Reaktivní formy kyslíku v lidském těle Antioxidační ochrana. MUDr. Jan Pláteník, PhD Ústav lékařské biochemie 1.LF UK. Co je volný radikál?

Transkript

1 Reaktivní formy kyslíku v lidském těle Antioxidační ochrana MUDr. Jan Pláteník, PhD Ústav lékařské biochemie 1.LF UK Co je volný radikál? - molekula, atom, nebo ion schopný samostatné existence, který obsahuje alespoň jeden nepárový elektron radikál O 2 ion molekula 1

2 K čemu vlastně potřebujeme kyslík? Přenos elektronů (oxidace) z organických látek na kyslík uvolňuje obrovské množství energie Př. Glukosa: C 6 H 12 O O 2 6 CO H 2 O G o = 2820 kj/ mol (180 g glukosy) Reaktivitu kyslíku lze navíc regulovat katalýzou přechodnými kovy (železo, měď) Hoří cukr? 2

3 3

4 Spinová restrikce kyslíku Normální (triplet) O 2 je biradikál, s vysokou afinitou k elektronům Ale příjem elektronu vyžaduje aby jeden ze stávajících nepárových elektronů změnil svůj spin, což je relativně pomalý proces. Bez této restrikce bychom v kyslíkaté atmosféře planety okamžitě shořeli. Singletový O 2 je excitovaná, vysoce reaktivní forma kyslíku. Dýchacířet etězec vnitřní mitochondriáln lní membrány 4

5 ..elektrony proudí po spádu redoxního potenciálu a končí na kyslíku ku celková reakce: NADH + H + + 1/2 O 2 NAD + + H 2 O G o = kj mol -1 Zároveň s proudem elektronů se pumpují protony a vzniklý protonový gradient pak pohání syntézu ATP 5

6 Reaktivní formy kyslíku (ROS, kyslíkové radikály ) lze odvodit od meziproduktů redukce kyslíku na vodu: O 2 +1 e- +4 e- (+4 H + ) O 2 superoxid +2 e- (+2 H + ) +3 e- (+3 H + ) H 2 O 2 peroxid vodíku 2H 2 O OH hydroxylový radikál ( +H 2 O ) 6

7 Superoxid O 2 Zdroje v těle: Únik elektronů na kyslík - Dýchacířetězec v mitochondriích - Jiné podobné redoxní systémy, např. mikrosomální cytochrom P450 monooxygenasa NAD(P)H Oxidasa: - Fagocyty ( respiratory burst ) - Nefagocytární buňky Některé enzymy: - Xanthinoxidasa - Cyklooxygenasa - Lipoxygenasa Reakce FeII-hemoglobinu s kyslíkem Autooxidace (reakce s kyslíkem) různých látek (askorbát, glutathion a jiné thioly, katecholaminy) Produkce superoxidu v dýchacímřetězci 1-2 % z celkové spotřeby O 2 Únik elektronů z redoxních center komplexů I a III, především ze semiubichinonu 7

8 Respirační vzplanutí fagocyta Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu Štípek S et al.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing, Praha,

9 Superoxid Vlastnosti: - Nepříliš reaktivní, oxidační i redukčníčinidlo - Omezená možnost průchodu přes membrány (jen skrz aniontové kanály nebo ve své protonované formě) - Uvolňuje železo z Fe-S clusterů Osud: Dismutace: O 2 O 2 + O H + O 2 + H 2 O 2 Reakce s oxidem dusnatým: NO + O 2 OONO (peroxynitrit) Peroxid vodíku H 2 O 2 Tvorba v těle: Dismutace superoxidu (spontánní nebo katalyzovaná superoxiddismutasou) O 2 + O H + O 2 + H 2 O 2 Přímočinností některých enzymů: Xanthinoxidasa Monoaminooxidasa (MAO) 9

10 Peroxid vodíku Vlastnosti: - Není radikál - Volně prochází skrz biologické membrány - Sám o sobě celkem nereaktivní - Ale rychle reaguje s redukovanými přechodnými kovy jako železo a měď (Fentonova reakce) Osud: Fentonova reakce: H 2 O 2 hydroxylový radikál H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ Bezpečné odstranění glutathionperoxidasou nebo katalasou Hydroxylový radikál Vznik v těle: Ionisační záření: H 2 O H + OH OH Fentonova reakce: H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ Vlastnosti: - Extrémně reaktivní. Poškozuje biomolekuly blízko místa svého vzniku 10

11 Reaktivní formy kyslíku (Reactive Oxygen Species, ROS) Radikály: Superoxid, O 2 Hydroperoxyl, HO 2 Hydroxylový radikál, OH Peroxyl, ROO Alkoxyl, RO Ne-radikály: Peroxid vodíku, H 2 O 2 Kyselina chlorná, HClO Ozón, O 3 Singletový kyslík, 1 O 2 Oxid dusnatý Vznik v těle: NO NO synthasová reakce: L-Arginin + O 2 + NADPH L-Citrullin + NADP + +NO Tři různé NO synthasy: - NOS I (neuronální, konstitutivní) - NOS II (fagocyty, inducibilní) - NOS III (endoteliální, konstitutivní) 11

12 Oxid dusnatý (NO) působí relaxaci hladkého svalstva cévní stěny: Oxid dusnatý Vlastnosti: - Plynný radikál - Reakce s hemovým železem guanylátcyklasy ( fyziologické účinky, relaxace hladkého svalstva atd.) - Reakce s hemovým železem hemoglobinu ( fyziologická inaktivace) - Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd. na nitrosothiol ( transport NO) - Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečně hydroxylový radikál ( toxicita): NO + O 2 OONO peroxynitrit NO OONO + H + HOONO OH + NO 2 kyselina peroxydusitá hydroxylový radikál 12

13 Reaktivní formy dusíku (Reactive Nitrogen Species, RNS) Radikály: Oxid dusnatý, NO Oxid dusičitý, NO 2 Ne-radikály: Nitrosonium, NO + Nitroxyl, NO Kyselina dusitá, HNO 2 Oxid dusitý, N 2 O 3 Oxid dusičitý, N 2 O 4 Nitronium, NO 2 + Peroxynitrit, ONOO Alkylperoxynitrit, ROONO Oxidační poškození biomolekul Lipidy: peroxidace polynenasycených mastných kyselin v membránách Proteiny: oxidace -SH, karbonylace -NH 2, hydroxylace/nitrosylace aromatických AMK, cross-linking, degradace Nukleové kyseliny: zlomy v řetězci DNA, hydroxylace basí... mutace, kancerogenese 13

14 Peroxidace lipidů (žluknutí) Další osud lipoperoxidů 14

15 Ionizační záření: Hydroxylový radikál vzniká ionizací vody: H 2 O + hν H + OH Reaktivní formy kyslíku v organismu: Jednoelektronovou redukcí kyslíku (mitochondrie, NADPH oxidasa) vzniká superoxid O 2 Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodíku: O 2 + O H + O 2 + H 2 O 2 Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvoří z peroxidu hydroxylový radikál: H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ Kde jsou RONS prospěšné: Monooxygenasy: hydroxylace steroidů, xenobiotik etc. Fagocyty: zabíjení mikrobů nebo nádorových buněk Mediátory zánětlivé reakce 15

16 Hydroxylace hydrofobních látek (monooxygenasy, cytochrom P450..) Mechanismus: v podstatěřízená Fentonova reakce Fe 3+ + SH + 2 e- + O 2 + H + FeOOH SH FeOOH SH FeO 3+ SH + H 2 O FeO 3+ SH FeOH 3+ S Fe 3+ SOH Fe 3+ + SOH Příklad prospěšnosti ROS: Respirační vzplanutí neutrofilního granulocytu 1998 Garland Publishing 16

17 Kde jsou RONS prospěšné: Monooxygenasy: hydroxylace steroidů, xenobiotik etc. Fagocyty: zabíjení mikrobů nebo nádorových buněk Mediátory zánětlivé reakce Lokální hormony/mediátory: - NO: - relaxace hladkého svalstva cévní stěny, gastrointestinálního traktu, corpus cavernosum penis - neurotransmitter/ neuromodulátor v CNS, funkce v synaptické plasticitě, učení a paměti - inhibice adhese a agregace trombocytů, adhese leukocytů Kde jsou RONS prospěšné: Monooxygenasy: hydroxylace steroidů, xenobiotik etc. Fagocyty: zabíjení mikrobů nebo nádorových buněk Mediátory zánětlivé reakce Lokální hormony/mediátory: - NO: - relaxace hladkého svalstva cévní stěny, gastrointestinálního traktu, corpus cavernosum penis - neurotransmitter/ neuromodulátor v CNS, funkce v synaptické plasticitě, učení a paměti - inhibice adhese a agregace trombocytů, adhese leukocytů Superoxid stejně tak, účinky protichůdné NO? 17

18 Koncept redoxní signalizace Redoxní prostředí buňky - přibližně dáno poměrem GSH/GSSG a NADH/NAD Redoxní sensory na proteinech: kritické -SH skupiny Fe-S centra Cíle redoxní signalizace: transkripční faktory proteinkinasy a fosfatasy Redoxní signalizace Oxidační stres aktivuje určité protein kinasy a transkripční faktory Výsledný efekt: např. stimulace proliferace, senescence (stárnutí) buněk Působení ROS/antioxidantů v buňce může být velmi specifické (T. Finkel & N.J. Holbrook, Nature 408 (2000), ) 18

19 a velmi komplikované Oxidační stres Hladina reaktivních forem kyslíku je udržována v určitých mezích mechanismy antioxidační ochrany Oxidační stres nastává při vychýlení této rovnováhy směrem k oxidaci 19

20 Antioxidační ochrana prevence tvorby ROS/RNS (regulace produkujících enzymů, sekvestrace přechodných kovů) vychytávání, lapání a zhášení radikálů reparační systémy (fosfolipasy, proteasom, enzymy opravující DNA) Antioxidant v chemii potravin Redukčníčinidlo schopné zastavit řetězovou reakci lipoperoxidace chain-breaking... Např.: Butylovaný hydroxytoluen (BHT) Butylovaný hydroxyanisol (BHA) Tokoferol (Vitamín E) 20

21 Antioxidační ochrana lidského těla Anatomické uspořádání regulující hladinu kyslíku ve tkáních Antioxidační enzymy Sekvestrace redoxně aktivních kovů Antioxidační substráty Stresová reakce (Reparace oxidačního poškození DNA, proteinů a lipidů) O 2 První organismus (anaerobní)? Vyvinout antioxidační ochranu? Vyhynout? Uchýlit se do anaerobních podmínek? 21

22 Shluknout se! O 2 O 2 Antioxidační ochrana I Regulace O 2 ve tkáních Vdechovaný vzduch: 160 mmhg O 2 Plicní kapiláry: 100 mmhg O 2 Arteriální krev: 85 mmhg O 2 Arterioly: 70 mmhg O 2 Kapiláry: 50 mmhg O 2 Buňky: 1-10 mmhg O 2 Mitochondrie: < 0,5 mmhg O 2 Obr: Wikipedie 22

23 Mitochondrie jsou původně fagocytované/parazitující bakterie... Antioxidační ochrana II Antioxidační enzymy Superoxiddismutasa: O 2 + O H + O 2 + H 2 O 2 Katalasa: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Glutathionperoxidasa, peroxiredoxin: H 2 O R-SH 2 H 2 O + RS-SR 23

24 Superoxiddismutasa (SOD) Katalyzuje dismutaci superoxidu: O 2 + O H + O 2 + H 2 O 2 Naprosto nezbytná pro život s kyslíkem SOD1: Cu+Zn (cytosol) SOD2: Mn (mitochondriální matrix) Fe (prokaryotická) EC-SOD: extracelulární, Cu+Zn, MW , vazba na heparansulfát na povrchu cévního lumen Glutathionperoxidasy (GPX) Redukce peroxidů spojená s oxidací glutathionu: 2 GSH + H 2 O 2 GS-SG + 2 H 2 O (glutathion je následně regenerován glutathionreduktasami) Obsahují selenocystein v aktivním místě Cytosolová glutathionperoxidasa: redukuje H 2 O 2 a LOOH po uvolnění z fosfolipidů Fosfolipidhydroperoxid-GSH-peroxidasa: redukuje LOOH i v membránách 24

25 Glutathion (GSH/GSSG) tripeptid, v každé buňce 1-10 mm udržuje redukční prostředí ICT substrát pro GPX, GST neenzymové reakce s ROS... produkty oxidace GSH jsou toxické pro buňku při oxidačním stresu export GSSG z buňky Katalasa Tetramer, každá podjednotka obsahuje hem s Fe Dismutace peroxidu vodíku: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Peroxisomy, erytrocyty Též peroxidasová aktivita: H 2 O 2 + ROOH H 2 O + ROH + O 2 (ve srovnání s GPX nevýznamná) 25

26 Oxidace dlouhých mastných kyselin v peroxisomech: O 2 Superoxiddismutasa H 2 O 2 H 2 O Glutathion peroxidasa GSH GS-SG Oxidovaný glutathion (GS-SG) Glutathion reduktasa NADP + Transhydrogenasa NAD + Redukovaný glutathion (GSH) NADPH+H + NADH+H + Pentosový cyklus ATP 26

27 O 2 Superoxiddismutasa NADPH+H + H 2 O 2 Peroxiredoxin RED Thioredoxin RED Thioredoxin reduktasa RED SH HS SH HS FADH 2 (Se) GSH Peroxiredoxin OX Thioredoxin OX Thioredoxin reduktasa OX H 2 O S S S S FAD (Se) NADP + Antioxidační ochrana III Sekvestrace železa a mědi Redoxně aktivní přechodné kovy (Fe, Cu) přijímají/dávají jeden elektron snadno... obcházejí spinovou restrikci kyslíku... kovy jsou v aktivních centrech všech proteinů pracujících s kyslíkem Ale, tytéž vlastnosti Fe, Cu jsou škodlivé pokud nejsou kontrolovány Fentonova reakce: H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ oxidativní poškození biomolekul 27

28 Antioxidační ochrana III Sekvestrace železa a mědi Proteiny zacházející s železem a/nebo mědí: transferin: váže 2 atomy Fe 3+ (transport) laktoferin: analogický transferinu, ale Fe neuvolňuje (... jen sekvestrace), leukocyty feritin: H a L podjednotky, H je ferroxidasa, skladování Fe (až 4500 atomů Fe 3+ ) haptoglobin: váže hemoglobin v cirkulaci hemopexin: váže hem v cirkulaci ceruloplasmin: obsahuje Cu, funkce: ferroxidasa (export Fe z buněk) albumin: transport Cu ICT ECT Superoxid Peroxid Fe/Cu Superoxid Peroxid Fe/Cu Superoxiddismutasa Glutathionperoxidasa Katalasa Glutathion Tokoferol Askorbát Redoxně aktivní Fe přítomno (LIP labile iron pool ) Antioxidační enzymy & hladiny glutathionu velmi nízké Tokoferol Askorbát Karotenoidy, kyselina močová, albumin, glukosa, bilirubin... Sekvestrace železa a mědi: - transferin, laktoferin - hemopexin - haptoglobin - ceruloplasmin (ferroxidasa) - Cu vázáno na albumin 28

29 Antioxidační ochrana IV Nízkomolekulární antioxidační substráty THIOLY: Glutathion Thioredoxin DALŠÍ ENDOGENNÍ METABOLITY: Bilirubin Kyselina močová Kyselina lipoová Z DIETY: Askorbát (Vitamín C) α-tokoferol (Vitamín E) Karotenoidy Rostlinné fenoly Tokoferoly (Vitamin E) skupina 8 isomerů, nejúčinnějšíαtokoferol antioxidant membrán (lipofilní) chain-breaking... zastavujeřetězovou reakci lipoperoxidace 29

30 Askorbát (Vitamín C) Redoxně aktivní derivát sacharidů U většiny živočichů syntetizován z kyseliny glukuronové Pro člověka, primáty, netopýry a morčata vitamín Deficit způsobuje onemocnění zvané kurděje (skorbut) Askorbát v těle: Hlavní funkce je pro-oxidační: kofaktor hydroxylas Hydroxylace Pro a Lys při syntéze kolagenu Syntéza noradrenalinu z dopaminu Syntéza karnitinu ( úloha v oxidaci tuků) Aktivace hypotalamických peptidových hormonů amidací (CRH, GRH, oxytocin, vasopresin, substance P) Reduktant pro železo: podpora jeho vstřebávání Při poruše sekvestrace Fe (hemochromatosa) může být nebezpečný pro-oxidant (?) Denní potřeba mg, vyšší dávky p.o. se vyloučí močí (renální práh cca 200 mg/24 hod.) 30

31 membránový kompartment: hydrofilní kompartment: LH Tokoferol Semidehydroascorbát LOO -e - +e - řetězová reakce lipoperoxidace Dehydroascorbát L LOOH Tokoferyl radikál Ascorbát dehydroascorbát reduktasa 2GSH GSSG Aktivované neutrofily akumulují dehydroaskorbát (DHA) DHA GLUT1 GSH Glutaredoxin Askorbát GSSG Ochrana membrány neutrofilu před oxidací vlastními ROS... 31

32 Selen: stopový prvek (denní potřeba 55 µg), možnost deficitu i intoxikace Součást řady antioxidačních enzymů (glutathionperoxidasy, thioredoxinreduktasy) a také např. 5 -dejodasy β-karoten (provitamín A) je prekursor pro syntézu: Retinal vidění Kyselina retinová regulátor genové exprese, růstu a diferenciace buněk Antioxidační ochrana V Stresová reakce Oxidace nebo nitrosylace kritických -SH skupin Transkripční faktory (NFκB, Nrf-2 ): aktivace, translokace do jádra Indukce genové exprese: chaperony (heat shock proteiny) enzymy antioxidační ochrany metalothionein hemoxygenasa 1 vyšší odolnost vůči dalšímu oxidačnímu stresu 32

33 Apoptosa jako extrémní antioxidační ochrana? Proč červené krvinky potřebuj ebují pentosový cyklus? 33

34 O 2 Superoxiddismutasa H 2 O 2 H 2 O Glutathion peroxidasa GSH GS-SG Glutathion reduktasa NADPH+H + NADP + Methemoglobinreduktasa Hb-FeII Pentosový cyklus Hb-FeIII Volné radikály v patogenesi lidských onemocnění Příčina chorobného stavu, např.: cancerogenese v důsledku expozice ionizačnímu záření retinopatie novorozenců (fibroplasia retrolentalis) Významný podíl na patogenesi, např.: aterosclerosa diabetes mellitus hypertenze některé typy rakoviny mozkové trauma/hemoragie ischemicko-reperfusní poškození srdce a jiných orgánů Parkinsonova nemoc Alzheimerova nemoc stárnutí Jen epifenomenon (obecný důsledek tkáňového poškození) 34