořene a k tvorbě tzv. Hartigovy sítě v mezibuněčných prostorách rhizodermis. Na rozdíl od klasické ektomykorhizy však hyfy penetrují rostlinné buněčné stěny a prorůstají do buněk rhizodermis a svrchního kortexu, kde se shlukují a tvoří klubíčka hyf obalená plazmatickou membránou, která mohou po určité době vyplnit téměř celou buňku (obr. 2a). Morfologie kořenů a struktury mykorhizní kolonizace u rostlin rodu Pyrola detailně popsali Hynson & Bruns (2009) (obr. 2b). Houby tvořící arbutoidní mykorhizní symbiózu byly na základě mikroskopických pozorování zařazeny do oddělení Basidiomycota (stopkovýtrusné houby), vytvářející se zelenými 16

17 MYKORHIZNÍ ASOCIACE MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN hostitelskými druhy typickou ektomykorhizu. Mezi charakteristické struktury těchto hub patří vláknité přehrádkované mycelium se soudkovitě ztloustlými úseky přepážek, v nichž se nachází otvory, tzv. dolipórní septa, překrytá tenkou membránou (perforovaným parenthesomem), které umožňují komunikaci mezi buňkami (Špaček 1999). Při analýze izolátů z kořenů P. aphylla bylo zjištěno, že tato rostlina může být kromě typických ektomykorhizních hub asociována i s celou řadou dalších druhů. V kořenech byly objeveny saprotrofní či nekrotrofní houby, houby vytvářející erikoidní mykorhizu a dále kořenoví endofyté patřící mezi askomycety. Největší podíl mezi vyizolovanými houbami měly druhy patřící do čeledi Russulaceae (holubinkovité) (Hynson & Bruns 2009). P. aphylla je tak jedinou známou rostlinou z čeledi Ericaceae, u které chybí specificita při výběru mykorhizního partnera. Obrázek 2: (a) Schéma ukazující hlavní znaky arbutoidní mykorhizy: hyfový plášť na povrchu kořene (HP), Hartigovu síť v intercelulárách rhizodermis ( ) a různě vyvinutá klubíčka hyf uvnitř buněk (KH). Převzato z Peterson et al. (2004), upraveno. (b) Příčný řez kolonizovaným kořenem Pyrola aphylla ukazující klubíčka hyf (šipka) v rhizodermálních buňkách. Foto Martin I. Bidartondo, převzato z Hynson & Bruns (2009), upraveno. 3.2 Monotropoidní mykorhiza Jeden z nejpokročilejších způsobů soužití houby s rostlinou představují zástupci čeledi Ericaceae, podčeledi Monotropoideae, u kterých se vyvinul tento specifický druh mykorhizní asociace. Z hlediska poznání MHT rostlin se jedná o unikátní druh symbiózy, protože všechny rostliny, u kterých se objevuje monotropoidní mykorhiza, jsou výhradně achlorofylní a 17

18 MYKORHIZNÍ ASOCIACE MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN obligátně mykoheterotrofní. Zástupci podčeledi Monotropoideae byli od počátku objektem zájmu vědců a existuje tak poměrně velké množství studií, zabývajících se těmito rostlinami a jejich houbovými partnery (Duddridge & Read 1982, Bidartondo & Bruns 2001, 2002). Podobně jako u arbutoidní mykorhizní symbiózy obalují i v tomto případě houbové hyfy povrch kořenů několikavrstevným hyfovým pláštěm a v mezibuněčných prostorách rhizodermis tvoří Hartigovu síť. Na rozdíl od arbutoidní mykorhizy však hyfy uvnitř buněk netvoří rozvětvená klubíčka, ale do buněk pronikají pomocí krátkých háčků (peg-like structure), které se uvnitř buněk již nevětví a jsou typickým znakem monotropoidní mykorhizy (obr. 3C). Obrázek 3: (A) Schéma propojení kořenů autotrofního hostitele ( ) (zde Pinus, borovice) s mykoheterotrofní rostlinou Monotropa uniflora ( ) prostřednictvím symbiotické ektomykorhizní houby. (B) Příčný řez ektomykorhizním kořenem borovice s hyfovým pláštěm obalujícím kořeny ( ) a Hartigovou sítí ( ), (C) Kořenové epidermální buňky M. uniflora s hyfovými háčky ( ). Převzato ze Southworth (2012). 18

19 MYKORHIZNÍ ASOCIACE MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN Houby, asociované s příslušníky podčeledi Monotropoideae, řadíme rovněž mezi bazidiomycety v tomto případě bylo mikroskopické pozorování houbových mycelií potvrzeno molekulárně-genetickou analýzou izolátů kořenových hyf (Bidartondo & Bruns 2001). Na základě této studie bylo zjištěno, že u monotropoidní mykorhizy existuje úzce specifický vztah mezi achlorofylní rostlinou a jejím houbovým partnerem, a že monotropoidní mykorhizu jsou schopni vytvářet zástupci pěti různých čeledí bazidiomycet. Například nejrozšířenější zástupce podčeledi Monotropoideae, M. hypopitys (hnilák smrkový) tvoří mykorhizu vždy pouze s houbami rodu Tricholoma (čirůvka), M. uniflora pak pouze s houbami patřícími do čeledi Russulaceae (holubinkovité). U všech těchto hub bylo zjištěno, že zároveň tvoří ektomykorhizu s okolními dřevinami (obr. 3), které jsou tedy, stejně jako v případě arbutoidní mykorhizy u plně MHT druhu P. aphylla, pro achlorofylní rostlinu primárním zdrojem energeticky bohatých látek. 3.3 Arbuskulární mykorhiza Jedná se o vývojově nejstarší a zároveň nejrozšířenější druh mykorhizní symbiózy, která se vyskytuje u širokého spektra rostlinných taxonů. Pro arbuskulární mykorhizu (AM) je typické mezibuněčné šíření nepřehrádkovaných hyf a jejich následné pronikání do buněk, kde se větví a tvoří charakteristické stromovité struktury tzv. arbuskuly a dále tvorba zásobních váčků, tzv. vezikulů. Již v roce 1905 popsal francouzský badatel Isidore Gallaud dva morfologicky odlišné typy arbuskulární mykorhizy (obr. 4), lišící se vnitrokořenovými strukturami a šířením houbového mycelia v kortexu, konkrétně jde o typ Arum (objevený u druhu Arum maculatum) a typ Paris (Paris quadrifolia). V porovnání se zelenými fotosyntetizujícími rostlinami existují u MHT rostlin s AM drobné strukturní a funkční rozdíly. Jedná se především o mohutnější rozvoj houbové kolonizace uvnitř rhizodermálních a kortikálních buněk kořene - je kolonizován větší počet buněk a houby obvykle nevytvářejí typické arbuskuly, ale pouze husté shluky hyf vyplňující téměř celou buňku (Leake 1994). Na rozdíl od AM zelených rostlin, u kterých může stejná houba kolonizovat široké spektrum hostitelů, vykazuje tato symbióza u plně MHT druhů mnohem vyšší specificitu. 19

20 MYKORHIZNÍ ASOCIACE MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN (a) (b) Obrázek 4: Schematické znázornění dvou morfotypů arbuskulární mykorhizy. (a) Typ Arum houbová hyfa vyrůstá z apresoria (A), prochází přes epidermální buňky kořene (E) až do kortexu (C), kde se rychle šíří intercelulárami ( ). Před vstupem do intercelulárního prostoru hyfy často tvoří závity uvnitř kortikálních buněk ( ), v hlubších vrstvách kortexu pak houba proniká do buněk a vytváří typické arbuskuly ( ). V závislosti na druhu asociované houby se mohou tvořit také vezikuly (V) (b) Typ Paris u tohoto typu nikdy nedochází k mezibuněčnému šíření hyf. Uvnitř kortikálních buněk se však hojně vyskytují klubíčka hyf ( ), ze kterých vyrůstají arbuskuly ( ). Opět, v závislosti na druhu houby, se mohou tvořit vezikuly (V). Převzato z Peterson et al. (2004). Je zřejmé, že v některých případech se arbuskulární mykorhiza MHT rostlin může svojí stavbou podobat např. mykorhize orchideoidní, rozhodujícím znakem je v tomto případě především rozdílná stavba houbového mycelia u těchto dvou druhů mykorhizních symbióz. Pro AM houby je charakteristické cenocytické mycelium, tj. nepřehrádkované a mnohojaderné, zatímco strukturně podobné orchideoidní mykorhizní houby tvoří mycelium výrazně přehrádkované s dolipórními septy a 1-2 jádry uvnitř každé buňky. V minulosti byly AM houby řazeny mezi zygomycety (houby spájivé) do řádu Glomales, dnes jsou však již vyčleňovány do nezávislého oddělení Glomeromycota (Schüssler et al. 2001), které tvoří samostatnou skupinu přibližně 160 druhů hub. Hlubšího poznání o arbuskulárních houbách bylo dosaženo pomocí molekulárně-biologických metod na základě analýzy sekvencí DNA kódující RNA malé ribozomální podjednotky (rdna) (Schüssler 2002), na jejímž základě bylo oddělení Glomeromycota rozděleno do čtyř řádů: Archaeosporales, Diversisporales, Glomerales a Paraglomerales. Jedná se o velmi starobylou skupinu biotrofních hub, u nichž existuje předpoklad, že všichni příslušníci tohoto oddělení jsou obligátními symbionty, tzn., že bez vytvoření mykorhizní asociace nejsou schopni prodělat svůj životní cyklus. 20

21 MYKORHIZNÍ ASOCIACE MYKOHETEROTROFNÍCH ROSTLIN Vzhledem k modifikované a lehce atypické struktuře arbuskulární mykorhizy u plně MHT rostlin, se pouhým mikroskopickým pozorováním kořenů dlouho nedařilo zjistit, o jaký typ mykorhizní asociace se u některých achlorofylních rostlin vlastně jedná (Imhof 1997). Teprve až na základě genetické analýzy hub izolovaných z achlorofylních zástupců čeledí Corsiaceae a Gentianaceae bylo zjištěno, že tyto rostliny tvoří mykorhizu s AM houbou z oddělení Glomeromycota a že stejná houba kolonizuje také kořeny sousedních autotrofních rostlin (Bidartondo et al. 2002). Autoři tak potvrdili domněnku, že i AM houby jsou schopny tvořit vysoce specifické asociace a že zelené fotosyntetizující rostliny jsou i zde opět primárním zdrojem energeticky bohatých sacharidů pro růst MHT rostlin. Další důkaz podal Mercx se spolupracovníky (2010), kteří zkoumali mykorhizní asociace u vybraných achlorofylních zástupců čeledí Burmanniaceae (Dictyostega orobanchoides), Gentianaceae (Voyria aphylla) a u druhu s redukovanou listovou plochou (Burmannia capitata). V kořenech všech studovaných jedinců byly přítomny podobné houby, které byly na základě analýzy sekvencí rdna zařazeny do rodu Glomus, u V. aphylla byly navíc identifikovány houby z čeledi Gigasporaceae. Na základě tohoto výsledku vzniká otázka, zda je specificita při výběru mykorhizního partnera u MHT rostlin s AM skutečně tak vysoká. Lze se domnívat, že některé mykoheterotrofní druhy jsou schopny vytvářet AM symbiózu s širším spektrem hub, především v závislosti na podmínkách daného stanoviště. Autoři rovněž provedli srovnání izotopového podpisu δ 13 C těchto rostlin s δ 13 C okolních autotrofních druhů, na jehož základě zjistili, že achlorofylní mykoheterotrofové obsahují větší množství 13 C než rostliny autotrofní, tzn., že získaly určitou část uhlíku z jiného zdroje, než rostliny autotrofní. U druhu B. capitata nebylo zjištěno statisticky významné obohacení δ 13 C, což znamená, že rostlina je schopna krýt svoje potřeby uhlíku výhradně pomocí fotosyntézy (Mercx et al. 2010). 21

22 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA 4 Mykoheterotrofie a orchideoidní mykorhiza 4.1 Orchideoidní mykorhizní symbióza Posledním a pro nás nejdůležitějším typem mykorhizní asociace, která se vyskytuje u MHT rostlin, je orchideoidní mykorhiza (OM). Jedná se o typ symbiózy, kterou jsou schopny tvořit pouze rostliny z čeledi Orchidaceae (vstavačovité). Tato čeleď má veliký ekologický, ale také ekonomický význam, patří do ní např. liána Vanilla planifolia (vanilka) a spousta okrasných druhů, jejichž pěstování je pro některé státy jedním z hlavních odvětví průmyslu (Dearnaley 2007). Společným znakem všech příslušníků čeledi je redukovaná velikost semen a tím pádem typicky nízký obsah zásobních látek (Arditti & Ghani 2000), podobně jako je tomu u rostlin mykoheterotrofních (Eriksson & Kainulainen 2011). Na základě této skutečnosti se domníváme, že vytvoření specifické asociace s mykorhizní houbou je v přirozených podmínkách pro všechny orchideje základní podmínkou úspěšného počátečního vývoje embrya v protokorm a následných raných fází jeho růstu. Asociace mezi orchidejemi a houbami patří k vůbec nejstarším pozorovaným symbiózám. Za objevitele mykorhizy u orchidejí je považován francouzský botanik Noël Bernard, který již na počátku 20. století detailně popsal kolonizaci kořenů a symbiotické klíčení semen u plně MHT druhu hlístníku hnízdáku (Neottia nidus-avis) a dalších druhů orchidejí. Jeho záznamy a detailní nákresy kolonizovaných kořenů a houbového mycelia byly na dlouhou dobu jediným dokladem o struktuře orchideoidní mykorhizy a i přes velký pokrok ve výzkumu OM jsou dodnes velice cenné a až překvapivě přesné. Byl to rovněž Bernard (1909) a později Burgeff (1932), kteří rozlišili a definovali dva morfologicky odlišné typy OM: tolypofágní formu, která je mnohem běžnější a nachází se u většiny druhů orchidejí, a ptyofágní formu, kterou nacházíme pouze u malého počtu tropických MHT orchidejí. Charakteristickým znakem tolypofágní formy OM jsou klubíčka hyf, tzv. pelotony, uvnitř kortikálních buněk kořene hostitelské rostliny. Houba se v kořeni šíří přímým prorůstáním z buňky do buňky, pravděpodobně přes plazodezmy - hovoříme o tzv. symplastickém šíření hyf. Mykorhizní houba za pomoci lytických enzymů a mechanického tlaku penetruje buněčnou stěnu hostitele, nikdy však není v přímém kontaktu s cytoplazmou rostlinné buňky. S postupným intenzivním růstem a větvením hyf uvnitř buněk dochází k postupnému obalování houby tzv. perifungální membránou, která je vlastně modifikovanou cytoplazmatickou membránou a která časem obaluje celý peloton (Peterson et al. 2004). Mezi buněčnou stěnou houby a perifungální 22

23 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA membránou tak vzniká tzv. mezilehlý prostor (interfacial matrix), ve němž dochází k přenosům látek a výměně informací mezi rostlinou a houbou. Postupem doby pelotony degenerují a v dříve kolonizovaných buňkách zůstávají pouze shluky amorfní houbové hmoty. Buňky s kolabovanými hyfovými pelotony označujeme jako stravovací (fagocyty) a časem je možná jejich opětovná kolonizace - v jedné buňce se mohou vyskytovat až 4 generace pelotonů (Senthilkumar & Krishnamurthy 1998). Proces samotné degradace pelotonu byl dlouho uvažován jako možný způsob přenosu látek z houby do orchideje, kdy by rostlina získávala potřebné živiny aktivním rozkladem houbových hyf. Proti této teorii však stojí pozorování klíčících orchidejí, při nichž bylo zjištěno, že růst protokormu nastává prakticky okamžitě po kolonizaci, tzn. ještě před výskytem prvního degenerovaného pelotonu (Hadley & Williamson 1971). Z toho důvodu se dnes soudí, že zánik pelotonů je buď následkem autolýzy houbových hyf, nebo obranným mechanismem hostitelské rostliny, avšak přenos látek mezi oběma symbionty probíhá biotrofně (Smith & Read 2008). Druhý morfotyp orchideoidní mykorhizy, ptyofágie, je mnohem méně prostudovaný a prozatím byl pozorován pouze u velmi malého množství orchidejí. Tato forma byla popsána u rodu Gastrodia (Burgeff 1932), dále u rodů Galeola, Zeuxine a Cystorchis. Všichni zástupci s ptyofágním typem mykorhizy jsou plně MHT v tropech rostoucí orchideje. Teprve nedávno se vědcům podařilo alespoň do určité míry objasnit fungování ptyofágního typu OM, konkrétně se jednalo o achlorofylní orchidej Gastrodia elata (Wang et al. 1997). Autoři při studiu ultrastruktury kořenů zjistili, že podobně jako v případě tolypofágní formy OM, mohou mykorhizní houby (zde Armillaria mellea) i u tohoto typu mykorhizy tvořit hyfové pelotony, avšak v porovnání s tolypofágním typem se jich v kořenových buňkách vyskytuje velmi malé množství a nacházejí se pouze v buňkách nejsvrchnějších vrstev kortexu. Buňky, obsahující klubíčka hyf, autoři pojmenovali jako hostitelské. V hlubších vrstvách kortexu se již pelotony vůbec nevyskytují a nacházíme zde jenom samostatné vchlípené hyfy obalené plazmalemou hostitele - mezi buněčnou stěnou houby a cytoplazmatickou membránou rostliny (= perifungální membránou) i v tomto případě vzniká tzv. mezilehlý prostor. Struktura ptyofágního typu kolonizace se tak na první pohled velmi podobá háčkům, které jsou charakteristickým znakem monotropoidní mykorhizy (Peterson & Massicotte 2004). Po prasknutí hyfy dochází k postupnému uvolňování jejího obsahu do mezilehlého prostoru a následnému shlukování uvolněného materiálu a obalování zformovaných struktur plazmalemou hostitele. V cytoplazmě hostitelských stravovacích 23

24 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA buněk se tak vyskytuje velké množství váčků, tzv. ptyozómů, které jsou naplněny látkami získanými lyzí hyf mykorhizního partnera. Důležitou strukturou OM je mimokořenové (extraradiální) mycelium, které má pro fungování této symbiózy zcela zásadní význam. Úkolem extraradiálního mycelia u všech typů mykorhizních asociací je zabezpečení minerální výživy svého hostitele. V případě MHT asociací a minimálně raných fází vývoje všech orchidejí, je úkolem mykorhizní houby také zásobování hostitele energií ve formě jednoduchých sacharidů. Orchideoidní mykorhizní houby používají k získávání uhlíkatých sloučenin různé způsoby. Většina hub tvořících OM je saprotrofních, tzn., že získávají živiny rozkladem mrtvé organické hmoty a sorpcí přímo z půdy (Rhizoctonia). V nedávné době byla rovněž prokázána tvorba OM u dřevokazné václavky, která je typickým příkladem nekrotrofní houby a živí se parazitováním na živých dřevinách. Posledním způsobem je epiparazitismus, kdy houba získá uhlíkaté sloučeniny pomocí ektomykorhizní asociace s kořeny autotrofních dřevin a ty následně poskytne orchideji, se kterou tvoří OM. Závislost orchidejí na mykorhizní houbě v pozdějších fázích životního cyklu je velice variabilní a u jednotlivých druhů se liší. Vzhledem k různorodosti životních forem a stanovišť, na kterých se příslušníci čeledi Orchidaceae vyskytují, vyvinuly se u dospělých orchidejí také různé varianty získávání energie a živin. Obecným pravidlem ale je, že orchidej si svého mykorhizního partnera ponechává po celý svůj život, avšak s rozvojem fotosyntetického aparátu přechází většina druhů na autotrofní, případně mixotrofní způsob výživy a mykorhiza jim slouží k získávání minerálních živin (především N, P) a usnadnění příjmu vody, stejně jako v případě mykorhizních symbióz ostatních rostlin (Smith & Read 2008). 4.2 Mykoheterotrofie klíčících orchidejí V části věnované mykoheterotrofním rostlinám bylo zmíněno, že všechny tyto rostliny mají velice redukovaná semena bez zásobních látek a s nediferencovaným embryem. Totéž platí rovněž pro orchideje, a to nejen pro achlorofylní, plně MHT druhy, ale i pro zelené a v dospělosti fotosynteticky aktivní jedince. Semena orchidejí označujeme vzhledem k jejich velikosti jako prachová (angl. dust seeds). Díky redukci jejich velikosti a tím pádem menší 24

25 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA energetické náročnosti na jejich produkci jsou orchideje schopné produkovat každoročně obrovská množství semen, která se šíří pomocí větru (anemochoricky) na velké vzdálenosti, stejně jako v případě semen mykoheterotrofních rostlin z jiných čeledí (Smith & Read 2008, Eriksson & Kainulainen 2011). Je známo, že klíčení semen a počáteční fáze vývoje jsou náročné procesy a že rostliny k nim potřebují velká množství energie, kterou získávají ze zásobních látek obalujících embryo. V raných vývojových stádiích totiž rostliny ještě nejsou schopny fotosynteticky asimilovat CO 2 a přeměňovat ho na energeticky bohaté sloučeniny cukry, takže zásobní látky uložené v pletivech semen jsou pro ně v této fázi jediným zdrojem energie a dalších živin nutných pro růst. V případě rostlin z čeledi Orchidaceae je však tento způsob zásobování nediferencovaného embrya prakticky nemožný, protože semena téměř žádné zásobní látky neobsahují. Samotný vývoj embrya v klíční rostlinu (protokorm) je proto zcela závislý na kolonizaci klíčícího semene vhodnou mykorhizní houbou, která umožňuje rozklad uhlíkatých sloučenin v půdě na jednoduché cukry, které následně přesouvá do rostoucího protokormu (Peterson et al. 1998, Rasmussen & Rasmussen 2009). Bylo také prokázáno, že v raných fázích vývoje je pro rostliny mnohem důležitější přísun uhlíkatých sloučenin z jakéhokoli zdroje, než dostupnost minerálních živin nebo světla, nicméně při dostatku minerálních živin je vývoj embrya v protokorm rychlejší a klíčení úspěšnější. V experimentu s asymbiotickým klíčením orchideje Bletia purpurea byly použity různé varianty kultivačního média a podmínek a byl porovnáván vliv jednotlivých variant na úspěšnost a rychlost klíčení. Např. u semen kultivovaných ve tmě a na médiu bez přidané sacharózy nedošlo k vývoji protokormu, zatímco pokud byl do agaru (základní varianta média byla ¼ Murashige-Skoog) ke klíčícím semenům přidán rozpustný sacharid, byly schopné klíčit i bez dodávky živin a bez zdroje světla. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při kultivaci na médiu s přídavkem minerálních solí, obohaceném o různé druhy rozpustných sacharidů, tedy nejen o sacharózu, ale i o fruktózu, glukózu, trehalózu, mannitol a sorbitol v koncentracích 10 a 50 mmol l -1 (Johnson et al. 2011). Ke kolonizaci klíčícího semene orchideje mykorhizní houbou dochází ještě před jeho intenzivním růstem hyfa prorůstá do semene nejčastěji přes suspenzor a zde proniká do embryonálních buněk, intenzivně se rozrůstá a spájí a vytváří typická klubíčka pelotony. Postupem času dochází k rozšíření kolonizace téměř do všech buněk embrya, především ale do buněk, ze kterých se později vyvíjí apikální meristém prýtu (Peterson et al. 1998). Teprve 25

26 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA až s dostatečným rozšířením kolonizace do většiny embryonálních buněk dochází k vývoji protokormů, vytvářejí se pravé listy a u většiny druhů začíná probíhat biosyntéza chlorofylu. S rozvojem listové plochy a fotosyntetického aparátu dochází u orchidejí k prudké změně výživové strategie, neboť rostliny jsou již schopny fixovat vzdušný CO 2 a svoje potřeby energie si krýt samy. Jeden z prvních experimentů, zabývajících se přenosem uhlíku v raných vývojových stádiích orchidejí, byl zaměřen na sledování začleňování radioaktivně značeného sacharidu 14 C z houbové hyfy do fotosynteticky neaktivních protokormů zelené orchideje Dactylorchis (= Dactylorhiza) purpurella (Smith 1967). Autorka při designu tohoto experimentu vycházela z faktu, že sacharidy obsažené v rostlinných pletivech jsou odlišné od sacharidů typických pro houby. Sacharóza je disacharid, který je typický pro rostliny, zatímco trehalózu nalézáme ve větších množstvích u hub, nikoli u rostlin. Při in vitro kultivaci byla vyseta semena orchideje D. purpurella na Petriho misky s Knudsonovým B médiem, které bylo zaočkováno vhodnou mykorhizní houbou, kultivace probíhala ve tmě při 22 C. Bylo tedy jasné, že orchideje neobsahují chlorofyl, a tudíž nemohou získávat uhlík fotosynteticky. Tři různé izoláty houby rodu Rhizoctonia byly pěstovány v čistých kulturách na Petriho miskách s PDA (potato dextrose agar) médiem. Po 1 3 měsících inkubace byly mykorhizní klíční rostliny orchidejí umístěny na jednu polovinu Petriho misky ( strana příjemce ), která obsahovala Knudsonovo B médium bez přidaných cukrů, dále pokračovala kultivace ve tmě při 22 C, během které mykorhizní houba prorostla z kořenů a přes bariéru kolonizovala druhou polovinu misky s PDA médiem ( strana dárce ). Po určité době byl do agaru na straně mycelia přidán roztok obsahující 14 C glukózu, během kultivace byly postupně odebírány vzorky na analýzu. Pro detekci zastoupení sacharidů autorka použila chromatografii extraktů z nemykorhizních protokormů, houbových mycelií a klíčních rostlin orchidejí kolonizovaných OM houbou. Bylo zjištěno, že vzorky z nemykorhizních pletiv (listy, hlízy) obsahují pouze glukózu a fruktózu, vzorky z houbového mycelia glukózu a trehalózu (vzorek mycelia R. solani izolovaný z rýže obsahoval navíc ještě mannitol). Analýza mykorhizních semenáčků pak odhalila zastoupení sacharidů od orchideje i houby - ve vzorku byla přítomna sacharóza, glukóza, fruktóza i trehalóza a v protokormech kultivovaných s R. solani byl detekován rovněž mannitol. Tento výsledek ukázal, že musí docházet k přenosu sacharidů z houby do orchideje, neboť trehalóza se u rostlin ve větších množstvích nevyskytuje (Smith 1967). V další části experimentu autorka sledovala transportní cestu radioaktivně značených sacharidů a jejich přesun do rostlinných pletiv. Protokormy byly kultivovány v přítomnosti 14 C glukózy po dobu 7 dní, po uplynutí této doby byly v různých 26

27 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA intervalech odebírány vzorky na analýzu. K detekci radioaktivity byla použita metoda autoradiografie, při níž jsou radioaktivní částice zachyceny na speciální citlivý film. Po jeho vyvolání pozorujeme na autoradiogramu černá místa o různé barevné intenzitě, která nás informují nejen o přítomnosti a rozložení radioaktivních částic ve vzorku, ale také o jejich množství (měření hustoty zčernání na snímku). U dvou variant byly vzorky na analýzu odebírány v pravidelných intervalech po dobu 7 dní, během nichž bylo sledováno začleňování 14 C glukózy do dalších sacharidů a jejich následná translokace do rostlinných pletiv. Autorce se podařilo dokázat, že transport 14 C glukózy probíhá postupně na začátku kultivace je nejvíce 14 C značeným sacharidem trehalóza v houbovém myceliu, postupem času však obsahuje nejvíce 14 C sacharóza v nekolonizovaných pletivech orchidejí, což ukazuje na přenos uhlíku z houby do orchideje prostřednictvím jednoduchých cukrů, zejména trehalózy. Tento disacharid je rostlinnou buňkou absorbován pravděpodobně v nezměněné podobě a následně je rostlinami metabolizován na sacharózu. Nelze však vyloučit, že trehalóza je hydrolyzována na monosacharidy ještě před přímým přenosem do rostlinné buňky, v tomto případě by rozklad trehalózy na glukózu zřejmě probíhal v tzv. mezilehlém prostoru na rozhraní houbového mycelia a cytoplazmy hostitelské buňky. 4.3 Orchideoidní mykorhiza plně mykoheterotrofních orchidejí Jak bylo uvedeno v předchozí kapitole, všechny druhy orchidejí jsou při klíčení zcela závislé na MHT způsobu výživy, obecně proto můžeme celou čeleď Orchidaceae alespoň po určitou část svého životního cyklu považovat za mykoheterotrofní. Ačkoli většina orchidejí je v pozdějších fázích svého životního cyklu schopna získávat energeticky bohaté sloučeniny uhlíku pomocí fotosyntézy, existuje v čeledi Orchidaceae skupina přibližně 220 druhů, které jsou na získávání uhlíkatých sloučenin od mykorhizní houby závislé po celý svůj život. Hovoříme o tzv. plně mykoheterotrofních orchidejích (Mercx & Freundstein. 2010), pro které je typické vytváření spojení s fotosyntetizujícími druhy rostlin prostřednictvím houbového mycelia, podobně jako u rostlin podčeledi Monotropoideae. Pro všechny plně MHT orchideje je typická redukce listové plochy a absence fotosyntetických barviv, jejich kořeny jsou ve většině případů zakrnělé, někdy vytvářejí pro OM typické oddenky, jindy mohou chybět úplně (obr. 5) (Leake 1994, Burgeff 1932). 27

28 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA Tento způsob výživy je nepochybně evolučně odvozen od mykoheterotrofie raných vývojových fází orchidejí (Julou et al. 2005). (A) (B) (C) (D) Obrázek 5: Morfologie plně mykoheterotrofních orchidejí. (A) Neottia nidus-avis Převzato z Leake (1994); (B) Cystorchis aphylla; (C) Epipogium nutans; (D) Cheirostylis phylippinensis Obrázky B až D převzaty z Burgeff (1932) Houby vytvářející mykorhizní asociace s plně MHT orchidejemi Houby, které tvoří mykorhizní asociaci s nefotosyntetizujícími, plně MHT orchidejemi, jsou poměrně různorodou skupinou organismů, mají však jednu důležitou společnou vlastnost a tou je zabezpečení uhlíkaté výživy hostitelské rostliny. Jejich různorodost pak spočívá ve způsobu, jakým uhlík získávají. První možností je saprofytismus, kdy mykorhizní houby rozkládají mrtvé organické látky na jednodušší sloučeniny, které absorbují mimokořenovým myceliem a následně předávají svému hostiteli. Do této kategorie spadá většina OM hub, avšak v případě mykorhizy u plně MHT druhů je asociace achlorofylních orchidejí se saprofytickou houbou spíše vzácností a setkáváme se s ní výhradně v tropech. K saprotrofním houbám tvořícím mykorhizu s plně MHT orchidejemi patří např. houby z rodu Erythromyces, 28

29 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA které byly identifikovány v kořenech Erythrorchis orchobiensis (Umata 1995), houby rodů Coprinus (hnojník) a Psathyrella (křehutka) identifikované u orchideje Epipogium roseum (Yagame et al. 2008) a dále třeba houby rodu Mycena (helmovka), izolované z orchideje Gastrodia confusa (Ogura-Tsujita 2009). Druhou strategií získávání uhlíku OM houbou je nekrotrofie, kdy organismus napadá živá pletiva, která po usmrcení buněk využívá jako zdroj energie. V případě nekrotrofních hub se často jedná o tzv. dřevokazné houby, parazitující na dřevinách. Do dnešního dne je znám jediný rod parazitických hub tvořících mykorhizní symbiózu s orchidejemi, konkrétně václavky (Armillaria sp.), které byly izolovány z achlorofylních orchidejí rodu Gastrodia. V případě specifických asociací s touto houbou byl objeven zajímavý případ změny mykorhizního partnera v průběhu ontogeneze orchideje. Zatímco v raných fázích životního cyklu tvoří G. elata symbiózu s houbou rodu Mycena, v dospělosti jsou její kořeny a hlízy kolonizovány houbou rodu Armillaria, která je v dospělosti jejím přirozeným symbiontem, zatímco v počátcích vývoje je pro klíčící orchidej parazitem (Xu & Guo 2000). Nejtypičtějším a nejčastějším zdrojem uhlíkatých sloučenin pro houby asociované s MHT orchidejemi je jejich čerpání od autotrofních rostlin, se kterými tvoří typickou ektomykorhizu (Roy et al. 2009). Model epiparazitismu tedy neplatí pouze pro příslušníky podčeledi Monotropoideae, ale zdá se, že je také nejčastější formou výživy plně MHT orchidejí, které nejčastěji tvoří mykorhizu s ektomykorhizními bazidiomycetami. Ektomykorhizní houby byly identifikovány např. u orchidejí Cephalanthera austinae a Corallorhiza trifida, které tvoří mykorhizní asociace s houbami z čeledi Thelephoraceae, u druhu Corallorhiza maculata to pak byly houby z čeledi Russulaceae (Taylor & Bruns 1997). Mnoho druhů orchidejí vytváří mykorhizní symbiózu s bazidiomycetami ze skupiny Rhizoctonia - polyfyletickým taxonem, který zahrnuje nejrůznější anamorfní (= asexuální) stádia hub. V případech, kde se podařilo vyvolat fruktifikaci a jsou tak známá teleomorfní (sexuální) stádia, byl taxon rozdělen na základě jejich morfologie na rody jako Ceratobasidium, Thanatephorus, Tulasnella a Sebacina. Houby rhizoktoniového typu byly zjištěny např. u orchidejí Rhizanthella gardneri (houba Thanatephorus gardneri sp.) (Warcup 1991), Neottia nidus-avis (McKendrick et al. 2002) nebo u Hexalectris spicata (Taylor et al. 2003), které tvoří mykorhizu s houbami rodu Sebacina. Podobně jako epiparazitismus u podčeledi Monotropoideae, vykazuje tento vztah u orchidejí rovněž vysokou specificitu ze strany MHT orchideje i ektomykorhizní houby, avšak stejná houba je schopná tvořit ektomykorhizu s velkým množstvím různých rostlin a v tomto případě se tak jedná o specificitu spíše ekologickou (Selosse et al. 2002). 29

30 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA Způsob výživy plně MHT orchidejí Dnes již především díky metodám molekulární biologie máme přesnou představu o mykorhize plně MHT orchidejí, v minulosti však nebylo dlouhou dobu jasné, jakým způsobem získávají houby asociované v tomto vztahu uhlík. Existovala hypotéza, že achlorofylní orchideje mohou vytvářet stejný model mykorhizní asociace, jaký byl prokázán u příslušníků podčeledi Monotropoideae, tedy parazitismus na autotrofní rostlině zprostředkovaný ektomykorhizní houbou, avšak přímý důkaz o existenci epiparazitismu u orchidejí chyběl. Prvním důkazem epiparazitismu u orchidejí byl experiment s orchidejí Corallorhiza trifida (Zelmer & Currah 1995). Vědci z orchideje izolovali houbu, která v jejích oddencích tvořila typické pelotony a použili ji jako inokulum se semenáčky Pinus concorta, se kterými stejná houba vytvořila typickou ektomykorhizu. Byl tak podán první důkaz, že houby, asociované s kořeny plně MHT orchidejí, mohou zároveň tvořit standardní ektomykorhizu s kořeny autotrofních dřevin. K definitivnímu potvrzení epiparazitismu u orchidejí však došlo až později na základě studia dvou nezelených druhů - Cephalanthera austinae a Corallorhiza maculata (Taylor & Bruns 1997). Vědci pomocí genetické analýzy mycelia izolovaného z kořenů orchideje a ektomykorhizních hub okolních dřevin zjistili, že se jedná o tutéž houbu, která je schopná vytvořit jak orchideoidní mykorhizu, tak ektomykorhizu. Většina vyizolovaných hub byla zařazena do čeledi Thelephoraceae, výrazné zastoupení měly také ektomykorhizní bazidiomycety rodu Russula (holubinka). Tento experiment definitivně potvrdil, že i orchideje jsou schopné parazitovat na autotrofní rostlině prostřednictvím ektomykorhizní houby a zároveň rovněž ukázal vysokou specificitu tohoto vztahu, stejně jako v případě mykorhizních asociací ostatních MHT rostlin. Obligátně MHT druhem Corallorhiza trifida (korálice trojklaná) se zabývala McKendrick se svými spolupracovníky (2000a,b). V prvním článku autoři popisují založení terénního experimentu, sledujícího rozvoj mykorhizní kolonizace, klíčení semen a vývoj protokormů. V tomto in situ experimentu byly pod zem umístěny váčky obsahující semena korálice spolu se semeny autotrofních stromů, konkrétně břízy bělokoré (Betula pendula), vrby plazivé (Salix repens), nebo borovice lesní (Pinus silvestris). V průběhu několika měsíců autoři sledovali přibývání biomasy korálice a rozdíly mezi jednotlivými variantami a kontrolou bez přítomnosti semen autotrofních dřevin. Na základě mikroskopického pozorování bylo zjištěno, že tatáž houba vytvořila standardní ektomykorhizu s autotrofními stromy a současně pelotony v kořenech MHT orchideje. Autoři rovněž provedli DNA analýzu houbového 30

31 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA mycelia a na jejím základě zařadili asociovanou mykorhizní houbu mezi bazidiomycety, do čeledi Thelephoraceae a rodu Tomentella sp.. V pozdější studii se autoři zaměřili na prokázání hypotézy epiparazitismu této nezelené orchideje (McKendrick et al. 2000b). Semenáčky z polního experimentu byly vyjmuty ze země, zváženy a umístěny do nádob obsahujících zeminu ze sousedství jejich původního stanoviště - do každé nádoby umístěna vždy jedna klíční rostlina C. trifida a k ní přidán semenáček autotrofní dřeviny (vrby nebo břízy) (obr. 6). Obrázek 6: Ukázka uspořádání rostlin v nádobách. (a) Velkou šipkou označen protokorm C. trifida, dvojitou šipkou kontrolní rostlina (není spojena s autotrofní dřevinou) a malou šipkou je označen semenáček zelené autotrofní rostliny (zde Betula pendula). (b) Detail z (a) možno rozeznat houbové hyfy (větší šipky) směřující od rhizoidu orchideje (dvojitá šipka) k sousedním ektomykorhizním kořenovým špičkám. (c) Detail kořenových špiček Betula pendula. Převzato z McKendrick et al. (2000b). Během 25 28denní kultivační doby došlo u orchidejí asociovaných s autotrofními ektomykorhizními dřevinami k 6 14% nárůstu hmotnosti, naopak u varianty bez autotrofních rostlin byl zaznamenán 13% úbytek z původní hmotnosti. Autoři rovněž použili metodu aplikace radioaktivně značeného uhlíku a sledování jeho toku mezi autotrofní rostlinou a orchidejí. V průběhu 25. (Betula pendula) a 28. (Salix repens) týdne kultivace byly autotrofní rostliny exponovány 14 CO 2 (doba expozice u břízy 18 dní a u vrby 10 dní). Analýza vzorků byla provedena kombinací metod autoradiografie a tkáňové oxidace, při níž jsou usušené vzorky nejprve spáleny a teprve následně analyzovány. Autorům se pomocí toku radioaktivně značených sloučenin podařilo prokázat přenos 14 C z autotrofní dřeviny směrem 31

32 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA do mykoheterotrofní orchideje. Pomocí této rozsáhlé studie se tedy kombinací několika metod definitivně podařilo prokázat hypotézu, že Corallorhiza trifida získává uhlík od okolních autotrofních rostlin pomocí sdíleného houbového mycelia. Rovněž byla prokázána pro MHT rostliny typická vysoká specificita výběru mykorhizního partnera. Další metodou, kterou lze použít při studiu plně MHT rostlin, je analýza stabilních izotopů 13 C a 15 N. Jeden z novějších experimentů, využívajících tuto metodu, byl proveden na vzácné australské podzemní orchideji Rhizanthella gardneri (Bougoure et al. 2010). Vzhledem k neschopnosti fotosyntetizovat a stupni mykorhizní kolonizace pozorované v oddencích R. gardneri, byla rostlina zařazena mezi obligátní mykoheterotrofy a předpokládalo se tak u ní, že získává uhlík a ostatní živiny od autotrofních rostlin prostřednictvím sdílené ektomykorhizní houby. Mykorhizní houba byla pomocí genetické analýzy sekvencí jaderné rdna identifikována jako Ceratobasidim sp. Vzhledem k faktu, že se tato orchidej vyskytuje pouze na malém počtu stanovišť a vždy ve vzdálenosti nejdále 1 m od keře Melaleuca scalena, předpokládá se, že mezi asociovanými organismy existuje vysoce specifický vztah. Vědci se v tomto experimentu zaměřili na uhlíkatou a dusíkatou výživu tohoto achlorofylního druhu a zároveň na objasnění možného ektomykorhizního potenciálu mykorhizní houby. Příslušníci řádu Ceratobasidiales jsou totiž známými saprotrofy a patogeny, zatím však existuje jen málo informací o schopnosti jednotlivých druhů těchto hub získávat C a N současně mykorhizně i saprotrofně. Výhradním zdrojem uhlíku a dusíku tak v případě R. gardneri nemusí být pouze sloučeniny, které jejich mykorhizní partner získá přímo z půdy rozkladem mrtvé organické hmoty, ale mohou to být také látky získané od autotrofního keře. Autoři se snažili simulovat přirozené podmínky pomocí mikrokosmů, ve kterých byla kultivována semena R. gardneri spolu s rostlinami M. scalena a mykorhizní houbou (1. varianta), nebo pouze M. scalena a Ceratobaidium sp. (2. varianta). Rostliny od sebe byly fyzicky odděleny přepážkami s malými otvory tak, aby se zabránilo prorůstání jejich kořenů a aby jediné možné spojení mezi nimi bylo prostřednictvím houbového mycelia. Všechny části byly naplněny sterilní zeminou odebranou z přirozeného stanoviště a bylo do nich aplikováno houbové inokulum Ceratobasidium sp. v podobě alginátových kapek, do vnějšího oddílu byla umístěna M. scalena a do vnitřního oddílu pak semena achlorofylní orchideje (obr. 7). 60 týdnů od založení experimentu byla stanovena míra ektomykorhizní kolonizace kořenů M. scalena a stupeň klíčení orchideje a následně k rostlinám M. scalena přidán 13 CO 2 (aplikace 13 CO 2 prostřednictvím na stonky nasazeného a utěsněného vaku). Analýzou listů 32

33 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA M. scalena pomocí hmotnostní spektrometrie bylo zjištěno, že došlo k většímu obohacení o 13 C u rostlin, které byly pěstovány v mikrokosmech bez R. gardneri (1. varianta), než u rostlin pěstovaných s touto orchidejí (2. varianta) a po 96 hodinách od aplikace 13 CO 2 bylo pozorováno obohacení o těžší izotop také u R. gardneri. Teorie, že tato mykoheterotrofní orchidej přijímá uhlík z autotrofních rostlin prostřednictvím ektomykorhizní houby, se tedy díky experimentu ukázala jako správná. Aplikací dvojitě značeného glycinu [ 13 C- 15 N] do půdy k houbovému myceliu se autoři v další části experimentu snažili zjistit, zda je tato ektomykorhizní houba schopná saprotrofní výživy, tj. získávat uhlík a ostatní živiny přímo z půdy a následně je transportovat buď do M. scalena, nebo R. gardneri. Glycin byl po kapkách přidán do prostřední části kultivačních nádob obsahující pouze mycelium Ceratobasidium sp., a to buď do mikrokosmů s orchidejí, nebo bez ní. Poté byly v pravidelných intervalech odebírány a analyzovány vzorky, konkrétně listy, ektomykorhizní kořeny a nemykorhizní kořeny M. scalena; dále půda s myceliem z prostřední části a nakonec pletivo z protokormů R. gardneri (Bougoure et al. 2010). Nejrychleji došlo k obohacení izotopového podpisu o 15 N a 13 C u ektomykorhizních kořenů M. scalena (po 24 hodinách), u listů bylo výrazně rychlejší obohacení u mikrokosmů bez přítomnosti orchideje, jejíž pletivo bylo obohaceno o 15 N po 120 hodinách od aplikace [ 13 C- 15 N]glycinu. Autorům se tak podařilo dokázat, že tato mykoheterotrofní orchidej může přijímat uhlík a dusík nejen od autotrofního keře, ale že ho může prostřednictvím svého mykorhizního partnera absorbovat přímo z půdy. Zajímavým faktem je, že pletivo mykoheterotrofní orchideje obsahuje celkově větší množství dusíku v porovnání s autotrofními rostlinami. Vzhledem k tomu, že většina dusíku je u zelených rostlin spotřebována v procesech souvisejících s fotosyntetickou asimilací CO 2, se spíše předpokládalo, že achlorofylní R. gardneri bude mít nižší nároky na jeho potřebu a tím pádem i obsah N v jejích pletivech bude nižší. 33

34 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA Obrázek 7: (a) Schéma a (b) design mikrokosmového experimentu. (a, e) Vnitřní uspořádání experimentálních nádob (mikrokosmů), kdy jednotlivé části byly od sebe odděleny pomocí propustných přepážek (PVC trubka s otvory překrytými nylonovou síťkou s 32μm otvory), které umožňují prorůstání pouze hyfám Ceratobasidium sp. (oddíl a, b, c), jejichž prostřednictvím je spojen keř Melaleuca scalena (oddíl c) s orchidejí Rhizanthella gardneri (oddíl a), (c) rostlina M. scalena, (d) vývojová stádia R. gardneri, zahrnující nabobtnalá semena (s), mladé protokormy (p) s mykorhizní kolonizací (myc).(f) dospělá, kvetoucí Rhizanthella gardneri. Obrázky (a) až (d) převzaty z Bougoure et al. (2010), upraveno; obrázky (e) až (f) převzaty z Dearnaley (2007). Stabilní izotopy ke studiu dalšího druhu plně MHT orchideje použili v nedávné době i Liebel & Gebauer (2011), kteří zkoumali ohrožený achlorofylní sklenobýl bezlistý (Epipogium aphyllum) in situ na jeho přirozeném stanovišti, kterým byl v tomto případě smrkový les v centrálním Norsku. Autoři porovnávali abundanci (výskyt) 13 C a 15 C ve stoncích a listech orchideje s jejich abundancí v pletivech autotrofních rostlin rostoucích na stejném stanovišti. Prostřednictvím hmotnostní spektrometrie bylo zjištěno, že E. aphyllum obsahoval ve svých pletivech více izotopu 13 C než fotoautotrofní rostliny získávající uhlík asimilací vzdušného CO 2. Izotopový podpis (δ 13 C) E. aphyllum byl téměř shodný s hodnotami δ 13 C typickými pro ektomykorhizní houby, což je jasný důkaz příjmu uhlíkatých sloučenin od houbového partnera. Na základě genetické analýzy byly houby vytvářející pelotony v kortikálních buňkách orchideje identifikovány jako ektomykorhizní bazidiomycety rodu Inocybe (vláknice) a Hebeloma (slzivka), s jejichž pomocí získává živiny od autotrofního stromu. 34

35 MYKOHETEROTROFIE A ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA Izotopový podpis E. aphyllum je natolik stálý a charakteristický, že jeho hodnota může být použita jako referenční při stanovení podílu mykoheterotrofie na výživě některých druhů zelených orchidejí, kde na přirozeném stanovišti plně MHT rostliny chybí (Liebel & Gebauer 2011). 35

36 MIXOTROFNÍ ORCHIDEJE 5 Mixotrofní orchideje V předcházejících kapitolách jsem se věnovala symbiotickému způsobu klíčení semen, tj. obligátní mykoheterotrofii raných vývojových fází všech orchidejí a dále achlorofylním, plně MHT druhům. Nyní se blíže podíváme na životní strategie orchidejí, které jsou v dospělosti schopné krýt alespoň částečně svoje potřeby uhlíku vlastními silami, tedy fixací vzdušného CO 2 s pomocí energie ze slunečního záření a fotosyntetických barviv. V čeledi Orchidaceae existuje široké spektrum životních strategií a forem, na jejichž základě se u těchto rostlin v průběhu evoluce vyvinuly různé strategie k zabezpečení svého vývoje a růstu. Většina zelených orchidejí patří mezi terestrity, tedy mezi rostliny rostoucí v půdě, mezi zelenými příslušníky čeledi nacházíme také druhy epifytické, rostoucí na jiných rostlinách, litofytické, tedy rostoucí na skalách a jiných minerálních podkladech, popřípadě i liány (rod Vanilla) (Gryndler et al. 2004). V souvislosti s životní strategií a stanovištěm, na kterém se rostlina vyskytuje, pak byly u zelených fotosyntetizujících orchidejí zjištěny dva možné způsoby získávání energeticky bohatých sloučenin, a sice autotrofie, kdy rostlina přijímá veškerý uhlík fotosyntetickou asimilací přímo ze vzduchu a dále smíšený způsob výživy, tzv. mixotrofie, při níž orchidej získává pouze část uhlíku pomocí fotosyntézy a část čerpá od svého mykorhizního partnera pomocí mykoheterotrofie. Vzhledem k tomu, že většina orchidejí zůstává kolonizována mykorhizními houbami po celý život, předpokládali vědci, že by některé druhy orchidejí, žijících na stinných stanovištích a majících malou listovou plochu, mohly tuto nevýhodu kompenzovat získáváním části uhlíkatých sloučenin od mykorhizní houby. Hypotézu, že i dospělé fotosyntetizující orchideje čerpají určitou část uhlíku od svého mykorhizního partnera, se vědcům podařilo experimentálně potvrdit s použitím stabilních izotopů (Gebauer & Meyer 2003). Zdá se, že mixotrofní rostliny jsou jakýmsi evolučním přechodným stupněm mezi autotrofií a obligátní mykoheterotrofií, která je evolučně nejpokročilejším způsobem výživy (Julou et al. 2005). Podíl mykoheterotrofie a autotrofie na výživě orchideje se jeví jako variabilní a u jednotlivých druhů se liší, tzn., že některé druhy mohou mít blíže k MHT a jiné k autotrofnímu způsobu výživy, podrobnější poznatky o jednotlivých druzích jsou však teprve předmětem dalšího zkoumání. Ke stanovení podílu autotrofie a mykoheterotrofie u zelených druhů lze použít tzv. lineární dvouzdrojový směsný izotopový model (linear two-source isotopic mixing model) (Gebauer 36

37 MIXOTROFNÍ ORCHIDEJE & Meyer 2003). Princip této metody je založen na srovnání izotopového podpisu plně MHT druhů orchidejí získávajících veškerý uhlík od mykorhizní houby s izotopovým podpisem okolních autotrofních rostlin, které v ideálním případě žádný druh mykorhizy netvoří a všechen uhlík získávají fotosyntetickou asimilací vzdušného CO 2. Jak již bylo uvedeno v kapitole o plně MHT orchidejích, obsahují pletiva plně MHT rostlin větší množství těžšího izotopu 13 C, než pletiva rostlin autotrofních (hovoříme o obohacení izotopového podpisu). Při experimentu autoři použili několik různých druhů kontrolních rostlin, které rozdělili do skupin podle jejich funkce na fotosynteticky aktivní rostliny: rostliny s arbuskulární mykorhizou, případně rostliny nemykorhizní (např. Dactylis glomerata, Plantago spicatum atd..), rostliny s erikoidní mykorhizou (Erica arborea), ektomykorhizní rostliny (Fagus sylvatica, Pinus pinaster, aj.) a fixátoři vzdušného N z čeledi Fabaceae; z plně MHT orchidejí byly použity druhy Neottia nidus-avis a Limodorum abortivum. Izotopové podpisy těchto referenčních rostlin pak byly porovnávány s δ 13 C a δ 15 Ν vybraných druhů zelených orchidejí (např. Epipactis atrorubens, Dactylorhiza sambucina aj.). Rostliny byly dále rozděleny podle lokalit a izotopový podpis byl srovnáván vždy pouze mezi druhy ze stejného stanoviště. Analýzou usušených a rozdrcených pletiv na hmotnostním spektrometru autoři skutečně zjistili, že zelené, fotosyntetizující orchideje získaly část uhlíku od svého OM symbionta, protože jejich δ 13 C ležel mezi hodnotami typickými pro MHT orchideje a hodnotami typickými pro autotrofní rostliny (Gebauer & Meyer 2003). Další pozornost věnovali autoři v tomto experimentu symbiotickému příjmu dusíku. Při srovnání δ 15 Ν bobovitých rostlin, které fixují vzdušný dusík pomocí symbiózy s bakteriemi rodu Rhizobium, s rostlinami s různými typy mykorhizy a s rostlinami tvořícími OM ze stejného stanoviště bylo zjištěno, že prokazatelně více těžšího izotopu dusíku obsahovala pletiva plně MHT rostlin, zatímco ostatní rostliny se v příjmu N nelišily, tedy příjem 15 Ν od jejich mykorhizní houby byl zanedbatelný. Orchidej Cephalanthera damasonium se v přírodě může vyskytovat ve dvou formách, běžně je zelená a fotosyntetizující, vzácně může být achlorofylní a plně MHT (obr. 8). U zelené formy této orchideje bylo pomocí srovnání jejího izotopového podpisu s izotopovým podpisem okolních nemykorhizních autotrofních rostlin zjištěno, že zatímco nemykorhizní autotrofové jej mají typický pro C 3 rostliny, C. damansonium obsahuje ve svých pletivech více těžšího izotopu 13 C a že tedy musí část uhlíku získávat z jiného zdroje než referenční rostliny. Autoři pomocí genetické analýzy zjistili, že achlorofylní plně MHT fenotyp tvoří 37

38 MIXOTROFNÍ ORCHIDEJE mykorhizu s houbou z čeledi Thelephoraceae, od níž získává veškeré zásoby uhlíku. Stejná houba byla zjištěna rovněž u zeleného fenotypu C. damasonium, avšak počet kolonizovaných kortikálních buněk byl u zelené formy rostliny menší, než u achlorofylní varianty. Na základě uvedených výsledků bylo zjištěno, že fotosynteticky aktivní C. damasonium získává část uhlíku od houbového symbionta a řadíme ji proto mezi mixotrofy (Julou et al 2005). Obrázek 8: Zelený (vlevo) a achlorofylní (vpravo) jedinec Cephalanthera damasonium z populace v lokalitě Boigneville (Francie). Převzato z Julou et al. (2005). V další studii věnované této orchideji (Stöckel et al. 2011) autoři zjistili, že množství chlorofylu, obsaženého v listech zelené varianty této orchideje, přímo souvisí s její závislostí na houbě jako zdroji uhlíku. Podařilo se prokázat, že podíl mykoheterotrofie a fotosyntetické asimilace CO 2 na výživě Cephalanthera damasonium je velice variabilní a v závislosti na podmínkách se může měnit. Typicky, pokud má tato orchidej přístup ke zdroji fotosynteticky aktivního záření, začne syntetizovat více chlorofylu a hlavní podíl na její uhlíkaté výživě bude mít fotosyntéza, naopak nastane-li zhoršení světelných podmínek, omezí rostlina produkci chlorofylu, dojde k nárůstu počtu pelotonů v kortikálních buňkách kořene a hlavním zdrojem uhlíku pro ni tak bude mykorhizní houba. Pro většinu příslušníků mediteránních orchidejí rodu Limodorum je typická velice malá listová plocha a výskyt na stinných stanovištích, nejčastěji v jehličnatých, případně listnatých 38

39 MIXOTROFNÍ ORCHIDEJE lesích. Přestože tyto orchideje v dospělosti obsahují chlorofyl a může u nich tedy probíhat fotosyntéza je evidentní, že by vzhledem k uvedeným vlastnostem a podmínkám růstu nebyly schopny krýt svoje potřeby uhlíku pouze vlastní fotosyntetickou asimilací, ale že část uhlíkatých sloučenin jim poskytuje mykorhizní houba, která intenzivně kolonizuje kořeny i u dospělých jedinců (Girlanda et al. 2006). Bylo zjištěno, že hlavními symbionty, izolovanými z kolonizovaných kořenů L. abortivum, byly houby z čeledi Russulaceae, rodu Russula (holubinka), které zároveň tvořily ektomykorhizu s okolními stromy. Je tedy zřejmé, že i mixotrofní druhy mohou částečně parazitovat na autotrofních dřevinách a že tedy model epiparazitismu není omezen pouze na plně MHT rostliny. Zajímavým druhem je achlorofylní orchidej Corallorhiza trifida (korálice trojklaná), o níž se soudilo, že vzhledem k absenci listů není schopná fotosyntézy a získává uhlík od autotrofních dřevin prostřednictvím sdílené ektomykorhizní houby rodu Russula (Zelmer & Currah 1995, Taylor & Bruns 1997). Pomocí analýzy obsahu stabilních izotopů 13 C a 15 N v pletivech orchideje bylo zjištěno, že jejím zdrojem uhlíku není pouze mykorhizní houba, ale že jeho část, konkrétně 33 ± 10%, pochází z fotosyntézy (Zimmer et al. 2008). V porovnání s ostatními příslušníky rodu Corallorhiza tak druh C. trifida může čerpat poměrně značné množství uhlíkatých sloučenin vlastní fotosyntetickou aktivitou a patří tedy spíše mezi mixotrofní orchideje. Součástí tohoto experimentu však nebylo přímé měření asimilace CO 2, které by v tomto případě bylo jasnějším a přesvědčivějším důkazem. O rok později provedl experiment se stejným druhem a populací také D. Cameron se spolupracovníky (2009), kteří tentokrát použili lineární směsný izotopový model (Gebauer & Meyer 2003), kdy porovnávali δ 13 C a δ 15 N C. trifida s izotopovými podpisy plně MHT hlístníku hnízdáku (Neottia nidus-avis), částečně autotrofní okrotice bílé (Cephalanthera damasonium) a dále s autotrofním bukem lesním (Fagus sylvatica), zároveň však pomocí stanovení obsahu chlorofylu v pletivech a fluorescence chlorofylu kvantifikovali její fotosyntetickou aktivitu. Autorům se podařilo prokázat, že C. trifida má aktivní reakční centra fotosystému II (PSII) a je tedy schopná fotosyntézy, avšak kvantový výtěžek (Φ PSII ) je v porovnání s Φ PSII okolních autotrofů menší. Zároveň byly potvrzeny výsledky předchozích experimentů (Zelmer & Currah 1995, McKendrick et al. 2000b), a sice že ektomykorhizní houba transportuje část uhlíkatých látek získaných od fotosyntetizující dřeviny prostřednictvím svého mycelia do korálovitých kořenů C. trifida. 39

40 AUTOTROFNÍ ORCHIDEJE 6 Autotrofní orchideje Posledním typem orchidejí jsou orchideje plně fotoautotrofní. Jedná se o druhy, které jsou v dospělosti z hlediska pokrytí svých potřeb uhlíku zcela nezávislé na mykorhizním partnerovi a OM asociace jim slouží pouze k získávání minerálních látek (především N a P) a vody, stejně jako v případě např. arbuskulární mykorhizy (Smith & Read 2008). Z celkového počtu více než druhů orchidejí je autotrofie dominantním způsobem výživy pro drtivou většinu příslušníků této čeledi, zatímco prokazatelná mixotrofie a obligátní mykoheterotrofie dospělých orchidejí jsou v poměru k počtu zástupců spíše minoritní skupinou. Lze však nalézt i názory, že MHT se i u zelených, fotosyntetizujících orchidejí uplatňuje vždy, minimálně po část jejich životního cyklu a orchideje by tedy neměly být nikdy označovány za plně fotoautotrofní organismy (Rasmussen & Rasmussen 2007, 2009) Pokud s přechodem k fotosyntetické asimilaci CO 2 orchideje ztrácí svoji závislost na MHT a přitom jsou tyto druhy i v dospělosti pravidelně kolonizovány, naskýtala se otázka, po dlouhou dobu nezodpovězená, zda může u dospělých zelených orchidejí fungovat OM jako jiné mykorhizní typy, zejména arbuskulární mykorhiza nebo ektomykorhiza, tedy zda hostitelská orchidej nemůže začít zásobovat svoji mykorhizní houbu uhlíkatými látkami výměnou za minerální živiny. O orchideoidní mykorhize se dlouhou dobu hovořilo pouze jako o určité formě parazitismu, neboť nebylo známo, zda jsou dospělé fotosyntetizující orchideje schopny poskytnout houbě jakékoli látky (Smith & Read 1997). Tzv. obrácený tok uhlíkatých látek, tj. z rostliny do houbového mycelia, se podařilo experimentálně prokázat až Cameronovi se spolupracovníky (2006). Při tomto in vitro experimentu byly rostliny Goodyera repens (smrkovník plazivý) zasazeny na kultivační misky, které obsahovaly agar inokulovaný myceliem Ceratobasidium cornigerum, otvor, kterým rostlina prorůstala ven z misky, byl utěsněn tak, aby nemohlo docházet k difúzi plynných látek do média nebo ke kořenům. Část agaru, ve které byly kořeny orchideje, byla pomocí mycelia C. cornigerum napojena na další agarový bloček, který obsahoval pouze houbové hyfy. K nadzemním částem rostlin byl aplikován 14 CO 2. Hodnocení výsledků proběhlo pomocí digitální autoradiografie, kdy analýza autoradiogramu ukázala, že rostliny asimilovaný 14 C translokovaly do kořenů, kde jej částečně zabudovaly do svých pletiv. Přítomnost 14 C se podařilo prokázat také v hyfách C. cornigerum. Houba tedy dokázala 14 C od rostliny nejen přijímat, ale také jej prostřednictvím mimokořenového mycelia transportovat do svých apikálních částí. Tento 40

41 AUTOTROFNÍ ORCHIDEJE experiment tak poskytl jasný a první důkaz o existenci toku látek z rostliny do houbového mycelia, který je naprosto typický pro arbuskulární, ekto- nebo erikoidní mykorhizu, také u OM symbiózy. Obrázek 9: Mikrokosmos používaný k pohybu 14 C značených fotoasimilátů, dodávaných ve formě 14 CO 2 k nadzemní části orchideje, ke kořenům a k extraradiálnímu myceliu rozrůstajícímu se v agaru [a, povrchově sterilizovaná orchidej; b vatová zátka; c, pevně uzavřená kultivační miska; d, houbové mycelium; e, agarový bloček se separovanými hyfovými můstky; f, agarový bloček s neporušenými hyfovými můstky spojenými s orchidejí; g, horní agraový bloček]. Převzato z Cameron et al. 2006, upraveno Podobný experiment realizoval tým pod vedením Duncana Camerona v roce Použili tytéž organismy a velmi podobný design experimentu, oproti předchozí studii navíc s využitím radioaktivně značeného glycinu zjistili, že přestože orchidej poskytovala houbě část svých fotoasimilátů, houba translokovala do orchideje přijatý glycin, ovšem tento MHT tok C látek byl více jak 5 nižší než tok C z rostliny do houby (Cameron et al. 2008) Na toto zjištění navázali podobným experimentem také vědci na našem ústavu (Látalová & Baláž 2010), kteří u orchideje Serapias strictiflora použili metodu analýzy stabilních izotopů 13 C. Orchidej byla kultivována spolu s myceliem houby Epulorhiza sp. v substrátu, který neobsahoval žádný zdroj organických sloučenin, ale pouze pletivo rozkládajících se kořenů Zea myays, která patří mezi C 4 rostliny. Porovnávali izotopové podpisy δ 13 C pletiv kukuřice, orchideje a mimokořenového mycelia OM houby v situaci, kdy se mohla živit buď pouze 41