Stanovení Ct hodnoty. Stanovení míry variability na úrovni izolace RNA, reverzní transkripce a real-time PCR

Transkript

1 Stanovení Ct hodnoty Ct hodnotu (číselný výstup real-time PCR) stanovíme z amplifikačního grafu (grafický výstup real-time PCR) proložením thresholdu skrze lineární část amplifikační křivky. V bodě protnutí thresholdu a amplifikační křivky vedeme pomyslnou kolmici na souřadnici x (cykly PCR), ze které tak odečteme hodnotu Ct. Pokud nezměníme nastavení, threshold bývá automaticky nastavován na hodnotu fluorescence Rn = 0.2. Stanovení míry variability na úrovni izolace RNA, reverzní transkripce a real-time PCR

2 Míra variability na úrovni real-time PCR je stanovena průměrnou hodnotou směrodatných odchylek vypočítaných z Ct hodnot všech jednotlivých real-time PCR triplikátů. V Real TimePCR = SD(1,2,) + SD(4,5,6) SD(25,26,27) Míra variability na úrovni reverzní transkripce je stanovena průměrnou hodnotou směrodatných odchylek vypočítaných z průměrných Ct hodnot všech příslušných real-time PCR triplikátů jednotlivých větví vyizolované RNA. V RT = SD( , , ) SD( , , ) Míra variability na úrovni izolace je stanovena směrodatnou odchylkou vypočítanou z průměrných Ct hodnot všech příslušných real-time PCR jednotlivých větví vyizolované RNA V izolace = SD(,, ) Červený kruh označuje právě jeden real-time PCR triplikát. Zelený kruh označuje právě tři real-time PCR triplikáty jedné větve vyizolované RNA. Stanovení efektivity PCR

3 Pro stanovení efektivity PCR sestrojíme z koncentrační řady vstupní cdna (minimálně pět koncentrací, každá ve třech opakováních) kalibrační křivku. Do grafu vyneseme průměrné Ct hodnoty každé koncentrace včetně jejich směrodatných odchylek a aplikujeme lineární regresi, čímž získáme směrnici lineární rovnice k a korelační koeficient R 2. Abychom mohli tvrdit, že PCR proběhla úspěšně, musí být jednak směrnice lineární rovnice k v intervalu <-.0; -.>, přičemž hodnota k = -. odpovídá 100% efektivitě PCR, a jednak korelační koeficient R Výpočet efektivity PCR: E = (10-1/k - 1) E (%) = (10-1/k - 1) * 100 Korekce Ct hodnoty na Interplate Control Pokud je experiment navrhnut tak, že jej nelze analyzovat souběžně na jedné PCR desce (tedy za identických podmínek), může mezi jednotlivými analýzami docházet k variabilitě účinnosti PCR reakce. Z tohoto důvodu se v některých případech provádí korekce získaných Ct hodnot na tzv. interplate control (IPC). IPC se rozumí analýza určitého genu u stejného vzorku na všech analyzovaných PCR deskách. Výsledkem takovéto korekce je pak Ct hodnota, kterou bychom hypoteticky získali, kdyby všechny analýzy probíhaly za stejných podmínek a se stejnou účinností PCR. Výpočet Ct hodnoty Genu A korigované na IPC: Ct korigovaná = Ct Gen Ct IPC + φct IPC Ct Gen - Ct hodnota konkrétního genu, který chceme korigovat (např. průměrná Ct hodnota triplikátu Genu A na desce 1).

4 Ct IPC - Průměrná Ct hodnota triplikátu IPC z téže desky, na které je i výše zmíněný konkrétní gen (v našem případě z desky 1). φct IPC - Průměrná Ct hodnota všech IPC ze všech analyzovaných desek (v našem případě desky 1-). Korekce Ct hodnoty na efektivitu PCR Pokud není efektivita PCR (E) pro analyzovaný gen rovna 1 (100%), využívá se v některých případech korekce získaných Ct hodnot právě na experimentálně stanovenou efektivitu, jejímž výsledkem je Ct hodnota, kterou bychom hypoteticky získali při 100% efektivitě PCR pro daný gen. Narozdíl od korekce Ct hodnoty na IPC, nebere korekce Ct hodnoty na efektivitu PCR v úvahu efektivitu PCR závislou na variabilitě externích podmínek, ale účinnost přepisu a/nebo amplifikace jednotlivých genů a to za předpokladu identických podmínek. Výpočet Ct hodnoty korigované na efektivitu PCR: Ct E=100% = Ct * log (1 + E) / log (2) Ct - nekorigovaná Ct hodnota daného genu E - efektivita PCR pro daný gen Stanovení relativní exprese námi analyzovaného genu Relativní expresi analyzovaného genu zjistíme pomocí normalizace jeho expresní hladiny (Ct a ) na expresní hladinu referenčního genu (Ct b ). Tuto normalizaci provedeme podle následujícího vzorce: 2 - Ct -(Cta - Ctb) = 2 Pokud bychom chtěli normalizovat expresi analyzovaného genu u zkoumaného vzorku (ZV) (např. pacient) na expresi analyzovaného genu u kontrolního vzorku (KV) (např. zdravý člověk), využijeme následující rovnici: 2 - Ct -(CtZVa - CtZVb) - (CtKVa - CtKVb) = 2

5 Úkol č. 1 Na základě přiloženého amplifikačního grafu (Příloha 1) stanovte u jednotlivých vzorků jejich Ct hodnoty. Úkol č. 2 Na základě uvedených Ct hodnot (Příloha 2) stanovte pro mir-21 míru variability na úrovni izolace, reverzní transkripce a real-time PCR. Úkol č. Na zákaldě uvedených Ct hodnot (Příloha ) vypočítejte efektivitu PCR pro mir-21 a diskutujte, zda PCR proběhla v pořádku. Úkol č. 4 Na základě vypočítané efektivity PCR pro mir-21 (Úkol č. ) proveďte korekci Ct hodnot mir-21 uvedených v Příloze 2. Zároveň proveďte korekci Ct hodnot RNU48, pokud víte, že efektivita PCR pro tento gen je 5 %. Úkol č. 5 Na základě korigovaných Ct hodnot (Úkol č. 4) normalizujte hladiny exprese mir-21 na hladinu referenčního genu RNU48. Úkol č. 6 Proveďte korekci Ct hodnot z Přílohy 2 na IPC, jestli že víte, že průměrná Ct hodnota všech IPC (ze všech dalších desek) je 28,1. V úkolech č. 1, 2, 4, 5 a 6 pracujete s daty, které jste získali vaším měřením v předchozích cvičeních. Pro úkol č. jsou uvedena data z nezávislého experimentu.