PRINCIPY A VYUŽITÍ qpcr (kvantifikace změn genové exprese)

Transkript

1 PRINCIPY A VYUŽITÍ qpcr (kvantifikace změn genové exprese)

2 Northern bloty Genové čipy pracné a zdlouhavé nákladné Semikvantitativní RT-PCR nepřesné qpcr vysoké dynamické rozpětí metodiky real-time PCR Paralelní sekvenování transkriptomu RNA-seq

3 problém: precizní kvantifikace mrna spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné řešení: stanovení koncentrace RNA pomocí fluorescenčního barviva RIBOgreen x citlivější, nereaguje s nukleotidy a krátkými fragmenty. nebo relativní stanovení pomocí qpcr

4 control expt NORTHERN BLOT cílový gen GOI referenční gen aktin, GAPDHetc korigovaný nárůst exprese = 10/2 = 5

5 g3 g4 PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce

6 Snímek 5 g3 g4 In 1992, Mullis founded a business with the intent to sell pieces of jewelry containing the amplified DNA of deceased famous people like Elvis Presley and Marilyn Monroe.[13][14 galuszka; Back in the 1960s and early '70s I took plenty of LSD. A lot of people were doing that in Berkeley back then. And I found it to be a mind-opening experience. It was certainly much more important than any courses I ever took galuszka;

7 Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus Taq Pfu

8

9 aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mrna nebo mikrorna mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami

10 princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání

11 chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot

12 chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5-3 exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine ) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer

13 srovnání TagMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace HRM analýza cena vysoká nízká

14 kontaminace největší problém PCR aerosol, pipety, plasmidy, staré amplikony částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsdna s inkorporovaným deoxyuracilem (dutp) termolabilní, 0% aktivita nad 55 C nereaguje s templátem (dttp) dutp v qpcr mixu místo dttp pracuje během nastavení PCR reakce

15 pg2 chyby v pipetování templát (cdna) premix (primery, proba, polymerasa, dntp, pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX (Karboxy-X-Rhodamin) fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI pracujeme s premixy 1) pufr, Mg 2+,dNTP, ROX, SybrGreen, TaqPol, primery 2) vzorek (cdna, genomická DNA)

16 Snímek 14 pg2 hořčík vyšší davky pro Tagman kvuli 5-3- exonucleasove aktivite galuszka;

17 CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 AMOUNT OF DNA AMOUN T OF D NA lineární vynesení PCR CYCLE NUMBER logaritmické vynesení PCR CYCLE NUMBER

18 lineární ~20 do ~1500

19 C T hodnoty threshold treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky C T počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)

20 před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku threshold templát: 10x ředění buď přímo cdna, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme C T koncentrace templátu

21 PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce %EFF kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu R 2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995) Eff=10 (-1/slope) 1

22 CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY , ,048 1, ,096 2,213 1, ,192 4,205 2, ,384 7,990 3,748 1, ,768 15,181 6,747 2, ,536 28,844 12,144 4, ,072 54,804 21,859 8, , ,127 39,346 14, , ,842 70,824 23, ,048, , ,482 40, ,097, , ,468 69, ,194,304 1,356, , , ,388,608 2,578, , , ,777,216 4,898,763 1,338, , ,554,432 9,307,650 2,408, , ,108,864 17,684,534 4,335, , ,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667, ,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835, ,870, ,298,220 25,287,311 4,819, ,073,741, ,466,618 45,517,160 8,193,466 AMOUNT OF DNA %EFF 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x 10,000,000,000 1,000,000, ,000,000 10,000,000 1,000, ,000 10,000 1, % EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF PCR CYCLE NUMBER relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% 3%

23 tolerance efektivity

24 Chemismus SybrGreen Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání teplota

25 g5 REFERENČNÍ GEN musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích nejčastěji provozní geny (house-keeping) aktin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA, EF1 18S ribosomální RNA přepisována jinou RNA polymerasou než mrna byly popsány výkyvy mezi množstvím rrna a mrna nelze použít pokud se vychází z mrna

26 Snímek 23 g5 cyclophilin izomerizace peptidove vazby prolinu - folding proteinů EF - elongace peptidoveho retezce behem translace galuszka;

27 TaqMan Human Endogenous Control Plate C T

28 C T = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvojnásobné změně ve výchozí koncentraci cdna threshold

29 vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (mrna) přepis do cdna navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení standardních křivek pro oba geny a stanovení efektivity GAPDH GOI GAPDH GOI GAPDH GOI

30 vyhodnocení kalibrátor sample A kalibrátor sample B sample A sample B GAPDH GOI

31 1 vyhodnocení změny exprese pro sample 1 metoda delta delta Ct 1. určíme C T pro všechny křivky 2. určíme C T GOI - C T GAPDH pro kalibrátor C T kalibrátor 3. určíme C T GOI - C T GAPDH pro sample 1 C T sample 1 4. C Tsample 1 - C Tkalibrátor C T výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2 - CT

32 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek

33 3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích

34 příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cdna a provedeno qpcr s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cdna kalibrator C T 22,48 cdna silencing C T 22,3 GAPDH Eff 77% cdna kalibrator C T 20,05 cdna silencing C T 16, CT pkg2 cdna kalibrator cdna silencing 1,1x10 4 kopií 1,23x10 4 kopií 2 (5,33-2,43) (1+0,86) 0,18 /(1+0,77) 3,08 cdna kalibrator cdna silencing GAPDH 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x 1,55x10 4 kopií 8,92x10 4 kopií

35 pg1 navrhování primerů velikost amplikonu bp délka primerů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70%, GC-clamps on the 5 end žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)

36 Snímek 32 pg1 > An ideal primer has a stable 5'end and an unstable 3' end. If the > primer has a stable 3' end, it will bond to a site which is > complementary to it other than the target with its 5' end hanging off > the edge...[nice terminology BTW]...Stability of the 5' termini allows for efficient bonding of the > primer to the target site. This stable 5' region is called the GC > Clamp. It ensures adequate binding of the primer to the template... > Notice that the 3' end should not be very stable and the 5' end should > have a strong GC clamp. galuszka;

37

38 navrhování proby délka proby bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C o 10 C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5 konci zháší fluorescenci FAM barvy

39 navrhování primerů a proby

40 kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon

41 MGB PROBY minor groove binding stabilizuje vazbu proby na ssdna výrazně zvyšuje Tm můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm

42

43 MGB PROBY využití pro alelické diskriminace

44 kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 3X 6X

45 kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 18X

46 instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System

47 halogenová lampa emisní filtry zesilovač ccd kamera excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku

48 instrumentace

49

50 HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) detekce SNP bez specifických sond díky kvalitní instrumentaci Corbett ( 0.02 C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus)

51 pro amplikony do 200bp HRM ANALYSA