Faktory určující diverzitu arbuskulárních mykorhizních hub v lučních ekosystémech Zuzana Sýkorová (Oddělení mykorhizních symbióz BÚAVČR)

Transkript

1 Faktory určující diverzitu arbuskulárních mykorhizních hub v lučních ekosystémech Zuzana Sýkorová (Oddělení mykorhizních symbióz BÚAVČR)

2 Struktura přednášky 1.Arbuskulární mykorhizní houby jak a kde je najít a jejich význam pro rostliny 2. Metody studia diverzity AM hub: mikroskopicky nebo molekulárně 3. Faktory určující diverzitu AM hub v lučních ekosystémech

3 Struktura přednášky 1.Arbuskulární mykorhizní houby jak a kde je najít a jejich význam pro rostliny 2. Metody studia diverzity AM hub: mikroskopicky nebo molekulárně 3. Faktory určující diverzitu AM hub v lučních ekosystémech

4 Struktury AM hub v půdě a kořenech 0,2 mm Arbuskuly Vesikuly 0,02 mm 0,05 mm Spóra 1. AMH jak a kde je najít a jejich funkce

5 Funkce arbuskulární mykorhizní symbiózy Rostlina Cukry AM houba Minerální živiny, ochrana před patogeny, suchem, 200µm 1. AMH jak a kde je najít a jejich funkce

6 Společné myceliální sítě důležité pro fungování lučních ekosystémů Jedna AM houba může kolonizovat více jedinců (téhož i různých druhů rostlin) Jedna rostlina může být kolonizována více AM houbami propojení rostlin mycéliem Pohyb živin v rámci této společné myceliální sítě Výhody pro uchycování semenáčků Obr. převzat z van der Heijden a Horton, AMH jak a kde je najít a jejich funkce

7 Diverzita AMH důležitá pro udržování diverzity a produktivity lučních ekosystémů Výsledky nádobového pokusu: s rostoucí diverzitou AMH diverzita rostlinného společenstva růst a příjem živin 1. AMH jak a kde je najít a jejich funkce Obr. převzat z van der Heijden et al., 1998.

8 Vztah AMH a rostliny po celé škále mezi mutualismem až k parasitismu závisí na dostupnosti živin v půdě závisí na druhu rostliny i houby (rostliny více či méně závislé na mykorhize; různé druhy i izoláty hub) závisí na ontogenetickém stadiu dané rostliny (semenáček, dospělá rostlina, odumírající rostlina) důležité vzít v úvahu při aplikacích mykorhizních inokul např. v zemědělství nebo zahradnictví 1. AMH jak a kde je najít a jejich funkce Mykotrofní rostlina jetel rozdíl mezi mykorhizní a nemykorhizní variantou pokusu v substrátu chudém na živiny (Püschel et al. 2007)

9 Struktura přednášky 1.Arbuskulární mykorhizní houby jak a kde je najít a jejich význam pro rostliny 2. Metody studia diverzity AM hub: mikroskopicky nebo molekulárně 3. Faktory určující diverzitu AM hub v lučních ekosystémech

10 Jak vyhodnotit diverzitu AMH na určitém stanovišti? AMH jsou obligátní symbionti - rostou pouze společně s jejich hostitelskými Záchytné kultury rostlinami ve skleníku inertní substrát, univerzální hostitelské rostliny jako je např. kukuřice Půda, kořeny Zkoumaná lokalita např. druhově bohatá louka Pravidelná kontrola pod binokulární lupou a mikroskopem Čistá kultura AM houby 2. Metody studia diverzity AMH

11 Dnes již zastaralý systém Glomeromycot ( Tvorba spór: - spóry jednotlivé nebo ve sporokarpech nebo klastrech - nálevkovité připojení hyfy nebo zaškrcená hyfa - pučením špičky hyfy nebo s pomocí sporogenních váčků 2. Metody studia diverzity AMH Klíčení spór: - klíční štítek - stěnou spóry - místem připojení hyfy rozlišení do čeledi, rodu

12 Mikroskopické preparáty spór Klíčové znaky: - velikost spóry - počet a vlastnosti stěn spór Rozlišení do druhu Diagnostické znaky spór: -často sporné - záleží na ontogenetickém stadiu spóry Problémy při určování 2. Metody studia diverzity AMH

13 Molekulárně biologické metody Jak určit druhovou diverzitu AM hub aktivně zapojených do symbiózy (v kořenech) na určitém stanovišti v přírodě? Jak určit druh AM houby, kde je to podle spór obtížné, nebo který nesporuluje? - PCR se specifickými primery pro jadernou rdna (ITS, LSU, SSU) AM hub - klonování, DGGE, RFLP, sekvenování - t-rflp 2. Metody studia diverzity AMH

14 Genetika AM hub Klonální (asexuální rozmnožování) spóry, fragmenty hyf Coenotytické (nepřehrádkované) mycélium, mnohojaderné spóry (až několik tisíc jader v 1 spóře) Glomus intraradices, mycélium se spórami. (Foto Radka Sudová) Gigaspora decipiens spóra, obarvená DAPI. (Foto Dirk Redecker) 2. Metody studia diverzity AMH

15 Variabilita sekvencí některých genů (např. rdna) AM hub: - v rámci celého druhu - v rámci jednoho izolátu - v rámci jedné spóry AM houby Variabilita sekvencí jaderné rdna 1 izolátu Glomus intraradices = variabilita v rámci celého druhu (Jansa et al. 2002)!! 2. Metody studia diverzity AMH

16 Sekvenční typ (fylotyp) - konzistentně separovaná monofyletická skupina - podobnost sekvencí (98%) ARCH-2 Fylotyp nahrazuje pojem druhu v molekulárních studiích 2. Metody studia diverzity AMH NJ analýza jaderné rdna

17 Popis nových druhů: kombinace mikroskopických a molekulárních metod: Acaulospora alpina Oehl et al. (2006). Fylogenetický strom rodu Acaulospora spp. získaný pomocí maximum likelihood analýzy sekvencí 5.8S rdna a ITS2. 2. Metody studia diverzity AMH

18 Struktura přednášky 1.Arbuskulární mykorhizní houby jak a kde je najít a jejich význam pro rostliny 2. Metody studia diverzity AM hub: mikroskopicky nebo molekulárně 3. Faktory určující diverzitu AM hub v lučních ekosystémech druhy a diverzita hostitelských rostlin, sukcese

19 Diverzita AM hub v kořenech rostlin v různých ekosystémech na Zemi: Öpik et al. 2006: studie srovnávající výsledky 16 publikací zaměřených na molekulární analýzy AMH v kořenech celkem 52 druhů rostlin diverzita AMH: tropické pralesy (18 druhů AMH/1 druh rostliny) luční ekosystémy (8) temperátní lesy (6) obdělávaná pole a narušené ekosystémy (5) některé AMH jsou rozšířeny globálně (např. Glomus intraradices), kolem 50% druhů AMH bylo nalezeno pouze na jednom stanovišti složení společenstev AMH závisí na typu ekosystému 3. Faktory určující diverzitu AMH

20 Komplikace při studiu diverzity AMH: - různé výzkumné týmy používají primery pro různé úseky DNA nelze výsledky porovnat mezi sebou - nejednotnost ve vymezení druhu/fylotypu (variabilita sekvencí není stejná u všech druhů) - mnoho nových molekulárních fylotypů, kde není znám příslušný morfologický druh Dosud popsáno necelých 200 druhů AM hub ( kolonizují téměř všechny vyšší rostliny nízká hostitelská specifita? 3. Faktory určující diverzitu AMH

21 2 druhově bohaté vysokohorské louky v Engadinu (Švýcarsko) a 2010 m n.m., cca 600 m daleko od sebe - AM houby charakterizovány v kořenech Gentiana verna, Gentiana acaulis a 8 taxonů jejich doprovodných rostlin (např. Trifolium spp.) hostitelská specificita/preference mezi AMH a rostlinami? Gentiana verna Gentiana acaulis 3. Faktory určující diverzitu AMH

22 Vyhodnocování diverzity AM hub v kořenech Kořeny Nested PCR s SSU rdna a ITS, klonování DNA sekvence Fylogenetický strom - definice fylotypů DNA extrakce Restrikční analýzy 3. Faktory určující diverzitu AMH

23 detekováno 17 fylotypů: 10x GLOM A; 2x ARCH; 3x GLOM B; 2x ACAU 77% fylotypů nemá morfologicky popsaný protějšek 2 fylotypy zcela nové Glomeromycota NJ analýza 18S regionu jaderné rdna 3. Faktory určující diverzitu AMH

24 Počet detekovaných fylotypů Sampling effort křivky G. verna G. verna G. G. acaulis acaulis Trifolium spp. spp. Surrounding plants Okolní rostliny Number of analyzed samples Počet analyzovaných vzorků kořenů pro G. verna, G. acaulis a Trifolium spp. křivky dosahují saturace společná křivka pro ostatní druhy rostlin strmě stoupá 3. Faktory určující diverzitu AMH

25 Různé druhy hostitelských rostlin měly v kořenech různé druhy AM hub Vliv hostitelské rostliny P=0.002 GLOM A-1 společný pro všechny 3 rostlinné taxony Kanonická korespondenční analýza (CCA) 3. Faktory určující diverzitu AMH

26 Shrnutí výsledků a závěry Identita hostitelské rostliny měla signifikantní vliv na složení AM houbového společenstva v kořenech, zatímco stanoviště vliv nemělo Společenstva AM hub G. verna, G. acaulis a Trifolium spp. se od sebe signifikantně lišila Lokální hostitelské preference rostlin pro určité druhy AM hub (na relativně malém území s podobnými klimatickými podmínkami) Sýkorová et al. (2007) Applied and Environmental Microbiology 73 (17): Faktory určující diverzitu AMH

27 Jak ovlivní způsob studia diverzity AMH výsledek? Ekologie a sukcese AMH 4 druhy rostlin: - z terénu druhově bohatá vápenitá louka nedaleko Basileje (490 m n.m.) - z kompartmentových systémů ve skleníku - záchytné rostliny vysazené do terénu Bromus erectus Origanum vulgare Medicago sativa 3. Faktory určující diverzitu AMH Inula salicina

28 Kompartmentové systémy střední kompartment: půda z terénu a rostlina B. erectus přesazená z terénu jako inokulum boční kompartmenty: sterilní půda, semenáčky cílových rostlin nylonová síť mezi středním a bočními kompartmenty 2 sklizně 3. Faktory určující diverzitu AMH

29 Záchytné rostliny vysazené do terénu nylonová síť ve dnu plastové lahve rostliny předpěstovány 2 měsíce ve skleníku, pak přesazeny do terénu 2 sklizně: po 3 a 10 měsících 3. Faktory určující diverzitu AMH

30 Detekováno 16 fylotypů: 9x GLOM A; 1x ARCH; 6x GLOM B 69% fylotypů nemá morfologicky popsaný protějšek 5 fylotypů zcela nových pouze 4 fylotypy společné s loukami v Alpách Glomeromycota NJ analýzačásti 18S rdna

31 14 Sampling effort křivky 12 Počet detekovaných fylotypů Kompartmenty Compartments Field Terén Bait plants Záchytné rostliny Number of analyzed root samples Počet analyzovaných vzorků kořenů pro kompartmentové systémy křivka dosáhla saturace křivky vzorků z terénu a záchytných rostlin nejsou saturovány 3. Faktory určující diverzitu AMH

32 Společenstva AM hub se signifikantně lišila mezi rostlinami z terénu, kompartmentů a záchytných kultur GLOM A-1 byl jediný fylotyp běžný ve všech třech typech vzorků Kanonická korespondenční analýza (CCA)

33 AM houby mohou mít různé ekologické strategie Morphologically described species Sequence type Relative abundance in the compartment systems (% of samples) 1 st 2 nd Relative abundance in the bait plants (% of samples) 1 st 2 nd harvest Relative abundance in the field (% of samples) harvest harvest harvest Glomus intraradices GLOM A Glomus mosseae GLOM A GLOM A-7b GLOM A GLOM A GLOM A Glomus constrictum GLOM A GLOM A Glomus badium GLOM A Sister to G. luteum GLOM B Sister to G. etunicatum GLOM B GLOM B GLOM B GLOM B GLOM B Archaeospora trappei ARCH generalista r stratég K stratég K stratég r stratég r stratég? r stratég? r stratég? r stratégové - houby typické také pro obdělávaná pole a záchytné kultury (pravidelná disturbance) 3. Faktory určující diverzitu AMH

34 Shrnutí výsledků Složení společenstva AM hub v kořenech bylo signifikantně ovlivněno způsobem kultivace Různé druhy AM hub mohou mít různé ekologické strategie (K stratégové, r stratégové, generalisté) AM houby s různými ekologickými strategiemi mají různé role při sukcesi společenstva AM hub V nepřirozených systémech jako jsou skleníkové kultury anebo krátkodobé experimenty je nutné zohlednit sukcesi AM hub Kultivace záchytných rostlin může být dobrou metodou, jak získat AM houby přítomné v terénu a vyhodnotit vliv různých ekologických faktorů na společenstvo AM hub přímo v terénu 3. Faktory určující diverzitu AMH Sýkorová et al. (2007) Mycorrhiza 18 (1): 1

35 Společenstvo AM hub v kořenech může být ovlivněno: Geografickou polohou různé podmínky prostředí a rostlinná společenstva na různých stanovištích vedou k odlišným společenstvům AM hub Hostitelskými preferencemi v rámci malého území se stejnými podmínkami prostředí Dynamikou společenstva AM hub především v nepřirozených prostředích 3. Faktory určující diverzitu AMH

36

37 Nové molekulární markery v systematice a populační biologii AM hub Izolát AM houby= linie AM houby pěstovaná v květináči nebo ROC a získaná z 1 nebo více spór z určitého stanoviště v terénu 1) Mikrosatelity - specifické primery, pouze pro G. intraradices, testovány na spórách z ROCs nebo květináčů, na kořenech z květináčů (čisté kultury G. intraradices) 2) AFLP pouze pro DNA z ROCs 3) Mitochondriální LSU rdna - DNA z: ROCs, spór z květináčů, kořenů z terénu Tyto markery jsou homogenní v rámci izolátu = umí izoláty odlišit využití při studiu ekologie a populační biologie AM hub využití při komerčních aplikacích AM hub - např. pro důkaz efektivity vnášení určitých izolátů do terénu

38 mtlsu rdna (Raab et al. 2005, Börstler et al. 2008) - homogenita v rámci izolátu - funguje i pro vzorky z terénu - odliší izoláty na základě délky PCR produktu, sekvence nebo RFLP profilu - testování 16 izolátů odhalilo 12 haplotypů (z Börstler et al. 2008)

39 mtlsu rdna (Raab et al. 2005, Börstler et al. 2008) DNA z: in vitro kultur, spór z květináčů, kořenů z terénu design primerů pro nested PCR specifických pro G. intraradices PCR produkty o délce 1070 až 3280 bp, variabilita díky přítomnosti nebo absenci 3 intronů a díky rozdílům v exonech (z Raab et al. 2005)

40 Konfokální mikroskopie spóry AM houby Glomus diaphanum: Zelené tečky: jádra obarvená SytoGreen, Červené tečky: mitochondrie obarvené MitoTracker, (+ autofluorescence stěn spóry v zelené a červené). (Převzato z Lang and Hijri, Scale bar 10um)

41 Genetika AM hub Vysoká variabilita jaderné rdna v rámci jedné spóry: Heterokaryotická hypotéza - geneticky různá jádra uvnitř jedné spóry (Hijri and Sanders 2005) Homokaryotická hypotéza -vnitrojaderný polymorfismus rdna (Pawlowska and Taylor 2004) Udržování genetické variability anastomózy hyf téhož izolátu?

42 Kontakty hyf AM hub: (a) Perfektní fúze umožňuje proudění cytoplazmy; (b) Žádná interakce; (c) Předfúzová inkompatibilita zatažení cytoplasmy; (d) Nekompatibilní fůze zatažení cytoplasmy, tvorba septa. Barvení pro sukcinát dehydrogenázu (a) a Trypanovou modří (b d). Převzato z Croll et al. (2008). Fůze hyf geneticky stejných i různých izolátů AM hub výměna cytoplasmy výměna genetické informace, rekombinace? (Croll et al. 2009)

43 Root organ cultures AM hub AM houby jsou obligátní symbionti = rostou pouze společně se svými hostitelskými rostlinami In-vitro kultivace některých druhů AM hub (např. Glomus intraradices) na transformovaných kořenech mrkve, čekanky, apod. Root organ cultures (ROCs) umožňují získat čistou biomasu AM spór a hyf vývoj nových molekulárních markerů

44 Převzato z Parniske (2008, modif. z Schuessler et al. 2002) Rozvoj molekulárních markerů neustálé popisy nových taxonů, rušení starých

45 Posun v porozumění genetice AM hub? Homokaryotická (a) a heterokaryotická (b) hypotéza (z Young 2008) Metapopulační koncept AM hub: - jádro je individuem pohybujícícm se myceliální sítí - dochází k anastomózám, a tak i k výměně jader - mitochondriální DNA - uniformní v rámci téhož izolátu (z Young 2009)