Kapitoly z bioorganické chemie OCH/KBCH. RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D. LS 2015/2016

Transkript

1 Kapitoly z bioorganické chemie CH/KBCH RDr. Lucie Brulíková, Ph.D. LS 2015/2016 brulikova@orgchem.upol.cz 1

2 4. Biosyntéza a metabolismus K 2

3 Biosyntéza a metabolismus K Biosyntéza nukleosidů de novo Většina živých organizmů není schopna získat dostatečné množství nukleosidů z potravy, proto v jejich buňkách probíhá de novo syntéza. Biosyntéza pyrimidinových a purinových nukleosidů se významně liší. Purinový heterocyklus je postupně vystavěn z 5-fosforibosyl-1-aminu. U pyrimidinů nejdříve vznikne báze (orotát) a ta je potom navázána na ribózu. 3

4 Biosyntéza a metabolismus K Biosyntéza nukleosidů - šetřící dráha Významným zdrojem nukleosidů je i šetřící dráha - salvage pathway - syntéza z bází a nukleosidů. mnohem méně energeticky náročné než de novo syntéza snižují syntézu de novo substráty: a) báze (adenin, guanin, hypoxanthin); PRDP b) ribonukleosidy; ATP 4

5 Biosyntéza K pyrimidinová analoga Carbamoyl phosphate aspartate PRPP (ribose phosphate) UTP CTP RA TMP dctp DA 5

6 Biosyntéza K pyrimidinová analoga 1. krok syntézy pyrimidinových nukleosidů de novo - vznik karbamoyl fosfátu. Reakce je katalyzovaná enzymem karbamoylfosfátsyntetasou. Aminoskupinu poskytuje glutamin, ze kterého při reakci vzniká kyselina glutamová, zdrojem fosfátu a energie jsou dvě molekuly ATP, při reakci se dále spotřebovává molekula vody. 6

7 Biosyntéza K pyrimidinová analoga Karbamoyl fosfát je velmi reaktivní meziprodukt, který za katalýzy aspartát transkarbamoylasou kondenzuje s kyselinou asparagovou za vzniku karbamoyl aspartátu (bez spotřeby ATP). 7

8 Biosyntéza K pyrimidinová analoga ásledně dojde k dehydrataci na cyklický dihydroorotát, jehož oxidací vzniká orotát. xidace je ireverzibilní a katalyzovaná enzymem dihydroorotátdehydrogenasou. 8

9 Biosyntéza K pyrimidinová analoga 9

10 Biosyntéza K pyrimidinová analoga V dalším kroku je orotát navázán na ribózu, která do reakce vstupuje aktivovaná, jako fosforibosylpyrofosfát (PRPP). Vzniká orotidin-5 -monofosfát (MP). Potřebná energie je získávána hydrolýzou PP i, katalyzátorem je enzym pyrimidinfosforibosyltransferasa. 10

11 Biosyntéza K pyrimidinová analoga ásleduje dekarboxylace MP za tvorby UMP, kterou katalyzuje enzym MPdekarboxylasa. 11

12 Biosyntéza K pyrimidinová analoga ukleosid monofosfát kinasy následně fosforylují UMP na UDP a UTP. CTP syntetasa je schopná naaminovat UTP za vzniku CTP, zdrojem dusíku je glutamin, ze kterého vznikne kyselina glutamová. 12

13 Biosyntéza K pyrimidinová analoga 13

14 Biosyntéza K pyrimidinová analoga Pro syntézu DA potřebují živé organizmy vyprodukovat thymidin. Výchozím nukleotidem pro biosyntézu thymidinu je deoxyuridin monofosfát dump. Methylová skupina pochází z 5, 10 -methylentetrahydrofolátu. 14

15 Biosyntéza K pyrimidinová analoga Dalším produktem této reakce je dihydrofolát, který musí být následně regenerován - redukce dihydrofolátu enzymem dihydrofolátreduktasou s koenzymem ADPH+H + a následně je na tetrahydrofolát přenesena methylenová skupina ze serinu pomocí enzymu serinhydroxymethyltransferasy. 15

16 Biosyntéza K pyrimidinová analoga Toto je jediný způsob, kterým živé organizmy syntetizují dtmp a správná funkce všech složek je tedy nutná pro syntézu DA během replikace. esprávná funkce thymidylát synthasy může v extrémním případě vést ke smrti z nedostatku thymidinu. 16

17 Enzymy biosyntézy pyrimidinových nukleotidů a možnost terapeutických cílů Dihydroorotátdehydrogenasa - obsahuje FM a nehemové Fe. 17

18 Enzymy biosyntézy pyrimidinových nukleotidů a možnost terapeutických cílů Dihydroorotátdehydrogenasa - je lokalizována na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidována chinony. Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v T- lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění revmatoidní arthritidu. a tomto principu funguje například v klinice používané léčivo leflunomid. 18

19 Enzymy biosyntézy pyrimidinových nukleotidů a možnost terapeutických cílů statní enzymy jsou cytosolární. Pyrimidinfosforibosyltransferasa je velmi důležitým enzymem, protože se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází, jako jsou uracil a cytosin v tzv. salvage pathway (viz dál). Enzym MPdekarboxylasa (DCasa) urychluje tvorbu UMP 2 x krát a je tak jedním z nejúčinnějších enzymů vůbec. 19

20 Enzymy biosyntézy pyrimidinových nukleotidů a možnost terapeutických cílů Vzhledem k tomu, že řada negativních procesů v organizmu, např. růst tumorů, je spojen s výrazně rychlejší replikací v nádorové tkáni a tedy i vyšší spotřebou dttp, je thymidylátsyntasa důležitým cílem chemoterapeutik. Z protinádorových inhibitorů thymidylátsynthasy můžeme jmenovat např. 5-fluoruracil. Blokáda syntézy thymidinu přivodí buňce smrt z jeho nedostatku, přesný mechanizmus účinku bude probrán dále. 20

21 Biosyntéza K purinová analoga datp ATP IMP GTP dgtp DA RA RA DA 21

22 Biosyntéza K de novo purinová analoga Enzymy: ribosafosfátpyrofosfátkinasa 1. amidofosforibosyltransferasa 2. GAR synthetasa 3. GAR transformylasa 4. FGAM synthetasa 5. AIR synthetasa 6. AIR karboxylasa 7. SAICAR synthethasa 8. adenylosukcinátlyasa 9. AICAR transformylasa 10. IMP cyklohydrolasa 22

23 Biosyntéza K de novo purinová analoga Výchozím materiálem je -D-ribosyl-5-fosfát, na který následně enzym ribosafosfátpyrofosfátkinasou přenese pyrofosfát z molekuly ATP, vzniká 5-fosforibosyl- -pyrofosfát (PRPP). V následném reakčním kroku dochází ke vzniku 5-fosforibosyl-1-aminu (PRA). Do reakce vstupuje PRPP, který je aminován v poloze 1 pomocí enzymu glutaminfosforibosylamidotransferasy. 23

24 Biosyntéza K de novo purinová analoga Aminová skupina pochází z glutaminu, do reakce vstupuje molekula vody a produktem jsou kromě aminované ribózy ještě pyrofosfát a kyselina glutamová. Zdrojem energie je makroergická vazba pyrofosfát~ribóza. Reakce je formálně nukleofilní substitucí s S 2 mechanizmem, který se projevuje charakteristickým Waldenovým zvratem konfigurace na stereogenním centru. Jedná se o kontrolní krok celé biosyntézy purinových nukleosidů. 24

25 Biosyntéza K de novo purinová analoga Dále do vznikající molekuly vstupují atomy C-4, C-5 a -7. Atomy pochází z molekuly glycinu, ten vytváří peptidovou vazbu s PRA (reaguje amin z PRA a karboxyl z Gly) a vzniká glycinamidribotid (GAR). Reakce je katalyzována enzymem GAR syntetasou. 25

26 Biosyntéza K de novo purinová analoga ásleduje vstup purinového atomu C-8. Volná aminoskupina GAR je formylována 10 -formyl THF za tvorby formylglycinamidribonukleotidu (FGAR). Reakce je katalyzována enzymem GAR transformylasou. 26

27 Biosyntéza K de novo purinová analoga Dále je do molekuly inkorporován purinový atom 3. Vstupuje ve formě Gln a energii dodá štěpení ATP ADP + P i. Reakce je katalyzována enzymem FGAM syntetasou. 27

28 Biosyntéza K de novo purinová analoga ásleduje uzavření imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzací se tvoří 5-aminoimidazolribonukleotid (AIR), energii k tomuto kroku opět dodá hydrolýza ATP ADP + P i ; reakci katalyzuje enzym AIRsyntetasa. 28

29 Biosyntéza K de novo purinová analoga C6 atom purinu se do molekuly dostane v následujícím kroku, kterým je reakce aminoskupiny AIR s HC 3 - za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR). 29

30 Biosyntéza K de novo purinová analoga 30

31 Biosyntéza K de novo purinová analoga Dále do molekuly vstoupí 1 atomu purinu. ejdříve se vytvoří amidická vazba mezi aminoskupinou kyseliny asparagové a C6 (který je ve formě karboxylu), energii dodá hydrolýza ATP ADP + P i, meziproduktem je 5-aminoimidazol-4-(-sukcinylokarboxamid) ribotid (SACAIR), reakce je katalyzována enzymem SAICAR syntetasou. 31

32 Biosyntéza K de novo purinová analoga Poté se z SACAIR odštěpí fumarát, tato reakce je podobná reakcím, ke kterým dochází v rámci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR). Enzymem katalyzujícím tento proces je adenylosukcinátlyasa. 32

33 Biosyntéza K de novo purinová analoga ásledně je do molekuly zabudován C2 atom purinu. Dochází ke druhé formylaci za účasti 10 -formyl THF a tvorby 5- formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). bě formylace jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p- aminobenzoové kyseliny. Eznymem katalyzujícím tuto reakci je AICAR transformylasa. 33

34 Biosyntéza K de novo purinová analoga Hlavním produktem celého tohoto sledu je univerzální meziprodukt syntézy purinových nukleotidů inosin monofosfát (IMP). Vzniká v posledním kroku cyklizací a eliminací vody. Zde není nutno štěpit ATP, reakce je katalyzována enzymem IMP cyklohydrolasou. 34

35 Biosyntéza K de novo purinová analoga 35

36 Biosyntéza K de novo purinová analoga Inosin monofosfát (IMP) se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a GMP. 36

37 Biosyntéza K de novo purinová analoga AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. a IMP se nejdřív naváže aspartát, což je spojeno s hydrolýzou GTP GDP a P i. V další reakci se eliminuje fumarát z adenylsukcinátu za tvorby AMP. 37

38 Biosyntéza K de novo purinová analoga GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti AD + za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup dusíku, který původně pochází z Gln; energii dodá současné štěpení ATP AMP + PP i. 38

39 Syntéza deoxyribonukleotidů Syntéza deoxyribonukleotidů spočívá v redukci 2 -CHH skupiny ribózy na 2 -CH 2 skupinu a probíhá na úrovni difosfátu. Enzymem, který reakci katalyzuje je ribonukleotidreduktasa (RR). 39

40 Syntéza deoxyribonukleotidů Redukce má poměrně složitý mechanizmus, který není ještě plně potvrzen. Předpokládá se, že nejdřív RR odejme radikál vodíku z atomu C-3 prostřednictvím svého radikálu cysteinu Cys439, potom dojde k protonaci 2 -H skupiny protonem z cysteinového zbytku a následné eliminaci molekuly vody za vzniku C-2 karbokationtu. ásleduje transfer atomu vodíku z Cys225 na C-2 a v molekule RR se vytvoří disulfidický můstek. Posledním krokem je navrácení vodíkového radikálu z RR na C-3 40

41 Syntéza deoxyribonukleotidů 41

42 Regulace syntézy nukleotidů Regulace syntézy nukleotidů probíhá na několika základních úrovních. Fosforibosylpyrofosfátsyntetasa je inhibována purinovými i pyrimidinovými nukleosid trifosfáty a difosfáty. Dále je syntéza jednotlivých nukleotidů regulována zpětnou vazbou. Hlavním kontrolním krokem v syntéze deoxyribonukleotidů je regulace nukleosiddifosfátreduktasy (ribonukleotidreduktasy), kterou aktivují nukleosid trifosfáty a inhibuje jí deoxyadenosin trifosfát (datp). 42

43 Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. ukleové kyseliny jsou odolné ke kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém střevě pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné membrány, a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. ukleosidy jsou ve střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami: ukleosidasa: ukleosid + H 2 báze + ribosa ukleosidfosforylasa: ukleosid + P i báze + ribosa-5-fosfát 43

44 Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů Recyklováno je jen velmi malé množství bází nukleových kyselin z potravy, proto musí probíhat biosyntéza de novo. Ribóza-1-fosfát, jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PP), je prekurzorem PRPP. Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající deriváty ionosinu, které jsou dále degradovány až na kyselinu močovou. Léčivo pentostatin (deoxycoformycin) je inhibitorem ADA (analog tranzitního stavu) a byl schválen k léčení některých typů leukemií. 44

45 Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů dbourávání purinů dbourávání purinů hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Xanthinoxidasa (X) převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu. U savců je X v játrech a v lemu tenkého střeva. X je homodimer obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo 6+ a Mo 4+. Koncovým akceptorem elektronů je 2 přecházející na H 2 2, což je nebezpečná oxidační sloučenina ihned štěpená katalasou na H 2 a 2. 45

46 46

47 47

48 Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů dbourávání pyrimidinových nukleosidů Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových vazeb. Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází. Konečnými produkty jsou b-alanin a b-aminoisobutyrát. bě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonyl- CoA a methylmalonyl CoA. 48

49 Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů dbourávání pyrimidinových nukleosidů Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA. Produkty degradace pyrimidinových nukleotidů přispívají k energetickému metabolizmu buňky. 49

50 50

51 dbourávání purinů a pyrimidinů SUHR: puriny H 3, kyselina močová - má antioxidační vlastnosti (částečně vylučována močí; poruchy: hyperurikémie, dna) normální hodnoty: sérum µmol/l (muži) µmol/l (ženy) moč 0,48 5,95 mmol/l pyrimidiny: C, U b-alanin, C 2, H 3 T b-aminoisobutyrát, C 2, H 3 51

52 Hlavní rozdíly metabolismu purinů a pyrimidinů tvorba -glykosidové vazby: Puriny: v 1. kroku syntézy (syntéza začíná na PRDP) Pyrimidiny: nejprve se syntetizuje pyrimidinový kruh lokalizace biosyntézy: Puriny: cytoplazma Pyrimidiny: cytoplazma + 1 enzym v mitochondrii produkty odbourávání: Puriny: kyselina močová (špatně rozpustná v H 2 ), H 3 Pyrimidiny: C 2, H 3, b-amk (dobře rozpustné v H 2 ) 52

53 Šetřící dráha (salvage pathway) Při degradaci nukleových kyselin se uvolňují báze adenin, guanin a hypoxanthin. V případě, že nejsou dále degradovány, mohou být tyto báze znovu recyklovány na nukleosidy cestou odlišnou od biosyntézy. U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy: adeninfosforibosyl transferasou (APRT) katalyzující reakci: Adenin + PRPP AMP + PP i hypoxanthinguaninfosforibosyl transferasou (HGPRT) katalyzující reakci: Hypoxanthin + PRPP IMP + Pp i a Guanin + PRPP GMP + Pp i 53

54 Šetřící dráha (salvage pathway) 54

55 Šetřící dráha (salvage pathway) S poruchou šetřící dráhy souvisí tzv. Lesch-yhamův syndrom deficit HGPRT způsobuje akumulaci PRPP u chlapců, což vede k vysoké hladině močové kyseliny v moči, krvi a tkáních, což souvisí s neurologickými potížemi a agresívním či destruktivním chováním. V těle se hromadí fosforibosyldifosfát (PRDP), který nemůže v důsledku mutace vstupovat do syntézy nukleotidů z nukleových bází, což v těle zvyšuje biosyntézu samotných purinů a konečným důsledkem je hromadění kyseliny močové v těle hyperurikémie. 55

56 Šetřící dráha (salvage pathway) 56

57 Poruchy metabolizmu purinů V souvislosti s metabolizmem nukleosidů je asi nejznámějším onemocněním dna, která je způsobená zvýšenou hladinou kyseliny močové v tělesných tekutinách, ta krystalizuje ve formě sodné soli a způsobuje záněty kloubů. Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování tohoto produktu odbourávání purinových bází, dalším může být např. nedostatečnost HGPRT (Lesch-yhamův syndrom) vedoucí k nadměrné produkci kyseliny močové z důvodů akumulace PRPP. Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je strukturní analog hypoxanthinu. X allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou formu enzymu, a tím ho ireverzibilně inhibuje. Jedná se o příklad suicide inhibitoru nebo mechanism-based substrátu. 57

58 Poruchy metabolizmu purinů Časté jsou geneticky podmíněné změny v aktivitách enzymů metabolizmu purinů, jejichž klinické projevy jsou pestré a nespecifické, např. poškození ledvin, kloubů (dna), postižení imunitního systému, anémie, nadprodukce kyseliny močové. Vyskytuje se např. polymorfizmus enzymů, který může způsobit zvýšenou či sníženou aktivitu, jejímž následkem je hromadění fyziologických či atypických metabolitů v tkáních nebo tělesných tekutinách, a tím může dojít k poškození organizmu. 58

59 Poruchy metabolizmu purinů Příklady nejběžnějších poruch mohou být: deficit hypoxanthin nebo guanin fosforibosyltransferasy (nadprodukce kyseliny močové, zvýšená syntéza purinů de novo poškození ledvin, poškození nervového systému, sebepoškozování) deficit adeninfosforibosyltransferasy (tvorba 2,8-dihydroxyadeninu, špatně rozpustný metabolit, vytváří močové konkrementy (kameny), může dojít až k akutnímu selhání ledvin) deficit xanthinoxidasy (zvýšené vylučováni xanthinu a hypoxanthinu močí) deficit/zvýšená aktivita adenosindeaminasy (deficit způsobuje těžký kombinovaný imunodeficit) deficit purinnukleosidfosforylasy (poškození imunitního systému T lymfocytů) deficit myoadenylátdeaminasy (enzymový defekt ve svalech) deficit adenylosukcinátlyasy (poškození CS, retardace) zýšená aktivita fosforibosyldifosfátsynthetasy (opožděný vývoj, ataxie, dysmorfické rysy) 59

60 Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky Enzymy biosyntézy složek K: nukleosiddifosfátreduktasa (DPreduktasa), někdy se označuje jako ribonukleotidreduktasa (RR) vznik 2 -deoxyribonukleotidů dihydrofolátreduktasa ovládá AICAR-formyltransferasu polyglutamylovatelné inhibitory nepolyglutamylovatelné inhibitory typu A neklasické antifoláty thymidylátsynthasa konverze dump na dtmp IMPdehydrogenasa konverze IMP na XMP 60

61 Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparazitárních léčiv, u nichž lze využít rozdílů v biochemických drahách u parazita a u člověka. apř. parazit Toxoplasma gondii (toxoplasmóza) může způsobit oslepnutí, neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsyntetasa II, enzym, který se strukturou i kineticky liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze hostitele a proto je musí syntetizovat de novo. 61

62 Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky Enzymy katabolismu K: cytidindeaminasa degradace cytosinových nukleosidů a nukleotidů adenosinaminohydrolasa zahajuje sled degradace nukleosidů adeninu adenylátdeaminasa konverze AMP na IMP purinnukleosidfosforylasa štěpí nukleosidovou vazbu na inosinu a 2 deoxyinosinu za vzniku hypoxanthinu a riboso-alfa-fosfátu, resp. 2- deoxyriboso-alfa-fosfátu xanthinoxidasa/xanthindehydrogenasa katalyzuje oxidaci xanthinu na kyselinu močovou uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa štěpí nukleosidovou vazbu pyrimidinů za vzniku U nebo T a D-riboso- -fosfátu, resp. 2-deoxy-D-riboso- -fosfátu 62

63 Enzymy biosyntézy složek K nukleosiddifosfátreduktasa (DP-reduktasa) hlavní zdroj deoxynukleotidů cílový enzym pro nádorovou terapii buněčná hotovost ddp a dtp je velmi nízká, proto inhibitory této reakce zasahují především rychle proliferující buňky také některé viry (př. některé herpesviry) kódují specifickou virovou DP reduktasu DP-reduktasa je čtyřjednotkový enzym, složený ze dvou dimerů, jsou v ní pevně vázané ionty Fe 3+, které stabilizují tyrosinový radikál 63

64 Enzymy biosyntézy složek K nukleosiddifosfátreduktasa (DP-reduktasa) Inhibitory hydroxymočovina a příbuzné látky thiosemikarbazony Triapine hydroxamové kyseliny Didox, Trimidox analoga substrátu Gemcitabin, Cladribin, DMDC, 2-Fluoro-araA; současně působí po převedení na trifosfát jako inhibitory DA nebo RA pol 64

65 Enzymy biosyntézy složek K nukleosiddifosfátreduktasa (DP-reduktasa) H 2 S H H 2 Triapirine H H Didox H H H H 2 F H H 2 Cl H H 2 H H H Trimidox H H 2 H H 2 H hydroxymocovina H F Gemcitabine H H H Cladribine, CldA H 2 F H F H 2 Cl H DMDC H H Fludarabine Clofarabine 65

66 Enzymy biosyntézy složek K IMP-dehydrogenasa IMP je uzlovým bodem syntézy obou purinových nukleotidů, GMP a AMP. Jako je thymidylátsynthasa nutná pro syntézu dtmp a thymidinu v buňce, je IMPdehydrogenasa klíčová pro guaninové nukleotidy a nukleosidy. Enzym katalyzuje konverzi IMP na xanthosin-5-fosfát (XMP). Enzym se aduje jednou ze svých SH skupin do polohy C-2 imidazolového kruhu hypoxanthinu. Po adici následuje oxidace působením AD a posléze hydrolýza v poloze C-2 doprovázená odštěpením enzymu. Funkce H-C v xanthinové bázi XMP je pak převedena za spoluúčasti ATP na aminoskupinu. 66

67 Enzymy biosyntézy složek K IMP-dehydrogenasa 67

68 mechanismus Enzymy biosyntézy složek K IMP-dehydrogenasa H Enz-Cys 331 H Rib-5-P IMP H AD ADH H H H Enz-Cys Enz-Cys 331 Rib-5-P 331 Rib-5-P H H XMP Rib-5-P 68

69 Enzymy biosyntézy složek K Inhibitory IMPdehydrogenasy IMP-dehydrogenasa analoga substrátu a produktů (inosin, IMP, xanthosin, XMP) analoga nikotinamidu analoga nikotinamidadenindinukleotidu (AD) a jejich prekurzory mykofenolová kyselina a její deriváty 69

70 Enzymy biosyntézy složek K IMP-dehydrogenasa - P - H H H 2 - P - H H H H 2 - P - H H H 2 Ribavirin MP Bredinin MP Mizoribine MP EICAR MP Cl H H - P - H H - P - H H - P - H H H 2 6-Chloropurine riboside MP 2-Vinylinosine MP 3-Deazaguanosine MP 70

71 Enzymy biosyntézy složek K IMP-dehydrogenasa - P - H X H H 2 H H - P P - H X H H 2 X = S, Thiazofurin X = Se, Selenazofurin H 2 X = S, TAD X = Se, SAD H CH 3 CH 3 CH 3 Mycophenolic acid H SH H 6-merkaptopurin SH H 2 H 6-thioguanin 71

72 Enzymy biosyntézy složek K Dihydrofolátreduktasa a thymidylátsyntasa syntéza dtmp de novo jediný zdroj thyminových nukleosidů 72

73 Enzymy biosyntézy složek K Inhibitory antifoláty Dihydrofolátreduktasa 73

74 Inhibitory Enzymy biosyntézy složek K Thymidylátsyntasa jejich účinkem nastává tzv. thymineless death použití cytostatika, antivirotika (inhibice syntézy DA, vzácně mají specifické dthd-synthasy i některé viry) rozdělení: analoga substrátu klasické antifoláty (omezený transport, musí být přítomen specifický transportní systém, koncová aminokyselina musí být polyglutamylována, aby vznikla profarmaka pomalu uvolňující aktivní látku, jinak probíhá rychlý eflux) neklasické antifoláty (místo zbytku glutamové kyseliny jiná elektronegativní skupina) 74

75 Enzymy biosyntézy složek K Thymidylátsyntasa Inhibitory analoga thymidinu H CH 3 H F H CF 3 H CH H H H H thymin 5 - fluoruracil 5 - trifluormetyhluracil 5 - ethynyluracil aktivní metabolit 5-fluoruracilu 5-fluoruridin monofosfát F H H P H H 75

76 inhibitory inaktivace thymidylatesynthase příklad mechanismu - irreverzibilní vazba s enzymem Enzymy biosyntézy složek K H H P H P H H H H C CH C CH Cys 198 Enz H P H H CH 2 THF C CH Cys 198 Enz H H H P H H C CH 2 Cys 198 Enz H P H H CH 2 C HCys 198 Enz H H 76

77 Enzymy biosyntézy složek K Inhibitory 5-fluoruracil Thymidylátsyntasa 77

78 78 H H H F Floxuridine 5-FUdR H H F 5FU phosphoribosyl transferase H H P P P H H F H P 5-FUMP H H F H P 5-FUDP ATP P DP H H F P 5-FdUDP P H H F P 5-FdUTP P ATP P Incorporation into DA H H F P 5-FdUTP THYMIDYLATE SYTHASE IHIBITI 5-FUTP Incorporation into RA

79 Enzymy katabolismu složek K adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa) katalyzuje hydrolytickou reakci adenosin je v organismu produkován ve velikém množství jako hormon, ale uvnitř buňky je, stejně jako 2 -deoxyadenosin, velmi toxický a jeho přebytek pokud není využit zachraňujícím mechanismem musí být stále odstraňován H 2 H H H H H H H 79

80 Enzymy katabolismu složek K adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa) inhibitory přirozené látky 80

81 Enzymy katabolismu složek K adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa) Syntetický inhibitor - Pentostatin kombinován s adenosinovými cytostatiky působí také jako cytostatikum (misinkorporace do DA, akumulace adenosinu ovlivnění jeho metaboslismu, inhibice methylací inhibice SAHasy) H H H H DEXYCFRMYCI PETSTATI, dcf transition state inhibitor K i ~ 2.5 x10-12 M anticancer activity, approved for hairy cell leukemia 81

82 Enzymy katabolismu složek K Cytidindeaminasa degraduje cytosinové nukleosidy a nukleotidy degraduje cytosinová cytostatika, která jsou poměrně široce využívána v chemoterapii nádorů a leukémií (např. cytosinarabinosid) nejčastějším inhibitorem je tetrahydrouridin další zebularin silný antibakteriální účinek 82

83 Enzymy katabolismu složek K Uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa mechanismus - oba enzymy katalyzují štěpení nukleosidové vazby fosforolýzou za vzniku pyrimidinové báze a D-riboso-alfa-fosfátu, resp. 2- deoxy-d-riboso-alfa-fosfátu H H H H H P H H H H H H P i H CH 3 H CH 3 H H H P H H P i H H 83

84 Enzymy katabolismu složek K Uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa Tyto enzymy metabolizují některá nukleosidová léčiva a jejich zvýšená aktivita může vést ke snížení koncentrace léčiva ve tkáních. Proto se někdy používá kombinace nukleosidového cytostatika a inhibitoru těchto dvou enzymů. Inhibitory jsou např. Thymindeoxyglukopyranosid 5-benzylpyrimidiny Acyklonukleosidy Anhydronukleosidy 84

85 Enzymy katabolismu složek K Uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa BAU (benzylacyklouridin) nejvíce prostudovaný, při jeho orálním podání současně s 5-FU dochází k několikanásobnému zvýšení hladiny uridinu v plasmě při zachování terapeutického účinku 85

86 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) H H R R H Rf (drf) R = H, H 2 + Rf(dRf)-1-phosphate purine salvage pathway enzym katabolismu adenosinu štěpí nukleosidovou vazbu fosforolysa přednostním substrátem je inosin a 2 -deoxyinosin vzniklé deaminací adenosinu a 2 -deoxyadenosinu může katalyzovat reakce v obou směrech, záleží na systému s jakým je spřažena ve spojení s xanthinoxidasou enzym katabolismu purinů ve spojení s hypoxanthin/guaninfosforibosyltransferasou enzym salvage pathway 86

87 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) H H H H 2 H H 2 H 2 H 2 H 2 H P H H H H H H H H 2 BCX-5 S H 2 BCX-34 (severe psoriasis, cutaneous T cell lymphoma) H 2 C 2 H Cl H H C H 2 H.HCl H 2 H H H P H n 87

88 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) DERIVÁTY 8-AMIGUAIU: H 2 H H H 2 H 2 H H 2 H H 2 H 2 S H H DERIVÁTY 9-DEAZAPURIU H H H H H H H H H I H 2 H 2 H H H H nejsilnější známý inhibitor PELDESIE BCX-34 88

89 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) analoga ACV-difosfátu 89

90 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) U dětí s dědičnou deficiencí PPasy se projevuje těžká imunodeficience T-buněk, zatímco B-buňky si svou aktivitu zachovávají. edostatečná aktivace T-lymfocytů se projevuje také psoriázou, revmatickou artritidou, T-buněčnými lymfomy nebo autoimunními stavy. Deficience je vyvolaná 2 -deoxyguanosinem, který se v buňkách hromadí, protože může být rozkládán jedině PPasou. Fosforyluje se na dgtp a zřejmě působí jako allosterický inhibitor ribonukleosidifosfátreduktasy: poruší se rovnováha mezi deoxynukleosidtrifosfáty v buněčné hotovosti a tím je narušena syntéza DA. 90

91 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) Mechanismus dguo toxicity při deficienci PPasy Ribosa-5-fosfát + guanin PPasa 5 -nukleotidasa dguo dgmp dcyd dcmp deoxycytidin kinasa inhibice dgtp inhibice DP ddp dtp ribonukleosid difosfát reduktasa 91

92 Enzymy katabolismu složek K Purinnukleosidfosforylasa (PPasa) Formycin B Immucilin H nejsilnější inhibitory 92