Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E

Transkript

1 Kapilární elektroforéza, CE I Capillary electrophoresis Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Kapilární elektroforéza Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E H.A.Claessens, HAH Bliliet Capillary Electroseparation Methods, 1995 Kevin D. Altria Capillary Electrophoresis Guidebook Principles, Operation, and Applications - Methods in Molecular Biology, Volume 52, Humana Press, Totowa, New Jersey 1996

3 Kapilární elektroforéza Některé nevýhody elektroforézy na deskách: Nízká účinnost Doba analýzy Obtížná automatizace Některé výhody kapilární elektroforézy (CE/HPCE): Malý poloměr kapilár je sám o sobě antikonvektivní, to umožňuje provádění elektroforézy bez použití nosičů freesolution/open tube electrophoresis za vysoké účinnosti dělení (nicméně nosiče jsou pro některé techniky užívány i v CE) Doba analýzy je relativně krátká (obvykle minuty) Automatizace v řadě případů snadná Historie elektroforézy a kapilární elektroforézy: 1937 Tiselius-směs proteinů, dělení v trubici, technika pohyblivého rozhraní-nobelova cena 1967 Hjertén-separace na milimetrové kapiláře 1980 Jorgenson a Lukacs, 75 µm kapilára z materiálu fused silica tavený křemen

4

5

6

7 Teoretický úvod k elektroforéze a kapilární elektroforéze popis následujícího obrázku Iont určitého znaménka je v roztoku obklopen molekulami rozpouštědla a ionty opačného znaménka - vzniká tzv. elektrická dvojvrstva Celkový náboj dvojvrstvy je nulový, ale distribuce náboje není náhodná a vede ke vzniku elektrického potenciálu Potenciál na rozhraní částice+solvent/roztok určuje elektroforetickou pohyblivost částice a nazývá se elektrokinetický nebo zeta potenciál ζ Kolem negativně nabité kulové částice se statisticky kumulují kladně nabité částice, protiionty, distribuce ko- a protiiontů je náhodná až v nekonečné vzdálenosti

8

9 Podle Gouy-Chapmanovy teorie elektrické dvojvrstvy klesá potenciál ve vzdálenosti x podle vztahu: ψ x = ψ0 exp( κx) Ψ 0 je potenciál na povrchu nabité částice (ve vzdálenosti a od středu) kde 1/κ je tzv. Debye-Huckelova délka, nebo-li tloušťka dvojvrstvy, má rozměr délky a platí: 1/ 2 1 ε kt 1 1 = konst 2 κ 2 Ne I I 1 2 I = c i z i 2 i ε je dielektrická konstanta prostředí, k je Boltzmanova konstanta, T absolutní teplota, N je Avogadrova konstanta, e je elementární náboj, I je iontová síla, c i je koncentrace i-tého iontu v elektrolytu, z i je nábojové číslo i-tého iontu v elektrolytu Zeta potenciál a tloušťka dvojvrstvy rychle klesá s nárůstem koncentrace a náboje elektrolytu v médiu Zeta potenciál nemůže být měřen přímo, je pouze počítán na základě teorií. Spolehlivost výpočtů je dána vhodností fyzikálních modelů

10 Dělení látek elektroforézou je založeno na rozdílné pohyblivosti nabitých částic v elektrickém poli, rychlost v nabité částice (iontu) je popsána rovnicí: v = µ e * E (1) kde µ e je elektroforetická pohyblivost nabité částice (iontu), E je intenzita elektrického pole (podíl napětí/vzdálenost [V/m]) µ e je charakteristikou daného iontu v daném prostředí Pohyblivost iontu je dána silami, které na něj v roztoku působí Nabitá částice je v elektrickém poli vystavena čtyřem silám, jejich působením dojde k vytvoření ustáleného stavu, charakterizovaného konstantní rychlostí migrace iontu v roztoku Dvě hlavní síly jsou: 1. Elektrická síla definovaná: F e = q * E (2) q je náboj iontu 2. Stokesova třecí síla (pro sférický iont): F d = -6 π η r v (3) η viskozita roztoku, r poloměr iontu, v rychlost iontu

11 Další síly jsou: 3. Elektroforetická retardace: Vzniká v důsledku uplatnění elektroosmotického toku vyvolaného nabitou částicí v okolním elektrolytu 4. Relaxační efekt: Vzniká narušením symetrie a polohy iontové atmosféry kolem nabité částice, kdy v důsledku nestejné pohyblivosti nabité částice a protiiontů, dojde ke vzájemnému posunu středů nabité částic a atmosféry protiiontů

12 a) Pokud je zanedbána elektroforetetická retardace a relaxační efekt, dostáváme z předcházejících rovnic (2,3) pro stav rovnováhy (kdy se vyrovná elektrická síla třecí síle) následující rovnost: q * E = 6 π η r v S využití rovnice (1) získáme výraz pro elektroforetickou mobilitu µ e : q µ e = 6 π η r z poslední rovnice je vidět, že malé ionty s velkým nábojem mají vyšší elektoforetickou pohyblivost než velké ionty s nízkým nábojem b) Pokud je zanedbán jen relaxační efekt a pro retardační sílu je užita Huckelova rovnice, má výraz pro elektroforetickou mobilitu tvar (platný pro sferické malé ionty při nízkých iontových silách): εζ µ e = 6 π η z poslední rovnice je patrno, že elektroforetická mobilita je přímo úměrná zeta potenciálu nabité částice

13 Elektroforetické pohyblivosti jsou tabelovány jako fyzikální konstanty Jsou určeny při úplné ionizaci analytu a je provedena extrapolace pro nekonečné zředění Tabelované hodnoty jsou proto často odlišné ve srovnání s pohyblivostmi pozorovanými experimentálně Experimentálně jsou snadněji dosažitelné tzv. efektivní elektorforetické pohyblivosti, které jsou často silně závislé na ph prostředí (v souvislosti s pk a hodnotami analytů) a na složení pufru použitého při elektroforéze Rozdíl mezi elektroforetickou pohyblivostí a efektivní elektroforetickou pohyblivostí vede k tomu, že dvě látky, podle tabelovaných hodnot nerozdělitelné (protože vykazují totožné elektroforetické pohyblivosti při jejich úplné disociaci), lze někdy snadno separovat při vhodné hodnotě ph pufru v důsledku jejich odlišných pk a konstant

14

15 Elektroosmotický tok (EOF) Základním rysem HPCE je existence elekroosmotického/elektroendoosmotického toku EOF je tok kapaliny v kapiláře, který se vytváří v důsledku přítomnosti fixovaného elektrického náboje (většinou negativního) na vnitřní stěně kapiláry po aplikaci elektrického napětí Protiionty (většinou pozitivní ionty) jsou poutány ke stěnám kapiláry Coulombickými silami, tím kompenzují náboj na stěnách. Vzniká elektrická dvojvrstva a v blízkosti stěny kapiláry se generuje elektrický potenciál Pokud je aplikováno na kapiláru vnější napětí, je difúzní dvojvrstva uvedena do pohybu směrem ke katodě. Protože jsou kladné ionty v difúzní dvojvrstvě solvatované, jejich pohyb strhává veškerou kapalinu k kapiláře směrem ke katodě (tzn. také neutrální molekuly jsou uvedeny do pohybu ve stejném směru)

16 Si-OH Si-O -

17 Ve vodném prostředí nese většina pevných povrchů celkově negativní náboj. Tento náboj může vznikat v důsledku ionizace povrchu (tzn. rovnováhy kyselina/zásada) a/nebo na základě adsorpce iontů na povrchu V případě kapilár z taveného křemene fused silica se uplatňují oba mechanizmy, ale rozhodující je vliv ionizace povrchu Povrch taveného křemene je tvořen silanolovými skupinami Si-OH, které jsou více, či méně ionizovány za vzniku Si-O -. Je obtížné stanovit hodnotu pk a silanolových skupin, ale je známo, že EOF nabývá výrazných hodnot při ph > 4 Neionogenní materiály, např. Teflon, také obvykle nesou náboj, pravděpodobně v důsledku adsorpce anionů na povrchu

18 Rychlost EOF lze vyjádřit jako: v (εζ η)e EOF = w ζ w je zeta potenciál kapiláry Elektroosmotická pohyblivost je dána vztahem: µ = EOF (εζ w η) Velikost zeta potenciálu ζ w je určena nábojem na povrchu stěny kapiláry. Tento náboj je silně závislý na hodnotě ph roztoku, a tím je také velikost EOF závislá na ph. Při vysokém ph, je EOF v kapilárách z taveného křemene podstatně vyšší než při nízkých hodnotách ph. V závislosti na podmínkách se může velikost EOF měnit v rozmezí ph 2-12 o více než jeden řád. Zeta potenciál je také závislý na iontové síle pufru. Zvýšení iontové síly pufru vede k zeslabení elektrické dvojvrstvy a k poklesu zeta potenciálu, tím ke snížení velikosti EOF

19

20 Jedinečným rysem EOF v kapiláře je jeho rychlostní profil

21 Hnací síla tvořící tok kapaliny v kapiláře, tj. zeta potenciál, je rovnoměrně rozprostřen podél stěny kapiláry. V důsledku toho nevzniká uvnitř kapiláry tlakový spád a tok kapaliny je téměř jednotný v celém průřezu kapiláry Plochý tvar toku je velmi výhodný, protože přímo nepřispívá k rozmývání dělených zón. Toto je výrazný rys HPCE, kterým se liší od chromatografie, kde je tok vytvořen externí pumpou a kde je generován tlak na koloně a profil rychlosti má parabolický charakter I v případě HPCE není rychlost toku zcela stejná v celém profilu kapiláry, velmi těsně podél stěn je rychlost menší. Zpomalení toku u stěn je vyvoláno třecími silami. Nicméně tato neuniformita toku je malá a k rozmývání zón přispívá nevýznamně Rychlost toku a jeho profil jsou nezávislé na vnitřním průměru kapiláry až do ~ µm, kdy dojde k narušení profilu toku

22 Dalším rysem EOF je skutečnost, že vyvolává pohyb téměř všech látek, nezávisle na náboji, v jednom směru Za běžných podmínek, tzn. negativní povrch kapiláry, EOF směřuje od anody ke katodě Kationty se pohybují v kapiláře ke katodě nejrychleji, následovány neutrálními látkami, které se ovšem vzájemně nedělí, a nakonec migrují anionty Anionty bývají unášeny ke katodě, protože jejich elektroforetická pohyblivost může být až o jeden řád nižší než je rychlost EOF Kationty, neutrální látky a anionty vedle sebe lze dělit v jedné analýze

23 ALE Při analýzách malých iontů, např. Na +, K +, Cl -, není obvykle rychlost EOF větší než elektroforetická pohyblivost takových iontů Kromě toho modifikace vnitřního povrchu kapiláry může vést ke snížení EOF Výsledkem může být vzájemně opačný pohyb kationtů a aniontů

24

25 Ovlivnění EOF Přestože je působení EOF obvykle výhodné pro separaci, je třeba mít prostředky pro jeho kontrolu Např. při vysokých hodnotách ph roztoku může být rychlost EOF příliš vysoká, to může vést k tak krátkým elučním časům, že nestačí dostatečně proběhnout separace v kapiláře Naopak, např. při nízké a střední hodnotě ph, může dojít k adsorpci pozitivně nabitých iontů analytu na negativně nabitých stěnách kapiláry Navíc určité druhy kapilární elektroforézy vyžadují potlačení EOF, jde o izoelektrickou fokusaci, izotachoforézu a kapilární gelovou elektroforézu V zásadě řízení EOF vyžaduje ovlivňování náboje na povrchu kapiláry nebo viskozity pufru. Existuje několik možností jak toto provést Vždy je třeba mít na paměti, že podmínky, které ovlivňují náboj na stěnách kapiláry působí také na analyt (ph pufru atd.) Nejlepší výsledky lze dosáhnout, pokud jsou optimalizovány současně parametry jak pro EOF, tak pro solut

26 Nejsnadnější cesta jak zpomalit rychlost EOF je snížit intenzitu elektrického pole. To má ovšem řadu nevýhod, tzn. delší doby analýzy, snížení účinnosti separace a zhoršení rozlišení Z praktického hlediska lze provést nejdramatičtější posun EOF změnou ph roztoku. (Je ovšem třeba mít na paměti i výše zmíněný vliv na analyty, proto je vhodné znát jejich pi hodnoty) EOF může být dále ovlivněno koncentrací a iontovou silou pufru. Vysoké koncentrace pufrů jsou vhodné pro potlačení nežádoucích coulombických interakcí na stěnách kapiláry, nicméně zvýšené zahřívání kapiláry je naopak nežádoucím doprovodným rysem. Koncentrace pufrů se pohybují v rozmezí ~10-100, a spíše vyjímečně >100 mmol/l EOF lze kontrolovat i kovalentní nebo dynamickou (aditiva v pufrech) modifikací povrchu kapiláry. Modifikace vede ke zvýšení, snížení nebo změně náboje na vnitřním povrchu kapiláry, což určuje velikost a směr EOF

27 Iontová síla pufru (mol*l -1 ) Tloušťka dvojvrstvy (nm)

28

29 Vlivy na EOF Proměnná Výsledek Komentář Intenzita elektrického pole ph pufru Iontová síla nebo koncentrace pufru Pokles vede ke snížení rychlosti EOF Pokles vede ke snížení rychlosti EOF Zvýšení vede ke snížení zeta potenciálu a snížení rychlosti EOF Účinnost a rozlišení separace může poklesnout při snížení E Joulovo zahřívání roste při zvýšení E Nejužitečnější a nejpohodlnější způsob ovlivnění EOF Vede v některých případech ke změně náboje analytu Vysoká iontová síla znamená vysoké proudy a nežádoucí vývoj tepla Nízká iontová síla může způsobovat adsorpci na povrchu kapiláry Tvar píku může být deformován, pokud je vodivost pufru a vzorku odlišná

30 Proměnná Výsledek Komentář Iontová síla nebo koncentrace pufru Teplota Zvýšení vede ke snížení zeta potenciálu a snížení rychlosti EOF Pokles vede ke zvýšení viskozity => snížení EOF změna ~2-3%/ C Organický modifikátor Mění zeta potenciál a viskozitu, obvykle snižuje EOF Zkoncentrování vzorku po nástřiku je zhoršeno, pokud je snížena iontová síla/koncentrace separačního pufru Vhodný parametr, protože je kontrolován instrumentálně Složitý vliv, většinou nutno zjistit experimentálně V některých případech vede ke změně selektivity

31 Proměnná Výsledek Komentář Povrchově-aktivní činidlo (detergent) Neutrální hydrofilní polymer Kovalentní modifikace povrchu Adsorbuje se na povrch kapiláry hydrofobní nebo iontovou interakcí Adsorbuje se hydrofobní interakcí na stěnu kapiláry Vzniká chemická vazba mezi povrchem kapiláry a modifikující látkou Aniontové detergenty mohou zvyšovat EOF Kationtové detergenty mohou snižovat nebo obracet směr EOF Obecně mohou významně měnit selektivitu dělení Snižuje EOF stíněním povrchu kapiláry a zvýšením viskozity Lze provést řadu modifikací povrchu Problém se stabilitou

32 Analytické parametry HPCE Analytické parametry v kapilární elektroforéze je možno popsat podobným způsobem jako v kolonové chromatografii Kapilární zónová elektroforéza (CZE) je nejjednodušším typem HPCE, následující text se vztahuje zejména k CZE Pohyblivost a migrační čas Čas, který potřebuje analyt k překonání vzdálenosti od místa nástřiku k místu detekce je označován jako migrační čas Součet vektoru (efektivní) elektroforetické pohyblivosti a vektoru elektroosmotické pohyblivosti analytu dává tzv. zdánlivou pohyblivost analytu µ a : µ + a = µ e µ EOF zdánlivá rychlost analytu v a je definována: v = µ E = (µ + µ )E = v + v a a dále platí: v E l te a µ a = = = e l L tu EOF e l aktivní délka kapiláry, t migrační čas látky, L celková délka kapiláry, U aplikované napětí EOF

33

34 Efektivní elektroforetická pohyblivost může být zjištěna na základě měření zdánlivé pohyblivosti analytu Nejprve je nutno zjistit elektroosmotickou pohyblivost, ta se měří pomocí neutrální látky, která se pohybuje stejnou rychlostí jako EOF (např. DMSO, aceton) Příklad

35 Účinnost dělení a rozmytí (disperze) zón Dělení v CZE je závislé na rozdílných mobilitách analytů. Velikost tohoto rozdílu potřebná pro dělení dvou zón je závislá na jejich délce. Délka zón je ovšem zásadně závislá na disperzních procesech v kapiláře. Tyto procesy musí být pod kontrolou, protože jsou zodpovědné za délku a tvar zón. Disperze (rozšíření, rozmytí) zón analytu je výsledkem rozdílných rychlostí molekul analytu uvnitř zóny a lze pro Gaussovský pík popsat takto: w b = 4 σ (1) w b je šířka píku při základně, σ je standardní odchylka píku Účinnost, vyjádřená jako počet teoretických pater N, je rovna: 2 l N = (2) σ

36 a může být vztažena k tzv. výškovému ekvivalentu teoretického patra H: l H = (3) N Za ideálních podmínek (při malém objemu nástřiku, žádných interakcí mezi solutem a stěnou kapiláry atd.) je jediným podstatným příspěvkem k rozmytí píku podélná (longitudinální) difúze Radiální difúze (difúze napříč kapilárou) je díky profilu průtoku málo významná. V takovém případě platí: σ 2 2DlL = 2Dt = (4) µ U a D je difúzní koeficient analytu, U je vložené napětí na kapiláru

37 Substitucí rovnice (4) do (2) získáme základní elektroforetickou rovnici pro počet teoretických pater: N µ a Ul µ ael = = (5) 2DL 2D Z poslední rovnice (5) je kromě jiného patrno, že zvýšení intenzity elektrického pole vede ke zlepšení účinnosti. Také je vidět, že velké makromolekuly s nízkým difúzním koeficientem, např. proteiny, fragmenty DNA, budou podléhat menšímu rozmytí v kapiláře než molekuly malé

38 Difúzní koeficienty vybraných molekul (v H 2 O, při 25 C) Název látky Mw D [ * 10-5 cm 2 /s] Glycin Citrát Cytochrom C ~ Hemoglobin - lidský ~ Tabákový mozajkový virus Počet teoretických pater N lze vypočítat přímo z elektroferogramu s užitím vhodného vztahu, např.: t N 5.54 w = (6) 1/2 2 kde w 1/2 je šířka píku v polovině jeho výšky Vztah (6) je platný pouze pokud má pík tvar odpovídající Gaussově rozdělení

39 Ve skutečnosti je většinou účinnost počítaná pomocí vztahu (5) vyšší než účinnost měřená podle (6). Je tomu tak proto, že ve vztahu (5) je uvažován jen příspěvek podélné difúze na rozmytí píku. Ve skutečnosti ovšem k rozmývání dochází i jinými procesy

40 Faktory ovlivňující účinnost Vedle podélné difúze se na rozmývání zón podílí především: 1. Teplotní gradient v kapiláře vyvolaný Jouleovým teplem 2. Objem nastřikovaného vzorku 3. Interakce analytu se stěnami kapiláry 4. Elektrodisperze Rovnice (4) je platná jen za předpokladu, že jediným příspěvkem k rozmytí zón je podélná difúze. Z hlediska rozptylu je systém jako celek úplněji popsán následujícím vztahem: σt = σ DIF + σ INJ + σ TEMP + σ ADS + σ DET +... Celkový rozptyl σ 2 T je tedy součtem jednotlivých dílčích příspěvků, tzn. podélné difúze, injektoru, teplotního gradientu, adsorpce na kapiláře, rozmývání v detektoru a dalších případných dějů vedoucích k rozmývání píku

41 1. Teplotní gradient Jednou z výhod kapilární elektroforézy ve srovnání s klasickou elektrofoézou je snížení efektu zahřívání Zahřívání systému průchodem elektrického proudu má negativní dopad na separaci Vytváří se teplotní gradient napříč kapiláry, tím gradient viskozity a nakonec rychlostní gradient vedoucí v konečném důsledku k prodloužení separačních zón (zvětšení rozmytí píků) Disipace tepla stěnami kapiláry může vést ke vzniku podstatně vyšších teplot uprostřed kapiláry ve srovnání s teplotami u stěn kapiláry, tím může dojít k deformaci zón Zatímco teoretické rovnice pro účinnost obhajují užití vysoké intenzity elektrického pole, zahřívání kapiláry s tím spojené, limituje tyto výhody Množství generovaného tepla souvisí s výkonem, který je dán součinem proudu procházejícího systémem a napětí vloženého na kapiláru

42

43

44 Teplotní rozdíl mezi středem kapiláry a stěnou kapiláry závisí na vnitřním průměru a tloušťce stěn kapiláry, tloušťce polyimidové vrstvy a na koeficientu přenosu tepla do okolí Teplotní rozdíl mezi vnitřní stěnou kapiláry a středem kapiláry Velký poměr vnitřní povrch kapiláry/objem kapiláry pomáhá odvádění tepla Z hlediska odvodu tepla a snížení nežádoucího efektu teplotního gradientu je výhodné, pokud má kapilára z taveného křemene malý vnitřní průměr a velký vnější průměr. Vrstva polyimidu by měla být co nejtenčí, protože polyimid, na rozdíl od taveného křemene, má nízkou tepelnou vodivost

45 Vývoj tepla průchodem proudu je zjistitelný řadou metod, např. pomocí měření závislosti proudu na napětí na kapiláře

46 Způsoby potlačení vlivu Jouleova tepla Proměnná Snížení intenzity elektrického pole Zmenšení vnitřního poloměru kapiláry Snížení iontové síly nebo koncentrace pufru Termostatování kapiláry Efekt Odpovídající pokles uvolňování tepla Snížení účinnosti a rozlišení Výrazný pokles proudu (I r 2 ) Pokles citlivosti detekce Může vést k adsorpci vzorku na povrchu kapiláry Odpovídající pokles proudu Může vést k adsorpci vzorku na povrchu kapiláry Snížení negativního vlivu teplotního gradientu na separaci Zlepšení stability migračních časů

47 2. Objem nástřiku Velikost nástřiku je třeba minimalizovat Pokud je délka nastřikované zóny větší než rozmytí způsobené difúzí, účinnost a rozlišení podstatně klesá Příspěvek nástřiku k celkovému rozptylu je roven: 2 2 w i σ = INJ 12 kde w i je délka nástřiku V ideálním případě by délka nástřiku měla být menší než standardní odchylka způsobená podélnou difúzí, (2Dt) 1/2 Jak plyne z předcházejícího vztahu, délka nástřiku závisí jak na difúzním koeficientu, tak na době analýzy Makromolekuly s difúzním koeficientem o dva řády nižším než nízkomolekulární látky je třeba nastřikovat v podstatně užší zóně Praktický limit pro délku nastřikované zóny je 1-2% délky kapiláry Pro kapiláru o rozměrech 70cm x 50µm představuje 1% 7 mm délky kapiláry nebo 14 nl

48

49 3. Interakce analytu se stěnami kapiláry Interakce analytu se stěnami kapiláry vede obecně k deformací píku, snížení účinnosti separace a v určitých případech může dojít i k úplné adsorpci analytu Na kapilárách z taveného křemene je adsorpce obvykle způsobena především iontovou interakcí, dále může docházet i k hydrofóbní interakci Velký poměr plocha stěn/objem, který je výhodou pro odvod tepla, zvyšuje možnost adsorpce složek vzorku Především velké peptidy a proteiny jsou snadno adsorbovány na stěnách kapipáry

50 Existuje řada metod k potlačení nežádoucí adsorpce na kapiláře: Zvýšení koncentrace pufru (vývoj tepla) Užití zwitterionických pufrů Separace za extrémních podmínek ph: ph<2 => potlačení disociace silanolů, snížení EOF, pozitivní náboj proteinů a jejich migrace směrem ke katodě nebo ph>10 => stěny kapiláry jsou negativně nabity a proteiny nesou negativní náboj, nedochází k adsorpci Pokrývání povrchu kapilár: dynamicky, pomocí aditiv v pufrech (hydrofilní polymery nebo detergenty), kovalentně

51 4. Elektrodisperze Z Kohlaruschovy regulační funkce plyne, že pokud má nastřikovaná zóna větší vodivost než eluční pufr, dochází ke vzniku difúzní náběhové hrany píku a strmé sestupné části píku Naopak pro nástřikovou zónu mající nižší vodivosti než eluční pufr platí, že náběh píku je strmý a sestupná část píku pozvolná

52

53 Rozlišení Rozlišení je obvykle jedním z nejdůležitějších sledovaných parametrů při dělení složek vzorku Lze vyjádřit jako: 2(t 2 t1) t 2 t = = (1) w + w 4σ R t je migrační čas, w je šířka píku na základně, σ je standardní odchylka píku, dolní indexy se vztahují ke dvěma analytům Rozlišení je také často vyjadřováno pomocí teoretického vztahu, který využívá účinnost: R = kde 1 4 N 1/2 µ = µ e1,2 µ = µ e + µ 1,2 µ µ EOF (2)

54 Ze vztahu (2), substitucí za N, lze odvodit následující rovnici pro rozlišení: R 1/ 2 1 U l = ( µ ) (3) 4 2 D ( µ e1,2 µ EOF ) L + Ze vztahu (3) je vidět, že napětí je třeba zvýšit čtyřikrát, pokud má dojít ke dvojnásobnému vzrůstu rozlišení Rozlišení dosahuje nekonečna pokud jsou mobility µ e1,2 s pruhem a µ EOF stejné, opačně orientované. Doba analýzy je ovšem v tomto případě nekonečně dlouhá. Je třeba volit parametry analýzy tak, aby při přijatelném čase analýzy, rozlišení dosáhlo dostatečně vysoké hodnoty

55 Techniky užívané v kapilární elektroforéze Název techniky Kapilární zónová elektroforéza Micelárníelektrokinetická chromatografie Kapilární gelová elektroforéza Isoelektrickáfokusace Izotachoforéza Podstata separace Pohyblivost v roztoku Hydrofobní/iontová interakce s micelami Velikost a náboj Izoelektrický bod Pohyblivé rozhraní

56 1.Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Nejčastěji užívaná technika CE Kapilára je naplněna jen pufrem Separace je dosažena na základě odlišné rychlosti migrace nabitých látek Lze rozdělovat kationty a anionty v jedné analýze (příspěvek EOF) Neutrální látky jsou koeluovány s EOF

57 Selektivita dělení Lze nejsnadněji ovlivnit pomocí ph pufru a užitím aditiv přidaných do mobilní fáze Výběr pufru Potřebné vlastnost elučního pufru: Dobrá pufrační kapacita v rozmezí používaného ph Nízká absorbance při vlnové délce užité pro detekci Nízká mobilita (tj. velké, minimálně nabité ionty)=>nízké proudy Je třeba sladit pohyblivost iontů ve vzorku a v elučním pufru, tj. omezit deformace píku Pufry se užívají tak aby platilo, pk a -1<pH<pK a +1 Lze využít tvorby komplexů k ovlivnění selektivity. (Tetraboritan, separace sacharidů)

58 ph pufru Nastavení ph pufru je velmi vhodné především pokud jsou dosažitelné hodnoty pi analytů Lze ovlivňovat náboj analytu a selektivitu dělení Na kapilárách z taveného křemene je možno pracovat v rozmezí ph=2-12 ph pufru mění i velikost EOF (je třeba vzít v úvahu) Povrchově aktivní látky Všechny typy povrchově aktivních látek jsou v CE hojně užívány Při množství pod kritickou micelární koncentrací mohou působit jako solubilizační činidla pro hydrofobní analyty, iontově-párová činidla, nebo jako modifikátory stěn kapiláry Interakce analytu s povrchuvě aktivní látkou je založena na iontové interakci nebo na interakci hydrofobní Mnoho povrchově aktivních látek je adsorbováno na stěnách kapiláry, mění velikost, případně směr EOF

59

60 Chirální selektory Význam chirálních separací stále roste především v oblasti analýzy potravin a léků Obvykle se přidává chirální selektor do používaného pufru Vzhledem k vysoké účinnosti CE separace se používá poměrně menší soubor chirálních látek než je běžné v HPLC, např. cyklodextriny, cyklické ethery, soli žlučových kyselin apod. Selektivita je laděna typem a koncentrací chirálních slelektorů, kromě toho také modifikátory-alkoholy, povrchově aktivní látky, močovina, ionty kovů atd. Rozlišení může být ovlivněno také koncentrací pufru a teplotou, při které probíhá dělení Teplota Ačkoli nejpodstatnějším úkolem termostatování kapiláry je odvádění Jouleova tepla a udržování konstantní teploty, teplota se také využívá pro optimalizaci dělení Zvýšení nebo snížení teploty vede ke změnám viskozity, EOF a délky trvání analýzy Teplota může také ovlivňovat kinetiku interakcí Konformace proteinů a interakce typu protein-dna jsou závislé na teplotě

61

62 Modifikace stěn kapiláry Kapilární zónová elektroforéza by na základě teorie měla poskytovat vysoké účinnosti především pro makromolekuly (N>10 6 )-vzhledem k malým difúzním koeficientům Proteiny často neposkytují teoretické účinnosti v důsledku adsorpce na stěnách kapiláry Adsorpce mají povahu iontové interakce a/nebo hydrofobní interakce Existence těchto interakcí není příliš překvapivá vzhledem k charakteru proteinů Omezení negativního vlivu adsorpce na stěny kapiláry je dosahováno řadou technik, např. práce-při extrémních hodnotách ph, při vysokých iontových silách, s kapilárami o velkém vnitřním průměru atd. Vhodnou metodou je také modifikování stěn kapiláry Uplatňují se dva přístupy: A) Permanentní modifikace s kovalentně vázanou nebo fyzikálně zakotvenou fází B) Dynamická modifikace, deaktivace povrchu kapiláry aditivy v pufru

63

64 Vázané a zakotvené fáze Nejčastěji je ke kovalentní modifikaci stěn využívána silylace následovaná deaktivací vhodnou funkční skupinou Jako deaktivační skupina se užívá např. polyakrylamid, polysacharidy, polyethylenglykol, maltóza, arylpentafluorylová skupina, atd. Nevýhodou siloxanové vazby (Si-O-Si) je její relativně malá stabilita Fyzikálně byly zakotveny např. následující polymery: celulóza, PEG, PVA, polyethylenimin Deaktivace může vést k snížení nebo obrácení směru EOF Neutrální deaktivace např. pomocí polyakrylamidu nebo polyethylenglykolu eliminuje EOF. Výsledkem je jednak podstatné snížení efektivního náboje na stěnách kapiláry, současně dojde i ke zvýšení viskozity u jejích stěn Deaktivace činidly nesoucími po navázání na stěnu pozitivní náboj vedou k obrácení směru EOF Pokud je uskutečněna deaktivace amfoterními látkami, proteiny, aminokyselinami, je obdržena modifikace s reverzibilním směrem EOF v závislosti na pi povrchu a ph roztoku Kovalentní modifikace by měly být permanentní a měly by být odolné vůči regeneračním činidlům, často je dlouhodobá stabilita fází problematická

65

66 Dynamická deaktivace Aditiva v mobilní fázi interagují s povrchem stěn kapiláry, tím mění velikost, případně směr EOF, kromě toho mění také hydrofobicitu povrchu Často se pro dynamickou modifikaci používají hydrofilní polymery, např. alkyl celulóza, PVA, dextrany, polyakrylamidy, nebo povrchově aktivní látky, např. aniontové-sds, kationtové-ctab(cetyl trimethyl ammonium bromide), neionogenní, zwitterionické Výhody dynamické modifikace: a) Stabilita - modifikátor je stále přítomen v mobilní fázi, pokrytí je kontinuálně regenerováno b) Snadnější optimalizace separace Nevýhody dynamické modifikace: a) Přítomnost aditiv má vliv nejen na stěny, ale i na analyt, např. biologická aktivita může být snížena apod. b) Ekvilibrační doby bývají značné c) Post-detekční analýzy (MS, enzymatické testy) mohou být zkomplikovány aditivem v jímané frakci

67 Aplikace CZE Metoda se užívá pro dělení jak nízkomolekulárních, tak vysokomolekulárních látek, např. analýza iontů, organických kyselin, aminokyselin, peptidů (peptide mapping), proteinů, apod. Velké uplatnění v analýze léčiv a metabolitů, dále v oblasti analýz potravin a vzorků ze životního prostředí Důležité je uplatnění v oblasti chirálních dělení V souvislosti s mapováním peptidů se často využívá dvourozměrné dělení, v první dimenzi HPLC pro předběžné dělení peptidů, ve druhé CZE pro separace předčištěné frakce z HPLC

68 2. Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) MEKC je hybridní technika spojující elektroforézu s chromatografií Metoda byla objevena v roce 1984 (Terabe), dnes patří k nejdůležitějším technikám užívaným v kapilární elektroforéze Největší předností MEKC je schopnost dělit nejen nabité látky, ale i neutrální molekuly Princip metody: Separace neutrálních látek je dosažena přidáním povrchově aktivního činidla v množství převyšujícím kritickou koncentraci do elučního pufru Překročení kritické koncentrace (např. pro SDS 8~9 mmol/l) vede k tvorbě agregátů, micel jednotlivých molekul smáčedla Micely jsou sférické útvary s hydrofobními částmi orientovanými do středu těchto útvarů. Tato orientace zamezuje interakci hydrofobních řetězců s hydrofilním prostředím elučního pufru Naopak nabité části molekul povrchově aktivních látek se nachází na povrchu micely Interkce mezi neutrálními analyty a micelami jsou zodpovědny za separaci Používaná povrchově aktivní činidla většinou nesou kladný nebo záporný náboj, podle toho se pak pohybují daným směrem ve srovnání se směrem EOF

69 Aniontová smáčedla (SDS) migrují k anodě, tzn. proti EOF. Protože EOF je obvykle rychlejší (při neutrálním a bazickém ph) než elektroforetická pohyblivost micel, výsledný směr pohybu micel je v souladu s EOF, tj. ke katodě V průběhu pohybu kapilárou interagují analyty s micelami, podobně jako při chromatografii se stacionární fází, hydrofobní a elektrostatickou interakcí Pro neutrální látky je za separaci odpovědno jen jejich rozdělování mezi pufr a micely Látky neutrální a hydrofobní silně interagující s micelami a jsou eluovány za neutrálními hydrofilními analyty interagujícími s micelami jen slabě

70

71

72

73 Separační mechanizmus neutrálních látek je svou podstatou chromatografický a matematický popis MEKC je obdobný jako pro HPLC Pro retenční faktor, tj. pro poměr celkového počtu molů analytu v micelách (pseudostacionární fázi) k počtu molů v mobilní fázi, platí: ( t t ) r 0 VS k = = K (1) t r VM t 0 1 t m t r je retenční čas analytu, t 0 je retenční čas nezadržovaného solutu pohybujícího se rychlosti shodnou s rychlostí EOF, tj. mrtvý čas, t m je retenční čas micel, K je distribuční konstanta, V S objem micelární fáze, V M objem mobilní fáze Výše uvedený vztah (1) je upravenou verzí pro retenční faktor v chromatografii, úprava zohledňuje pohyb pseodostacionární fáze, pokud se t m se blíží nekonečnu (micely se stávají pravou stacionární fází), redukuje se rovnice (1) přesně na formu užívanou v chromatografii

74 Rozlišení dvou látek v MEKC je definováno: + = 1 m 0 m /2 k t t 1- t t 1 1 k k α 1 α 4 N R (2) kde α = k 2 /k 1 Výraz pro rozlišení (2) se skládá z částí pro účinnost, selektivitu a retenci Rozlišení lze zlepšit optimalizací účinnosti, selektivity a/nebo retenčních faktorů Separaci je možno zkvalitnit rozšířením separačního okna. K tomu je vhodné nastavit středně rychlý EOF a aplikovat micely s vysokou elektroforetickou pohyblivostí Při dělení neutrálních látek jsou všechny látky eluovány mezi t 0 a t m. Přestože eluční rozsah je obvykle relativně nízký, separační kapacita je většinou značná, protože dosažené účinnosti bývají vysoké

75 Retenční faktor obecně roste lineárně se zvyšováním koncentrace detergentu Užití ionogenních povrchově aktivních látek ve vysokých koncentracích je ale omezeno zvýšeným uvolňováním tepla. Naproti tomu, neionogenní a zwiteriontové detergenty nezvyšují vodivost pufru, nemění výrazně EOF a mohou mít jen malý efekt na strukturu bílkovin a jejich aktivitu. Jejich přítomnost ovšem mění selektivitu, to je žádoucí efekt

76 SDS = sodium dodecylsulfate, DTAB = dodecyltrimethyl ammonium bromide, CTAB = cetyltrimethyl ammonium bromide, CHAPS = 3-[(3- cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPSO = 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propanesulfonate

77 Podobně jako v chromatografii i v MEKC jsou užívány organické modifikátory pufru, např. methanol, 2-propanol, acetonitril. Jsou přidávány do koncentrace 50%(v/v), snižují hydrofobní interakce mezi analyty a micelami, mohou urychlovat chromatografickou kinetiku, ustavování rovnováh Povrchově aktivní látky samozřejmě mohou interagovat se stěnami kapiláry a mívají velký vliv na EOF a adsorpci analytů na stěny kapiláry. Vliv detergentu na EOF a dělení analytů může být složitý Aplikace MEKC Technika se užívá pro dělení nabitých, nenabitých, hydrofilních i hydrofobních analytů Aplikace zahrnují např. dělení aminokyselin, nukleotidů, vitamínů, léčiv, aromatických uhlovodíků, složek výbušnin