Analýza ovocných kvasů a destilátů ve vztahu k finálnímu výrobku

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Analýza ovocných kvasů a destilátů ve vztahu k finálnímu výrobku Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Tomáš Gregor, Ph.D. Vypracovala: Bc. Jana Kleinová Brno 2011

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Analýza ovocných kvasů a destilátů ve vztahu k finálnímu výrobku vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

3 PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D za cenné připomínky a odborné rady, kterými přispěl k vypracování této diplomové práce.

4 ABSTRAKT Diplomová práce na téma Analýza ovocných kvasů a destilátů ve vztahu k finálnímu výrobku popisuje proces výroby a analýzu ovocných kvasů a destilátů. Při přípravě kvasů je možné do suroviny přidat řadu látek, které podporují alkoholovou fermentaci. V této práci je zkoumán vliv přídavku enzymů, kvasinek a sacharózy na průběh kvašení a složení destilátů. Z jablek a hrušek bylo připraveno 15 variant kvasů, které fermentovaly za stejných podmínek a destilovaly se na totožném zařízení. Pomocí kapalinového chromatografu s refraktometrickým detektorem byly hodnoceny ovocné šťávy, kvasy a destiláty. Dle chemického složení se stanovily rozdíly mezi vzorky. Kvasy bez přidatných látek obsahovaly více neprokvašených cukrů a méně ethanolu, což se promítlo i do složení ovocných destilátů. V destilátech z kvasů připravených z moštů bylo méně methanolu než z celého ovoce a to potvrzuje, že prekurzorem methanolu jsou pektinové látky. Odlišnosti mezi vzorky byly potvrzeny i statisticky. Klíčová slova: kvašení, destilace, ovoce, kvasinky, enzymy, kapalinová chromatografie, ethanol. ABSTRACT Thesis with its subject The analysis of fruit ferments and spirits in relation to the final product describes the process of production and analysis of ferment and fruit distillates. During the preparation of ferment can be added a lot of substances that promote alcohol fermentation. In this work was investigated the effect of added enzymes, yeast and sucrose on the fermentation and the composition of distillates. It was prepared 15 ferment from apples and pears, which ferment under the same conditions and distilled on an identical equipment. Using liquid chromatography with refractometry detectors were evaluated fruit juices, ferments and spirits. According to the chemical composition was determined difference between samples. Ferments without additives contain more sugar and less etanol, which is reflected in the composition of fruit distillates. Spirits from the ferment prepared from the juices contained less methanol than the whole fruit, which confirms that the precursor of methanol are pectic substances. The difference between samples was confirmed statistically. Keywords: fermentation, distillation, fruit, yeast, enzymes, liquid chromatography, ethanol.

5 OBSAH 1 ÚVOD OVOCNÉ KVASY A DESTILÁTY, JEJICH PŘÍPRAVA A ANALÝZA VLIV KVALITY A SLOŽENÍ OVOCE NA JAKOST KVASŮ A DESTILÁTŮ Chemické složení ovoce PŘÍPRAVA KVASŮ, ROZMĚLŇOVÁNÍ OVOCE A POUŽITÍ POMOCNÝCH LÁTEK Výhody přinášející použití pektolytických enzymů Použití čistých kultur kvasinek Rozvoj mikroflóry alkoholového kvašení snížením ph drtě Další faktory zajišťující správný průběh fermentace KVAŠENÍ, PROCES A PRODUKTY Tvorba alkoholu lihovým kvašením Princip alkoholové fermentace DESTILACE, CHEMICKÉ SLOŽENÍ DESTILÁTU Rektifikace lutru opakováním destilace Pomocná zařízení, která zdokonalují jednoduchou destilaci Chemické látky přecházející během procesu do destilátu INSTRUMENTÁLNÍ ANALÝZA Metody používané k přípravě vzorků před chromatografickou analýzou Kapalinová chromatografie Analýza hlavních komponentů PCA MODERNÍ METODY SENZORICKÉHO HODNOCENÍ, ANALÝZA ELEKTRONICKÝM NOSEM Olfaktometrické hodnocení kvality ovocných destilátů Analýza těkavých látek pomocí elektronického nosu EXPERIMENTY PROVÁDĚNÉ ZA ÚČELEM OVĚŘIT VLIV PŘÍDATNÝCH LÁTEK NA PRŮBĚH KVAŠENÍ A KVALITU DESTILÁTŮ Vliv přidání čistých kultur kvasinek na přípravu švestkových pálenek Vliv snížení ph kvasu na fermentaci a finální kvalitu destilátu CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODIKA PŘÍPRAVA OVOCNÝCH KVASŮ Z JABLEK A HRUŠEK Použité kvasinky a enzymy Úprava cukernatosti ovocné břečky DESTILAČNÍ ZAŘÍZENÍ STANOVENÍ CHEMICKÉHO SLOŽENÍ MOŠTŮ, KVASŮ A DESTILÁTŮ POMOCÍ HPLC Materiál a podmínky analýzy POUŽITÉ STATISTICKÉ METODY VLASTNÍ VÝSLEDKY A DISKUZE INSTRUMENTÁLNÍ ANALÝZA OVOCNÝCH MOŠTŮ PRŮBĚH KVAŠENÍ OVOCNÉHO RMUTU Fermentace s řepným cukrem Kvašení bez přidání sacharosy DESTILACE Obsah methanolu v ovocných destilátech Stanovení výtěžku ethanolu Senzorická analýza připravených destilátů STATISTICKÉ POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ Vliv přidatných látek na obsah ethanolu a methanolu v destilátech Stanovení závislosti koncentrace ethanolu a methanolu na cukernatosti ovocných rmutů 64 6 ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...68

6 8 SEZNAM TABULEK, GRAFŮ, OBRÁZKŮ, VZORCŮ A ROVNIC SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK...74

7 1 ÚVOD Ovocné destiláty se připravují už několik tisíc let a od té doby došlo ke značnému vývoji technologie jejich přípravy. Protože je destilace jednoduchý proces, bylo možné již v raném středověku připravit pálenky o vysoké koncentraci alkoholu, i když v té době používaly jen primitivní destilační aparaturu. Alkoholické nápoje byly vyráběny mnichy a lékaři a považovaly se za léčivý prostředek. Jakost a především zdravotní nezávadnost nápojů však zaručena nebyla. A ani v průběhu času, kdy se proces destilace zdokonaloval, nebyla známa rizika spojená s konzumací destilátů. K destilační aparatuře se přidávala různá rektifikační zařízení, aby se co nejvíce zvýšilo procento alkoholu, že je však nutné oddělit úkap s jedovatým methanolem se nevědělo. Analýza destilátů probíhala pouze senzoricky. Úkap sice má štiplavou chuť, kterou mu dodává acetaldehyd, nelze však předpokládat, že tuto první část destilátu výrobci oddělovali, stejně jako přiboudlinu s vyššími alkoholy, které dodávají destilátům negativní organoleptické vlastnosti. Senzoricky se většinou zkoumal jen výsledný nápoj a analýza byla hédonická, kdy hodnotitelé vyjadřovali, jen zda jim výrobek chutná či nikoliv. Přesto je senzorická analýze dodnes nenahraditelná, protože umožňuje komplexní hodnocení příjemnosti a v dnešní době převažuje. Pokud je dobře nastaveno oddělování úkapu a dokapu, není nutné vzorky po každé destilaci analyticky prověřovat. V laboratořích podniků, kde se destiláty vyrábí pro komerční účely, se stanovuje jen alkohol, extrakt a cukry. Podrobnější analýza destilátů se provádí jen zřídka na přání zákazníků přes akreditovanou laboratoř. V dnešní době se instrumentální analýza často používá pro stanovení jakosti výrobního procesu a výrobku. Nejpoužívanější metodou je plynová chromatografie, kterou lze zdokonalit přípravou vzorku před vstupem do chromatografické kolony. Mezi tyto postupy patří mikroextrakce na pevnou fázi, extrakce rozpouštědly, headspace metody, frakcionace s dodatečnou extrakcí, selektivní extrakční techniky či superkritická extrakce. Ovocné destiláty mají tu výhodu, že vzorky není nutné před chromatografickou analýzou nijak zvlášť předčišťovat a stačí použít např. mikroextrakci na pevnou fázi k oddělení těkavých látek od vody, či použít metodu horké jehly, která zajistí zkapalnění vzorku před vstupem do kolony plynového chromatografu. Také senzorická analýza začíná být nahrazována instrumentálními metodami a těkavé látky lze posuzovat přístrojově pomocí elektronického nosu. Touto metodou je 7

8 však zatím možné stanovit těkavé látky pouze kvantitativně. Pokud chceme získat i kvalitativní vyhodnocení těkavých látek destilátu je nejvhodnější použít plynovou chromatografii ve spojení s olfaktometrií, kdy hodnotitelé posuzují vůni látek, které jsou separované kolonou. Tato metoda však postrádá vyhodnocení aroma - sekundárního čichového počitku, který vzniká po ochutnání vzorku a také olfaktometrií není hodnocena chuť pálenek. Při hodnocení jakosti ovocných destilátů je tedy nejvhodnější stanovit kvantitativní složení chromatografickými metodami a pomocí senzorického panelu hodnotitelů posoudit celkovou jakost vzorku. Při přípravě nápoje by se nemělo opomenout odebírat vzorky ovocné suroviny a také prokvašených rmutů, aby bylo možné odhalit nesrovnalosti v celém procesu přeměny cukrů a aroma ovoce na hotový výrobek. Díky tomu případně odhalit chyby, kterých se lze dopustit během přípravy kvasu a při destilaci. 8

9 2 OVOCNÉ KVASY A DESTILÁTY, JEJICH PŘÍPRAVA A ANALÝZA Jakost ovocných kvasů a destilátů je dána mnoha faktory a správný průběh kvašení je možné zaručit mnoha způsoby. Nejčastěji se do kvasů přidávají kvasinky či pektolytické enzymy, dále se pak snižuje ph málo kyselé drtě, rmuty se před začátkem fermentace síří či se do nich přidávají přípravky pro přiživování kvasinek. Často se však také nechává ovocná surovina prokvasit bez pomocných látek, a pokud se zvolí vhodné ovoce a rmut kvasí za příznivých podmínek, je z něj možné získat kvalitní destilát. Při destilaci je stěžejní správně oddělit úkap a dokap a o jakou se jedná destilační aparaturu, není tolik podstatné. Správným postupem lze vydestilovat kvalitní nápoj i na jednoduchém přístroji. Pomocná zařízení však proces zdokonalují a zjednodušují. 2.1 Vliv kvality a složení ovoce na jakost kvasů a destilátů Aby byla zajištěna nejvyšší jakost nápoje, je nutné použít kvalitní ovoce. Určující je v tomto případě stupeň zralosti, mikrobiální a mechanické poškození. Nejvhodnější je použít plody příjemně aromatické, s dostatkem cukru a bez mikrobiálního napadení. Protože se těkavé látky tvoří až v poslední fázi zrání, destiláty z přezrálého ovoce budou mít silné aroma a více alkoholu díky vyššímu obsahu cukrů. Rmut ale bude více náchylný na plesnivění, a proto je někdy nutné např. vylisovat před kvašením z ovoce šťávu. Pokud se na kvašení použije nevhodné ovoce, nelze předpokládat vysoký alkoholický výtěžek a ani výraznou senzorickou jakost. Přiboudlina z nahnilých, plesnivých a nedozrálých plodů zastírá ostatní těkavé látky destilátu. Produkty rozkladné činnosti nežádoucí mikroflóry jsou acetaldehyd, diacetyl, acetoin. Tyto látky je pak potřeba odstranit během destilace, dochází tak ale ke ztrátě i ostatních těkavých látek, které jsou v destilátu naopak žádoucí (SCHMICKLOVÁ a MALLEOVÁ, 2004) Chemické složení ovoce Obsah látek v ovoci kolísá v závislosti na druhu, odrůdě, stupni zralosti, klimatu a vegetačních podmínkách. Mezi základní složky ovoce důležité pro výrobu alkoholu patří sacharidy spojené s výtěžností alkoholu. Obsažené cukry se nachází zejména 9

10 ve formě jednoduchých sacharidů a jen malé množství spadá do cukrů složitých. Kvasinky jsou glukofilní a sacharózu a pektózy nezkvašují, sacharóza se v kvasu přeměňuje na glukózu a fruktózu invertázou. Senzoricky významné látky, které se podílí na typickém charakteru destilátu, patří do více skupin, jedná se zejména o terpeny, silice, estery, karbonylové a karboxylové sloučeniny. Výživu kvasinek tvoří dusíkaté a minerální látky, které jsou tvořeny draselnými, vápenatými, sodnými a fosforečnými solemi. Dusík kvasinky využívají ve formě amonných solí nebo aminokyselin. Nejvíce dusíku obsahuje bobulovité ovoce, naopak od jádrového. Negativním faktorem je přítomnost tříslovin, s bílkovinami tvoří nerozpustné sloučeniny, ty jsou pak pro kvasinky nepřístupné. V sušině ovoce se také nachází kyseliny, které ovlivňují zdárný průběh kvašení. Pokud má ovocná břečka přiměřenou vyšší počáteční kyselost, kvasí zpravidla čistěji, je chráněna před bakteriální infekcí, mikroby jsou citlivé na nižší ph. Kyselé prostředí také potlačuje disociaci, konzervovadla typu organických kyselin a jejich solí jsou účinnější, protože nedisociované molekuly mohou prostupovat buněčnou blanou velmi rychle. Pokud ph nevyhovuje, lze kvas okyselit a teoreticky i neutralizovat, což se ale neprovádí. Významnou složkou ovoce, která se nepodílí na nutriční hodnotě suroviny, ale má velký význam pro rozklad a přeměnu chemických látek v ovoci v průběhu kvašení, jsou enzymy. Na kvašení se podílí enzymy nacházející se v ovoci, a také enzymy produkované mikroorganismy. Na začátku fermentace je i možné přidat do suroviny enzymatické preparáty, které rozkládají složitější sacharidy a pektinové látky na glukosu, která je prekurzorem pro vznik ethanolu. O enzymech a pektinových látkách nacházejících se v ovoci pojednávají následující podkapitoly (HAGMANN a ESSICH, 2007; DYR, 1997) Enzymy Enzymy jsou bílkoviny, které mají katalytický účinek. Určitý enzym ovlivňuje jen určitou specifickou reakci konkrétních látek. Jejich účinek je tedy přísně specifický. Enzym výrazně ovlivňuje rychlost reakce a přitom se nemění. Tyto bílkoviny jsou produkovány živými buňkami a jsou nutné pro jejich základní potřeby. Jejich činnost je závislá na podmínkách, kterými jsou vystaveny. Většina enzymů 10

11 pracuje optimálně při teplotě C, světlo má pro ně negativní účinek. Ohledně ph se nedá říct konkrétní rozmezí hodnot, protože některým enzymům vyhovuje více prostředí kyselé a jiné jsou účinnější v alkalickém prostředí. Některé enzymy potřebují ke své funkci látku zvanou koenzym, jinak bez něj nedojde k reakci. Enzymy se nazývají podle reakce, kterou ovlivňují. Během fermentace působí řada enzymů. Oxidoredukční reakce katalyzují oxidoreduktázy a při kvašení se uplatňuje alkoholová dehydrogenáza, která katalyzuje redukci acetaldehydu na etanol v posledním stupni kvašení a enzym katalyzující oxidační fosforylaci. Transferázy přenášejí skupiny atomů radikály nebo celé velké části molekul mezi dvěma substráty. Patří mezi ně transfosforylázy a ty, u nichž je donorem fosfátové skupiny adenosintrifosfát (ATP), se nazývají kinasy. Hydrolázy katalyzují hydrolýzu esterů, glykosidů, amidů, aminů, peptidů, bílkovin a některých dalších sloučenin a řada z nich se přímo účastní lihového kvašení anebo pomáhají rozkládat polysacharidy a oligosacharidy, což má vliv na rozběhnutí procesu fermentace. Řadí se mezi ně hlavně glukosidázy a galaktosidázy, sacharázy, amylázy a celuláza. Maltáza (α-glukosidasa) štěpí disacharid maltózu na dvě molekuly glukózy. Optimální teplota pro působení maltasy je kolem 35 C a rozmezí ph od 6,7 do 7,2. Sacharáza štěpí sacharózu na fruktózu a glukózu, což jsou cukry přímo zkvasitelné. Sacharáza je pevně vázaná na kvasničnou buňku a do roztoku se jí dostává jen malé množství. Optimální interval ph je 3,5 až 5,5 a ideální teplota 55 C. Amyláza štěpí škrob přes dextriny až na disacharid maltózu. Amylázy mají tedy důležitou úlohu především při zpracování obilí nebo brambor na alkohol. V ovocných pálenicích se amylázové preparáty využívají jen jako přídavek k nezralým jablkům nebo hruškám, které ještě obsahují škrob. Optimální teplota pro amylázu je 63 C, avšak při této teplotě se enzym rychle opotřebuje, a proto se volí teplota pro zcukřování škrobu 50 až 57 C. Lyázy katalyzují nehydrolytické štěpení substrátů na dvě složky, často za vzniku dvojných vazeb nebo nových cyklických sloučenin. Mezi lyázy patří např. syntázy bez štěpení ATP, dekarboxylázy, aldehydlyázy a dehydratázy. Isomerázy se podílí na různých intramolekulárních přesunech atomů nebo skupin atomů, tedy na vzájemných přeměnách isomerních sloučenin. Při reakcích dochází k vnitřním přechodům uvnitř molekul. Celkové chemické složení reagujících látek, jejich sumární vzorec, se při tom nemění (HAGMANN a ESSICH, 2007; DYR, 1997). 11

12 Pektinové látky Pektinové látky jsou přítomny především v jádrovém ovoci, a protože jsou prekurzory pro tvorbu metanolu, je jim nutné věnovat pozornost. Pektinové látky se v nerozpustné formě váží na dužninu, lze je tedy z ovoce odstranit lisováním. Rozpustné pektiny přechází do kvasu. Odštěpení methanolu z molekuly pektinu je znázorněno ve vzorci č. 1. Vzorec 1: Odštěpení methanolu z molekuly pektinu (JÍLEK a ZENTRICH, 1999). Pektinové látky je obecný název pro záporně nabité sloučeniny o vysoké molekulární hmotnosti. Jde o komplexní glykosidické makromolekuly (polysacharidy). Pokud jsou přítomné jako hlavní složka střední lamely mezi buňkami jako sloučeniny s vápníkem a hořčíkem, jedná se o pektany. Pomocí alkalického hydroxylaminu bylo potvrzeno, že střední lamela neboli mezibuněčná hmota se z velké části skládá z pektinových látek. V čerstvém rostlinném materiálu se nachází asi 0,5 až 4 % pektinových látek. Pektinové látky nemají definovanou molekulovou hmotnost, na rozdíl od proteinů, lipidů, nukleových kyselin a polysacharidů. Relativní molekulová hmotnost pektinových látek je v rozsahu 25 až 360 kda, což udává kolikrát je klidová hmotnost dané molekuly větší než konstanta Dalton. Pektinové látky se skládají především z galakturonanů a rhamnogalakturonanů, ve kterých je šesti uhlíkatá galaktóza zoxidovaná na karboxylovou skupinu, arabinózu a arabinogalaktózu. Tyto látky jsou komplexní koloidní polymerní materiály složené převážně z jednotek anhydrogalakturonové kyseliny. Karboxylové skupiny kyseliny galakturonové jsou částečně esterifikované methyl skupinami a částečně nebo úplně neutralizovány sodíkem, draslíkem nebo amonnými ionty. Některé z hydroxylových skupin na druhém a třetím uhlíku mohou být acetylované. Pektinové látky jsou 12

13 přítomny v různých formách v rostlinných buňkách, a proto existují i různé formy pektolytických enzymů. Pektinové látky lze rozdělit na čtyři hlavní typy. Protopektiny jsou ve vodě nerozpustné látky přítomné v neporušené tkáni. Hydrolýzou se protopektiny rozkládají na pektin nebo pektinovou kyselinu. Pektinová kyselina je rozpustný polymer galakuronanů, který obsahuje zanedbatelné množství methoxylových skupin. Neutrální nebo kyselé soli kyselin se nazývají pektany. Pektinátová kyselina je polygalakturonový řetěz, který obsahuje více než nulu a méně než 75 % denaturovaných galakturonových jednotek. Jejich neutrální nebo kyselé soli jsou pektináty. Pektin (polymetylgalakturonát) je polymerní materiál, ve kterém je alespoň 75 % z karboxylových skupin galakturonátových jednotek esterifikováno methanolem. Pokud je vázán na celulózu v buněčné stěně, způsobuje, že je buněčná stěna tuhá (ALKORTA, 1998; JAYANI, 2005) Těkavé látky nacházející se v ovoci a jejich vznik Těkavé látky se tvoří během zrání ovoce a jsou buď vedlejší složky látkové výměny, nebo jejím konečným produktem. Alkoholy vznikají především fermentací, v nepatrném množství se ale nachází i v samotném ovoci, a to jako alifatické a aromatické. Methanol se nachází v plodech především v pektinech a je složkou esterů aromatických kyselin. Volný methanol vzniká převážně hydrolýzou pektinů katalyzovanou rostlinnými pektinesterázami. Větší množství ho vzniká až během kvašení. Ethanol se vytváří aerobní glykolýzou a jeho nadměrný vznik, způsobený nedostatkem kyslíku pro dýchání, není žádaný. V ovocných plodech se tvoří i vyšší alkoholy obsažené v přiboudlině, jakými jsou propanol, butanol, pentanol, hexanol a isoalkoholy. Alkoholy se tvoří z alifatických kyselin o stejném počtu uhlíku, ale i z vyšších mastných kyselin. Důležité pro aroma ovoce jsou alkoholy s šesti uhlíky jako například 1-hexanol, jež vznikají oxidací nenasycených mastných kyselin, která je katalyzována enzymem lipoxygenázou. Tyto alkoholy vykazují tzv. zelenou a bylinnou vůni. Aldehydy vznikají z alkoholů nebo aminokyselin prostřednictvím α-ketokyselin. Neenzymaticky za vyšších teplot se Streckerovou reakcí tvoří heterocyklické aldehydy. Ketony se podobně jako aldehydy vyskytují v ovoci primárně a sekundárně, kdy 13

14 vznikají během metabolických procesů. Ketony tvoří žádoucí vůně, ale i přípachy. V ovoci se nachází především aceton, jehož prekurzorem je acetonacetát. Další důležitou primární složkou ovoce jsou estery, které vznikají z příslušné karboxylové kyseliny a alkoholu. Mezi vázané kyseliny v esterech patří zejména kyselina octová a z alkoholů ethanol. Obecně se lépe esterifikují alifatické kyseliny na rozdíl od kyselin s rozvětveným řetězcem stejně jako alkoholy. Při tvorbě esterů hraje významnou roli přítomnost derivátů koenzymu A, druhou podmínkou je dostatečná koncentrace alkoholu a jeho dosažitelnost. Estery jsou nejdůležitější skupinou těkavých látek pro tvorbu aroma čerstvého ovoce (CROUZET et al., 1990; GOLIÁŠ, 1996; WILLIAMS et al., 1981; VELÍŠEK, 2002). 2.2 Příprava kvasů, rozmělňování ovoce a použití pomocných látek Po pečlivém vytřídění ovoce následuje oprání a rozmělňování. Pro proces kvašení je důležité, aby ovocná břečka byla pokud možno kusovitá, ne kašovitá. Čím jemněji bude ovoce rozmělněno, tím lépe se uvolní cukr z rostlinných buněk. K úpravě ovoce lze použít drtiče, neboli mlýnky, což jsou například dva nerezové profilované válce, otáčející se proti sobě. Při práci stroje se roztrhává dužina a dochází k vytékání ovocné šťávy. Plody se mohou mechanicky narušit také přímo v kvasné nádobě sekáčky nebo tlouky. Dalším způsobem je strouhání. Jádrové ovoce je nejlepší vylisovat a mošt nechat zakvasit. Při mačkání ovoce dochází více či méně k drcení pecek. Dříve se doporučovalo používat mlecí zařízení, která rozdrtila asi jednu třetinu pecek. Pálenka získala silnější aroma po hořkých mandlích. Při drcení pecek se však extrahují nežádoucí látky, které jsou prekurzory derivátů kyanidů a ethylkarbamátu v destilátu. Pokud stroj rozdrtí víc jak 5 % pecek, přenese se do pálenky víc jak 40 mg/l kyanovodíku. Připravená homogenní hmota ovocné břečky se plní do kvasných nádob, kde nastává proces alkoholového kvašení. Někdy je však nutné upravit fyzikální, chemické a mechanické vlastnosti drtě, abychom nastolili vhodné prostředí pro rozvoj požadované mikroflóry. Z břečky pak získáme kvas o chemickém složení, které bude předpokladem pro výrobu jakostního destilátu s příjemnou chutí a aroma. Při kvašení se optimálně využijí cukry a získáme vysoké alkoholové výtěžky (UHROVÁ, 2001). 14

15 2.2.1 Výhody přinášející použití pektolytických enzymů Pektolýzu drtě je vhodné použít především u břeček ze zvadlého ovoce, ze kterých získáme špatně tekoucí kvasy a u hustých drtí. Přidáním enzymů dochází k rychlému rozkladu pektinů, celulózy a škrobu, teplota kvašení ale není pro enzymy optimální. Při 45 C dojde k maximální účinnosti za 1 hodinu, břečky však kvasí při C a pektolýza trvá až 25 hodin. Dalším limitujícím hlediskem je ph, kdy u málo kyselých kvasů neproběhne pektolýza optimálně. Takto ošetřené drtě jsou pak lépe přístupné pro kvasinky, kvašení je snadněji zahájeno, nevytváří se nepohyblivý povrch, ovocná hmota lépe prokváší, cukry jsou lépe využity a stejně tak i kapacita kvasných nádob. Do kvasu se snáze vnáší přidatné látky. Vykvašená hmota se rychleji čerpá čerpadlem a zkrátí se i doba destilace. Nádoby a zařízení se čistí snadněji a nevytváří se pevné nánosy na vnitřní straně kotle. Kvas se při záhřevu nepřipaluje. Preparáty lze použít v pevné nebo tekuté formě, jedná se o Pektinol, Panzyn, Rohament, Ultrazym a další. Dávkují se v množství několik ml na 10 l ovocné suroviny, větší dávka nezvyšuje účinnost (VEVERKA, 2008) Rozdělení pektolytických enzymů Pektolytické enzymy neboli pektinázy jsou heterogenní skupina souvisejících enzymů, které hydrolyzují pektinové látky, jež jsou obsaženy především v rostlinách. Mezi pektolytické enzymy patří protopektinázy, polygalakturonázy, lyázy a pektin esterázy. Pektinázy jsou široce obsažené ve vyšších rostlinách a mikroorganismech. Mají prvořadý význam pro rostliny, protože pomáhají při rozšiřování buněčné stěny a při změkčování některých rostlinných tkání během zrání a skladování. Dále také podporují udržení ekologické rovnováhy tím, že rozkládají a recyklují rostlinné odpady. Patogenita a kažení ovoce a zeleniny hnilobou jsou některé další významné projevy pektolytických enzymů. V přírodě byly mikroorganismy obdařeny obrovským potenciálem. Produkují řadu enzymů, které jsou obchodně využívány už řadu let. Pektolytické enzymy jsou velmi významnou skupinou enzymů. Na celosvětovém prodeji potravinářských enzymů se podílí asi z 25 % a do budoucna by se zájem o ně měl ještě zvětšovat. V potravinářském průmyslu mají význam především pro přípravu šťáv, jinak se používají např. v papírnictví. Téměř všechny komerčně připravené pektinázy jsou 15

16 vyrobeny z plísní. Aspergillus niger je nejčastěji používaný druh pro průmyslovou výrobu pektolytických enzymů. Protopektinázy degradují nerozpustné protopektiny na rozpustný vysoce polymerní pektin. Protopektinázy neboli PPázy katalyzují solubilizace protopektinu, což znamená, že se látka pomocí něj zrozpustní. PPázy jsou rozděleny do dvou typů, a to na základě jejich reakčního mechanismus. A-typ PPáz reaguje s vnitřní stranou, tedy s polygalakturonovou kyselinou protopektinu. Zato B-typ PPáz reaguje na vnější straně, tedy s polysacharidovým řetězcem, na kterém mohou být připojeny polygalakturonová kyselina a složky buněčné stěny. A-typ PPáz se nachází v kulturách kvasinek. Byly izolovány z Kluyveromyces fragilis, Galactomyces reesei L. a např. z Trichosporon penicillatum. B-typu PPáz produkuje např. Bacillus subtilis. Polygalakturonázy čili PGázy jsou pektázy, které katalyzují hydrolytické štěpení řetězce polygalakturonové kyseliny včleněním molekuly vody přes kyslíkový můstek. Jsou nejhojnějšími ze všech pektináz. PGázy podílející se na hydrolýze pektinových látek se dají rozdělit na endo-pgázy a exo-pgázy. PGázy produkují bakterie, kvasinky ale i vyšší rostliny. Endo-PGázy se vyskytují častěji než exo-pgázy. Lyázy katalyzují trans-eliminativní štěpení kyseliny galakturonové. Lyázy produkuje mnoho bakterií a některé patogenní houby a pro potravinářství nemají velký význam. Pektinesterázy, PE, katalyzují deesterifikaci pektinů odstraněním methoxy esterů. Způsob deesterifikace se liší v závislosti na původu PE. Pektinesterázy z plísní odstraňují methyl skupiny v náhodném pořadí. Rostlinné PE katalyzují reakce na neredukovaném konci nebo na volné karboxylové skupině a proces pokračuje podél molekuly. PE činnost souvisí s metabolismem buněčné stěny včetně buněčného růstu a dozrávání rostliny. Komerčně PE mohou být použity na ochranu a zlepšování textury a pevnosti zpracovaného ovoce a zeleniny, stejně jako na vylepšování extrakce a vyčiření ovocných šťáv. PE se nachází v rostlinách, patogenních bakteriích a plísních. Rovnice č. 1 znázorňují štěpení pektinových látek (BLANCO, 1999). 16

17 Rovnice 1: Rozklad pektinových látek pomocí protopektináz a pektinesteráz, (BLANCO, 1999) Použití čistých kultur kvasinek S přídavkem čistých kultur kvasinek břečky rychleji prokvášejí, kvašení je bezpečnější, kvasy nejsou tak náchylné k octovatění a pálenky bývají jemnější s čistým tόnem v chuti. Rozvoj škodlivých mikrobů je hned z počátku utlumen rychle vznikajícím alkoholem a oxidem uhličitým. Zákvas se přidává hlavně, pokud jsou břečky připravené z podřadného ovoce, protože jsou více náchylné na octové kvašení a také když obsahují hodně tříslovin. Přídavkem čisté kultury se obecně sníží ztráty cukru na vedlejší produkty kvašení, zvýší se tedy lihovitost destilátu. Správný druh kvasinek již od začátku v populaci převažuje a usměrní fermentaci správným směrem. S kvasinkami se do rmutu dodávají i živné soli. Do rmutu se nejčastěji přidávají čisté kultury vinařských kvasinek ASVK aktivní suché vinné kvasinky. Méně časté je přidávání pekařských kvasnic, které nejsou adaptované na proces lihového kvašení, jsou tedy méně odolné vůči alkoholu. Pokud hodláme rmut nechat kvasit za nižších teplot, je vhodné použít pivovarské kvasnice, které jsou chladnomilné a kvašení bude probíhat i za teplot 4-6 C. Nižší kvasnou teplotou se eliminují ztráty alkoholu a aromatických látek. Do rmutu, který již kvasí, se kvasinky nepřidávají, mohlo by dojít k narušení přirozeného kvašení (DYR, 1997) Rozvoj mikroflóry alkoholového kvašení snížením ph drtě Je běžné, že se při zakládání do kvasu přidává cukr, ušlechtilé kvasinky či enzymy, které rozkládají složitější sacharidy a pektiny. Pozornost by se však měla věnovat i ph rmutu, protože kvasinkám rodu Saccharomyces, které jsou pro lihové kvašení nejdůležitější, vyhovuje kyselé prostředí, což je pro ostatní mikroflóru limitující. Pokud budou kvasy málo kyselé, dojde k rozvoji nežádoucích forem 17

18 kvasinek, octových bakterií, bakterií mléčného a máselného kvašení, hnilobných bakterií a plísní. Skladba mikroorganismů ovlivní tvorbu aromatických látek a výtěžek ethanolu. Pro kvašení ovocného rmutu je nejvhodnější ph kolem hodnoty 3,5. Při ph nižším jak 3 ustávám i činnost kvasinek. Drtě se okyselují kyselinou sírovou, která se dobře disociuje a vytváří velký podíl vodíkových iontů. H 2 SO 4 se zředí vodou na 10 % a vmíchá se do drtě. Dále je možné do rmutu přidat kyselinu mléčnou, šťavelovou, jablečnou a mléčnou s fosforečnou. K dostání je koncentrát s organickými kyselinami z ovoce např. Biogen-M (JÍLEK a ZENTRICH, 1999) Další faktory zajišťující správný průběh fermentace Nežádoucí mikroorganismy lze také inaktivovat sířením, které je rozšířeno především ve vinařství, ale při výrobě pálenek se také používá. Oxid siřičitý omezuje rozvoj především povrchové mikroflóry, octových bakterií a divokých kvasinek, bude-li však jeho obsah vysoký, inaktivují se i kvasinky. Limitní dávky 1 gram na 100 litrů opozdí kvašení i o několik dní, bude ale probíhat čistě. Účinnost závisí na zralosti ovoce. Přezrálé plody obsahují hodně acetaldehydu, na který se SO 2 váže a vzniká kyselina aldehyd-siřičitá. K zasiřování kvasů se používá plynný SO 2 v tlakových lahvích, pyrosiřičitan draselný hydrogensiřičitan sodný a kyselina siřičitá. Na kvašení má také vliv teplota, při které proces probíhá. Optimální teplota pro rozmnožování kvasinek je C, pro průběh kvašení je ale příliš vysoká. Břečka se doporučuje zakvasit v rozmezí teplot C, během kvašení se teplota zvýší až o 6 C, přeměnou cukrů v alkohol se uvolňuje energie. Pokud necháme kvas prokvášet za vyšších teplot, bude destilát obsahovat více vyšších alkoholů, protože bude v kvasu více namnožených kvasinek. Autolyzované kvasinky jsou organickou dusíkatou živnou substancí a výchozí látkou pro vznik přiboudliny. Při tzv. studeném vedení kvasu se získávají pálenky velmi kvalitní, jemného aroma a příjemné chuti, riziko octovatění je daleko menší. Kvasy ale budou prokvášet pomaleji. Alkoholovou fermentaci lze také zajistit přiživováním kvasinek. Na buněčnou stavbu využijí kvasinky jen 1 2 % cukru, zbytek jejich enzymy zkvasí a kvasinky z cukru získají energii. Z 1 kg monosacharidů se uvolní kvašením průměrně 502 kj. Z této energie stačí kvasinkám k asimilaci jen nepatrná část, zbytek zůstává v kvasu ve formě tepla a kvas se takto může ohřát až o několik C. Velkou výhodou je nechat kvas 18

19 fermentovat v kvasných nádobách s regulací teploty, které jsou především ve velkovýrobnách. Získají se tak pálenky s vysokým zastoupením aromatických látek. Dalším zdrojem živin jsou pro kvasinky dusíkaté látky. Z dusíkatých látek získávají kvasinky amoniak. Bílkoviny jsou pro ně nevyužitelné, štěpí je enzymaticky na peptidy a bílkoviny. Amoniak lze do kvasu přidat ve formě amonných solí, dusičnany jsou pro výživu kvasinek nevhodné. Přiživování vede jen k růstu buněk, k rozmnožování je potřeba organický substrát. Minerální látky se do kvasu nepřidávají, jsou přítomny v dostačujícím množství. Pro mikroflόru jsou podstatné především fosforečnany, draslík, hořčík, vápník a sírany. Při nedostatku substrátu nastává proces zvaný samozkvášení. Minimum živin dostačuje k vegetaci jen některých mikroorganismů, ostatní kvasinky lyzují, rozkládají se. Kvasný proces pokračuje dál, protože živinami se stávají lyzované buňky. (WAGNER, 2001; DYR, 1997). 2.3 Kvašení, proces a produkty Kvašení je děj, který umožňuje mikroorganismům získat energii štěpením cukrů na menší molekuly, které mají celkově menší chemickou energii, zbylá energie se uvolňuje a mikroby ji využívají ke svým životním pochodům. Podle latinského fervere, což znamená vřít, se tento děj cizím slovem nazývá fermentace. Fermentace probíhá odlišně, podle toho jaké mikroorganismy se na ní podílejí. Z cukrů vznikají různé produkty a podle toho se liší kvašení, případně potravina. V kvasu může mimo alkoholového kvašení probíhat i mléčné, octové a máselné. Bližší popis těchto forem kvašení je v bakalářské práci, na kterou tato práce navazuje (KLEINOVÁ, 2009). Při přípravě kvasu je nutné zajistit takové podmínky, které podporují čisté lihové kvašení a jiné formy potlačují. Už v první fázi je důležité, aby se začaly rychle rozrůstat kvasinky rodu Saccharomyces. Produkce alkoholu je pro ostatní mikroby toxická. Kvašení je druh biologické konzervace, protože metabolity jedné skupiny mikroorganismů brání rozvoji jiných Tvorba alkoholu lihovým kvašením Teoreticky vzniká ze 100 % cukru 51,1 % ethanolu, což je 64,4 l ze 100 kg zkvasitelných cukrů. Ne všechen cukr je však využit na tvorbu alkoholu. Kvašením vzniká z ethanolu glycerol a část cukru je využita kvasinkami. Další ztráty jsou 19

20 způsobeny průběhem procesu kvašení. Během fermentace není všechen cukr zkvašen, ethanol se vypařuje a přeměňuje na acetaldehyd a kyselinu octovou. Část cukrů spotřebuje cizí mikroflóra. Úbytek alkoholu lze ovlivnit pečlivostí práce. Při dokonalém pracovním postupu lze získat ze 100 kg hexóz 60 l alkoholu. Průměrná výtěžnost alkoholu ze 100 l kvasu je od 3 l u trnek až po 8 l u třešní. Kvasinek etanolového kvašení žijí dva druhy, sedlinové a křísové. Do první skupiny patří rody Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes a Schzosaccharomyces. U kvasných technologií se používají tyto rody kvasinek, které svými enzymy vytváří ethanol a oxid uhličitý a ke své vegetaci jim stačí jen malé množství cukru. Nejrozšířenější lihovou kvasinkou je Saccharomyces cerevisiae. Sedlinové kvasinky rostou uvnitř suspenze, to však neznamená, že nepotřebují kyslík. Z počátku je ve rmutu kyslíku dostatek a kvasinky ho potřebují jen na své rozmnožování, když je kyslík spotřebován, kvasinky se přestávají množit, ale žijí dále. Provzdušňování kvasu není nutné, naopak při umělém provětrávání vznikají alkoholové ztráty. Více kvasinek spotřebovává více cukru, bílkovin a eventuálně i alkohol. Výsledný produkt má nižší lihovitost a větší podíl přiboudliny, kdy se oxidací ethanolu vytváří především mastné kyseliny. Aerobní formy mikroorganismů lihového kvašení žijí na povrchu kvasu a říká se jim křísové kvasinky, v hlavní fázi kvašení kontaminace nehrozí, protože vzduch na povrch je vytlačován vznikajícím oxidem uhličitým. Než je prokvašená surovina vydestilována, musí se kvasná nádoba doplnit po okraj, protože křísové kvasinky se v této fázi rychle množí, ethanolu vytvářejí velmi málo a všechen rozkládají. Jejich činností vznikají nežádoucí splodiny a tyto kvasinky často ničí i aromatické a chuťové látky. Nejznámější křísovou kvasinkou je Saccharomyces pastorianus Princip alkoholové fermentace Produkty degradace cukrů vznikají odebíráním vodíkových atomů a elektronů oxidací či dehydrogenací. Donorem částic však nejsou zkvasitelné hexózy, je třeba je fosforylovat. Tato reakce vyžaduje dodání energie, která je ve formě adenosintrifosfátu, jenž je zdrojem dvou makromolekul fosfátové vazby. Děj probíhá pomocí enzymu hexokinázy a konečným produktem fosforylace hexóz je fruktoso-1,6-bisfosfát. V druhé fázi probíhá štěpení vzniklého esteru na dvě triózy, které jsou stejné složením, ale liší se strukturou. Na vznik ethanolu je potřebný jen glyceraldehyd-3-20

21 fosfát, z dihydroxyacetonfosfátu se vytváří glycerol, který je důležitý pro jakost vína. Vznik triosofosfátů je katalyzován působením jednoho z nejdůležitějších enzymů kvasinek aldolázou. Dihydroxyacetonfosfát se postupně přetváří na glyceraldehyd-3- fosfát, aby byla v systému rovnováha. Glyceraldehyd-3-fosfát je dehydrogenován koenzymem NAD +, což je oxidovaná forma nikotinamidadenindinukleotidu NADH, a současně fosforylován kyselinou fosforečnou. Vzniklá 1,3-difosfoglycerová kyselina je defosforylována na 3-fosfoglycerovou kyselinu a ta se defosforyluje pomocí enzymu fosfoglyceromutázy na 2- fosfoglycerovou kyselinu. Za katalytického účinku enzymu enolázy se z 2- fosfoglycerové kyseliny vytvoří kyselina fosfoenolpyrohroznová. Prekurzorem vzniku ethanolu je acetaldehyd, který je vytvořen z kyseliny hroznové. Nezbytný pro tuto reakci je koenzym thiamindifosfát. Acetaldehyd je redukován za pomocí alokoholdehydrogenázy (JÍLEK a ZENTRICH, 1999; GÖLLES, 2002; VELÍŠEK, 2002). 2.4 Destilace, chemické složení destilátu Když je kvašení u konce, nastává fáze, kdy se destilací oddělují těkavé složky kvasu od méně těkavých. Závěr fermentace lze stanovit podle cukernatosti a obsahu alkoholu v kvasu, už není pozorovatelný únik oxidu uhličitého přes kvasnou uzávěrku, kvas nepění a pevné složky klesly ke dnu. Destilace je podmíněna zahříváním kvasu, teplota se zvyšuje, až dosáhne mezní hodnoty, kdy se vyrovnává vnější tlak nasycených par s tlakem kapaliny a nastává bod varu. Kapalná a plynná fáze je v rovnováze. Druhou veličinou, která má vliv na destilaci, je tlak. Čím nižší je vnější tlak, tím stačí k bodu varu kapaliny nižší teplota. Bod varu spočívá v chemickém složení kvasu. Jednotlivé molekuly se navzájem ovlivňují, což má dopad na průběh destilace. Kapaliny lze destilací oddělovat do stádia, kdy nastává azeotropický bod, v tomto momentu už nelze kapaliny oddělit varem. Při odpařování dochází k vyrovnávání chemického složení mezi kapalnou a plynou fází, a pokud už je stejné, roztok je azeotropický, neměnný. Azeotropický bod směsi ethanol a voda nastává, když se koncentrace alkoholu zvýší na 95,57 % hm. ethanolu. Při výrobě pálenek není 21

22 účelem destilace získat nápoj o takto vysoké lihovitosti, ale odloučit z kvasu co nevyšší podíl aromatických a chuťových látek. Postupným vývojem se mění technika destilace. Zabudování pomocných rektifikačních armatur vede ke zdokonalování pálení, protože pomocí přidatných zařízení se kapaliny lépe rozdělí a zvýší se lihovitost výrobku. Koncentrace alkoholu se zvýší i opakováním celého procesu destilace. Dokonalým oddělením alkoholu se však nezvyšujeme jakost pálenky, společně s vodou dochází k separaci aromatických látek a pálenka je o ně ochuzována Rektifikace lutru opakováním destilace Prostou destilací je z kvasu možné získat polotovar zvaný lutr, který ještě nemá odpovídající vlastnosti hotového výrobku. Jeho lihovitost je jen % obj. a koncentraci alkoholu je nutné zvýšit přibližně na 50 % obj. Také je nezbytné, oddělit nežádoucí frakce destilátu. Zesílení lihovitosti destilátu se dosáhne opakováním celého procesu, čili násobnou destilací, která se nazývá rektifikace. Jednoduché destilační aparatury s jedním kotlem na destilaci a druhým na rektifikaci pracují periodicky Destilace pomocí jednoduchého destilačního zařízení Při vícenásobné destilaci není nutné používat různá zesilující zařízení. Destilační aparát se skládá z varného kotle, na kterém je víko, kterému se říká klobouk nebo helma. Kotel musí být opatřen otvory na plnění a vypouštění výpalků a míchacím zařízením. Čím jsou kotle širší, tím se snadněji prohřívají a mají větší odpařovací plochu. Helma je sestavena tak, aby se kypící kvas nedostal do chladiče, což hrozí u menších klobouků. Z kotle vystupují alkoholové páry přímo do chladiče, kde kondenzují zchlazením na C. Chlazení nemá vliv na jakost pálenky. Aby bylo chladící zařízení účelné, přitéká studená voda vždy protiproudně. Nejvýkonnější jsou chladiče trubkové. Sestávají ze svazku svisle postavených trubek, do nichž je přiváděna lihová pára. Dobře se osvědčily také chladiče plášťové, talířové apod. Destilát protéká do zásobníku přes měřič lihovitosti. Jímáním malého množství kondenzátu z každého přitékajícího litru je možné změřit celkovou lihovitost destilátu. 22

23 Oddělení nežádoucích složek destilátu Rychlost vypařování jednotlivých složek pálenky závisí na tom, jaký mají tlak v plynné fázi. Čím je tlak par látek vyšší, tím jsou těkavější a tím mají nižší bod varu. Destilace začíná už při teplotě 75 C. Z kvasu se začínají vypařovat látky těkavější jak samotný alkohol. Ethanol má bod varu 78,3 C, ale destilace probíhá až do teploty 95 C, protože odpařování ethanolu je závislé na tom, jaké množství vody je v kvasu. Bod varu směsi záleží na poměru kapalin, a čím je z kvasu vydestilováno větší množství ethanolu, tím je potřeba vyšší teploty, aby se odpařil zbývající. Této zákonitosti lze využít na oddělení jedovatých a senzoricky nežádoucích látek. První vydestilovanou frakcí je úkap neboli předek. Úkap vzniká špatným kvašením. Pracuje-li se nečistě, vytváří nahnilé nebo plesnivé ovoce, listy, stopky a jiné nečistoty podstatnou část úkapu. Čím bude kvašení čistší, tím vznikne míň úkapu. Základem vzniku nežádoucích látek jsou kontaminující mikroorganismy. Různými biochemickými pochody vznikají nežádoucí vedlejší produkty, jako je například acetaldehyd, etylacetát, butanol, aceton, kyseliny octová, máselná a propionová, hexanol, diacetyl aj. Protože tyto látky vedou k poškození kvality destilátu, je bezpodmínečně nutné se tvorbě těchto látek vyhnout. Úkap se skládá především z aldehydů, zejména z acetaldehydu, který mino kontaminující mikroflóru vytváří i kvasinky. Významnou složkou předku je methanol, který se nachází ve všech frakcích destilátu. Oddělení methanolu v úkapu je dostačující, aby jeho množství nestouplo nad povolených mg v 1 litru alkoholu. Methanol je jedovatá látka, kterou nelze senzoricky odlišit od ethanolu, proto je nutné oddělení úkapu věnovat zvýšenou pozornost. Střední část destilátu obsahuje žádaný ethanol, a pokud má lutr lihovitost 30 % obj., předpokládá se výtěžek alkoholu 60 % obj. Tato část se nazývá prokap či jádro a je hotová pálenka, která se podle potřeby zřeďuje měkkou vodou. Silná koncentrace ethanolu dráždí sliznice a jeho pálivá chuť a dráždivá vůně překrývají lahodnou chuť a aromatickou vůni pravého ovocného destilátu. Při 91 C se začíná vypařovat dokap. Tento podíl není jedovatý, správné oddělení dokapu je stěžejní pro jakost pálenky. Souhrný název pro látky v dokapu, které mají vyšší bod varu než voda, je přiboudlina. Malé množství přiboudliny je žádoucí, dodává pálence typickou chuť a vůni. Pokud je dokap nedostatečně oddělen, má 23

24 výsledný destilát nepříjemný přípach (SCHMICKLOVÁ a MALLEOVÁ, 2003; DYR, 1997) Pomocná zařízení, která zdokonalují jednoduchou destilaci Opakovaná destilace není jediný způsob jak zvýšit lihovitost pálenky. K destilačnímu zařízení lze připojit další přístroje, které svou stavbou umožňují rektifikaci destilátu. Tyto destilační zařízení umožňují získat konečný produkt v jedné pracovní operaci a mohou tedy pracovat kontinuálně Rektifikační kolony a jejich druhy Každá kolona se skládá z rektifikačních pater, na kterých se zachycují alkoholové páry, které na článku kondenzují. Z destilačního kotle přichází čím dál teplejší páry, takže dochází k tomu, že se kondenzát znovu odpařuje a dvakrát předestilovaná lihovina pokračuje do vyššího patra, kde dochází k opětovné destilaci. Část kondenzátu s vodou, který má menší bod varu, stéká do nižších pater. Lihovitost destilátu vycházejícího z kolony je podmíněna počtem pater. V koloně s více patry dochází k přesnějšímu oddělení kapalin a destilát je čistší a bohatší na ethanol. Počet pater kolony znamená počet cyklů deflegmace odpařování deflegmace. Deflegmace znamená částečnou kondenzaci, méně těkavý podíl kondenzuje, prchavý ethanol postupuje do vyšších pater. Nástřik do patrové kolony se přivede přibližně doprostřed a probublává do vyšších pater, přičemž se obohacuje o prchavější látku až do té doby, kdy ji obsahuje téměř stoprocentní. Teplota na dně kolony, v tzv. ochuzovací části, je maximální, protože je zde látka s vysokým bodem varu. Naproti tomu teplota v hlavě kolony, v tzv. obohacovací části, je minimální, neboť se zde nachází látka s nízkým bodem varu. Patra kolon mohou být různá, například přepadová, kloboučková, sítová. Obměnou patrových kolon jsou kolony náplňové, které jsou založené na stejné zákonitosti, ale místo pater obsahují drobná tělíska s členitým povrchem, kterými mohou být Berlova sedélka, Raschigovy kroužky, drcený křemen, koks, spirály, Gurmánovy koule a jiné. Náplň je volena tak, aby byla velká plocha styku páry a kapaliny. Páry kondenzují na náplni a stékají po ní proti stoupajícím parám. Specifickým příkladem jsou filmové kolony. Na stěnu pláště kolony se nanese kapalinový film, který unáší zachycené méně těkavé látky do jímky destilačních zbytků. 24

25 Rektifikační kolonu můžeme chápat i jako tenkou svislou trubku. Pára kondenzuje na stěnách, kde dochází ke styku s další přicházející horkou párou a část nízkovroucího podílu se opět odpaří a destiluje. Zpětný tok se tedy projevuje u každé destilace. Nekontrolovaná deflegmace probíhá na stěnách kotle a v přestupníku mezi kotlem a kondenzátorem Deflegmátor a jeho funkce Stejně jako patrové rektifikační kolony je deflegmátor sestaven z jednoho či více pater, kde dochází ke kondenzaci vody a dalších látek s vyšším bodem varu. Od rektifikačních kolon se deflegmátor liší tím, že ke srážení vody nedochází samovolně, ale alkoholové páry jsou chlazeny vlažnou či studenou vodou. Látky méně těkavé kondenzují dříve než ethanol, jsou jímány a sestupují do spodních částí destilačního zařízení. Do destilačního kotle nebo rektifikační kolony se tedy vrací tzv. zpětný tok neboli reflux. Zesílení alkoholových par záleží na počtu pater a na teplotě chladící vody. V ovocných lihovarech je vhodné nemontovat zesilovací zařízení přímo na destilační kotel, ale bokem, což umožňuje použít je, jen když je to nutné. Zesilovacím zařízením se odstraňují četné aromatické látky, které jsou nepostradatelné pro jakost ovocného destilátu. Rozdělování směsi látek lze usměrňovat regulací přítoku vody a její teplotou. Při silném chlazení se koncentruje alkohol, ale těžko lze řídit přechod vedlejších látek z kvasu do destilátu. Při destilaci je nutné do pálenky převést malé množství přiboudliny. Při výrobě destilátu z jakostního kvasu se deflegmace neosvědčila, pokud použijeme kvas podřadný, což předurčuje použité ovoce a průběh kvašení, deflegmátorem se z pálenky účinně vyřadí nežádoucí přípachy. Získá se alkohol vhodný k ředění méně kvalitních pálenek Zvýšení koncentrace alkoholu děličem kondenzátu Za kondenzátorem je často destilát rozdělen a část se ho vrací zpět do horní části rektifikační věže, kde se vypírá. Horní produkt přechází do zásobníku, kde se jímá výsledný destilát. Zesilování lihoviny je částečné. Účinnost dělení je podmíněna reflexním poměrem, což je podíl zpětného toku v objemových jednotkách k počtu objemových jednotek odebraného destilátu. Zesilující zařízení by bylo nejvíce efektivní 25

26 při úplném zpětném toku, kdy by se žádný destilát neodebíral (CÍDLOVÁ, 2007; ŠKOPEK, 2003) Chemické látky přecházející během procesu do destilátu Hlavní podíl ovocných pálenek tvoří ethanol a voda. Charakteristické vlastnosti, kterými se ovocné destiláty liší od ostatních lihovin, jsou dány zastoupením aromatických látek, které se v destilátu nachází jen v nepatrném množství. Aromatické látky z ovoce buď přechází přímo do pálenky, nebo se během kvašení rmutu rozkládají a jiné se tvoří. Ke změně chemického složení dochází i vlivem vysoké teploty během destilace. Hlavní část aromatických látek v destilátu chybí, protože se s vyčleněním úkapu oddělily látky s nižším bodem varu a v pálence schází hlavní podíl přiboudliny, která přešla do dokapu. Při destilaci se postupuje tak, aby zastoupení aromatických látek bylo dostatečné pro vznik typického aroma, nesmí se však překročit přijatelná mez, kdy se frakce špatně oddělí a množství těkavých látek, pak uděluje destilátu nežádoucí přípachy. K složkám, které destilátům přidělují nežádoucí vlastnosti, patří především acetaldehyd a ethylacetát, které lze díky rozdílnému bodu varu oddělit v úkapu a prokapu. Tyto látky jsou indikátory nesprávného průběhu kvašení, především infekce octovými bakteriemi. Aby při destilaci nepřešly do nápoje, se však musí oddělit i velká část alkoholů přiboudliny, které mají stejný bod varu jako ethylacetát, destilát pak bude mít nevýrazné aroma, takže nelze očekávat vysokou kvalitu výrobku. Mezi látky s příznivými senzorickými vlastnostmi patří např. aldehydy s 8-14 atomy uhlíku, acetaly a estery s 4 10 atomy uhlíku. Vyšší alkoholy jsou v nápoji přijatelné jen v nízkých koncentracích. Naopak nepřijatelný je jedovatý kyanovodík a ethylkarbamát. Podrobnější popis chemického složení destilátů je v bakalářské práci, na kterou tato práce navazuje (HAGMANN a ESSICH, 2007; KLEINOVÁ, 2009). 2.5 Instrumentální analýza Nejvhodnější instrumentální analýzou je chromatografie, která dokáže spolehlivě stanovit kvantitativní složení vzorku. Pro přesné stanovení koncentrace vyskytujících se látek je nenahraditelná. V destilátech se nacházejí jedovaté látky jako je methanol, kyanovodík a ethylkarbamát. Analýzou lze sledovat jejich množství, a tím zajistit 26

27 zdravotní nezávadnost produktu. Protože destilát se skládá z látek těkavých, je pro rozbor složení nejvhodnější plynová chromatografie. Chromatografie patří mezi separační metody analýzy vzorku. Využívají se při nich rozdílné fyzikální a chemické vlastnosti vzorku. V chromatografické koloně dochází k separaci látek, což umožňuje jejich stanovení detektorem, který je zapojen za kolonou. Separační metody se od sebe liší rozsahem použitelnosti a frakční kapacitou, která udává maximální počet složek, které mohou být separovány v jedné operaci. Plynová chromatografie má frakční kapacitu až několik set. Princip rozdělení látek v chromatografii, popis plynové chromatografie a chromatografické veličiny jsou popsány v bakalářské práci, na kterou tato diplomová práce navazuje (KLEINOVÁ, 2009) Metody používané k přípravě vzorků před chromatografickou analýzou Stanovení látek pomocí instrumentální techniky se skládá ze dvou etap. První etapa analýzy, izolace analytů z matrice, je zvláště důležitá. Chromatogramy závisí do značné míry na izolačním postupu, protože technika izolace má vliv na složení a obsah izolovaných látek. Izolovaný extrakt by měl být reprezentativní, a proto má výběr metody přípravy vzorku zásadní význam. Vzorky získané pomocí extrakce rozpouštědlem či destilací ne vždy odpovídají chuti a aromatu, které vnímáme pomocí chuťových receptorů v průběhu senzorické analýzy. Pouze některé z těkavých sloučenin přispívají k vůni nápojů a potravin. Během přípravy vzorku se mění složení těkavých látek v závislosti na jejich rozpustnosti a vlastnostech matrice (např. obsahu cukru). Proto je výhodnější používat metody izolace, při kterých jsou patrné rozdíly mezi tím, jak se látky uvolňují z matrice, než že se stanoví celkový obsah těchto složek. Usnadňuje to srovnání se senzorickou analýzou výsledků. Statické i dynamické headspace metody mohou být pro tento účel použity, ale dynamické se používají častěji, protože je zde možnost obohatit analyt (POLLIEN et al., 1997; NONATO, 2001). U headspace metod nedochází ve srovnání s konvenčními extrakčními technikami k významným ztrátám těkavých látek, což může být v tomto případě i nízké množství, protože aroma můžeme vnímat i při velmi nízké koncentraci látek. Kromě toho headspace techniky umožňují lepší chromatografickou analýzu, která je s rozpouštědlem obtížná vzhledem k přítomnosti píku rozpouštědla. Headspace analýza 27

28 se používá pro izolování těkavých složek z matrice, neumožňuje však stanovení celkového obsahu těchto složek, a proto se používá např. v kombinaci se senzorickou analýzou nebo plynovou chromatografií (GROSH, 2001). Mikroextrakce na pevnou fázi je často používaná headspace metoda, která umožňuje podstatné zjednodušení procesu. Místo ředění extraktu je možné přímo ředit vzorek, což je obvykle mnohem méně časově náročné. SPME umožňuje téměř úplnou eliminaci přípravy vzorku. Jednoduchost této techniky spočívá v možnosti využít různé tloušťky pevné fáze nátěry na vlákna, místo série ředění vzorku. Nevýhodou tohoto přístupu je malý počet komerčně dostupných vláken o různých tloušťkách. Časově náročná příprava vzorků o různých koncentracích těkavých látek může být odstraněna pomocí různého rozdělovacího poměru nosného plynu a vzorku při analýze s děličem toku nebo pomocí různých délek vláken. Umožňuje to dosáhnout i 50ti násobné ředění vzorku. Molekuly analytu se oddělí od matrice a do chromatografu vstupují zakoncentrované látky. Technika SPME rychle, jednoduše a citlivě odebírá vzorek bez použití rozpouštědla (CHAINTREAU, 2001; ROCHA et al., 2001; SEDLÁKOVÁ, 1998). Extrakce rozpouštědly je obvykle časově náročná a zahrnuje mnoho etap. Je nutné opláchnout organický extrakt vodným roztokem s odlišným ph, abychom odstranili kyseliny a netěkavé sloučeniny, které by se mohly dostat do špatně selektivního extrakčního rozpouštědla. Odstranění netěkavých látek ze vzorku je důležité nejen kvůli kontaminaci chromatografické kolony ale také proto, že by mohly zkreslit výsledky. (VERMAULEN, GUYOT-DECLERCK a COLLIN, 2003). Frakcionace s dodatečnou extrakcí se používá, když se těkavé látky alkoholického nápoje vyznačují velmi komplikovaným kvalitativním složením. Tento postup umožňuje stanovení aromat i ve stopovém množství. Například frakcionace těkavých látek obsažených v čínském alkoholickém nápoji Yanghe Daqu pomocí extrakce s rozpouštědlem - Freonem 11, umožnila účinné oddělení a identifikaci více než 70ti sloučenin. Pomocí metody byla získána jedna kyselá frakce a čtyři neutrální a alkalické frakce. Neutrální a alkalické frakce byly získány extrakcí freonovým izolátem s vodou při zvýšeném ph, a kyselá frakce byla získána pomocí extrakcí dietyléterem při nízkém ph. Vzhledem ke složitému složení neutrální a alkalické frakce, následovala preparativní kapalinové chromatografie s normální fází (AZNAR et al., 2001; FAN a QIAN, 2006). 28

29 K identifikaci a kvantitativnímu hodnocení konkrétních analytů z dané třídy organických sloučenin se používají selektivní extrakční metody. Například Bouchilloux et al. použili kombinaci vakuové destilace se selektivní extrakční technikou, kde reagoval thiol s kyselinou p-hydroxy merkurbenzeovou (p-hmb). Byly analyzovány sirné sloučeniny bez vlivu široké řady jiných těkavých látek. Další výhodou této metody je odstranění polyfenolů z extraktu. Tyto sloučeniny, které se nachází v extraktech získaných konvenčním extrakčním rozpouštědlem, činí chromatografickou analýzu mnohem těžší (BOUCHILLOUX et al, 1998) Relativně nová technika je superkritická extrakce. Ve srovnání s jinými rozpouštědly dává tato technika čistší extrakt, který také prodlužuje životnost kolony. Další výhodou, zejména ve srovnání s headspace analýzami, je možnost izolovat sloučeniny, které nejsou snadno těkavé nebo jsou silně vázány k matici. Tato technika lze použít např. k získání polárních analytů oxidem uhličitým nebo vodou v superkritickém stavu (SIDES et al., 2000) Kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie (LC) se využívá k separaci směsi látek, které jsou netěkavé nebo špatně těkavé a tepelně nestálé. K separaci využívá různé systémy pevné nebo kapalné stacionární fáze a kapalné mobilní fáze. Na rozdíl od plynové chromatografie hraje mobilní fáze aktivní roli. V soustavě se ustavuje rovnováha mezi rozpouštědlem a stacionární fází. V dnešní době se prakticky výhradně jako kapalinová chromatografie používá varianta Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography HPLC). HPLC je separační metoda používající kolony s vhodnou stacionární fází pro dosažení rychlé separace látek, protože účinnost separace je dána vysokým počtem teoretických pater kolony. Stacionární fáze je složena z malých částic s úzkou distribucí velikostí (3-10 µm), případně homogenním filmem zakotvené stacionární fáze (SOMMER, 2000). V současnosti se při analýze ovocných destilátů dává přednost plynové chromatografii před kapalinovou. HPLC se stanovují např. aldehydy a ethyl-karbamát, protože pro tyto látky má kapalinová chromatografie větší účinnost. GC byla použita v bakalářské práci, na kterou tato práce navazuje, a ukázalo se, že metoda HPLC je pro stanovení kvantitativního složení vzorků méně citlivá. Chemické složení destilátů analyzovaných v bakalářské práci je popsáno v přílohách

30 Výhodou použití kapalinové chromatografie je snadná aplikace metody. Před vstupem do kolony není nutná izolace vzorku z matrice. Pevný podíl u ovocných šťáv a kvasů stačí pouze přefiltrovat a odstředit, aby se nezanesla chromatografická kolona. Stejnou metodu kapalinové chromatografie s refraktometrickým detektorem je možné použít pro stanovení kvantitativního složení rmutů, kvasů i destilátů. Chromatograf s polymerní stacionární fází s diferenčním refraktometrickým detektorem se dá využít pro stanovení cukrů v ovocných rmutech a také pro stanovení cukrů, ethanolu a methanolu v ovocných kvasech a destilátech. Podle koncentrací jednotlivých látek lze posoudit, jak ovocná surovina prokvasila a podle toho určit vhodnost použité metody výroby destilátu. V následujících odstavcích je lépe popsán princip kapalinové chromatografie a je zde také vysvětlena funkce refraktometrického detektoru, který se používá pro stanovení chemického složení ovocných rmutů, kvasů a destilátů Kapalinová chromatografie dle použité stacionární a mobilní fáze Při adsorpční chromatografii je stacionární fází pevná látka a metoda je založena na různé schopnosti látek v roztoku adsorbovat se na povrch pevné fáze neboli absorbentu. Látky mají různou afinitu k absorbentu, a čím je jejich schopnost adsorbovat se na povrch horší, tím bude delší jejich retenční čas a díky rozdílné afinitě dojde k separaci látek. Poté je nutné látky z vazeb na sorbent uvolnit. Někdy se látky uvolní samy pomocí mobilní fáze, jindy je nutné je vymýt vytěsněním roztokem látky, která má k adsorbentu větší afinitu než navázaná látka. Dnes dochází k vývoji především afinitní chromatografie, která patří k metodám adsorpčním. Při rozdělovací chromatografii dochází k separaci látek mezi dvěma navzájem nemísitelnými kapalinami dle odlišného rozdělovacího koeficientu. Stacionární fáze je zakotvená na inertním nosiči a je tedy nepohyblivá. Mobilní fáze se vzorkem přes tuto fázi přetéká, přičemž nedochází k vazbám rozpuštěných látek na fázi a není je tedy nutné látky ze stacionární fáze vymývat. Při chromatografii na normální fázi je stacionární fáze polární a nejčastěji je to voda nebo látka s vodou mísitelná, mobilní fáze je pak méně polární. Čím pak máme polárnější analyt, tím je delší jeho retence v koloně. Nosiči stacionární fáze musí být látky, které jsou schopny adsorbovat značné procento vody, aniž by se změnilo jejich skupenství, což je např. silikagel, dextrany či neklížený papír. Normální fáze se 30

31 používá pro separaci látek rozpustných ve vodě. Zvyšováním polarity mobilní fáze klesá retenční doba, protože jsou látky více vázány na mobilní fázi a nedochází tolik k reakcím se stacionární fází. Nejčastěji se normální fáze používá v adsorpční chromatografii. Pokud potřebujeme od sebe oddělit látky ve vodě nerozpustné, je třeba je separovat v chromatografii s převrácenou (reverzní) fází, při níž se stacionární fází stává fáze nepolární a používá se pro látky rozpustné v nepolárních rozpouštědlech. Stacionární fázi je v tomto případě nutné kovalentně navázat na inertní nosič, např. chemicky modifikovaný silikagel. K dělení látek poté dochází na základě hydrofobicity. Silikagel se modifikuje reakcí mezi silanovými skupinami a chlorsilanovou sloučeninou, jejíž uhlíkaté radikály určují charakter nosiče. Jde-li o radikály s krátkými uhlíkatými řetězci, sorbent bude mít povrch hydrofilní (alkoholové, aminové a kyanoskupiny). Alkylové řetězce s 8-22 uhlíky dodají sorbentu charakter hydrofobní a užívají se proto jako stacionární fáze převážně v chromatografii s reverzní fází (ROWAN, 2004) Kapalinová chromatografie s refraktometrickým detektorem Pro stanovení chemického složení rmutů, kvasů a destilátů je možné použít stejnou metodu HPLC s refraktometrickým detektorem. Tento detektor je univerzální, každý typ látek poskytuje signál. Odezva je dána rozdílem indexu lomu mobilní fáze ve srovnávací cele a indexu lomu analyzovaných látek v měrné cele. Jde tedy o diferenciální detektor. Přístroj kontinuálně zaznamenává rozdíly v indexech lomu mezi výtokem z kolony a čistým elučním činidlem. Nevýhodou je malá citlivost detektoru a velká teplotní závislost, takže tento detektor nelze použít při gradientové eluci. Index lomu se mění s teplotou, proto je nutné udržovat daný teplotní režim. (JANDERA, 2002; KLOUDA, 2003) Stanovení organických kyselin a cukrů v nápojích pomocí HPLC Jako při každé analýze lze postup stanovení koncentrací různých látek metodou HPLC obměňovat a záleží na laborantovi, jaký postup si zvolí, aby to nejlépe vyhovovalo pro stanovení konkrétních sloučenin konkrétní metodou. Chinnici et al. zvolili pro stanovení organických kyselin v nápojích jako nejvhodnější kapalinový chromatogram s UV/VIS detektorem, kde se látky kvantifikují spektrometricky. 31

32 Při stanovení organických kyselin v nápojích pomocí HPLC je prvním krokem příprava mobilní fáze a standardních roztoků. Jako eluční roztoky se používají např. 0,01 M fosforečnan sodný upravený na ph 2,25 pomocí kyseliny fosforečné (mobilní fáze A) a methanol pro HPLC (mobilní fáze B). Jako stacionární fázi je vhodné použít např. kolonu Gemini NX3 v zapojení s předkolonou SecurityGuard. Kolona byla uložena v termostatu přístroje s teplotou 30 C. Průběh analýzy je vhodné nastavit takto: 0-15 min 100 % mobilní fáze A, min 100% mobilní fáze B, min 100 % mobilní fáze A. Doba jedné analýzy je tedy v tomto případě 20 min, čas regenerace mezi analýzami 2 min. UV detektor byl nastaven tak, aby snímal sloučeniny při 200, 210 a 220 nm. Průtok mobilní fáze je 1 ml/min a velikost dávkovací smyčky 20 µl. Pro kvantifikaci jednotlivých organických kyselin v reálném vzorku je nutné sestavit kalibrační křivku a rovnici standardních roztoků, které získáme pomocí kalibrační řady směsných roztoků organických kyselin a odečtením velikosti píků. Vzorek před měřením je nutné důkladně zhomogenizovat a zfiltrovat. Následně probíhá analýza a odečtení velikosti píků pro jednotlivé kyseliny. Pokud je koncentrace kyselin ve vzorcích příliš vysoká (nebude odpovídat kalibrační řadě), je nutné upravit vzorek zředěním mobilní fáze tak, aby se koncentrace nevymykala kalibrační řadě. Popsaný postup je však možné obměňovat a vylepšovat. Za účelem dosažení co nejlepšího rozlišení a přesnosti je možné vzorek před vstříknutím do kolony extrahovat SPE (extrakce na pevnou fázi) a filtrovat např. přes 0,22 mm celuloacetátovou membránu. Cílem je oddělení neutrálních sloučenin (např. cukrů a alkoholů) od těch kyselých. Kolonky (3 ml/500 mg) byly předběžně stabilizovány methanolem (3 ml) a redestilovanou vodou (3 ml). Pak byly vzorky (0,5 ml) upraveny pomocí NaOH na ph 9 10 a pomalu eluovány (0,5 ml/min) přes patronu. Pro oddělení neutrálních látek se patrony promývaly dvakrát redestilovanou vodou s ph 7 (upraveno NaOH), zatímco kyseliny byly eluovány s 0,5 ml 1 molární HCl (5 krát). Dvě frakce (neutrální a kyselé sloučeniny) byly zředěny s mobilní fází na konečný objem 5 ml a filtrovaný přes 0,22 mm membránu a nakonec vstřikovány do zařízení na HPLC. Pomocí UV a RI detektoru se stanovily kyselina šťavelová, sacharóza, kyselina citrónová, kyselina galakturonová, glukóza, dehydroaskorbová kyselina, kyseliny jablečná, fruktóza, kyselina chinová, kyselina askorbová, kyselina jantarová, kyseliny 32

33 šikimová a kyselina fumarová. V následujících chromatogramech, které jsou znázorněny v obrázku č. 1, jsou označeny čísly 1-10 (CHINNICI et al., 2005). Obrázek 1: Stanovení organických kyselin v ovocné šťávě pomocí UV a RI detektoru (CHINNICI et al., 2005) Kvantitativní a kvalitativní analýza aldehydů v alkoholických nápojích Nascimento a kol. popsali analýzu osmnácti aldehydů v destilátech z cukrové třtiny a jiných lihovinách. Aldehydy byly odděleny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fází. Navrhovaná metodika je poměrně jednoduchá a není příliš časově náročná. V 75 nápojích bylo zjištěno deset aldehydů. Kvantifikace proběhla pomocí UV detektoru při 365 nm. Znalost obsahu aldehydů by měla významně přispět ke zlepšení kontroly kvality lihovin. Bylo zjištěno, že aldehydy jako je akrolein, isovaleraldehyd, n-valeraldehyd, furfural a propanal nemůžou být zcela odděleny mobilní fází acetonitrilem s vodou. Ve skutečnosti takto byly oddělěny pouze sloučeniny se třemi uhlíky, ale ne s pěti. Jak se dalo očekávat, retenční čas nasycených alifatických aldehydů se zvyšoval podle molekulové hmotnosti a nenasycené alifatické aldehydy se vymývaly před nasycenými. K nejúčinnějšímu oddělení příslušných aldehydů došlo na kolonách Supelcosil (25cm 4,6 mm, ø 5 µm) a Shimadzu (15 cm 6,0 mm, ø 5 µm) s gradientovou elucí methanolu s vodou. Následující chromatogram byl získán z kolony Shimadzu, která byla nakonec na separaci nejlepší. 33

34 Obrázek 2: Analýza aldehydů pomocí HPLC (NASCIMENTO et al., 1997). Z obrázku č. 2 je vidět vynikající oddělení standardních aldehydů. V alkoholickém nápoji byly kvantifikovány postupně formaldehyd, 5- hydroxymethylfurfural, acetaldehyd, akrolein, furfural, propanal, p-anisaldehyd, butyraldehyd, benzaldehyd, krotonaldehydem, isovaleraldehyde, n-valeraldehyde, cinnamaldehyd, 2 - methylbenzaldehyd, n-hexanaldehyd, n-heptanaldehyd, n- nonaldehyd a n-decanaldehyd. Vzorky byly derivatizovány 2,4-dinitrofenylhydrazinem a analýzy byly provedeny duplicitně. Detekční limit pro jednotlivé aldehydy byl 500 µg/l acetonitrilu. Brazilská legislativa povoluje maximální obsah 5 mg furfuralu/100 ml absolutního ethanolu a 30 mg celkových aldehydů vyjádřených jako acetaldehyd, což nebylo u vzorků brazilského nápoje caninhasu překročeno. Množství aldehydů v jiných destilátech bylo výrazně vyšší v porovnání s brazilským caninhasem. Ve skutečnosti většina whisek, rumů, brandy a dalších alkoholických nápojů je obvykle starší než caninhasu a obsah aldehydů v lihovinách se zvyšuje v důsledku oxidačních procesů. Výskytu a kvantifikaci furfuralu a 5-hydroxymethylfurfuralu byla věnována větší pozornost, protože lze díky nim kontrolovat zachování organoleptických vlastností v průběhu distribuce a skladování destilátů. Tyto aldehydy jsou přednostně tvořeny při zvýšených teplotách a tvoří se až při destilaci a během zrání. Také lze pomocí nich rozpoznat falšování lihovin a klamání spotřebitele. Ačkoli zdravotní rizika jsou přičítána hlavně formaldehydu, acetaldehydu a akroleinu, neměly by se opomíjet ani ostatní aldehydy, jejichž toxicita nebyla zatím 34

35 prokázána. Zde popsanou metodou HPLC je možné snadno stanovit koncentrace mnoha aldehydů a bylo prokázáno, že v některých lihovinách se nacházejí v poměrně vysoké koncentraci (NASCIMENTO et al., 1997) Stanovení ethylkarbamátu v destilátech z jablečných moštů Metoda HPLC byla také použita pro stanovení ethylkarbamátu v destilátech z jablečných moštů. Vzorky bylo nutné před analýzou derivatizovat. Na derivatizaci se použil roztok o koncentraci 0,02 mol/l 9-xanthydrolu v 1-propanolu a 1,5 mol/l HCl v 1-propanolu. Derivatizační reakce byla provedena v chromatografických lahvičkách tak, že 0,4 ml roztoku 9-xanthydrolu se přidalo do 2 ml vzorku nebo standardu a pak 0,2 ml roztoku HCl. Směs se protřepala po dobu několika sekund pro zajištění homogenizace a poté se chromatografické lahvičky odstavily na 30 min, aby proběhla reakce. Následovala chromatografická analýza. Všechny vzorky byly připraveny ve dvou vyhotoveních s výjimkou standardů, u kterých proběhla analýza 3 krát (HERBERT et al., 2002). Separace byla provedena na koloně Spherisorb ODS-2 (250 4 mm, 3 µm). Vzorky se dávkovaly autosamplerem a jejich objem byl 60 µl. Pec měla teplotu 35 C. Excitační a emisní vlnové délky byly 233 nm a 600 nm. Eluce byla provedena v gradientovém režimu, kdy mobilními fázemi byli metanol a voda. Prvních 22 min protékal kolonou roztok s 61 % metanolu, poté protékal 6 min 100% methanol. Tato analytická metoda navržená pro stanovení úrovně ethylkarbamátu v lihovinách z jablečného cideru (prokvašený jablečný mošt) prokázala dobré statistické výsledky jako je linearita, přesnost a mez detekce. Dále tato metoda vyžaduje minimální zpracování vzorku, což umožňuje její použití v rutinní analýze této kontaminující látky. Koncentrace ethylkarbamátu zjištěného v této studii z jablečných lihovin byly podobné těm nalezeným v jiných ovocných destilátech a s výjimkou některé pálenek z peckovin se pohybovaly lehce nad limitem kvantifikace, což bylo 67 µg/l. V destilátech z peckovin se nachází více jedovatého ethylkarbamátu, protože v peckách se nachází jeho prekurzor kyanovodík. Výrazné zvýšení ethylkarbamátu bylo v destilátech z vyzrálých moštů, protože vzniká reakcí ethanolu s kyanovodíkem. Obrázek č. 3 znázorňuje stanovení ethylkarbamátu pomocí jeho derivátu xanthylu-ec ve standardu a jablečném destilátu (MADREDA a VALLES, 2009). 35

36 Obrázek 3: Stanovení ethylkarbamátu HPLC pomocí jeho derivátu xanthylu-ec ve standardu (a) a jablečném destilátu (b) (osa x čas, osa y fluorescence) (MADREDA a VALLES, 2009) Analýza hlavních komponentů PCA Analýza hlavních komponentů (Principal Components Analysis) je analytický nástroj, který se používá na redukci rozměrnosti (počtu proměnných) velkého počtu vzájemně souvisejících proměnných na hlavní komponenty při co nejmenší ztrátě informací (variability). PCA vypočítá soubor vzájemně nezávislých proměnných (hlavních komponentů), které jsou lineární kombinací (váženým průměrem) originálních proměnných. První hlavní komponent vysvětluje největší část variability proměnných, druhý komponent vysvětluje druhou největší část variability atd., dokud není vysvětlena veškerá variabilita. Komponenty jsou vzájemně nezávislé a několik z nich často vysvětluje kolem 80 % variability. Tyto se pak zkoumají, graficky znázorní, případně použijí jako vstupy do lineární regrese, diskriminační analýzy nebo shlukové analýzy. PCA na rozdíl od příbuzné faktorové analýzy (FA) přináší vždy stejné výsledky. FA i PCA se snaží zredukovat rozměrnost skupiny údajů. Hlavní rozdíl mezi FA a PCA je ten, že PCA vysvětluje veškerou variabilitu mezi originálními proměnnými (vyjádřenou ve srovnávací matici) a FA pouze variabilitu, kterou mají proměnné společnou. Cílem PCA je odvození malého množství lineárních kombinací (hlavních komponent) z množiny proměnných při zachování co nejvíce informací obsažených v původních proměnných (RIMARČÍK, 2007). 36

37 Použití PCA k porovnání destilátů, které se lišily okyselením kvasu a použitou destilační aparaturou PCA analýza byla použita pro srovnání hruškových destilátů s cílem ověřit rozdíly mezi destiláty. K analýze byly použity všechny získané údaje o hruškových destilátech. K dobrému rozlišení došlo při porovnání složek PCA1 a PCA2, což je zřejmé z obrázku č. 4. PC1 tvořily 46,88% z celkového rozptylu, a to na obrázku zřetelně odděluje destiláty získané rozdílnou destilační aparaturou. PC2 tvořily 26,32 % rozptylu, a to oddělilo destiláty získané při dvou různých kvašeních. PC2 tvoří hlavně 2 -methyl-1-butanol, 3-methyl-1-butanol a 2-methyl-1-propanol, tyto sloučeniny prokázaly významné rozdíly v destilátech získaných při dvou různých kvašeních. Analýza hlavních komponentů je tedy vhodná pro porovnávání různých vzorků a k ověření, jestli jsou mezi nimi statisticky významné rozdíly. V tomto případě analýza ověřila, že snížení ph kvasu má vliv na chemické složení destilátu, stejně jako použití různé destilační aparatury (LLOBODANIN, 2010). Obrázek 4: Porovnání hruškových destilátů získaných různými metodami destilace a připravených z různě kyselých kvasů pomocí PCA analýzy (LLOBODANIN, 2010). 37

38 2.6 Moderní metody senzorického hodnocení, analýza elektronickým nosem Olfaktometrické hodnocení kvality ovocných destilátů Olfaktometrie je metoda stanovení pachových látek, která využívá hodnotitele, aby určili a ohodnotili vonné látky vystupující z olfaktometru. Jako u ostatních senzorických hodnocení je sestaven panel hodnotitelů. Nejčastěji dochází v olfaktometru k různému naředění vzorku a posuzovatelé musí určit podnětový práh těkavých látek, tedy práh detekce, který udává nejmenší hodnotu senzorického podnětu potřebnou k vyvolání počitku. Počítá se zde s pravděpodobností 0,5, což udává, že alespoň 50 % hodnotitelů reagovalo kladně na senzorický podnět. Při hodnocení ovocných destilátů je nejvhodnější použít olfaktometrii v kombinaci s plynovou chromatografií. Chromatografy dokáží stanovit i takové koncentrace látek, které u hodnotitelů nevyvolávají pachový vjem, proto je analýza neúplná pokud neznáme práh detekce vonných látek. Při výstupu látek z chromatografické kolony, jde část látek do detektoru a druhá do olfaktometru. V souladu s retenčními časy dochází k analýze vonných látek pomocí hodnotitelů. Ti zaznamenají, zda u nich daná látka vyvolala počitek či nikoliv. Případně zda šlo počitek identifikovat a jestli byl příjemný či naopak. V porovnání s ostatními senzorickými metodami dokáží posuzovatelé vyhodnotit každou těkavou látku destilátu zvlášť, není však známo aroma látek, které představuje sekundární čichový počitek po polknutí a výdechu nosem. Stanovení aroma se často stává součástí hodnocení chuti a komplexní vjem se značí jako flavour, což je slovo, které nemá v češtině ekvivalent. Následující obrázek č. 5 znázorňuje porovnání analýzy tequily pomocí plynové chromatografie s olfaktometrickým hodnocením vzorku. Při olfaktometrii byla použita metoda ředění až na nejnižší práh senzorického vnímání, která poskytuje kvantitativní popis vzorku. Pro tuto metodu je připravena série ředění vzorku. Hodnotitel popisuje typ vůně a uvádí při jaké nejnižší koncentraci je ještě možné dané aroma vnímat (PLUTOWSKA a WARDENCKI, 2008). 38

39 Obrázek 5: Analýza tequily pomocí plynové chromatografie a olfaktometrie (PLUTOWSKA a WARDENCKI, 2008) Analýza těkavých látek pomocí elektronického nosu Měření těkavých látek elektronickým nosem je metoda, která nahrazuje senzorické hodnocení, ale na rozdíl od něj je objektivní, opakovatelné, přesné a relativně levné. Interpretace je jednoduchá, rychlá a výsledky lze získat prakticky okamžitě. Stejně jako vnímání vůně čichem i elektronický nos se "učí" na základě zkušeností a jeho výkony se zlepšují s četností používání. Je konstruován tak, aby byl schopen analyzovat, rozeznat a identifikovat těkavé sloučeniny ve velmi nízkých koncentracích. Technologie je založena na absorpci a desorpci (při průchodu) těkavých sloučenin na souboru senzorů, což se projevuje specifickými změnami elektrického odporu měřenými na každém jednotlivém senzoru při styku s různými vůněmi a zápachy. Základem zařízení je tedy senzor a iontový spektrometr. Pachy přístroj nasává a ionizuje, v elektrickém poli analyzuje a během několika vteřin zjistí, o jaké látky jde. Elektronický nos obsahuje tenké polymerové vrstvy, jejichž elektrická vodivost se mění v závislosti na tom, jakou chemickou látku zachytí. Jde o velmi sofistikované senzory, které umožňují tvorbu digitálních záznamů různých pachů a vůní. V potravinářství nahází uplatnění hlavně při kontrole kvality současných a vývoji nových výrobků a také řeší problém s průběžným hodnocením zralosti ovoce. Velký význam má však i v jiných odvětvích jako je zdravotnictví a bezpečnost (C. DI NATALE et al., 1998). 39

40 Hodnocení ovocných šťáv pomocí elektronického nosu a PCA Jako senzor elektrického nosu byl použit oxid wolframový (WO 3 ), který snímal indukované elektrické pole. Tenké WO 3 filmy byly připraveny naprašováním magnetronovým systémem na oxid hlinitý při 400 C v suchém vzduchu po dobu 6 h. Jako katalyzátory byly vybrány paladium (Pd), zlato (Au), bismut (Bi) a antimon (Sb) a pomocí vakuového odpařování na povrchu WO 3 byly vyrobeny čtyři dvojvrstvy s různou citlivostí. Obrázek č. 6 znázorňuje typické grafy s Pd, Au, Bi a Sb katalyzátory na tenkém filmu oxidu wolframového, který byl cyklicky vystaven třem vzorkům ovocné šťávy (hruškové, meruňkové a pomerančové) při teplotě 180 C. Výsledky jsou reverzibilní a docela reprodukovatelné. Nicméně při srovnání šťáv pomocí PCA je jasně odlišná jen hrušková šťáva. Pomerančová a meruňková šťáva se částečně překrývaly, což znamená, že WO3 senzor není zcela optimální pro tento účel (PENZA et al., 2001). Obrázek 6: Hodnocení hruškové (a), pomerančové (b) a meruňkové (c) šťávy pomocí elektronického nosu a jejich porovnání pomocí PCA (PENZA et al., 2001). 40

41 2.7 Experimenty prováděné za účelem ověřit vliv přídatných látek na průběh kvašení a kvalitu destilátů Vliv přidání čistých kultur kvasinek na přípravu švestkových pálenek Pokud do ovocného kvasu nepřidáváme žádné kvasinky, probíhá spontánní kvašení rmutu. Na fermentaci se podílí různé druhy kvasinek, které se nachází na povrchu ovoce. Nejběžnějšími druhy jsou Aureobasidium sp., K. apiculata a S. cerevisiae (POHVE et al., 2001). Vedle ostatních druhů dominují především během iniciační a finální fáze spontánního kvašení. Nejběžnějším druhem kvasinky, která se používá při řízeném kvašení je S. cerevisiae. Jaký vliv má přídavek kvasinek na průběh kvašení, zjišťovali výzkumníci na polské univerzitě v Krakově, kde použili kvasinku S. cerevisce a její kmeny Hansen M2 34 a Burgund 19, což je kmen vyskytující se ve víně. Po podrcení ovoce byly vzorky ošetřeny pektolytickým přípravkem Pektopol PT- 400 v množství 0,3 ml na 1 kg ovoce. Enzymy se nechaly působit 3 hodiny při 28 C a vylisovala se šťáva. Mošty, které měly být zkvašené pomocí čistých kultur, byly nejprve pasterizované po dobu 15 minut při 104 C, aby se odstranila epifitní mikroflóra, a potom byly naočkovány 0,5 g suchých kvasinek na 1 l šťávy. Alkoholové kvašení probíhalo po dobu 30 dní při teplotě 25 C v nádobách o objemu 5 l, ve kterých bylo 2,5 l moštu. Denně se měřily hmotnostní ztráty spojené s uvolňováním oxidu uhličitého a dle toho se stanovila kinetika kvašení švestkových moštů a rozdíly mezy kvasy fermentovanými pomocí přidaných kvasinek a epifytní mikroflóry. Proces je znázorněn v grafu č. 1. Nejrychleji začaly kvasit mošty naočkované kvasinkami rodu S. cerevisiae a nejvyšší hmotnostní ztráty spojené s uvolňováním oxidu uhličitého byly pozorovány během prvních pěti dnů kvašení. Vzorky fermentované kmeny Aureobasidium sp. a K. apiculata kvasily mírně pomaleji. Zpožděný průběh kvašení u epifytní mikroflóry byl dán zřejmě jejich nízkou koncentrací na začátku fermentace, ale během kvašení se změnil poměr mezi mikroorganismy v kvasu. Koncentrace alkoholu se zvýšila a živiny se vyčerpaly. U vzorků fermentovaných spontánně byly zjištěny nejvyšší hmotností ztráty (až 7 %), což znamená, že více sloučenin uhlíku bylo metabolizováno na oxid uhličitý. Co se týče výtěžku alkoholu, v moštech zkvašených pomocí monokultur bylo méně ethanolu (kolem 1,0 1,5 % obj.) než po spontánním kvašení. Vzorky zkvašené 41

42 pomocí přirozené mikroflóry se rovněž vyznačují velmi vysokou účinností procesu (96 %) a spotřebou cukru (přes 99 %). Vysoká koncentrace bezcukerného extraktu v moštech fermentovaných spontánně kmeny K. apiculata a Aureobasidium sp. by mohla být spojená se zvýšenou produkcí glycerolu a netěkavých organických kyselin (CIANI a FERRARO, 1998). Graf 1: Rozdíly v kinetice kvašení dle požitých kmenů kvasinek (SATORA a TUSZYNSKI, 2010). Pokud jde o kvalitativní a kvantitativní složení destilátů, mezi švestkovými pálenkami byly zaznamenány statisticky významné rozdíly. Získané destiláty obsahovaly od 66,3 (K. apiculata) až do 74,3 % obj. ethanolu (spontánní kvašení). Jednou z nejdůležitějších složek destilátů je methanol přítomný v relativně vysokých koncentracích. Podle směrnic EU pro švestkové pálenky nesmí koncentrace methanolu překročit 12 g l -1 absolutního alkoholu. Všechny analyzované vzorky splňovaly tento požadavek. Nejvyšší množství bylo nalezeno ve slivovicích získáných pomocí kvasinek K. apiculata (9744 mg l -1 ) a nejnižší ve spontánně kvašených vzorcích (7550 mg l -1 ). Koncentrace metanolu je závislá na činnosti pektolytických esteráz kvasinek, jejichž optimální hodnoty ph se můžou pohybovat od 3,75 až po 6,0. I v rámci jednoho druhu pektolytických enzymů se může jejich činnost měnit v širokém rozsahu. Nižší obsahu methanolu ve vzorcích by mohl být spojen s vysokou aktivitou cholinesteráz 42

43 mikroorganismů, které zahajují kvašení. To také vysvětluje relativně vysoké množství celkových esterů, které činilo až 2470 mg l -1 absolutního alkoholu ve vzorcích po spontánním kvašení (BLANCO et al., 1999; SATORA et al., 2008). Vyšší alkoholy jsou dominantní skupinou těkavých látek v pálenkách a mají významný vliv na jejich senzorické vlastnosti a kvalitu. Podle předpisů EU by měl být celkový obsah těchto sloučenin od 2250 do 6000 mg l -1 absolutního alkoholu. Obsah vyšších alkoholů v testovaných vzorcích se značně lišil. V destilátech po spontánním kvašení byla zjištěna méně než polovina koncentrace vyšších alkoholů přiboudliny (1960 mg l -1 absolutního alkoholu) ve srovnání se vzorky získanými po kvašení moštů s přidanými kvasinkami. Menší množství vyšších alkoholů ve vzorcích po spontánním kvašení bylo pravděpodobně spjato s přítomností kvasinek K. apiculata během počáteční fáze kvašení moštu. Tyto mikroorganismy se vyznačují relativně nízkou syntézou alkoholů přiboudliny. Také přirozené kmeny Saccharomyces cerevisiae produkovaly výrazně nižší množství vyšších alkoholů (3560 mg l -1 absolutního alkoholu) než komerční kultury. Zhruba z 90 % zastupovaly vyšší alkoholy amyl alkoholy, propanol a isobutanol. Amyl alkoholy, 2-methyl-1-butanol a 3-methyl-1- butanol, převládaly ve všech vzorcích s výjimkou pálenek vyrobených s použitím kmenů S. cerevisiae, v nichž převažoval propanol. Poměry amyl alkoholy/isobutanol a isobutanol/propanol se v některých alkoholických nápojích (whisky) používají jako index kvality a měly by být větší než jedna. Hodnota prvního byla vyšší než 1,3 a druhého nižší než 1,0 u všech vzorků. 1-hexanol má negativní vliv na chuť a aroma destilátu a zvýšená koncentrace (nad 100 mg l -1 absolutního alkoholu) dodává destilátu travnaté aroma. 1-hexanol je produkován rodem Saccharomyces jen v nízkých objemech, zato nejvyšší jeho koncentraci měl destilát připravený s kmenem K. apiculata, jehož koncentrace překročila hranici přijatelnosti (CLEMENTE-JIMENEZ et al., 2005). Další látkou, která byla zjištěna ve vyrobených slivovicích je 2-fenylethanol, který vzniká z L-fenylalaninu přes metabolické transformace za účasti kvasinek za anaerobních podmínek a dodává příjemné aroma. Druhy S. cerevisiae a Hansenula antala jsou považovány za relativně dobrého producenta této sloučeniny, zatímco jiné mikroorganismy, jako jsou Kloeckera, Hanseniaspora, Candida stellata a ostatní mohou syntetizovat jen malé množství (ALBERTAZZI et al, 1994). 43

44 Acetaldehyd je jednou z nejdůležitějších karbonylových sloučenin v alkoholických nápojích, a je produkován kvasinkami během fermentace. Schopnost produkovat acetaldehyd mají různé druhy kvasinek a dostupné údaje naznačují, že S. cerevisiae produkuje relativně vysoké množství acetaldehydu ( mg l -1 vína), zatímco jiné kvasinky nikoliv. Vyšší koncentrace acetaldehydu než 125 mg l -1 může negativně ovlivnit senzorický profil lihovin a jiných alkoholických nápojů. Nicméně ve většině případů je tato koncentrace překročena. Lze předpokládat, že v alkoholických nápojích s vyšším obsahem alkoholu, je vysoká koncentrace acetaldehydu maskována dalšími sloučeninami (ERTEN, 2002). Acetoin je spojován s metabolismem cukrů a může být tvořen enzymatickou kondenzací dvou molekul acetaldehydu nebo redukcí diacetylu. Kvasinky redukují acetoin na 2,3-butan pomocí acetoin reduktázy. S. cerevisiae mají vysokou aktivitu tohoto enzymu a bylo také změřeno, že destiláty kvašené s jejich pomocí mají nízké množství acetoinu na rozdíl od ostatních. Estery vznikají reakcemi mezi alkoholy a acetylem, proces je katalyzován acetyltransferázou. Vzhledem k tomu, že v pálenkách se nachází především etanol, ethylacetát tvořený z etanolu a acetyl-coa je převládající ester syntetizován kvasinkami. Rod Saccharomyces intenzivně tvoří alkoholy, karbonylové a karboxylové sloučeniny, zatímco kmeny rodu Kloeckera je převádějí na odpovídající estery. Destiláty získané z rodů mimo Saccharomyces obsahovaly podstatně více ethylacetátu (přes 90 % z celkových esterů). Kvasinky Saccharomyces tvoří více estery jako je ethyl butyrát, isoamylacetát, ethyl hexanoát a další (PLATA et al, 2005). Kyselina octová vzniká oxidací acetaldehydu a její obsah v alkoholických nápojích závisí především na kmeni použitých kvasinek a v menší míře na použité surovině. Vysoké množství acetaldehydu přímo určuje koncentraci kyseliny octové v analyzovaných švestkových pálenkách. Největší rozdíly byly zjištěny mezi vzorky vyrobenými s použitím kmenů S. cerevisiae ( mg l -1 absolutního alkoholu). V destilátech získaných spontánním kvašením bylo zjištěno menší množství této kyseliny (170 mg l -1 absulutního alkoholu). Nižší obsah kyseliny octové ve vzorcích, které obsahovaly vysoké koncentrace etanolu, by mohl být způsoben esterifikací, v jejímž důsledku vzniklo vyšší množství esterů (LILY et al., 2000). Na závěr bylo provedeno senzorické hodnocení vzorků pomocí modelu Buxbaum. Vzorky získané pomocí lihovarnických kmenů S. cerevisiae získaly nejvyšší 44

45 počet bodů (18,2) a hodnotitelé k nim přiřadili harmonickou chuť a aroma. Slivovice získané po fermentaci kmenem Aureobasidium sp. získaly nejnižší skóre - 14,2 bodů, protože měly kyselou chuť a vůni připomínající zelí. Aureobasidium sp. jsou mikroorganismy, který můžou redukovat, oxidovat a také methylovat různé sloučeniny síry. Popsané aroma může být spojené se vznikem těkavých derivátů těchto sloučenin. Senzorickou analýzu znázorňuje tabulka č. 1. Tabulka 1: Senzorický profil švestkových pálenek dle modelu Buxbaum (SATORA a TUSZYNSKI, 2010). Mezi chemickým složením švestkových pálenek byly prokázány významné rozdíly. Výsledky analýzy potvrdily, že kvasinky mimo rod Saccharomyces přítomné v počáteční fázi spontánního kvašení syntetizují především estery. Kvasinky Saccharomyces, které ukončují proces kvašení, syntetizují především ethanol a vyšší alkoholy. Nižší množství vyšších alkoholů tvoří přírodní kmeny S. cerevisiae ve srovnání s jinými kmeny S. cerevisce. To mělo vliv na koncentrace těchto látek ve vzorcích po spontánním kvašení. Rod Aureobasidium prokázal dobré kvasící vlastnosti a slivovice z nich měly podobné chemické složení jako ty po kvašení přírodními kmeny S. cerevisiae. Tato kvasinka může mít vliv na vznik těkavých sloučenin během spontánního kvašení, protože se nachází na povrchu švestek a ovlivňuje kvašení především v průběhu prvních dvou dnů (SATORA a TUSZYNSKI, 2010) Vliv snížení ph kvasu na fermentaci a finální kvalitu destilátu Llobodanin et al. prováděli v roce 2010 experimenty, za účelem prokázat vliv snížení ph na průběh fermentace a jakost destilátu. Pomocí plynové chromatografie bylo zjištěno, že zvýšení kyselosti při přípravě kvasu má vliv na průběh fermentace a chemické složení pálenky. V destilátech se sníženým ph kvasu byla vyšší koncentrace 45

46 vyšších alkoholů a esterů s 6-12 uhlíky, které mají příznivý vliv na aroma destilátu. Ethylacetátu, který signalizuje nesprávný průběh kvašení, v nich bylo méně. Hruškový mošt na přípravu kvasů byl rozdělen na dvě části, do první se přidaly jablečná a mléčná kyselina, aby se snížilo ph na 3,2, ph druhé části zůstalo přirozené a to o hodnotě 4,25. Během fermentace hodnota přirozeného ph vzrostla na 4,45. U vzorků, kde byla kyselost upravena, se ph zvýšilo jen na 3,3. Analýza vzorků kvasů pomocí HPLC s refraktometrickým detektorem prokázala, že fermentace při nižším ph probíhala pomaleji, pokud se však do tohoto kvasu přidaly kvasinky, probíhala fermentace optimálně. Graf č. 2 znázorňuje, že okyselený rmut obsahoval v konečné fázi fermentace více ethanolu a sacharidy byly více prokvašeny. Graf 2: Změny koncentrací látek během kvašení okyseleného rmutu (ph 3,2) a rmutu s přirozeným ph (4,25) (LLOBODANIN et al., 2010). Po destilaci následovala analýza úkapu, která prokázala, že více acetaldehydu je ve vzorku, kde bylo upraveno ph. Senzorická analýza odhalila přípach po kyselině máselné v dokapu a jen slabé hruškové aroma. Koncentrace látek v prokapu byla analyzována pomocí GC, výsledek znázorňuje příloha č. 4. Dle množství a kvality těkavých látek v prokapech lze říci, že v obou typech destilátů se nachází těkavé látky s pozitivním i negativním dopadem na kvalitu pálenky. Při senzorické analýze nebyl prokázán podstatný rozdíl mezi vzorky. 46

47 V destilátu s upraveným ph kvasu byla stanovena vysoká koncentrace acetaldehydu, který je během kvasného procesu produkován zejména kvasinkami, ale na jeho vzniku se můžou podílet i mikroorganismy spontánního kvašení. Vysoká koncentrace acetaldehydu byla příčinou zpomalení fermentace kvasu. Acetyl vzniká reakcí ethanolu a acetaldehydem, proto ho bylo chromatografem zaznamenáno takové množství. Zvýšené množství furfuralu lze vysvětlit větším množstvím cukru v okyseleném kvasu, ze kterého vzniká termickou degradací. I tak se dá říci, že koncentrace acetaldehydu, acetalu a furfuralu nebyla v žádném vzorku příliš vysoká, a proto nemohla ovlivnit kvalitu destilátů. Koncentrace methanolu splňuje ve všech destilátech limit 1200 g hl -1. Množství aromatických látek nekleslo pod hranici 200 g hl - 1, která je dána evropskými standardy. Koncentrace vyšších alkoholů - phenethyl alkoholu, 1-hexanolu, 2-methyl-1- butanolu, 3-methyl-1-butanol a 2-methyl-1-propanolu byla výrazně vyšší u vzorku s upraveným ph. 1-hexanol má pozitivní organoleptické vlastnosti o koncentraci 0,5-10 g hl -1. V prvním případě množství 1-hexanolu odpovídá danému rozmezí, ve druhém se však nachází ve vyšší koncentraci, což způsobuje nepříjemný přípach. I ostatní vyšší alkoholy způsobují příjemný vjem jen při nízkých koncentracích a jejich suma by měla být v rozmezí g hl -1. Destilát z neokyseleného kvasu měl nižší koncentraci vyšších alkoholů než je žádaná, destilát z upraveného kvasu odpovídal limitům na vyšší alkoholy. Při analýze esterů se dospělo k zcela odlišným závěrům. Ethylacetát, který připomíná vůni ředidla či lepidla, se nacházel v nepřijatelném množství ve vzorku s přirozeným ph kvasu. Ethylestery kyselin, které mají příjemné aroma, neprokázaly rozdíl v kvalitě mezi destiláty, protože ethyl hexanoátu bylo více v prvním případě a ethyl-2-trans-4-cis-dekadienoátu ve druhém vzorku (LLOBODANIN et al., 2010). 47

48 3 CÍL PRÁCE Vypracovat literární rešerši na téma Analýza ovocných kvasů a destilátů ve vztahu k finálnímu výrobku. Nastudovat a navrhnout možnosti přípravy ovocných kvasů. Provést navržené metody fermentace a destilace. Použít kapalinovou chromatografii ke stanovení koncentrace jednotlivých složek ovocných rmutů, kvasů a destilátů. Pomocí chemického složení destilátů zhodnotit varianty založených kvasů. Prokázat zda jsou mezi danými vzorky statisticky významné rozdíly. Zjištěné poznatky shrnout do závěru. 48

49 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Příprava ovocných kvasů z jablek a hrušek Ovocný rmut byl připraven z jablek odrůdy Otava a hrušek Pastornic z vlastních sadů z regionu Haná. Ovoce se po omytí postrouhalo a pro jednu polovinu vzorků se z něj vylisovala ovocná šťáva. Ovocný materiál se pak plnil po 3 litrech do skleněných nádob, které byly naplněny asi z 80 % ovocnou surovinou. Když bylo připraveno po třech nádobách jablečného a hruškového moštu a jablečné a hruškové drtě, nechala se vždy jedna nádoba bez kvasinek a enzymů a do druhé se daly aktivované kvasinky. V třetí nádobě kvasily vzorky s pomocí kvasinek i enzymů. Než se kvasinky přidaly do ovocné suroviny, nechaly se jednu hodinu aktivovat v teplé ovocné šťávě. Během této doby došlo i k jejich pomnožení, což bylo patrné podle zvětšení objemu přípravku. Na každý vzorek se do teplé ovocné šťávy přidaly 2 g kvasinek a pro vzorky, které měly kvasit za pomocí pektináz, 1 ml enzymů. Stanovení chemického složení vzorků probíhalo na kapalinovém chromatografu. Před chromatografickou analýzou byly ovocné šťávy přefiltrovány přes filtrační papír a následně byl odstředěn pevný podíl, aby nedošlo k zanesení chromatografické kolony. Na kvašení se nepoužily kvasné zátky, ale nádoby se uzavřely polyethylenovou folií a provázkem tak, aby mohl unikat oxid uhličitý. Kvašení probíhalo v chladné místnosti o teplotě 12 C. Destilace následovala po jedenácti týdnech od začátku kvašení, kdy pevný podíl kvasu klesl na dno nádoby a surovina byla tedy prokvašená Použité kvasinky a enzymy Na přípravu kvasů, které fermentovaly s pomocí čistých kultur kvasinek, byly použity Kvasinky BS univerzální od firmy BS Vinařské potřeby s.r.o. Tyto kvasinky jsou především určeny pro řízené kvašení vín, je však možné je použít i na přípravu destilátů. Tyto kvasinky se vyznačují vysokou odolností k alkoholu, nízkou tvorbou pěny a nízkou tvorbou těkavých kyselin. Jsou také vhodné pro kvašení bez řízené teploty. Kvasinky patří k druhu Saccharomyces cerevisiae. Dávka 10 g kvasinek na 100 l moštu vyprodukuje optimální množství životaschopných kvasinek. Pro rozklad pektinových látek byl vybrán přípravek Pectinex SMASH XXL od dánské firmy Novozymes A/S. Jedná se o enzymatický preparát produkovaný 49

50 plísněmi Aspergillus niger, který obsahuje pektolytické lyázy. Jeden ml přípravku obsahuje pektinázových jednotek Úprava cukernatosti ovocné břečky Jedním z cílů diplomové práce bylo posoudit, jaký vliv má přidání cukru na průběh kvašení a jakost destilátů. Pro tento účel se připravily 3 vzorky kvasů z postrouhaných jablek, ke kterým se přidalo vždy 100 g sacharosy, což zvýšilo cukernatost kvasů o objemu 3 l o 3 Rf, což jsou stupně refraktometrické, které udávají % nerozpustné sušiny. Vzorky se nelišily množstvím přidaného cukru, ale přídavkem kvasinek a enzymů. Stejně jako u předešlých experimentů se první vzorek nechal bez kvasinek a enzymů, do druhého se přidaly 2 g kvasinek a do třetího se dodaly kvasinky i enzymy, a to 1 ml. 4.2 Destilační zařízení Destilace probíhala na destilační aparatuře s rektifikační kolonou, a proto nebylo nutné zvyšovat lihovitost opakováním procesu. V rektifikační koloně docházelo k opakované kondenzaci par a díky odlišnému bodu varu těkavých látek se destilát zesiloval. Kvasy se destilovaly v kvasné baňce, na kterou byla napojena rektifikační kolona. Po rektifikaci se chladily těkavé látky ve spirálovém chladiči. Chladící voda byla připojena tak, aby přicházela protiproudně k destilátu, kondenzátor tak byl účinnější. V hlavě kolony byl nainstalován teploměr a podle teploty bylo možné nastavit zpětný tok pomocí kohoutku. Koncentrace těkavých látek tak mohla být měněna. Hrdlo destilační baňky bylo opatřeno zábrusem, stejně jako teploměr a spojovací trubice, aby nedocházelo k unikání aromatických látek. U všech vydestilovaných vzorků se stanovila koncentrace methanolu a ethanolu pomocí kapalinové chromatografie. 4.3 Stanovení chemického složení moštů, kvasů a destilátů pomocí HPLC Materiál a podmínky analýzy Pro stanovení chemického složení moštů, kvasů a destilátů byla použita stejná metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie, která byla předem zavedena 50

51 a odzkoušena. Kapalinový chromatogram byl sestaven převážně z přístrojů od pražské firmy Ecom. Mobilní fáze, deionizovaná voda byla čerpána dvoupístovou pumpou LCP 4000 a její průtok byl 0,5 ml/min. Vzorky se dávkovaly pomocí D ventilu s nástřikem 5 µl. Na koloně byl pracovní tlak 6,7 MPa. Teplota analýzy byla řízena termostatem LCO 101 a byl nastaven režim se stálou teplotou 50 C. Ocelová předkolona HEMA BIO Q+Sb 10 µm o délce 50 mm a průměru 4 mm a ocelová kolona s polymerní stacionární fází IEX Pb form byly dodány pražskou firmou Vatrex. Kolona měla délku 250 mm a průměr 8 mm. Ke stanovení látek vycházejících z kolony se použil diferenční refraktometrický detektor Laboratorní přístroje Praha RIDK-102 s citlivostí 0,32. Dále byla použita deionizovaná voda pro HPLC a standardy o čistototě pro HPLC. Vzorky ovocných šťáv a kvasů byly před analýzou odstředěny laboratorní odstředivkou Hobbolab 2110, Francie. Vyhodnocení detekovaných látek probíhalo pomocí programu Clarity. Ke kalibraci se použily roztoky maltózy, sacharózy, glukózy, fruktózy, glycerolu, methanolu a ethanolu o koncentraci 0; 1; 5 a 10 g/100ml (Merci, Německo). Kalibrační křivky standardů jsou znázorněny v příloze č Použité statistické metody Pomocí dvouvýběrového t-testu se ověřovalo, zda existuje statisticky průkazná závislost mezi přídavkem kvasinek a enzymů do kvasů a množstvím ethanolu v destilátech. Porovnávaly se vždy dvě dvojice ze tří variant ethanol v destilátech z kvasů bez přidatných látek, z kvasů s kvasinkami a z kvasů s kvasinkami a enzymy. K určení, zda dochází po přidání přidatných látek ke zvýšení koncentrace ethanolu, je vhodné použít dvouvýběrový t-test, který ověřuje tuto hypotézu. T-test se používá k určení, zda dvě normální rozdělení mají stejný rozptyl a zda dva nezávislé náhodné výběry z nich, mají stejné střední hodnoty, tedy jestli je rozdíl těchto středních hodnot roven určitému danému číslu. Test porovnává, zda se výsledky měření jedné skupiny vzorků významné liší od výsledků měření druhé skupiny vzorků. Statistické měření závislosti je také možné lineární regresí, kdy se několik bodů v grafu proloží takovou přímkou, aby součet druhých mocnin odchylek jednotlivých bodů od přímky byl minimální. Rovnice regrese udává závislost mezi hodnotami na ose x a y. Na statistické ověření rozdílů mezi vzorky byl použit program Statistika

52 5 VLASTNÍ VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Instrumentální analýza ovocných moštů Z chromatogramu č. 1 jsou patrné rozdíly mezi jablečnou a hruškovou šťávou, kdy jablečná byla bohatší na sacharosu a hrušková na fruktosu, což je pro tyto druhy jádrového ovoce typické. Z chromatogramu č. 2 je zřejmé, že se zvýšil obsah sacharosy i invertních cukrů po přídavku řepného cukru do jablečné šťávy. Červenou barvou je znázorněná jablečná šťáva s přídavkem sacharosy, černou jablečná šťáva bez cukru. Z grafu č. 3 jsou patrné rozdíly mezi koncentracemi v g 100 ml -1. Chromatogram 1: Porovnání složení sacharidů v jablečné šťávě (černá křivka) a hruškovém šťávě (žlutá křivka). 52

53 Chromatogram 2: Zvýšení jednotlivých cukrů v jablečné šťávě po přídavku sacharózy (šťáva se sacharózou černá křivka, šťáva bez přídavku cukru červená křivka). Graf 3: Stanovení sacharidů v ovocných šťávách. 5.2 Průběh kvašení ovocného rmutu Kvašení ovocných rmutů probíhalo při teplotě 12 C po dobu jedenácti týdnů. Po třech týdnech kvašení se na povrchu kvasů bez přidatných látek vytvořily kožovité 53

54 povlaky způsobené křísovými kvasinkami Kluyveromyces a šedozelené kolonie plísní rodu Penicillium. Zbylé rmuty kvasily čistě, a lze tedy předpokládat, že přídavek kvasinek, enzymů a cukru byl pro průběh kvašení pozitivní Fermentace s řepným cukrem Přidáním cukru byla podpořena činnost kvasinek Saccharomyces cerevisiae, čímž se potlačila aktivita ostatních mikroorganismů, a všechny tři vzorky s cukrem kvasily čistě. V následujícím grafu č. 4 je uvedeno složení prokvašených rmutů, které fermentovaly s přídavkem sacharosy. V grafu není uvedena glukosa, protože její koncentrace byla nižší jak 0,03 g 100 ml -1, kvasinky ji téměř všechnu prokvasily. Chromatogram č. 3 znázorňuje retenční časy a velikosti píků stanovených látek. Graf 4: Vliv přidání kvasinek a enzymů na chemické složení kvasů, které byly před fermentací obohaceny sacharosou. 54

55 Chromatogram 3: Stanovení chemického složení kvasů, které fermentovaly s přídavkem sacharózy Kvašení bez přidání sacharosy Kvasy, do kterých se nepřidávala sacharosa, obsahovaly po osmi týdnech vyšší koncentrace cukrů a především ty bez kvasinek a enzymů byly málo prokvašené. Příčinou je rozvoj nežádoucí mikroflóry, která potlačila činnost kvasinek. V grafu č. 5 je zaznamenáno chemické složení ovocných kvasů bez přídavku sacharosy. Koncentrace složek jsou vypsány v tabulce č. 2. Číslům 1 12 odpovídá surovina popsaná v grafu. 55

56 Graf 5: Chemické složení ovocných kvasů dle rmutu, ze kterého byly připraveny. Tabulka 2: Stanovení chemického složení ovocných kvasů č. glukosa [g 100 ml -1 ] fruktosa [g 100 ml -1 ] glycerol [g 100 ml -1 ] methanol [g 100 ml -1 ] ethanol [g 100 ml -1 ] 1 0,052 3,353 0,541 0,021 3, ,013 3,372 0,067 0,028 5, ,052 0,538 0,645 0,024 6, ,162 0,407 0,943 0,017 2, ,015 0,650 0,225 0,043 6, ,016 0,542 0,659 0,025 7, ,983 3,171 0,863 0,022 1, ,128 2,112 1,083 0,021 2, ,733 0,427 0,443 0,027 2, ,900 0,419 1,027 0,020 1, ,043 1,964 0,601 0,048 3, ,016 1,999 0,467 0,027 3,286 Chromatogramy č. 4-7 znázorňují vliv přidání kvasinek a enzymů na průběh fermentace kvasů ze stejných surovin. V rámečku je vždy popsána surovina a pomocné látky, které se přidaly před začátkem kvašení. 56

57 Chromatogram 4: Stanovení chemického složení kvasů z jablečného moštu, rozdíly v koncentracích dle použitých pomocných látek. Chromatogram 5: Stanovení chemického složení kvasů z hruškového moštu, rozdíly v koncentracích dle použitých pomocných látek. 57

58 Chromatogram 6: Stanovení chemického složení kvasů z jablečné drtě, rozdíly v koncentracích dle použitých pomocných látek. Chromatogram 7: Stanovení chemického složení kvasů z hruškové drtě, rozdíly v koncentracích dle použitých pomocných látek. 58

59 5.3 Destilace Obsah methanolu v ovocných destilátech Methanol vzniká z pektinových látek a tak lze předpokládat, že vyšší množství ho bude v destilátech připravených z kvasů z celého ovoce než z kvasů, které byly připraveny z ovocného moštu. Na obsah metanolu by mělo mít vliv i použití pektolytických enzymů, protože díky nim se rozkládají pektinové látky, které jsou prekurzory metanolu. Podle přílohy k vyhlášce č. 305/2004 sb. zákona č. 110/1997 o potravinách a tabákových výrobcích je v pravých ovocných destilátech z jablek a hrušek stanoveno přípustné množství methanolu mg. l -1 vyjádřeno na 100 % objemových ethanolu. Aby obsah methanolu ve vzorcích odpovídal těmto jednotkám, bylo nutné přepočítat koncentraci ethanolu z hmotnostních procent na objemová a poté, když byl znám poměr methanolu a ethanolu, dopočítalo se, jaké množství ethanolu by obsahoval 1 l absolutního alkoholu. Hodnoty udává tabulka č. 3. Tabulka 3: Vliv použité suroviny na množství methanolu v destilátech. č. surovina ethanol [g 100 ml -1 ] ethanol [ml 100 ml -1 ] methanol [g 100 ml -1 ] methanol [mg l -1 ethanolu] 1 jablečný mošt bez př.látek 15,790 20,053 0, ,280 2 jablečný mošt + kvasinky 17,786 22,588 0, ,060 3 jablečný mošt + kv. a enzymy 20,408 25,918 0, ,830 4 hruškový mošt bez př.látek 15,913 20,210 0, ,950 5 hruškový mošt + kvasinky 20,077 25,498 0, ,310 6 hruškový mošt + kv. a enzymy 15,901 20,194 0, ,890 7 jablečná drť bez př.látek 9,418 11,961 0, ,010 8 jablečná drť + kvasinky 17,336 22,017 0, ,900 9 jablečná drť + kv. a enzymy 13,677 17,370 0, , hrušková drť bez př.látek 16,804 21,341 0, , hrušková drť+ kvasinky 7,866 9,990 0, , hrušková drť + kv. a enzymy 12,145 15,424 0, , jablečná drť+cukr bez př.látek 12,695 16,123 0, ,83 14 jablečná drť+cukr+kvasinky 12,821 16,283 0, ,48 15 jablečná drť+cukr+kv.+enz. 13,098 16,634 0, ,65 Výsledky jsou znázorněny v grafu č. 6, kde je zřejmé, že více methanolu obsahovaly vzorky připravené z celého ovoce jak z ovocných moštů a že se přidáním 59

60 pektolytických enzymů snížila koncentrace methanolu v destilátech. Pektolytické enzymy neměly vliv na chemické složení kvasů z ovocných moštů, protože ty obsahovaly jen malé množství rozpustných pektinových látek. Jablka obecně obsahují více pektinů jak hrušky, a proto by také měly jablečné pálenky obsahovat více methanolu jak hruškové, rozdíly ve vzorcích byly v tomto případě minimální. Graf 6: Obsah metanolu v ovocných destilátech, rozdíly mezi vzorky dle použité suroviny a přídavku pomocných látek Stanovení výtěžku ethanolu Teoreticky je možné získat ze 100 g glukosy 51,1 g ethanolu, což je v objemových jednotkách 64,4 ml. Této teoretické výtěžnosti však nikdy nelze dosáhnout. Maximálně je možné získat 60 l alkoholu ze 100 kg zkvasitelných cukrů. Následující graf č. 7 udává výtěžek ethanolu z 1 l kvasu. Údaje o koncentraci byly získány pomocí kapalinového chromatografu. Protože však byl vzorek před analýzou ředěn, bylo podle přídavku vody nutné přepočítat, kolik ethanolu obsahoval skutečný vzorek. Poté bylo potřeba zohlednit, kolik množství ovocné pálenky se vydestilovalo, a podle toho stanovit kolik gramů etanolu obsahoval celý vzorek. Koncentrace ethanolu, kterou udával chromatogram, byla dána v g 100 ml -1. Na destilaci se použilo 3 l ovocného kvasu, a proto byl výtěžek zmenšen na třetinu, aby hodnota udávala, kolik je 60

61 etanolu v 1 l kvasu. Nakonec se přepočítala procenta hmotnostní alkoholu na objemová, protože etanol má hustotu 0,789 g/cm 3 a 1000 ml váží 789 gramů, takže je nepřípustné, aby se zaměňovaly gramy a mililitry. Tyto hodnoty udává tabulka č. 4, číslům 1 15 odpovídá použitá surovina z předcházející tabulky č. 3. Tabulka 4: Výtěžek ethanolu v destilátech připravených z odlišných surovin č. ethanol [g 100 ml -1 ] ředění vydestilované množství [ml] množství ethanolu [g] výtěžek ethanolu [g] na 1 l kvasu výtěžek ethanolu [ml] na 1 l kvasu 1 15,790 1: ,63 24,21 30, ,786 1: ,40 49,80 63, ,408 1: ,10 51,70 65, ,913 1: ,92 12,31 15, ,077 1: ,55 48,18 61, ,901 1: ,03 41,34 52,51 7 9,418 1: ,97 13,66 17, ,336 1: ,46 15,49 19, ,677 1: ,70 27,90 35, ,804 1: ,25 10,08 12, ,866 1: ,38 18,46 23, ,145 1: ,53 28,18 35, ,695 1: ,85 61,95 78, ,821 1: ,78 60,26 76, ,098 1: ,68 65,23 82,84 Z grafu č. 7 je patrné, že přídavek kvasinek měl značný vliv na výtěžek ethanolu. Díky nim rmuty fermentovaly čistě a kvasy obsahovaly více ethanolu, což se promítlo do chemického složení ovocných destilátů. Také vylisování ovocné šťávy se promítlo kladně na výtěžek alkoholu, protože rmuty z ovocných moštů obsahovaly více jednoduchých cukrů než rmuty z celého nastrouhaného ovoce. Mezi destiláty z jablek a hrušek byly jen nepatrné rozdíly. Z jablečné suroviny se získalo více etanolu díky vyššímu obsahu cukrů, což je zřejmé hlavně při porovnání destilátů, které byly připravené z kvasů bez přidatných látek. Přídavek pektolytických enzymů měl vliv jen na kvasy z celého ovoce, protože obsahovaly více pektinů jak kvasy z moštů. Nejvyšší výtěžnost vyla zaznamenána u destilátů, jejichž kvasy fermentovaly s přídavkem sacharosy, protože kvasinky měly více substrátu pro produkci ethanolu. Rozdíly v koncentracích ethanolu a methanolu jsou patrné z grafu č

62 Graf 7: Vliv přídavku kvasinek a enzymů do rmutů na stanovení alkoholového výtěžku destilátů v ml absolutního alkoholu na 1 l kvasu. Graf 8: Množství ethanolu a methanolu dle suroviny z jaké se připravoval kvas Senzorická analýza připravených destilátů Během destilace se neodděloval úkap a dokap, protože to pro vyhodnocení průběhu kvašení a jakosti destilátů pomocí kapalinové chromatografie nebylo nutné. Na chuti destilátů to však bylo znát, výrazné byly zejména vyšší alkoholy přiboudliny. 62

63 Především v nápojích z kvasů bez pomocných látek byl silně cítit ethylacetát, což potvrzuje, že u těchto destilátů neprobíhalo kvašení zcela optimálně. Také celková jakost těchto destilátů byla nejhorší. Mezi destiláty z kvasů, do kterých byly přidány kvasinky a enzymy, nebyly zjištěny významné senzorické rozdíly. Nejjakostnější se jevily nápoje připravené z kvasů s přídavkem sacharózy. Všechny tři destiláty byly chuťově nejlepší. U těchto vzorků nešly senzoricky rozpoznat rozdíly mezi variantami založení kvasů. I destilát z kvasu s řepným cukrem, ale bez dalších pomocných látek, prokazoval dobré senzorické vlastnosti. V tomto případě nebylo prokázáno zlepšení jakosti u destilátů, které kvasily s přídavkem kvasinek či enzymů. 5.4 Statistické porovnání výsledků Vliv přidatných látek na obsah ethanolu a methanolu v destilátech Statisticky bylo porovnáváno množství ethanolu v destilátech z kvasů bez přidatných látek, z kvasů s kvasinkami a z kvasů s kvasinkami i enzymy. Závislost mezi produkcí etanolu a přidatnými látkami v kvasu se zkoumala pomocí t-testu. V tabulce č. 5 jsou potřebné statistické hodnoty k určení, zda existuje statisticky průkazná závislost. Hodnota t udává, zda je nutné danou hypotézu zamítnout či nikoli. Hypotéza se zamítá, pokud veličina t překročí kritickou hodnotu. Směrodatná odchylka určuje míru variability a udává, jak moc se od sebe navzájem liší hodnoty v souboru zkoumaných čísel. F-poměr udává, zda daná hypotéza platí a v tomto případě je to číslo blízké jedničce. Pokud hypotéza neplatí je tento poměr výrazně vyšší jak číslo jedna. Pokud je hodnota F-poměru malá, p-value je číslo vyšší a daná hypotéza platí. Hodnota p udává pravděpodobnost, s jakou testovací statistika nabývá hodnot horších, než je porovnávaná hodnota statistiky. Horšími hodnotami se myslí ty, které vyvrací testovanou hypotézu. P-hodnota udává mezní hladinu významnosti, při které bychom hypotézu ještě zamítli. Dle zjištěných statistických hodnot je průkazný rozdíl jen mezi kvasy bez přidatných látek a mezi kvasy s kvasinky a enzymy, ať už byly do kvasu přidány jen kvasinky nebo kvasinky i enzymy. Rozdíl mezi kvasy s přídavkem kvasinek a s přídavkem kvasinek a enzymů nebyl podle procent etanolu v destilátu prokázán. Díky přídavku kvasinek a enzymů do kvasů tedy došlo ke zvýšení množství ethanolu v destilátech. 63

64 Tabulka 5: Ethanol v destilátech [%] v závislosti, zda byly připravené z kvasu bez přidatných látek (1), s kvasinkami (2) či s kvasinkami a enzymy (3). Průměr skupina 1 T-test: proměnné byly brány jako nezávislé vzorky Průměr Sm.odch. Hodnota skupina p skupina t 2 1 Sm.odch. skupina 2 F-poměr p-value 1 vs. 2 16, , ,7736 0, , , , , vs. 3 16, , ,9815 0, , , , , vs. 3 21, , ,9563 0, , , , ,7026 Na stejném principu bylo založené porovnání procent metanolu v destilátech v závislosti na přípravě kvasů. V tomto případě byl prokázán statistický rozdíl mezi všemi třemi variantami založení kvasů, z čehož vyplývá, že přídavek kvasinek i enzymů do kvasu snižuje množství metanolu v destilátech. Závislost určují hodnoty v tab. č. 6. Tabulka 6: Methanol v destilátech [%] v závislosti, zda byly připravené z kvasů bez přidatných látek (1), s kvasinkami (2) či s kvasinkami a enzymy (3). Průměr skupina 1 T-test: proměnné byly brány jako nezávislé vzorky Průměr Sm.odch. Hodnota skupina p skupina t 2 1 Sm.odch. skupina 2 F-poměr p-value 1 vs. 2 0, , , , , , , , vs. 3 0, , , , , , , , vs. 3 0, , , , , , , , Stanovení závislosti koncentrace ethanolu a methanolu na cukernatosti ovocných rmutů Pro určení závislou výtěžku ethanolu na množství sacharidů v ovocném rmutu byla sestavena regresní přímka patrná z grafu č. 9. Dle koeficientu korelace r lze určit, zda se jedná o nezávislost, volnou závislost či pevnou závislost. Protože je r = 0,966 jde o velmi vysokou volnou závislost. Koeficient determinace r 2 porovnává skutečné hodnoty y a jejich odhady. Pokud je koeficient determinace 0,9331, znamená to, že existuje téměř dokonalá korelace, tj. mezi hodnotami přímky a skutečnými hodnotami není téměř žádný rozdíl. 64

65 Graf 9: Regresní přímka závislosti množství EtOH v kvasech na cukernatosti rmutů. Z grafu č. 10 je patrné, že mezi cukernatostí rmutu a koncentrací metanolu v destilátech není žádná závislost. Hodnoty koeficientu korelace a determinace jsou příliš nízké. Stejně tak tomu je v grafu č. 11 u stanovení souvislosti mezi koncentrací ethanolu a methanolu. Množství methanolu v destilátech není nijak závislé na množství ethanolu. Graf 10: Regresní přímka závislosti množství methanolu v destilátech na cukernatosti rmutů. 65

66 Graf 11: Regresní přímka závislosti množství methanolu v destilátech na koncentraci ethanolu v kvasech. 66

67 6 ZÁVĚR Analýza ovocných kvasů a destilátů může probíhat senzoricky či instrumentálně. Ačkoliv je senzorické hodnocení subjektivní a nedá se pomocí něj stanovit kvantitativní složení destilátů, je to významná metoda pro posouzení jakosti nápojů a je nenahraditelná, protože udává celkovou jakost destilátů. Instrumentálními metodami se dají s velkou přesností stanovit koncentrace látek a má to vysokou vypovídající hodnotu o jakosti destilátů. Pro posouzení výrobního postupu však nestačí znát jen složení destilátů, ale je nutné stanovit i obsah jednotlivých látek v rmutech a kvasech, aby bylo možné zhodnotit průběh fermentace a zda byla zvolena vhodná metoda destilace. Hlavním cílem diplomové práce bylo stanovit, jaký vliv má přidání kvasinek, enzymů a sacharózy na průběh fermentace. Podle složení kvasů je zřejmé, že za jedenáct týdnů, během kterých probíhalo kvašení všech vzorků, byly vzorky s pomocnými látkami lépe prokvašené. Kvasy obsahovaly v průměru pod 1 g 100 ml -1 sacharidů, koncentrace cukrů v kvasech bez pomocných látek však byla až 4 g 100 ml -1. Nejlépe prokvasily vzorky s přídavkem sacharózy. Obsah ethanolu v těchto kvasech byl 6,56; 6,75 a 8,11 g 100 ml -1. Vysokou koncentraci alkoholu měly díky přeměně přidaného cukru na ethanol, ale také protože se nejlépe zužitkovaly sacharidy obsažené v ovoci. S přídavkem řepného cukru také kvasily rmuty nejčistěji, a tak bylo minimum cukrů spotřebováno nežádoucí mikroflórou. Přídavek řepného cukru do kvasu je ale ze zákona zakázán, protože vyrobený destilát obsahuje kvůli ethanolu ze sacharózy méně aromatických látek z ovoce. Pomocí senzorické analýzy však tento fakt nebyl potvrzen, destiláty z oslazeného kvasu vykazovaly lepší organoleptické vlastnosti. Vliv přidatných látek na průběh kvašení byl ověřen i statisticky. Pomocí t-testu byly vyhodnoceny rozdíly mezi vzorky bez přidatných látek, s kvasinkami a s kvasinkami a enzymy. Porovnávalo se množství ethanolu v destilátech a bylo dokázáno, že po přídavku kvasinek a enzymů se zvýšila koncentrace ethanolu. Mezi vzorky kvašenými s kvasinkami a s kvasinkami i enzymy však nebyl statisticky významný rozdíl. Mezi všemi variantami vzorků byl prokázán rozdíl v koncentracích methanolu. Nejméně methanolu obsahovaly destiláty, které byly připraveny z kvasů s pektolytickými enzymy a u kterých byla pro kvašení použita jen vylisovaná ovocná šťáva. Statisticky bylo také ověřeno, že z kvasů s přídavkem sacharózy se připraví destilát s vyšším obsahem ethanolu. 67

68 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ALBERTAZZI, E., et al., 1994: Biogeneration of 2-phenylethanol and 2- phenylethanylacetate important aroma components. Biotechnol. Lett., 16, 5, s ALKORTA, I. et al., 1998: Industrial applications of pectic enzymes. Process Biochemistry, 33, 1, s AZNAR, M., LOPEZ, R., CACHO, J. F., FERREIRA, V., 2001: Identification and quantification of impact odorants of aged red wines from Rioja. GC olfactometry, quantitative GC MS, and odor evaluation of HPLC fractions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, s BLANCO, P., SIEIRO, C., VILLA, T. G., 1999: Production of pectic enzymes in yeasts. FEMS Microbiology Letters, 175, 1, s BOUCHILLOUX, P., et al., 1998: Identification of volatile and powerful odorous thiols in Bordeaux red wine varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, s C. DI NATALE, et al., 1998: Electronic nose and sensorial analysis: comparison of performances in selected cases. Sensors and Actuators B, 50, 3, s CIANI, M., FERRARO, L., 1998: Combined use of immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wines. J. Appl. Microbiol. 85, 10, s CLEMENTE-JIMENEZ, J. M., et al Influence of sequential yeast mixtures on wine fermentation. Food Microbiol., 98, s CROUZET, J., ETIEVANT, P., BAYONOVE, C., 1990: Stoned fruit: Apricot, plum, peach, cherry. In I. D. Morton & A. J. Macleod (Eds.), Food flavours. Part C. The flavour of fruits (pp ). Amsterdam, Netherlands: Elsevier Science Publishers B.V. DYR, J. a kol., 1997: Výroba slivovice a jiných pálenek. 4. doplněné vydání Praha: Maxdorf, 219 s. ISBN ERTEN, H., 2002: Relations between elevated temperatures and fermentation behaviour of Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed cultures. World J. Microbiol. Biotechnol., 18, s FAN, W., QIAN, M. C., 2006: Identification of aroma compounds in Chinese Yanghe Daqu liquor by normal phase chromatogramy fractionation followed by gas chromatography/olfactometry. Flavour Fragrance Journal, 21, s GOLIÁŠ, J., 1996: Skladování a zpracování I. 2. vyd. Brno: MZLU, 158 s. ISBN

69 GÖLLES, A., 2002: Ušlechtilé destiláty - praktická kniha o pálení. Praha: Ivo Železný, 110s. ISBN GROSCH, W., 2001: Evaluation of the key odorants of foods by dilution experiments, aroma models and omission. Chemical Senses, 26, s HAGMANN, K., ESSICH. B., 2007: Pálíme ovoce. Víkend, 95 s. ISBN CHAINTREAU, A., 2001: Simultaneous distillation extraction: From birth to maturity review. Flavour and Fragrance Journal, 16(2), s CHINNICI, F., et al., 2005: Optimization of the determination of organic acids and sugars in fruit juices by ion-exclusion liquid chromatography. Journal of Food Composition and Analysis, 18, 2-3, s HERBERT, P., et al., 2002: New HPLC method to determine ethyl carbamate in alcoholic beverages using fluorescence detection. Journal of Food Science, 67, s JANDERA, P., 2002: Gradient elution in normal-phase high-performance liquid chromatographic systems. Journal of Chromatography A, 965, 1-2, s JAYANI, R. S., SAXENA, S., GUPTA, R., 2005: Microbial pectinolytic enzymes. Process Biochemistr, 40, 9, s JÍLEK, J., ZENTRICH, J., 1999: Příprava ovocných kvasů na výrobu slivovice. Olomouc: Dobra a Fontána, 208 s. ISBN KLEINOVÁ, J., 2009: Jakost ovocných kvasů a destilátů. Bakalářská práce. MZLU ZF Brno, 71 s. KLOUDA, P., 2003: Moderní analytické metod. 2. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 132 s. ISBN LILY, M., LAMBRECHTS, M. G., PRETORIUS, I. S., 2000: Effect of increased yeast alkohol acetyltransferase activity on flavour profiles of wine and distillates. Appl. Environ. Microbiol., 66, s LLOBODANIN, L. G., et al., 2010: Influence of the fermentation ph on the final quality of Blanquilla pear spirits, International Journal of Food Science and Technology, 45, MADREDA, R. R., VALLES, B. S., 2009: Determination of ethyl carbamate in cider spirits by HPLC-FLD. Food Control, 20, 2, s NASCIMENTO, R. F., et al., 1997: Qualitative and quantitative highperformance liquid chromatographic analysis of aldehydes in Brazilian suger cane spirits and other distilled alcoholic beverages. Journal of Chromatography, 782, 1, s

70 NONATO, E. A., et al., 2001: A headspace solid-phase microextraction method for the determination of some secondary compounds of Brazilian sugar cane spirits by gas chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, s PENZA, M., et al., 2001: Classification of food, beverages and perfumes by WO 3 thin film sensors array and pattern recognition techniques. Sensors and Actuators B, 73, s PLATA, C., et al. 2005: Influence of glucose and oxygen on the production of ethyl acetate and isoamyl acetate by a Saccharomyces cerevisiae strain during alcoholic fermentation. World J. Microbiol. Biotechnol., 21, s PLUTOWSKA, B., WARDENCKI, W., 2008: Application of gas chromatography olfaktometry (GC-O) in analysis and quality assessment of alcoholic beverages. Food Chemistry, 107, 1, s POHVE, J. K., et al., 2001: Yeast population dynamics in five spontaneous fermentations of Malvasia must. Food Microbiol., 18, 4, s POLLIEN, P., et al., 1999: First attempt of odorant quantitation using gas chromatography-olfactometry. Analytical Chemistry, 71, s ROCHA, S., RAMALHEIRA, V., BARROS, A., DELGADILLO, I., COIMBRA, M. A., 2001: Headspace solid phase microextraction (SPME) analysis of flavor compounds in wines. Effect of the matrix volatile composition in the relative response factors in a wine model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(11), s SATORA, P., TUSZYNSKI, T., 2010: Influence of indigenous yeasts on the fermentation and volatile profile of plum brandies. Food Microbiology, 27, 3, s SATORA, P., TUSZYNSKI, T., 2008: Chemical characteristics of Sliwowica qacka and other plum brandies. J. Sci. Food Agric., 88, s SATORA, P., et al., 2008: The profile of volatile compounds and polyphenols in wines produced from dessert varieties of apples. Food Chem., 111, 10, s SEDLÁKOVÁ, J. a kol., 1998: Mikroextrakcia na tuhej fáze a jej využiti v environmentálnej analýze. Chemické listy, č. 92, s SCHMICKLOVÁ, H., MALLEOVÁ, B., 2004: Domácí výroba lihovin. Praha: BETA, 159 s. ISBN SIDES, A., ROBARDS, K., HELLIWELL, S., 2000: Developments in extraction techniques and their application to analysis of volatiles in foods. Trends in Analytical Chemistry, 19, s SOMMER, L., 2000: Základy analytické chemie II. 1. vyd. Brno: VUTIUM, 347 s. ISBN

71 ŠKOPEK, J., 2003: Výroba destilátů z vlastního ovoce. České Budějovice: DONA, 39 s. ISBN UHROVÁ, H., 2001: Děláme si sami: slivovici, meruňkovici, hruškovici, jablkovici a jiné ovocné destiláty, vína, šťávy a sirupy. Vimperk: Víkend, 107 s. ISBN VELÍŠEK, J., 2002: Chemie potravin vyd. Tábor: OSSIS, 303 s. ISBN VERMAULEN, C., GUYOT-DECLERCK, C., COLLIN, S., 2003: Combinatorial synthesis and sensorial properties of Mercapto primary alcohols and analogues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, s VEVERKA, L., et al., 2008: Chemické složení vín a vinných destilátů. Acta horticulturae et regiotecturae. Nitra: Slovenská polnohospodárska univerzita v Nitre, 2008, s ISSN WAGNER, R., 2001: Calvados po lopatě: Návod na výrobu jablečného destilátu. Olomouc, 111 s. ISBN WILLIAMS, A. A., ISMAIL, H. M. M., 1981: The volatile flavour components of plums and their sensory evaluation. In J. Solms & R. L. Hall (Eds.), Criteria of food acceptance, s Internetové zdroje: CÍDLOVÁ, H., 2007: Destilace. Databáze online [cit ]. Dostupné na: < RIMARČÍK, M., 2007: Analýza hlavných komponentov. Databáze online [cit ]. Dostupné na: ROWAN, J., 2004: Typy chromatografických metod. Databáze online [cit ]. Dostupné na: 71

72 8 SEZNAM TABULEK, GRAFŮ, OBRÁZKŮ, VZORCŮ A ROVNIC Seznam tabulek: Tabulka 1: Senzorický profil švestkových pálenek dle modelu Buxbaum Tabulka 2: Stanovení chemického složení ovocných kvasů Tabulka 3: Vliv použité suroviny na množství methanolu v destilátech Tabulka 4: Výtěžek ethanolu v destilátech připravených z odlišných surovin Tabulka 5: Ethanol v destilátech [%] v závislosti, zda byly připravené z kvasu bez přidatných látek (1), s kvasinkami (2) či s kvasinkami a enzymy (3) Tabulka 6: Methanol v destilátech [%] v závislosti, zda byly připravené z kvasů bez přidatných látek (1), s kvasinkami (2) či s kvasinkami a enzymy (3) Seznam grafů: Graf 1: Rozdíly v kinetice kvašení dle požitých kmenů kvasinek Graf 2: Změny koncentrací látek během kvašení okyseleného rmutu (ph 3,2) a rmutu s přirozeným ph (4,25) Graf 3: Stanovení sacharidů v ovocných šťávách Graf 4: Vliv přidání kvasinek a enzymů na chemické složení kvasů, které byly před fermentací obohaceny sacharosou Graf 5: Chemické složení ovocných kvasů dle rmutu, ze kterého byly připraveny Graf 6: Obsah metanolu v ovocných destilátech, rozdíly mezi vzorky dle použité suroviny a přídavku pomocných látek Graf 7: Vliv přídavku kvasinek a enzymů do rmutů na stanovení alkoholového výtěžku destilátů v ml absolutního alkoholu na 1 l kvasu Graf 8: Množství ethanolu a methanolu dle suroviny z jaké se připravoval kvas Graf 9: Regresní přímka závislosti množství EtOH v kvasech na cukernatosti rmutů Graf 10: Regresní přímka závislosti množství methanolu v destilátech na cukernatosti rmutů Graf 11: Regresní přímka závislosti množství methanolu v destilátech na koncentraci ethanolu v kvasech

73 Seznam obrázků: Obrázek 1: Stanovení organických kyselin v ovocné šťávě pomocí UV a RI detektoru Obrázek 2: Analýza aldehydů pomocí HPLC Obrázek 3: Stanovení ethylkarbamátu HPLC pomocí jeho derivátu xanthylu-ec ve standardu (a) a jablečném destilátu (b) (osa x čas, osa y fluorescence) Obrázek 4: Porovnání hruškových destilátů získaných různými metodami destilace a připravených z různě kyselých kvasů pomocí PCA analýzy Obrázek 5: Analýza tequily pomocí plynové chromatografie a olfaktometrie Obrázek 6: Hodnocení hruškové (a), pomerančové (b) a meruňkové (c) šťávy pomocí elektronického nosu a jejich porovnání pomocí PCA Seznam vzorců a rovnic: Vzorec 1: Odštěpení methanolu z molekuly pektinu Rovnice 1: Rozklad pektinových látek pomocí protopektináz a pektinesteráz

74 9 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK ASVK ATP Da EN EtOH EU FA FID GC HPLC LC MeOH NADH NAD + PCA ph PE PGázy PPázy Rf RI detektor SPE SPME UV UV detektor UV/VIS detektor aktivní suché vinné kvasinky adenosintrifosfát Dalton (stanovení relativní molekulové hmotnosti) evropská norma ethanol Evropská unie faktorová analýza plamenově ionizační detektor plynová chromatografie vysokoúčinná kapalinová chromatografie kapalinová chromatografie methanol nikotinamidadenindinukleotid oxidovaná forma nikotinamidadenindinukleotidu analýza hlavních komponentů koncentrace vodíkových iontů pektinesterázy polygalakturonázy protopektinázy stupně refraktometrické (stanovení obsahu rozpustné sušiny) refraktometrický detektor extrakce na pevnou fázi mikroextrakce na pevnou fázi ultrafialové detektor s vlnovou délkovou ultrafialového záření spektrofotometrický detektor 74

75 PŘÍLOHY

76 Seznam příloh Příloha 1: Stanovení těkavých látek v meruňkovicích s koncentrací nad 20 mg. l -1. Příloha 2: Stanovení těkavých látek v meruňkovicích s koncentrací pod 20 mg. l -1. Příloha 3: Koncentrace těkavých látek v meruňkovicích z různě přislazeného kvasu. Příloha 4: Složení destilátů z kvasů s přirozeným ph (4,25) a okyseleným (3,2). Příloha 5: Kalibrační křivky zleva doprava sacharosy, glukosy, fruktosy, glycerolu, methanolu a ethanolu.

77 koncentrace [mg l -1 ] destilát z nepřislazeného kvasu 600 destilát z doslazeného kvasu o 3 Rf ,9 447,3 470,6 destilát z doslazeného kvasu o 6 Rf , , ,7 38,1 42,6 55,6 42,3 33,1 19,4 15,2 složky o koncentraci nad 20 mg l -1 Příloha 6: Stanovení těkavých látek v meruňkovicích s koncentrací nad 20 mg. l -1. koncentrace [mg l -1 ] ,6 4,8 4,6 1,8 1,1 2 2,1 1,2 3,3 3 3,3 2 destilát z nepřislazeného kvasu destilát z doslazeného kvasu o 3 Rf destilát z doslazeného kvasu o 6 Rf 10,8 9,7 8,1 6,8 4,8 3,4 0,2 složky o koncentraci pod 20 mg l -1 Příloha 7: Stanovení těkavých látek v meruňkovicích s koncentrací pod 20 mg. l -1.

78 Příloha 8: Koncentrace těkavých látek v meruňkovicích z různě přislazeného kvasu. skupiny látek zaznamenané složky koncentrace [mg/l] meruňkovice z nepřislazeného kvasu (13,97 Rf) meruňkovice z přislazeného kvasu o 3 Rf (16,97 Rf) meruňkovice z přislazeného kvasu o 6 Rf (19,97 Rf) ethanol 157,98 280, methyl-1-butanol 19,99 447,33 488,88 3-methyl-1-butanol 68,14 3,26 0 alkoholy n-hexanol 2,09 0 1,2 trans-2-hexen-1-ol 2,99 0 3,26 phenethyl alkohol 6,78 4,76 0 kyselina ethanová 133,65 470,6 239,06 kyselina hexanová 0 0 1,01 kyseliny kyselina n-oktanová 42,34 19,43 15,23 kyselina dekanová 9,68 8,08 3,39 ethylacetát 3,64 4,81 4,62 2-methyl-1-butylacetát 0 0 0,16 estery butyl-2-methylbutyrát 1,05 1,75 1,97 ethylhexanoát 0 0 0,18 ethyloctanoát 0 0 1,81 trans-2-hexenal 38,1 0 42,62 n-oktanal 0, aldehydy furfural 0,76 0,36 0,38 trans-2-decenal 0 0 0,08 linalol 0,2 0,31 0,23 terpeny a-terpineol 0,17 0,14 0,04 nerol 0,1 0 0 cis-geraniol 55,6 0 33,12 laktony c-dekalakton 0,03 0 0

79 Příloha 9: Složení destilátů z kvasů s přirozeným ph (4,25) a okyseleným (3,2) (LLOBODANIN et al., 2010).

80 Příloha 10: Kalibrační křivky zleva doprava sacharosy, glukosy, fruktosy, glycerolu, methanolu a ethanolu.