D IPLOMOVÁ PRÁCE. Agregabilita trombocytů indukovaná nízkými koncentracemi ADP s epinefrinu u pacientek s karcinomem prsu

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOLOGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD D IPLOMOVÁ PRÁCE Agregabilita trombocytů indukovaná nízkými koncentracemi ADP s epinefrinu u pacientek s karcinomem prsu Vedoucí diplomové práce: Mgr. Ilona Fátorová Konzultant: prim. MUDr. Petr Kessler HRADEC KRÁLOVÉ, 2017 Bc. Jana Razimová

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne

3 Poděkování Mé poděkování a vděčnost patří především prim. MUDr. Petrovi Kesslerovi za jeho čas, pozornost, neocenitelnou pomoc, rady, připomínky, ochotu a zájem, a dále také odbornému garantovi Mgr. Iloně Fátorové za pomoc při vypracování diplomové práce, taktéž i doc. MUDr. Lukáši Smolejovi, Ph.D. Velké poděkování patří i všem pracovníkům Oddělení hematologie a transfuziologie Nemocnice Pelhřimov, bez kterých by tato práce nemohla vzniknout. Nakonec patří můj dík mé rodině za pomoc a podporu při studiu. 3

4 OBSAH 1. ABSTRAKT ABSTRACT POUŽITÉ ZKRATKY ÚVOD ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE - CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Hemostáza Úloha trombocytů v primární hemostáze Syndrom lepivých destiček Nádorová onemocnění a trombóza Diagnostika SPS EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Charakteristika vyšetřovaného souboru Vyšetřovaný materiál Přístrojové vybavení Referenční hranice pro diagnostiku SPS Vyhodnocení a zpracování výsledků měření VÝSLEDKY Základní demografické charakteristiky Primární cíl Sekundární cíle Doplňkové analýzy DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM TABULEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM GRAFŮ POUŽITÁ LITERATURA PŘÍLOHY

5 1. ABSTRAKT Východisko: Trombóza je důležitá příčina nemocnosti a úmrtnosti u pacientů se zhoubnými nádory. V našich znalostech o patogenezi trombózy asociované s nádorem existuje řada neznámých míst. Syndrom lepivých destiček je vrozená porucha charakterizovaná hyperagregabilitou destiček s nízkými koncentracemi ADP a/nebo epinefrinu. Agregace trombocytů s nízkými koncentracemi ADP a epinefrinu nebyla u pacientek s karcinomem prsu léčeným endokrinní terapií dosud zkoumána. Cíle studie: Primární cíl: Vyšetřit agregaci trombocytů s nízkými koncentracemi induktorů ADP a epinefrinu u pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou s použitím optické agregometrie a porovnat výsledky s výsledky agregace trombocytů zdravých dobrovolníků. Porovnat podíl pacientek splňujících laboratorní kritéria syndromu lepivých destiček s podílem zdravých dobrovolnic splňujících tato kritéria. Sekundární cíle: 1. Ve skupině pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou analyzovat korelaci agregace (s nízkými koncentracemi induktorů) s expresí P- selektinu na nestimulovaných trombocytech. 2. Porovnat expresi P-selektinu na nestimulovaných trombocytech ve skupině pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou s expresí ve skupině zdravých dobrovolníků. 3. Analyzovat korelaci agregace trombocytů s nízkými koncentracemi induktorů s vybranými ukazateli metabolismu železa (hladina železa v séru, saturace transferinu, hladina sérového ferritinu). Soubor: 40 pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou a 30 zdravých dobrovolníků. Metodika: Vzorky krve byly odebrány po 10 dnech vynechání léků s protidestičkovým efektem (včetně protidestičkových léků a nesteroidních antirevmatik), gingo biloba, bylinkových čajů a ryb. Agregace byla vyšetřena optickou agregometrií s použitím nízkých koncentrací ADP (2,5; 1,0 a 0,5 μmol/l) a epinefrinu (10,0; 1,0 a 0,5 μmol/l). Exprese P-selektinu byla vyšetřena cytoflowmetricky s použitím protilátky anti CD62p- PE. Pro statistické vyhodnocení výsledků byl použit software Statistica CZ; ke zhodnocení rozdílů zastoupení nominálních proměnných byl použit chí kvadrát test, k vyhodnocení normality rozložení kvantitativních proměnných byl použit Shapiro- 5

6 Wilkův test a k vyhodnocení rozdílů průměrů kvantitativních proměnných byly použity T-test a Mann-Whitneyův test. K vyšetření závislostí vícečetných kvantitativních proměnných byly použity korelační matice. Výsledky: Laboratorní kritéria pro syndrom lepivých destiček byla splněna u 86,6 % zdravých dobrovolníků a 62,5 % pacientů; Rozdíl byl statisticky významný (p = 0,0245). Hyperagregabilita s nejméně dvěma koncentracemi ADP byla zjištěna u 46,7 % a 17,5 % zdravých dobrovolníků a pacientů; rozdíl byl statisticky významný (p = 0,0084). Hyperagregabilita s alespoň 2 koncentracemi epinefrinu byla zjištěna u 80,0 % a 60,0 % zdravých dobrovolníků a pacientů; rozdíl nebyl statisticky významný. Průměrné hodnoty agregace trombocytů byly vyšší u skupiny zdravých dobrovolníků než u skupiny pacientů s použitím ADP 2,5 μmol/l (p = 0,0227), ADP 1,0 μmol/l (p = 0,0027) a epinefrinu 1,0 μmol/l (p = 0,01423). Korelace mezi expresí P-selektinu na nestimulovaných destičkách a agregací byla významná s použitím ADP 0,5 μmol/l (p = 0,0110) a nebyla zjištěna žádná korelace s použitím ADP 2,5 μmol/l, ADP 1 μmol/l a všech koncentrací epinefrinu u skupiny pacientů. Ve skupině zdravých dobrovolníků nebyla nalezena žádná korelace mezi expresí P-selektinu na nestimulovaných krevních destičkách a agregací za použití všech koncentrací ADP a epinefrinu. Průměrná exprese P-selektinu na destičkách byla u pacientů vyšší než u zdravých dobrovolníků (p = 0,00008). Byly zjištěny středně silné a zároveň protichůdné korelace mezi agregací destiček a ukazateli metabolismu železa. Ve skupině pacientů byly zjištěny korelace mezi sérovou hladinou železa a agregací krevních destiček za použití ADP 2,5 μmol/l (r = -0,326892, p = 0,039510), ADP 0,5 μmol/l (r = 0,424480, p = 0,006335), mezi saturací transferinu a agregací trombocytů za použití ADP 2,5 μmol/l (r = -0,345935, p = 0,028778), ADP 0,5 μmol/l (r = 0,325656, p = 0,040307) a mezi sérovým ferritinem a agregací krevních destiček za použití ADP 0,5 μmol/l (r = 0,318242, p = 0,045361). Ve skupině zdravých dobrovolníků byly zjištěny korelace mezi sérovou hladinou železa a agregací trombocytů s použitím ADP 1,0 μmol/l (r = -0,406945, p = 0,025627) a mezi saturací transferinu a agregací trombocytů s použitím ADP 1,0 μmol/l (r = -0,380388, p = 0,038115). Závěry: Hyperagregabilita za použití nejméně dvou nízkých koncentrací ADP a / nebo epinefrinu byla zjištěna u nižšího podílu pacientů než u zdravých dobrovolníků a stejný 6

7 rozdíl byl zjištěn při použití nejméně dvou nízkých koncentrací ADP. Podíl hyperagregability s použitím alespoň dvou nízkých koncentrací ADP a / nebo epinefrinu je vysoký u žen středního věku a starších žen; použití kritérií získaných vyšetřením mladších dobrovolníků proto není pro tyto ženy vhodné. Vyšší exprese P-selektinu na destičkách byla nalezena u skupiny pacientů než u skupiny zdravých dobrovolníků. Nebyla zjištěna žádná silná korelace mezi vybranými parametry metabolismu železa a agregací trombocytů při nízkých koncentracích ADP a epinefrinu. 7

8 2. ABSTRACT Background: Thrombosis is an important cause of morbidity and mortality in cancer patients. There are many blank spaces in our knowledge on the pathogenesis of cancer associated thrombosis. The sticky platelet syndrome is an inherited disorder characterized by platelet hyperaggregability with low concentrations of ADP and/or epinephrine. The platelet aggregation with low concentrations of ADP and epinephrine has not yet been investigated in breast cancer patients treated with endocrine therapy. Aims of the study: Primary objective: To analyze the platelet aggregation with low concentrations of ADP and epinephrine in patients with breast cancer treated with endocrine therapy using light transmission aggregometry and compare the results with the results of the platelet aggregation in healthy volunteers. To compare the proportion of patients fulfilling the laboratory criteria for sticky platelet syndrome with the proportion of healthy volunteers fulfilling these criteria. Secondary objectives: 1. To analyze the correlation of aggregation with low concentrations of inductors with the expression of P-selectin on the non stimulated platelets in the group of breast cancer patients treated with endocrine therapy and in the group of healthy volunteers. 2. To compare the expression of P-selectin on the non stimulated platelets in the group of breast cancer patients treated with endocrine therapy with the P-selectin expression in the group of healthy volunteers. 3. To analyze the correlation between platelet aggregation with low concentrations of inductors and levels of selected markers of iron metabolism (serum iron, transferrin saturation and serum ferritin). Subjects: 40 breast cancer patients treated with endocrine therapy. Methods: The blood samples were taken after 10 days period of avoiding drugs with anti-platelet effect (including anti platelet drugs and non-steroid anti inflammatory drugs), gingo biloba, herbal tea and fish. The aggregation was examined by light transmission aggregometry using low concentrations of ADP (2.5, 1.0 and 0.5 μmol/l) and epinephrine (10.0, 1.0 and 0.5 μmol/l). The expression of P-selectin on platelets was determined by flow cytometry using the antibody anti CD62p-PE. The software Statistica CZ was used for statistical evaluation of results; The chi square test was used 8

9 to evaluate differences of nominal variables distribution; the Shapiro-Wilk test was used for the evaluation of distribution normality of quantitative variables, and the T- test and Mann-Whitney test were used to evaluate the differences in means of quantitative variables. The correlation matrix was used to investigate the dependence of multiple quantitative variables. Results: The laboratory criteria for sticky platelet syndrome were fulfilled in 86.6 % of healthy volunteers and in 62.5 % of patients; the difference was statistically significant (p=0.0245). The hyperaggregability with at least 2 concentrations of ADP was found in 46.7 % and 17.5 % of healthy volunteers and patients, respectively; the difference was statistically significant (P=0.0084). The hyperaggregability with at least 2 concentrations of epinephrine was found in 80.0 % and 60.0 % of healthy volunteers and patients, respectively; the difference was not statistically significant. The mean values of platelet aggregation were higher in the group of healthy volunteers than in the group of patients using ADP 2.5 μmol/l (p = ), ADP 1.0 μmol/l (p = ) and epinephrine 1.0 μmol/l (p = ). The correlation between the expression of P-selectin on the non-stimulated platelets and aggregation was significant using ADP 0.5 μmol/l (p = ), and no correlation was found using ADP 2.5 μmol/l, ADP 1 µmol/l and all concentrations of epinephrine in the group of patients. No correlation between the expression of P-selectin on the non-stimulated platelets and aggregation using all concentrations of ADP and epinephrine was found in the group of healthy volunteers. The mean P-selectin expression on platelets was higher in patients than in healthy volunteers (p = ). Moderate and contradictory correlations between platelet aggregation and markers of iron metabolism were found. The correlations between serum iron and platelet aggregation using ADP 2.5 μmol/l (r = , p = ), ADP 0.5 μmol/l (r = , p = ), between transferrin saturation and platelet aggregation using ADP 2.5 μmol/l (r = , p = ), ADP 0.5 μmol/l (r = , p = ) and between serum ferritin and platelet aggregation using ADP 0.5 μmol/l (r = , p = ) were found in the group of patients; the correlation between serum iron and platelet aggregation using ADP 1.0 μmol/l (r = , p = ) and between transferrin saturation and 9

10 platelet aggregation using ADP 1.0 μmol/l (r = , p = ) were found in the group of healthy volunteers. Conclusions: Hyperaggregability using at least two low concentrations of ADP and/or epinephrine was found in lower proportion of patients than of healthy volunteers and the same difference was found using at least two low concentrations of ADP. The proportion of hyperaggregability using at least two low concentrations of ADP and/or epinephrine is high in middle aged and older women; the usage of criteria obtained by the examination of younger volunteers are thus not feasible for these women. Higher P-selectin expression on platelets was found in the group of patients than in the group of healthy volunteers. No strong correlation between selected iron metabolism parameters and platelet aggregation using low concentrations of ADP and epinephrine was found. 10

11 3. POUŽITÉ ZKRATKY ADP APC ASA ATP β-tg CA Ca 2+ CLL DIK DVT EPCR EPI FSC Adenosindifosfát Aktivovaný protein C Acetylsalicylová kyselina Adenosintrifosfát Beta-tromboglobulin Karcinom Vápenaté ionty Chronická lymfatická leukemie Diseminovaná intravaskulární koagulace Deep vein thrombosis - Hluboká žilní trombóza Endoeliální receptor pro protein C Epinefrin - adrenalin Forward scatter - Rozptyl v přímém směru GAS6 Growth-arrest specific protein 6 GP LTA MM Glykoprotein Light Transmission Aggregometry - Optická agregometrie Multiple myeloma - Mnohočetný myelom NF-κB Nukleární faktor kappa B PAF Faktor aktivující destičky PAI-1 Inhibitor aktivátoru plazminogenu PDF PE Fibrin degradační produkty Pulmonary embolism - Plicní embolie PF4 Platelet factor 4 Destičkový faktor 4 11

12 PGI2 PLT PPP PRP SPS SSC TAFI TEN TFPI TM TPA TXA2 u-pa vwf WBA Prostacyklin I2 Platelet Trombocyt Platelet poor plazma - Plazma chudá na trombocyty Platelet rich plazma - Plazma bohatá na trombocyty Sticky platelet syndrome - Syndrom lepivých destiček Side scatter - Boční rozptyl Trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy Tromboembolická nemoc Inhibitor cesty tkáňového faktoru trombomodulin Tkáňový aktivátor plazminogenu Tromboxan A2 Urokináza Von Willebrandův faktor Whole Blood Aggregometry - Impedanční agregometrie 12

13 4. ÚVOD Syndrom lepivých destiček je popsán jako trombofilní stav, charakterizovaný zvýšenou in vitro agregabilitou s nízkými koncentracemi epinefrinu a/nebo adenosindifosfátu (ADP). Klinicky se projevuje trombózou v tepenném i žilním řečišti a těhotenskými komplikacemi. Vzhledem k velké pracnosti vyšetření, které zatím nelze plně automatizovat, a k velké ovlivnitelnosti trombocytů v preanalytické fázi je literatura o tomto trombofilním stavu v porovnání s jinými trombofiliemi velmi chudá. U syndromu lepivých destiček byla zjištěna autozomálně dominantní dědičnost s neúplnou laboratorní i klinickou expresí. Etiologie tohoto syndromu není dosud plně objasněna. Předpokládá se výskyt abnormálních glykoproteinových receptorů na povrchu membrány trombocytů. Jejich polymorfizmus zřejmě vede k hyperagregabilitě trombocytů. Výskyt trombózy u pacientů se zhoubnými nádory je významně vyšší oproti populaci bez nádorového onemocnění. Byla popsána řada jevů, které do určité míry náchylnost pacientů s nádory ke vzniku trombózy vysvětlují, jako například zvýšená koncentrace faktoru VIII, zvýšená exprese tkáňového faktoru na monocytech a konečně i sekrece tkáňového faktoru samotnými nádorovými buňkami. Také některé formy protinádorové léčby zvyšují riziko trombózy, např. hormonální léčba či chemoterapie. V dostupné literatuře nebylo zatím zjištěno, zda pacientky s karcinomem prsu léčeným endokrinní terapií mají zvýšenou agregabilitu trombocytů s nízkými koncentracemi epinefrinu a adenosindifosfátu. 13

14 5. ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE - CÍL PRÁCE Primárním cílem této práce je zjistit, jaký je výskyt zvýšené agregability trombocytů s nízkými koncentracemi ADP a adrenalinu u pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní terapií a zda agregabilita trombocytů s nízkými koncentracemi ADP a adrenalinu u pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou je jiná než u zdravých dobrovolníků. Sekundárními cíli je zjistit, zda agregabilita trombocytů s nízkými koncentracemi ADP a adrenalinu u pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou a u kontrolního souboru zdravých dobrovolnic koreluje s expresí P-selektinu na nestimulovaných trombocytech. Dále zjistit, zda exprese P-selektinu na trombocytech u pacientek s karcinomem prsu léčených hormonální léčbou je odlišná od exprese P- selektinu na trombocytech zdravých dobrovolnic. A posledním cílem je zjistit, zda agregabilita trombocytů koreluje s parametry metabolismu železa. 14

15 6. TEORETICKÁ ČÁST 6.1 Hemostáza Hemostáza je za fyziologických podmínek komplexní proces, který na jedné straně udržuje krev v tekutém stavu a na druhé straně dokáže zastavit krvácení po poranění cévy tvorbou krevní sraženiny. Jedná se o složitý mechanismus, který je regulován celou řadou pozitivních i negativních zpětných vazeb. Tato přesná regulace umožňuje zastavit krvácení pouze v místě poranění, aniž by došlo k ucpání cév krevní sraženinou. Při narušení rovnováhy procesu může dojít k vychýlení k jedné či druhé straně. Následkem toho pak může snadno dojít při snížené srážlivosti krve k patologickému krvácení nebo naopak při zvýšené srážlivosti k trombózám. Na udržení správné funkce hemostázy se podílí především cévní stěna, složka tkáňová a trombocyty (primární hemostáza), plazmatické koagulační faktory a jejich inhibitory (hemokoagulace) a fibrinolytický systém. (1-3) Cévní stěna Cévní stěna společně s endotelem hraje v hemostáze důležitou roli. Cévní stěna se účastní hemostázy několika způsoby, a to schopností vazokonstrikce (při níž dochází ke stažení cévy), déle je místem interakcí jednotlivých složek všech systémů hemostázy a v neposlední řadě je zdrojem a zásobárnou některých faktorů, inhibitorů a dalších látek. Cévní (endoteliální) výstelka je tvořena jednou vrstvou buněk, které jsou spojeny polysacharidovou extracelulární matrix a jsou od subendoteliálního prostoru oddělené bazální membránou. Pod bazální membránou se nachází extracelulární matrix, kolagenní vlákna a buňky - především fibroblasty a hladké svalové buňky. Endotelové buňky vytváří bariéru mezi krví a tkáněmi, zajišťují nesmáčivý negativně nabitý povrch cév. Intaktní endoteliální buňky na svém povrchu exprimují trombomodulin (TM) a řadu receptorů (například pro endoteliální receptor pro protein C - EPCR), a napomáhají tak lokální aktivaci systému proteinu C. Syntetizují von Wilebrandův faktor (vwf) a uvolňují ho do subendoteliálního prostoru i do cirkulace. Produkcí vasodilatačních působků oxidu dusného a prostacyklinu ovlivňují tonus cév. (1,4) 15

16 Endoteliální buňky také produkují tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA) a inhibitor aktivárotu plazminogenu (PAI-1) a účastní se tak regulace fibrinolýzy. (1,4) Z poraněné tkáně a okolních buněk se uvolňuje zejména adenosindifosfát (ADP), který vyvolává primární agregaci trombocytů, a dále tkáňový faktor, aktivující koagulační kaskádu a vedoucí k přeměně protrombinu na trombin. (1) Trombocyty Trombocyty jsou bezjaderná tělíska, jejichž tvorba probíhá v kostní dřeni uvolňováním z megakaryocytů. Megakaryocyty naléhají na krevní kapiláry a skrze jejich membránu se krevní destičky, fragmenty cytoplazmy megakaryocytů, dostávají do krevního oběhu. Životnost trombocytů v periferní krvi je přibližně 9 dní a jejich průměrný počet bývá v rozmezí od 150 do 400x10 9 /l. Pro zjednodušení složité struktury trombocytů lze jejich anatomické znaky rozdělit do tří hlavních oblastí, a to na periferní oblast, oblast solubilního gelu a oblast organel. Anatomické rozdělení trombocytů do tří funkčních oblastí je arbitrární. Nicméně, to rámcově vystihuje strukturu trombocytů, která se týká funkce a stejně tak patologie. (1,3,4,6,7) Obrázek 1: Ultrastruktura trombocytu. (8) (Upraveno dle MUNKER, R., et al.: Modern Hematology, 2006.) 16

17 Periferní oblast můžeme dělit opět do několika oblastí. Nejvrchnější oblast tvoří glykokalyx, který je tvořen z glykolipidů, povrchově adhezivních glykoproteinových (GP) receptorů GP IIb/IIIa a GP Ia/IIa, selektinů, dále receptorů pro aktivátory trombocytů, například trombin, kolagen, ADP, epinefrin a receptorů pro agregační inhibitory prostacykliny a prostaglandiny. Další oblastí je membrána, která se skládá z dvojité vrstvy lipidů s asymetrickým uložením fosfolipidů a cholesterolu. Trombocyty mají v klidovém stavu negativně nabité fosfolipidy (fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinozitol) uloženy ve vnitřní části membrány. Po aktivaci trombocytu mohou fosfolipidy difundovat podél lipidické dvojvrstvy, a také dochází k přetočení této dvojvrstvy (flip-flop fenomén), čímž dojde k přehození vnitřní a vnější části membrány. Součástí membrány je i otevřený kanálkový systém, který je tvořen početnými zvlněnými vychlípeninami membrány, které zasahují až do nitra buňky. Kanálky jsou navzájem propojeny, urychluje se tak membránový transport a zvětšuje se povrch trombocytu a slouží i k vyplavení granulí na povrch buňky. (1,3,6,7) Oblast solubilního gelu se sestává z obvodového pásu mikrotubulů, submembránových filamentů, mikrotubulů a proteinových podjednotek. Celkově tyto struktury tvoří základní jednotku kontraktilního systému trombocytu (cytoskelet). Tento systém udržuje diskoidní tvar trombocytu a podílí se na změně tvaru, tvorbě pseudopodií, vnitřní kontrakci a sekreci. Největší část filament tvoří monomer aktin, který po aktivaci destičky polymeruje. K dalším proteinům mikrofilamentární struktury trombocytů patří hexamer myozin. Komplex myozinu s aktinem vede při aktivaci destičky ke kontrakci mikrofilament a tím ke změně tvaru na kulovitý. Zároveň dochází k vytvoření pseudopodií. Mezi další proteiny mikrofilamentozní sítě patří spektrin, tropomyozin, kaldesmon, talin a α-aktinin. Základní stavební jednotkou mikrotubulů je tubulin, který je polymerizovaný do tvaru trubiček. Jejich hlavní úlohou je udržení klidového diskoidního tvaru destičky a uchycení zanořené části transmembránových receptorů. Při aktivaci destičky se mikrotubuly podílejí na přesunu sekrečních granul do blízkosti otevřeného kanálkového systému a na následné sekreci jejich obsahu. (1,3,6,7) Oblast organel se skládá z granulí, denzních těles, peroxizómů, lysozómů, glykozómů, a mitochondrií, které jsou v neaktivovaném stavu náhodně rozptýlené v cytoplazmě. Slouží k metabolickým procesům a pro skladování enzymů, serotoninu, různých 17

18 proteinových složek a vápníku určených k sekreci. Denzní tělíska obsahují ADP, adenosintrifosfát (ATP), serotonin (z extracelulárního prostoru) a vápenaté ionty (Ca 2+ ). Alfa granula obsahují proteiny tvořené při vývoji megakaryocytu: vwf, destičkový faktor 4 (PF4), beta-tromboglobulin (β-tg); proteiny absorbované z plazmy pomocí endocytózy: imunoglobuliny IgG a IgA, fibrinogen, albumin. Obsah lysozómů je tvořen hydrolytickými enzymy (kyselá fosfatáza, β-glukuronidáza a arylsulfatáza). Tyto enzymy jsou uplatňovány při aktivaci destiček při kontaktu s cévní stěnou. Peroxizómy obsahují enzym glutationperoxidázu. Mitochondrie tvoří energetický aparát trombocytu. Energii pro činnost buňky získávají oxidativní fosforylací. Probíhá v nich tvorba některých destičkových proteinů. Denzní tubulární systém je membránový systém, odvozený od endoplazmatického retikula megakaryocytů, neobsahuje však ribozómy. Vytváří souvislou síť úzkých kanálků a místy je spojen s otevřeným kanálkovým systémem. Obsahuje enzymy cyklu kyseliny arachidonové: ATP-ázu a cyklooxygenázu, které jsou potřebné k tvorbě prostaglandinů, tromboxanu A2 (TXA2) a některých bílkovin. Je hlavní zásobárnou vápenatých iontů. (1,3,6,7) Koagulační faktory Plazmatický koagulační systém představuje skupinu dějů, jejichž výsledkem je přeměna rozpustné bílkoviny fibrinogenu na nerozpustný fibrin. Koagulační faktory představují skupinu plazmatických proteinů. Většina z nich (vyjma faktoru II a faktoru I) cirkuluje v plazmě ve velmi nízkých koncentracích. Kromě tkáňového faktoru vázaného na buněčnou membránu vyžadují ostatní plazmatické koagulační faktory aktivační krok, při kterém z původního proenzymu vzniká koagulačně aktivní enzym. Většina koagulačních činitelů se tvoří v játrech, některé potřebují k posttranslační aktivaci z neaktivních prekursorů vitamín K. Hemokoagulační děj probíhá na povrchu aktivovaných trombocytů a subendotelu. K vazbě koagulačních faktorů na negativně nabitý povrch trombocytů je zapotřebí Ca 2+. Po spuštění hemokoagulačního systému dochází k postupnému sledu reakcí, tzv. koagulační kaskádě. Neaktivní formy koagulačních faktorů (proenzymy) jsou postupně štěpeny na aktivní formu. Aktivní forma enzymu - produkt předcházející reakce, štěpí neaktivní proenzym v reakci následující. Podle způsobu aktivace se hemokoagulační 18

19 kaskáda dělí na tzv. vnitřní a vnější cestu. Obě cesty jsou propojeny aktivací faktoru IX komplexem aktivovaného faktoru VII a tkáňového faktoru a sbíhají se při štěpení faktoru X na Xa. Nakonec dochází k vytvoření trombinu, který štěpí fibrinogen na monomery, které polymerizují za vzniku fibrinové sítě. Vlivem působení faktoru XIIIa vzniká nerozpustný fibrin. (1,3,8) Obrázek 2: Schéma koagulační kaskády. (8) (Upraveno dle MUNKER, R., et al.: Modern Hematology, 2006.) Inhibitory krevního srážení jsou základním regulačním mechanismem koagulace. Po proběhnutí celé koagulační kaskády se docílí značného zesílení prvotního aktivačního impulsu. Tento sled reakcí by mohl vést v krátké době k masivnímu srážení krve a ucpání cévy. Udržení dynamické rovnováhy je základním principem procesů krevního srážení. Podílí se na něm celá řada mechanismů a při jeho regulaci mají nejvýznamnější účinek fyziologické inhibitory koagulačního a fibrinolytického systému. Inhibitory krevního srážení inhibují aktivní složky hemostatického procesu 19

20 proteolytické enzymy. Z fyziologických inhibitorů krevního srážení se v plazmatickém koagulačním systému nejvíce uplatňují antitrombin a systém proteinu C. Antitrombin vyvazuje trombin a aktivovaný faktor X za vzniku komplexu, který je odbouráván v mononukleáro-fagocytárním systému. Rychlost vzniku tohoto komplexu může být mnohonásobně zvýšena navázáním heparinu nebo proteoglykanů. Regulace syntézy antitrombinu je propojena s regulací syntézy fibrinogenu. Při štěpení fibrinogenu na fibrin dochází ke zvýšení syntézy fibrinogenu a zároveň ke zvýšení syntézy antitrombinu. Systém proteinu C je tvořen proteinem C (PC), proteinem S (PS) a trombomodulinem (TM). Protein C je syntetizován dominantně v játrech. Protein S je obsažen v endotelu, v plazmě je zčásti vázán na C4b binding protein, přičemž aktivní je jen volný protein S. Trombomodulin je neustále přítomen na povrchu endotelu. Aktivace proteinu C na aktivovaný protein C (APC) probíhá na povrchu endotelií po vazbě na EPCR působením trombinu navázaného na TM. Trombin po vazbě na TM již není schopen prokoagulační aktivity. APC společně s PS inaktivuje faktor VIIIa a faktor Va a blokuje tak tvorbu dalšího trombinu. U pacientů s Leidenskou mutací je faktor Va rezistentní vůči této inaktivaci APC a tak jsou nosiči této mutace náchylnější ke vzniku trombózy. Dalšími inhibitory koagulace jsou například inhibitor cesty tkáňového faktoru, heparin kofaktor II, protein Z, α 2 -makroglobulin a α 1 -antitrypsin. (1,3) Fibrinolytický systém Za fyziologických podmínek fybrinolytický systém udržuje hemostatickou rovnováhu. Fibrinové koagulum výrazně omezuje krevní tok a mohlo by dojít až k úplnému uzavření cévy. Proto je důležité, aby došlo k úplnému zprůchodnění cévy a ke znovuobnovení hladkého průtoku krve. Toto se děje za pomoci fibrinolýzy. Centrální složkou fibrinolytického systému je plazminogen, který je aktivován celou řadou aktivátorů, z nichž hlavní roli hraje tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA) a urokináza (u-pa). Tkáňový aktivátor plazminogenu, který je uvolňován z aktivovaných či poškozených endotelií, aktivuje fibrinolýzu tím způsobem, že aktivuje přeměnu plazminogenu na plazmin. Společná vazba plazminogenu a TPA na fibrin tento proces výrazně urychluje. Plazmin proteolyticky štěpí fibrin a následkem toho vznikají fragmenty, souhrnně označované jako fibrin degradační produkty (FDP). V situaci nadměrné aktivace fibrinolýzy štěpí volný plazmin i fibrinogen za vzniku fibrinogen 20

21 degradačních produktů. Diagnosticky významné jsou tzv. D-dimery - nejmenší štěpné produkty nerozpustného fibrinu. Aktivace plazminogenu prostřednictvím u-pa je druhým mechanismem aktivace fibrinolýzy. Díky faktoru XII, kalikreinu a plazminu přechází prourokináza na aktivní formu urokinázu, která také aktivuje plazminogen na plazmin. (1,3,48,49) Obrázek 3: Fibrinolytický systém se složkami aktivace a inhibice. (8) (Upraveno dle MUNKER, R., et al.: Modern Hematology, 2006.) Podobně jako koagulační systém má i ten fibrinolytický své inhibitory, které za fyziologických podmínek zajišťují lokalizaci a utlumení fibrinolytických dějů a zabraňují jejich šíření do okolí. Mezi hlavní přirozené inhibitory se řadí inhibitor aktivátoru plazminogenu (PAI), α 2 -antiplazmin a trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy (TAFI). α 2 -antiplazmin vyvazuje volný plazmin přítomný v plazmě. Pokud je plazmin navázaný na fibrin, tak je před účinkem α 2 -antiplazminu chráněn. TAFI představuje proenzym, který po aktivaci trombinem, plazminem či trypsinem štěpí specifická vazebná místa fibrinových vláken a brání tak vazbě tpa a plazminogenu na fibrin. (1,3,48,49) 21

22 Fibrinolytický systém má kromě důležité role v regulaci fluidokoagulační rovnováhy řadu dalších rolí. Podstatnou úlohu hraje při degradaci kolagenu, v angiogenezi a remodelaci cév, modulaci imunitní odpovědi a u metastáz maligních nádorů. (1,48) 6.2 Úloha trombocytů v primární hemostáze Trombocyty jsou nejmenší z krevních elementů. Jsou to jen fragmenty cytoplazmy megakaryocytů, a přesto mají rozhodující roli v primární hemostáze a jsou důležití přispěvovatelé při trombotických poruchách. Pochopení role trombocytů při srážení krve a vymezení poruch, vyvolaných abnormální funkcí trombocytů, je velmi důležité pro terapii trombotických onemocnění. (6) Neaktivní trombocyty cirkulují volně cévním řečištěm a mají oválný diskoidní tvar. Na normální (nenarušenou, nezměněnou) endotelovou výstelku cévní stěny trombocyty nereagují. Pokud dojde k jejímu narušení, je okamžitě zahájen proces tvorby primární hemostatické zátky. Tento proces může být rozdělen do několika stupňů, které jsou velmi úzce provázány: adheze trombocytů, změna tvaru, uvolňující reakce a agregace trombocytů. (1,4,8) Adheze Adheze destiček je prvním krokem v hemostatické odpovědi, a proto je znalost mechanismů adheze trombocytů důležitá pro vývoj selektivních antitrombotik. Adhezní proteiny odpovědné za optimální adhezi trombocytů jsou odlišné od adhezivních proteinů podílejících se na adhezi jiných buněk. Adheze trombocytů má několik jedinečných funkcí. Trombocyty adherují v proudící krvi, což znamená, že tento proces musí být velice rychlý a interakce musí být dostatečně pevné, aby odolávaly třecí síle proudící krve. (7) Před první interakcí trombocytů s poškozenou cévní stěnou, se vwf z plazmy váže na exponovaný kolagen přítomný v cévní stěně. Navázání trombocytů probíhá prostřednictvím interakce trombocytárního receptorového komplexu GPIb/V/IX s imobilizovaným vwf na kolagenu cévní stěny. Adheze trombocytů na subendotel se účastní kromě komplexu GPIb/V/IX nejméně čtyři další receptory: kolagenové receptory α2β1 a GPVI, α5β1 fibronectinový receptor a αiibβ3 receptory fibrinogenu 22

23 (GPIIb/IIIa). Dále dochází k pevnému přilehnutí trombocytů, což je nezbytné proto, aby odolaly třecí síle vyvolané proudící krví. Trombocyty adherované na poškozenou cévní stěnu jsou novým povrchem pro adhezi dalších trombocytů, a jsou základem trombocytárního agregátu. Adheze trombocytů je indukována malým množstvím ADP, který pochází z okolní perivaskulární tkáně. Míra adheze je dále ovlivněna počtem destiček, množstvím a viskozitou krve, velikostí a tvarem cév. (1,3,4,7,8,9) Změna tvaru a uvolňující reakce Současně s adhezí dochází ke změně tvaru trombocytu a společně s aktivací receptorů GP povahy se spustí kaskáda biochemických pochodů, při nichž dojde k aktivaci trombocytu. Proces aktivace je provázen uvolněním silně působících proagregačních působků (ADP, TXA2, trombinu a faktoru aktivujícího destičky - PAF) z endoteliálních buněk, polymorfonukleárů nebo z monocytů. Ke změně tvaru trombocytu dojde z důvodu přeskupení cytoskeletu a centralizaci organel. Při změně tvaru dochází k přesunu fosfolipidů s negativním nábojem (fosfatidyliserin, fosfatidylinositol) z vnitřní do vnější vrstvy cytoplazmatické membrány. Tento přesmyk, spojený se změnou náboje povrchových vrstev, se nazývá flip-flop fenomén. Výsledkem je během několika sekund změna diskoidního tvaru destičky na kulovitý a vytvoření pseudopodií, čímž dochází až k desetinásobnému zvětšení povrchu krevní destičky. Dále dochází k uvolnění obsahu denzních granul (ADP a ATP), alfa granul (fibrinogenu, fibronektinu a vwf) a k expozici receptorů pro fibrinogen a fibronektin na povrchu trombocytu. Nakonec dojde k uvolnění kyseliny arachidonové, která je metabolizována enzymem cyklooxygenázou na TXA2, což je významný stimulátor agregace trombocytů. (1,3,4,7,8,10,11) Agregace Samotná agregace vzniká vytvořením můstků vazbou přes fibrinogen mezi receptory GPIIb/IIIa dvou sousedních trombocytů. Trombocyty jsou spojeny mezi sebou pouze prostřednictvím receptorů na svých výběžcích. Receptory GPIIb/IIIa se v tuto chvíli na povrchu vyskytují jen v malém počtu, proto i spojení krevních destiček je pouze částečné. Nejdůležitějšími agregačními induktory jsou kolagen z cévní stěny, ADP z erytrocytů nebo uvolněný ze samotných trombocytů, TXA2 tvořený stimulovanými 23

24 trombocyty a trombin. Epinefrin sám nezpůsobuje shlukování trombocytů, ale zato silně zvyšuje agregaci stimulovanou jinými agonisty. Proagregační stimuly působí ve vzájemné synergii, což vede k mnohem většímu účinku induktorů. Při uvolňující reakci se z alfa granul secernuje trombospodin, který se podílí na stabilizaci fibrinogenových můstků. Na povrchu trombocytu dojde k expresi mnohem většího počtu receptorů GPIIb/IIIa. Trombocyty se vzájemně spojí mnohem těsněji, čímž dojde k ireverzibilní sekundární agregaci a následně se vytvoří bílý trombus primární hemostatická zátka. Agregace fyziologicky následuje po adhezi, ale lze ji i snadno vyvolat in vitro přímým působením induktorů, například ADP, kyselinou arachidonovou, epinefrinem, kolagenem, trombinem nebo TXA2. Zvýšená agregabilita destiček při několikanásobném ředění indukrotů ADP a epinefrinu bývá popisována při syndromu (1,3, 4,7,10) lepivých destiček. 6.3 Syndrom lepivých destiček Syndrom lepivých destiček (Sticky platelet syndrome SPS) poprvé popsal Holiday a spol. v roce 1983, ale po dlouhou dobu to byla jen teoretická koncepce. Jedná se dědičnou trombocytopatii s častým výskytem arteriálních a žilních trombóz a spontánních abortů u pacientů bez zjevných rizikových faktorů pro trombotická onemocnění. SPS je definován jako hyperagregabilita trombocytů po stimulaci trombocytů velmi nízkými koncentracemi induktorů - ADP a epinefrinu (EPI), zatímco odpověď trombocytů na jiné induktory je fyziologická. (5,13,16,20) Jsou definovány tři typy SPS a to podle toho, který z trombocytárních induktorů vyvolá zvýšenou agregaci krevních destiček. Nejčastěji se vyskytuje SPS II. typu (hyperagregabilita po samotném EPI), následuje SPS I. typu (hyperagregabilita po EPI i ADP), zatímco SPS III. typu (hyperagregabilita po samotném ADP) je vzácný. Ve studii provedené Kubiszem et al. byl SPS I. typu zjištěn u 30 %, SPS II. typu u 69 % a SPS III. typu u 1 % testované populace. Je důležité zdůraznit, že tato klasifikace je založena na laboratorních testech a nesouvisí s klinickými projevy, prognózou či terapií. (14,16,20) 24

25 Tabulka 1: Přehled zastoupení jednotlivých typů SPS ve vybraných studiích v posledních deseti letech. (14) Vybrané studie Počet pacientů (n) Populace (n) Prevalence SPS dle typů M Ž I. II. III. Kubisz et al (2006) % 67 % 11 % Ruiz-Argüelles et al (2012) % 6 % 29 % Kubisz et al (2010) % 71 % 2 % Kutulicova et al (2012) % 70 % 1 % Sokol et al (2012) % 74 % - Kubisz et al (2012) % 73 % 3 % Kubisz et al (2013) % - (Upraveno dle SANTIMONE I, GEMMATI D: Sticky Platelet Syndrome and the Role of Glycoprotein Receptors, 2013.) Etiopatogeneze SPS SPS se zdá být poměrně častou chorobou. Po rezistenci na aktivovaný protein C se považuje za druhý nejčastější vrozený trombofilní stav v populaci. Podle Bicka zapříčiňuje přibližně 13 % jinak nevysvětlitelných žilních trombóz. V souvislosti s arteriální trombózou jde o nejčastější trombofilii. Představuje přibližně 21 % ze všech nevysvětlitelných arteriálních trombóz. (5,14,16,18) SPS má autozomálně dominantní způsob dědičnosti. Obvykle jeden rodič je nositelem této choroby. Jsou popisovány i případy rodin, kde jsou postiženy i tři generace. SPS se u pacienta nemusí nijak klinicky projevit, jedná se daleko více o vrozenou dispozici k trombózám, nežli o její přímou příčinu. Když už se trombotické epizody objeví, vyskytují se v jakémkoliv věku, avšak zvláště postihují dospělé mezi lety. Byl popsán i případ 5-letého dítěte, u kterého se syndrom projevil ve formě trombózy. (5,14,16,20) Přesná příčina SPS není dodnes známa. V mnohých pracích bylo zjištěno, že trombózy při SPS vznikají i v normálních arteriích bez známek aterosklerotického eventuálně 25

26 i jiného organického postižení cévy. V současné době se uvažuje, že v patogenezi SPS by mohlo jít o defekt jednoho anebo více povrchových receptorů glykoproteinové povahy, který vede k jejich zvýšené citlivosti na trombocytární induktory a následně k abnormálně zvýšené agregabilitě trombocytů. (13,14,23) Jedním ze zkoumaných receptorů je heterodimerní trombocytární povrchový receptor GPIIb/IIIa, skládající se z αiib (CD41) a β3 (CD61) podjednotek. Tento receptor slouží jako receptor pro fibrinogen a hraje důležitou roli v agregaci trombocytů. Gen receptoru GPIIb/IIIa je vysoce polymorfní. Jeden z polymorfismu GPIIIa PLA1/A2 má vliv na signalizaci GPIIb/IIIa, což má za následek zvýšenou citlivost receptorů pro ADP, a to následně vede k hyperagregabilitě trombocytů i při podprahových koncentracích ADP a epinefrinu. Klinicky polymorfizmus GPIIIa může znamenat zvýšené riziko arteriálních trombóz a infarktů myokardu. (13,14,23) Dalším receptorem je receptor pro kolagen GPIa/IIa (CD29/49b), který zprostředkovává adhezi trombocytů na kolagen I. typu. Díky polymorfismu C807T dochází k defektu receptoru GPIa/IIa, který způsobí zvýšenou expresi tohoto receptoru a tím pádem i zvýšenou adhezivitu destiček. (3,13) Dále se v poslední době objevují práce zabývající se významem GAS-6 proteinu v patogenezi SPS. Protein GAS-6 je produkt GAS-6 genu (growth-arrest specific gene 6). Gas-6 protein je obsažen v α-granulech a náleží k proteinům vitamin K dependentním. Jeho struktura je vysoce homologní ke struktuře přirozeného inhibitoru proteinu S. Gas-6 protein se zdá se být odpovědným za formování trombu. Na základě provedených pokusů na myších, s přeneseným Gas-6, byla prokázána zvýšená agregabilita trombocytů i při nízkých koncentracích ADP a epinefrinu. U druhé skupiny pokusných myší Gas-6 deficientních sice není snížena schopnost agregability, nicméně ale brání následné stabilizaci trombocytárních agregátů a částečně redukuje sekreci destičkových granul. U myši s deficitem Gas-6 nebylo prokázáno spontánní krvácení, zdá se proto, že by vyvolaná inhibice Gas-6 mohla mít uplatnění v antitrombotické léčbě. (13,14,21) Velmi důležitým ukazatelem aktivace trombocytů je P-selektin (CD62). Tento transmembránový glykoprotein se nachází v alfa-granulech trombocytů a ve Weibel- Paladeho tělískách endotelových buněk. K aktivaci trombocytů dochází při kontaktu 26

27 s mnoha fyziologickými agonisty, např. ADP, EPI, kolagenem či trombinem. Bylo prokázáno, že zvýšená hladina P-selektinu je rizikovým faktorem pro infarkt myokardu a žilní tromboembolismus. P-selektin dále zprostředkovává i rolování leukocytů po povrchu aktivovaného endotelu a jejich extravazaci, čímž se účastní obranného mechanismu organismu při zánětlivé reakci, tudíž jeho exprese může být užitečným markerem infekce. (5,24,25) Nicméně, přímý vztah SPS s těmito polymorfizmy se stále nepodařilo jednoznačně prokázat a jsou nutné další studie Klinické projevy Trombofilie je vrozená nebo získaná porucha hemostatického mechanismu, která je příčinou zvýšené tendence k trombóze. Trombóza (krevní sraženina v cévním řečišti nebo srdečních dutinách) vzniká v situaci převahy aktivace krevního srážení nad kapacitou inhibitorů koagulace a fibrinolytického systému nebo v místech nepřítomnosti proudění krve. Aktivace krevního srážení má častěji získanou příčinu spojenou s poraněním cévy nebo endoteliální dysfunkcí (trauma, operace, imobilizace končetiny, těhotenství, porod, infekce apod.), i když existují i vrozené dispozice ke zvýšené aktivaci krevního srážení. Je známá celá řada faktorů, které se u jedinců s trombózou vyskytují častěji, a proto je nazýváme rizikové. Mezi obecné rizikové faktory trombózy patří věk nad 45 let, obezita, operace, imobilizace, úraz, cestování, těhotenství, šestinedělí a hormonální terapie. Každý tento faktor zvyšuje riziko o 4-18 %. (26,27,28) V případě SPS se za významný vyvolávající faktor považuje závažný stres, pravděpodobně v důsledku zvýšené koncentrace adrenalinu. U pacientů se vyskytují jak tepenné, tak i žilní trombózy, přitom tepenné se zdají být častější. Typické jsou angina pectoris, infarkt myokardu, náhlá cévní mozková příhoda, idiopatická trombotická neuropatie, hluboká žilní trombóza, syndrom ztráty plodu a trombóza periferních tepen. Charakteristická je progrese nebo opakovaný výskyt žilních trombóz i při adekvátní antikoagulační léčbě. (13) 27

28 Žilní trombózou z nevysvětlených příčin se zabývá turecká studie, které se zúčastnilo 28 pacientů. U šesti pacientů byl diagnostikován SPS, z toho 3 byli klasifikováni jako typ II, 2 jako typ I a jeden jako třetí typ SPS. U dalších 6 pacientů bylo pouze podezření na SPS, protože z důvodu odmítnutí dalšího testování nebylo potvrzení SPS možné. Dalším důležitým zjištěním této studie je, že mezi pacienty s potvrzenou diagnózou SPS, pouze u jednoho pacienta byl SPS jedinou trombofilní abnormalitou. U ostatních 5 pacientů s potvrzeným SPS koexistoval s dalšími koagulačními abnormalitami, a proto zde byl SPS interpretován jako přispívající faktor pro rozvoj trombózy. Další studie, zabývající se nevysvětlitelnými žilními trombózami, proběhla v Mexiku a zúčastnilo se jí 46 pacientů. Zde uvádějí výskyt SPS dokonce 48 %. Z toho vyplývá, že výskyt SPS u osob s trombózou se mění se zastoupením studované populace a lokalizací postižených cév. (12) Do další studie bylo zahrnuto 41 pacientů po překonaném infarktu myokardu a s anginou pectoris. U všech pacientů byla nalezena hyperagregabilita trombocytů s induktory ADP a EPI. Po zahájení terapie acetylsalicylovou kyselinou (ASA) pouze jeden pacient prodělal fatální infarkt myokardu, ostatní byli již bez klinických projevů. Dále se objevují studie, ve kterých SPS zapříčinil cévní mozkovou příhodu u pacientů v mladém věku. (17,18) SPS může být i příčinou opakujících se spontánních potratů. Uvádí se, že až 55 % všech potratů je způsobeno defekty koagulačních faktorů či trombocytů, které vyvolávají trombotické infarkty placentárních cév. Po antifosfolipidovém syndromu představuje SPS druhý nejčastější trombofilní stav zapříčiňující syndrom ztráty plodu. Tímto tématem se zabývá i studie, které se zúčastnilo 351 žen s opakovanými samovolnými potraty. Již předem byly u pacientek vyloučeny anatomické, hormonální a chromozomální abnormality. Celkem bylo diagnostikováno 364 trombofilních vad u 312 pacientek, tedy u některých pacientek se vyskytovalo i více trombofilních vad najednou. Například antifosfolipidový syndrom byl zjištěn u 60 % pacientek, SPS pak u 20 %. Po nasazení léčby ASA v kombinaci s heparinem se podařilo 94 % z těchto 312 pacientek úspěšně dovést k normálnímu termínu porodu. (13,19) Další studie ukazují, že SPS může být i pravděpodobnou příčinou vzniku trombóz po transplantaci ledvin. Mezi 259 příjemci renálního alotransplantátu byl ve třech 28

29 případech prokázán SPS I. typu. Do této doby byli tito pacienti bez klinických příznaků, ale po podstoupení transplantace ledvin se u nich záhy rozvinula arteriální či venózní trombóza. S největší pravděpodobností tomu bylo proto, že samotná operace je pro pacienta stresová situace, během které dochází k uvolnění induktorů způsobujících hyperagregabilitu trombocytů. Z těchto důvodů autoři studií usuzují, že by testování SPS mělo být zahrnuto do předtransplanatačních vyšetření. (15,22) 6.4 Nádorová onemocnění a trombóza Nádorová onemocnění jsou doprovázena krvácivými i trombotickými komplikacemi. Trombotické komplikace pak mohou zásadním způsobem ovlivnit kvalitu života pacientů a mohou vést až k jejich úmrtí. Příčiny změn hemostatické rovnováhy jsou různorodé a vyplývají z povahy nádorového onemocnění, odezvy imunitního systému, změn provázejících komplikace nádorových onemocnění a z faktorů, které provází jejich agresivní léčbu. Změny hemostázy v průběhu nádorových onemocnění jsou známy a sledovány již více než sto let. (29) Klinické projevy trombózy u nádorových onemocnění jsou různé, od tromboembolické nemoci (TEN) až po diseminovanou intravaskulární koagulaci (DIK). TEN se u pacientů s nádorovým onemocněním může projevovat širokou škálou klinicky významných trombotických komplikací, jako je hluboká žilní trombóza, plicní embolie, arteriální trombóza, povrchová tromboflebitida a jaterní žilní okluze. (30) TEN na jedné straně může signalizovat dosud nepoznanou malignitu, na druhé straně často provází a komplikuje malignitu již rozpoznanou. Bylo prokázáno, že riziko TEN je u nádorových chorob vyšší než u nenádorové populace. Uvádí se, že pacienti se zhoubným nádorem mají oproti osobám bez malignity asi sedmkrát vyšší riziko TEN. Dále se ukazuje, že u nemocných s prokázanými nádorovými chorobami se nachází až u 50 % žilní či méně často arteriální tromboembolie. Riziko však není u všech pacientů s malignitou stejné. Největší je u lymfomů, myelomů, nádorů mozku, plic, pankreatu, žaludku, ovaria a ledvin. Výskyt je přímo úměrný délce probíhajícího onemocnění, nejvíce se TEN objevuje v počátečním období po stanovení diagnózy a úmrtnost na TEN je nejvyšší v prvním roce od stanovení diagnózy. V jedné studii popisují, že incidence TEN u pacientů s kolorektálním karcinomem je v průběhu prvních 6 měsíců 29

30 po stanovení diagnózy 5 %, během následných 7-12 měsíců 1,4 % a během měsíců po stanovení diagnózy 0,6 %. (29,30,50,51) V patogenezi TEN u nádorových onemocnění hrají roli rizikové faktory, jako jsou zvýšené koncentrace koagulačních faktorů (faktor VIII, fibrinogen), snížená fibrinolýza, zvýšené počty trombocytů a leukocytů, dlouhodobá imobilizace, prodělané operace, chemoterapie, hormonální terapie či centrální žilní katetry. Patofyziologie vzniku TEN u nádorových onemocnění je komplexní děj a odráží různé mechanismy, které jsou obecně spojené s reakcí hostitele na maligní nádor. Tyto mechanismy zahrnují aktivaci koagulace a fibrinolytického systému, reakci akutní fáze, zánět, nekrózu a produkci cytokinů. Zhoubné buňky mohou přímo aktivovat srážení krve tím, že produkují tkáňový faktor, prokoagulační působky, zánětlivé mediátory a cytokiny. Mnohé studie naznačují, že svojí roli v patogenezi vzniku TEN při nádorovém onemocnění hrají i trombocyty. Trombocyty jsou zdrojem aktivních metabolitů a proteinů, prosazují se v buněčných interakcích a poskytují biologicky aktivní povrch. Dále aktivně zasahují při sepsi, zánětu, regeneraci tkání a podporují přirozenou imunitní odpověď. Bylo prokázáno, že produkty zhoubných buněk způsobují aktivaci trombocytů (Obrázek 4). Na druhé straně aktivované trombocyty uvolňují velké množství růstových faktorů, které podporují růst nádoru a angiogenezi. Následkem toho může docházet k lepšímu uchycení nádoru či jeho šíření. Mezi markery aktivace trombocytů jsou řazeny exprese P-selektinu na trombocytech, hladina v plazmě rozpustného P-selektinu a β-tg. Vysoké koncentrace těchto markerů jsou často spojovány s pokročilým nádorovým onemocněním. Jedna studie uvádí, že riziko TEN bylo 2,6krát vyšší u pacientů s malignitou s vysokou hladinou v plazmě rozpustného P-selektinu v porovnání s pacienty trpícími nádorovým onemocněním s nižší hladinou v plazmě rozpustného P- selektinu. Vzhledem k tomu, že P-selektin není specifický jen pro trombocyty, zvýšené plazmatické hladiny rozpustného P-selektinu nemusí odrážet pouze aktivaci trombocytů. Dále je popisován i vztah mezi početními změnami trombocytů a nádorovým onemocněním. Trombocytopenie je často pozorována u pacientů s malignitou, ale ve většině případů je příčinou útlum kostní dřeně cytostatiky. Naopak trombocytóza může odrážet probíhající zánět, ale také je někdy považována za paraneoplastický jev, pozorovaný v souvislosti s mnoha nádorovými onemocněními. 30

31 Bylo prokázáno, že zvýšený počet trombocytů u pacientů s kolorektálním karcinomem předpovídá tendenci k tvorbě metastáz a tedy i špatnou prognózu. (7,30,31,32,33,60) Obrázek 4: Schematické znázornění vzniku mikroembolu následkem nádorových buněk. Trombocyty jsou aktivovány díky stimulům z nádorových buněk pomocí P-selektinu a β3-integrinů, což má za následek vznik mikroembolů či metastáz. (7) (Upraveno dle GRESELE, P., PAGE, C. P., FUSTER, V., VERMYLEN, J.: Platelets in Thrombotic and Non-Thrombotic Disorders, 2002.) Zvláště závažné riziko TEN představuje chemoterapie a hormonální terapie, což ukazuje i studie, ve které bylo zjištěno, že četnost TEN při předoperační chemoterapii byla 0,8 % a při současné chemoterapii a hormonální terapii 2,8 %. Pokud pacienti před operací nebyli léčeni chemoterapií, přítomnost TEN zjištěna nebyla. Další studie prokázala vyšší četnost výskytu TEN, pokud jsou pacienti léčeni vícero chemoterapeutiky. U žen léčených cyklofosfamidem, methotrexátem, fluorouracilem a tamoxifenem byl výskyt TEN 13,6 %, u žen léčených pouze samotným tamoxifenem byl výskyt TEN už pouze 2,6 %. (29,34) Karcinom prsu je jedním z nejčastějších typů zhoubného onemocnění v ženské populaci. Incidence hluboké žilní trombózy se u karcinomu prsu stadia II pohybuje mezi 31

32 3 9,6 %, ale u stadia IV dosahuje již 17,6 %. Bylo zjištěno, že ženy léčené tamoxifenem pro karcinom prsu mají lehce sníženou hladinu antitrombinu, proteinu S a fibrinogenu. Toto zjištění patrně souvisí se zvýšeným rizikem trombózy u pacientek užívající tamoxifen. Kombinace tamoxifenu s chemoterapií riziko ještě zvyšuje. Riziko je podobné jako při léčbě estrogeny nebo jinými selektivními modulátory estrogenních receptorů. (57,58,59) Specifickou skupinu tvoří pacienti s mnohočetným myelomem (MM), kteří jsou ohroženi především během indukční chemoterapie nově diagnostikovaného onemocnění. Nedávné studie naznačují, že pacienti s hematologickými malignitami mají podobné nebo i dokonce vyšší riziko vzniku TEN, než pacienti se solidními nádory, nejvyšší riziko se vyskytuje u pacientů s MM a akutní leukémií. Po zavedení imunomodulačních přípravků, jako jsou thalidomid a lenalidomid, do praxe došlo ke zlepšení klinických výsledků u pacientů s MM. Na druhé straně však byla v řadě studií pozorována vysoká míra tromboembolických komplikací při použití těchto přípravků, a to zejména v kombinaci s chemoterapií a vysokými dávkami kortikosteroidů. Některé práce uvádí riziko vzniku TEN 3-19 %, jiné dokonce až 25 %. Další studie se zabývají inhibitory proteazomu, konkrétně preparátem bortezomib. Ukazuje se, že výskyt arteriální či venózní trombózy v průběhu léčebného režimu zahrnující bortezomib je velmi nízký. Účinek botezomibu nastává prostřednictvím inhibice hlavního transkripčního faktoru NF-kB (nukleární faktor kappa B), což vede ke snížení exprese adhezivních molekul na plazmatických buňkách a k jejich odlišnému růstu a přežívání. Tento jedinečný mechanismus má dopad na hematopoetickou funkci. Ve studiích byl prokázán inhibiční účinek bortezomibu jednak na agregaci trombocytů vyvolané ADP, kolagenem a ristocetinem, dále pak i na počet trombocytů, což může vést až k trombocytopenii. Otázka, zda má bortezomib antitrombotickou aktivitu, ovšem není stále jednoznačná a měla by být vyjasněna dalšími studiemi. (29,34,35,36,37) 32

33 6.5 Diagnostika SPS Před stanovením diagnózy SPS musí být vyloučené všechny známé rizikové faktory trombózy. U většiny pacientů se vyšetřuje kompletní panel testů na vrozené a získané trombofilní stavy, které jsou spojené s opakovanými trombózami a rodinným výskytem tromboembolických příhod. Trombofilní screening zahrnuje: aktivitu faktoru VIII, aktivitu proteinu C a proteinu S, aktivitu antitrombinu, sérovou koncentraci homocysteinu, stanovení protilátek typu lupus antikoagulans a mutaci faktoru V Leiden a faktoru II. (3,13) Pro laboratorní vyšetření SPS dosud neexistuje standardizovaná metoda, proto se v laboratořích provádějí vyšetření SPS různými metodami a odlišnosti najdeme i v postupech měření. Nejčastěji se používá pro vyšetření SPS agregometrie, kde se používají podprahové koncentrace induktorů, na které za fyziologických podmínek trombocyty nereagují. Dle typu detekce se rozlišují agregometry optické a impedanční. Rozdíly v postupech měření jsou například v rozdílném způsobu přípravy plazmy bohaté na trombocyty (PRP), v různém počtu trombocytů po úpravě PRP, v použití různého množství vzorku nebo také v různých koncentracích použitých induktorů. Další možností je stanovovat aktivitu trombocytů pomocí průtokové cytometrie. Toto testovaní je však v současné době otázkou výzkumu. (5,18,39) Optická agregometrie Roku 1960 byl představen dosud zlatý standard testování funkce destiček optická agregometrie (Light Transmission Aggregometry, LTA). Tato metoda zjišťuje schopnost trombocytů vytvářet agregáty, což vypovídá i o jejich schopnosti vytvářet primární zátku in vivo. Agregace je shlukování trombocytů, které může následovat po jejich adhezi nebo po stimulaci řadou stimulátorů (induktorů). Dle provedení testu se může sledovat agregace bez přidání stimulátoru, tj. samovolná (spontánní) agregace. Přidávají-li se látky, které mohou vyvolat agregaci, mluvíme o stimulované agregaci. Induktory lze rozdělit do dvou skupin a to na silné induktory (kolagen, trombin), které přímo vyvolávají agregaci a navíc syntézu TXA2 a sekreci z destičkových granul, dále na slabé induktory (ADP, kyselina arachidonová, adrenalin) vyvolávající agregaci bez sekrece, ta může nastat až po vzájemném kontaktu destiček, což se na agregační křivce 33

34 projeví druhou agregační vlnou. Na vyšetření SPS se používají 3 podprahové koncentrace ADP a epinefrinu. Standardně se pro stanovení agregace optickou agregometrií odebírá žilní krev do zkumavky s citrátem sodným s koncentrací citrátu v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci se doporučuje používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů), dále je nutné vyvarovat se použití škrtidla. Doporučuje se také provádět odběr přímo na pracovišti, kde se vyšetření provádí. Velmi důležitý je časový limit pro vyšetření funkce trombocytů, které musí být provedeno do 2 hodin od odběru. Z odebraných vzorků se získává plazma bohatá na trombocyty (PRP, platelet rich plazma) centrifugací min. při G a plazma chudá na trombocyty (PPP, platelet poor plasma) centrifugaci min při 1800 až 2500 G. Optimální hodnota trombocytů v PRP se udává x10 9 /l. Hodnoty pod 100x10 9 /l trombocytů mohou vykazovat nižší odezvy, vyšší hodnoty lze upravit přidáním PPP. Dále by se test neměl provádět v případě, že plazma je velmi lipemická. Optický agregometr pracuje na turbidimetrickém principu, což znamená, že je sledována změna průchodu světla ve vyšetřovaném vzorku v závislosti na procentu agregovaných trombocytů v čase (Obrázek 5). Přístroj se před analýzou kalibruje, přičemž PRP představuje 0 % agregace a PPP 100 % agregace. Následně se vzorek PRP umístí do měřicí komory temperované na 37 C, kde se sleduje agregace. Vzorek musí být neustále míchán, aby nedošlo k usazování trombocytů a jejich vzájemnému styku. Přístroj zaznamenává změnu optických vlastností vzorku. Výsledkem záznamu je tzv. agregační křivka, z které lze odvodit maximální amplitudu neboli procento agregace, tedy maximálně možnou agregační odpověď na daný podnět (výše agregační křivky vztažená ke 100 % agregace, tj. PPP), maximální sklon (slope), který udává rychlost nárůstu agregace (závisí na počtu a velikosti trombocytárních agregátů) a dobu latence agregační křivky, tedy čas od přidání induktoru do doby, při které dojde k změně optických vlastností prostředí (Obrázek 6). V praxi se nejčastěji využívá maximální amplituda. Referenční meze pro hodnoty agregace se v literatuře různí, příklady zahrnují následující tabulky. (13,38,39,40,41,42) 34

35 Tabulka 2: Referenční hodnoty agregace po ADP a EPI používané ve fakultní nemocnici Martin. (13) Koncentrace ADP (µmol/l) Referenční hodnoty (%) 2, , , Koncentrace EPI (µmol/l) Referenční hodnoty (%) , , (Upraveno dle BARTOŠOVÁ L, a kol.: Syndrom lepivých doštičiek - jeho diagnostika a liečba, 2008.) Tabulka 3: Referenční hodnoty agregace po ADP a EPI dle Bicka, (18) Koncentrace ADP (µmol/l) Referenční hodnoty (%) 2,34 7,5-55 1, , Koncentrace EPI (µmol/l) Referenční hodnoty (%) , , (Upraveno dle BICK RL: Sticky platelet syndrome: A common cause of unexplained arterial and venous thrombosis, 1998) 35

36 Obrázek 5: Princip optické agegometrie. (42) (Upraveno dle _testing_lta.html.) Obrázek 6: Ukázka agregační křivky. (42) (Upraveno dle _testing_lta.html.) 36

37 Měření agregace trombocytů může být ovlivněna interferencemi, kterých je třeba se předem vyvarovat. Snížení agregační amplitudy může nastat po užívání léků ovlivňující funkci trombocytů, po užití alkoholu, kofeinu i výtažků z bylin. Naopak zvýšené hodnoty můžeme naměřit po těžké tělesné zátěži, hormonální antikoncepci, kouření, či po stravě bohaté na tuky. (13,38,39,40,41) U pacientů s diagnostikovaným SPS doporučují někteří autoři vyšetřit i pokrevní příbuzné (rodiče, sourozence, děti), a v případě pozitivního výsledku vyšetření jim nastavit adekvátní profylaxi TEN. (13) Impedanční agregometrie U impedančních agregometrů (Whole Blood Aggregometry, WBA) trombocyty přilnou na senzor (blízké situaci in vivo) a agregace je detekovaná zvýšením elektrického odporu mezi dvěma elektrodami, který je zaznamenáván kontinuálně v čase. Výsledek je udáván jako plocha pod křivkou (AUC), maximální amplituda a maximální sklon agregace. Některé analyzátory obsahují dvojici nezávislých senzorů, čím je zvýšená spolehlivost výstupu. Největší výhodou impedančních agregometrů je, že jsou schopny krom PRP měřit i agregaci v plné krvi. Odpadá tím cetrifugace, která může zkreslovat výsledek. Nicméně, impedanční agregometrie vyžaduje odběr krve do speciálního protisrážlivého činidla hirudinu a výsledky nelze srovnávat s optickou agregometrií. (38,39,40) Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie hraje významnou roli v charakterizaci trombocytů a v analýze jejich funkce ve vztahu k riziku trombózy a krvácení. V klinické praxi se uplatňuje v diagnostice vrozených poruch funkce trombocytů, imunitních a megakaryocytárních trombocytopenií, neonatální trombocytopenii a potransfuzní purpuře. Trombocyty jsou metodou průtokové cytometrie snadno identifikovatelné, vyšetření se provádí z minimálního množství nesrážlivé krve, je rychlé a umožňuje analýzu jak jednotlivých částic, tak i identifikaci a kvantifikaci jednotlivých subpopulací. (43,44) Průtoková cytometrie je založena na měření a následné analýze fyzikálních charakteristik vyšetřovaných částic unášených nosnou kapalinou a interagujících se 37

38 světelným zářením. Základními analyzovanými veličinami jsou velikost částic, denzita jejich vnitřního obsahu (granularita) a intenzita fluorescence. Vzorek je vnášen do kapiláry s laminárně proudící nosnou kapalinou, kde hydrodynamická fokusace zajišťuje stabilní pozici a rychlost analyzovaných částic. K vlastnímu procesu stanovení, tedy interakci buněk s laserovým paprskem, dochází v měřicí komoře. Po průchodu komorou jsou buňkám přiřazeny naměřené hodnoty a tato data jsou uložena k dalšímu zpracování ve formě datového souboru. Ten umožňuje naměřená data opakovaně analyzovat a kombinovat za použití booleovských operátorů (tzv. gatování). Analyzovaný materiál musí být připraven ve formě jednobuněčné suspenze, respektive suspenze částic menších než průměr trysky v měřicí komoře. (44) Průtokový cytometr sestává ze tří základních, vzájemně propojených systémů. Optický systém zahrnuje zdroje záření (lasery) a sběrné optické dráhy, které systémem čoček, zrcadel a optických filtrů zachycují fluorescenční a rozptýlené záření a přivádějí je na opticky aktivní vrstvu optoelektronických detektorů (fotonásobičů a fotodiod) tvořících rozhraní mezi optickým a elektronickým podsystémem průtokového cytometru. Fluidika zajišťuje transport buněk ze suspenze, které jedna za druhou postupně přicházejí do průtokové komory, když jsou předtím hydrodynamicky fokusovány hnací tekutinou do proudnice a konstantní rychlostí procházejí jednotlivými laserovými paprsky. Během tohoto průchodu paprskem fotonů excitačního záření dochází k detekci fluorescence a u jednoho z laserů i rozptylu záření. Buňky jsou poté unášeny do třídicí jednotky nebo do odpadní nádoby. Z technického hlediska je nejsložitějším systémem průtokového cytometru elektronika, která převádí optické signály (fluorescenci a rozptyl) na signály elektronické, ty potom zesiluje, digitalizuje a zpracovává do srozumitelné formy, kterou je grafická reprezentace jednotlivých buněk. (44,45,46,47) 38

39 Obrázek 7: Schéma průtokového cytometru se třemi excitačními lasery. FL1-FL9: detektory zachycující příslušnou fluorescenci buněk. (45) (Upraveno dle ŠINKOROVÁ Z., ZÁRYBNICKÁ L.: Průtoková cytometrie jako analytická a selekční metoda, 2008.) Hlavní předností průtokové cytometrie je vysoká frekvence analýzy jednotlivých buněk. Moderní analyzátory dokáží zpracovat za vteřinu desetitisíce buněk (nebo jiných elementů) unášených v okamžiku analýzy rychlostí několika metrů za vteřinu. Kromě poměrně velkého počtu fluoresenčních parametrů obsahují údaje o jednotlivých buňkách tradičně také dva rozptylové parametry, a to rozptyl v přímém směru (forward scatter, FSC), úměrný velikosti buněk a boční rozptyl (side scatter, SSC), který odráží vnitřní komplexitu buněk. Při akvizici dat je třeba odstranit debris, tzv. konfliktní případy a také kompenzovat vzájemný přesvit jednotlivých fluorochromů. Fluorochromy jsou barviva schopná absorbovat světelnou energii dané vlnové délky a následně ji vyzařovat v délce jiné. V praxi se používají fluorochromy s absorbčními maximy dosažitelnými excitací komerčně dostupnými lasery (λ=488nm), a to buď jako fluorochromy samostatné nebo tandemové, u kterých je využito přenosu energie (FRET- fluorescence resonant energy transfer) mezi fluorochromem sloužícím jako donor a fluorochromem akceptorovým. Nejčastěji používané fluorochromy zobrazuje tabulka 4. Fluorochromy jsou v naprosté většině konjugovány s monoklonální 39

40 protilátkou, která zajišťuje specifickou vazbu na cílovou strukturu. Pro diagnostické účely se používají komerčně syntetizované monoklonální protilátky. (44,45,46,47) Tabulka 4: Nejčastěji používané fluorochromy v průtokové cytometrii. (47) Fluorochrom Zkratka Hlavní emisní barva Excitace (nm) Emise (nm) Fluorescein isothiocyanate FITC Zelená Phycoerytrin PE Oranžová Phycoerytrin texas red ECD Červená Red peridin-chlorophyl PerCP Červená Phycoerythrin-cyanin5 PC5 Temně červená Phycoerythrin-cyanin7 PC7 Temně červená Allophycocyanin APC Temně červená (Upraveno dle PECKA M.: Praktická hematologie, 2010.) Vyšetření se provádí povrchovým značením buněk z nesrážlivé krve. Značení buněk koktejlem vybraných monoklonálních protilátek označených fluorofory může probíhat před lýzou nebo po lýze bezjaderných krevních elementů. Buňky se s protilátkami inkubují obvykle po dobu minut a potom se resuspendují v pufrovaném izotonickém roztoku. Na jeden vzorek se běžně používá μl krve a odebrané vzorky se doporučuje zpracovat co nejdříve. Uložení biologického materiálu před značením hraje velkou roli, krev je vhodné skladovat při laboratorní teplotě. (45) Průtokovou cytometrií lze monitorovat aktivační stav destiček in vivo nebo nepřímo hodnotit schopnost destiček aktivovat se in vitro po přidání trombocytárních agonistů. Na aktivovaných trombocytech se nalézají znaky CD62p, CD63, CD68, CD107a, CD107b, CD109 a CD154. Nutno podotknout, že některé CD znaky zastoupené na trombocytech se vyskytují i na jiných buňkách či elementech lidského těla. V praxi se nejčastěji stanovuje znak CD41, což je transmembránový glykoprotein složený ze dvou řetězců GPIIbα a GPIIbβ, který tvoří s beta-integrinem komplex GPIIb/IIIa (CD41/CD61) a objevuje se na povrchu trombocytů. Dále znak CD63, což je glykoprotein lysozomální 40

41 membrány na trombocytech. A nakonec P-selektin (CD62P), což je transmembránový glykoprotein, který se nachází v alfa-granulech trombocytů. (43,46) 41

42 7. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 7.1 Charakteristika vyšetřovaného souboru Vyšetření bylo provedeno u 40 pacientek s karcinomem prsu léčených endokrinní léčbou sledovaných na hematologické ambulanci Nemocnice Pelhřimov. Sběr dat probíhal v období od prosince 2015 po duben Vstupní kritéria: Endokrinní léčba karcinomu prsu. Věk nad 18 let. Podepsaný informovaný souhlas (viz Příloha 1). Dostupné periferní žilní řečiště vhodné pro odběr krve na vyšetření primární hemostázy. Vylučovací kritéria: Užívání léků ovlivňující funkci trombocytů (acetylsalicylová kyselina, clopidogrel, ticlopidin, prasugrel, nesteroidní antirevmatika a jiné) Trombocytopenie s počtem trombocytů pod 80x10 9 /l. Kontrolní skupinu tvoří 30 zdravých dobrovolnic. Aby byl dárce pro studii vybrán, musel projít lékařskou prohlídkou, vstupními kritérii a souhlasit se zapojením do studie (viz Příloha 2). Vylučovací kritéria byla stejná jako u vyšetřovaných pacientek. Sběr dat probíhal od ledna do března Vyšetřovaný materiál Odběry krve pacientek probíhaly v hematologické ambulanci Nemocnice Pelhřimov po předchozím objednání a vysvětlení přípravy k vyšetření (viz Příloha 3). Odběry krve zdravých dobrovolnic probíhaly na transfuzním oddělení Nemocnice Pelhřimov při darování krve, případně dle předchozí domluvy. Pacientkám i zdravým dobrovolnicím bylo vždy odebráno: 4 zkumavky s protisrážlivým činidlem citrátem sodným na vyšetření SPS. 42

43 1 zkumavka s protisrážlivým činidlem K 3 EDTA pro vyšetření krevního obrazu. 1 zkumavka s protisrážlivým činidlem citrátem sodným pro vyšetření pomocí průtokové cytometrie. 1 zkumavka bez protisrážlivého činidla na vyšetření ukazatelů metabolismu železa Odběr vzorku pro vyšetření agregace trombocytů Na odběr vzorků pro vyšetření agregace trombocytů jsou kladeny zvláštní požadavky. Odběr se provádí nalačno, nejlépe v dopoledních hodinách. Doporučuje se jen krátké zaškrcení žíly a rychlý šetrný vpich. Z důvodu případné nežádoucí aktivace trombocytů se nedoporučuje použít odběr pomocí vakua, krev se proto nechala volně kapat až po rysku do 4 otevřených zkumavek s citrátem sodným (0,129 mol/l). Zkumavky se bezprostředně po odběru opět uzavřely a opatrně promíchaly. Ideální je provádět odběr co nejblíže laboratoři, protože interval mezi venepunkcí a stanovením agregace nesmí být delší než 2 hodiny. Po této době může dojít ke zkreslení agregační odpovědi. (63,64) 7.3 Přístrojové vybavení CHRONO-LOG Model 540 VS Na vyšetření agregace trombocytů byl použit optický agregometr typu Chromo-log Model 540 VS. Agregometr pracuje na principu infračerveného světla a fotodiodového detektoru, který přesně zjistí rozdíl optické hustoty světa prošlého dvěma vzorky, a to v plazmě bohaté na trombocyty a v plazmě bez trombocytů. Rozdíly v intenzitě světla se pak zobrazují ve formě agregační křivky, kterou lze vytisknout. Přístroj se skládá z vlastního analyzátoru, počítače s AGGRO/LINK software Version 5 a grafické tiskárny. (65) 43

44 Příprava vzorku pro vyšetření agregace trombocytů Protože u trombocytů velice snadno dochází k jejich aktivaci, veškerá manipulace se vzorkem a jeho promíchávání se provádí velmi opatrně. Je nutno trombocyty udržet v neaktivním stavu až do okamžiku vlastního vyšetření. (63,64) Příprava plazmy bohaté na trombocyty (PRP) Odebraná krev se centrifuguje 11 minut při 1460 otáčkách za minutu (200 g) bez brzdy. Po stočení se horní vrstva plazmy bohaté na destičky stáhne do nové označené zkumavky a opatrně promíchá. Na analyzátoru krevního obrazu se stanoví počet trombocytů. Počet naměřených trombocytů by se měl pohybovat v rozmezí 150 až 350x10 9 /l. Pokud by byl počet trombocytů nižší, opakuje se centrifugace pouze PRP a následně se stáhne cca 1 ml plazmy z vrchní části zkumavky. A naopak, pokud by byl počet trombocytů vyšší, použije se plazma chudá na destičky k naředění PRP. (63,64) Příprava plazmy bez trombocytů (PPP) Na přípravu plazmy bez trombocytů se použitá krev centrifuguje při 4000 otáčkách za minutu (1520 g) po dobu 10ti minut. Po stočení se horní vrstva plazmy stáhne do označené zkumavky. Počet trombocytů by měl být nižší než 20x10 9 /l. (63,64) Reagencie ADP Reagent (ADP) firmy Helena (lyofilizovaný preparát ADP - Adenosine-5- diphosphoric acid disodium salt). Obsah lahvičky se rozpustí v 1 ml destilované vody a mírně se míchá až do úplného rozpuštění reagencie, poté se ponechá 30 min stát. Výsledná koncentrace je 200 μmol/l. Epinephrine Reagent (EPI) firmy Helena (lyofilizovaný preparát L-epinefrine bitartrate). Obsah lahvičky se rozpustí v 1 ml destilované vody a mírně se míchá až do úplného rozpuštění reagencie, poté se ponechá 30 min stát. Výsledná koncentrace je 3000 μmol/l. Aqua per injectione B-Braun Chlorid sodný 0,9 % roztok B-Braun (fyziologický roztok) 44

45 Spotřební materiál Kyvety k agregometru, pipety, špičky k pipetám, zkumavky, magnetická míchadla Ředění induktorů Induktory ADP a EPI se musí naředit na příslušné koncentrace a to pomocí fyziologického roztoku. Toto dávka postačuje na 5 měření SPS. ADP ředíme na koncentraci 25 µmol/l a 10 µmol/l. EPI ředíme na koncentraci 100 µmol/l a 10 µmol/l. Postup ředění popisuje tabulka 5. (63,64) Tabulka 5: Postup ředění induktorů. Požadovaná koncentrace induktoru Množství pracovního roztoku induktoru Množství fyziologického roztoku ADP 25 µmol/l ADP 10 µmol/l EPI 100 µmol/l EPI 10 µmol/l 40 µl ADP (200 µmol/l) 30 µl ADP (200 µmol/l) 15 µl EPI (3000 µmol/l) 40 µl EPI (100 µmol/l) 280 µl 570 µl 435 µl 360 µl Zdroj: SOPV 515 (Agregace ADP); SOPV 539 (Agregace EPI) Pracovní postup agregace trombocytů optickým agregometrem Po zapnutí agregometru se nastaví rychlost míchání na 1000 otáček za minutu a bloky přístroje se nechají vyhřát na teplotu 37 C. Samotné měření tedy probíhá za stálého míchání ve skleněných kyvetách inkubovaných při 37 C. Do první kyvety se pipetuje PRP a do druhé kyvety PPP, tato kyveta slouží jako blank pro nastavení tzv. 100 % agregace. Kyvety s magnetickým míchadlem a PRP plazmou se vloží do měřicích míst jednoho z kanálů agregometru. Maximální a minimální optická hustota na grafickém záznamu je nastavena automaticky. Do programu v počítači se zadají identifikační údaje testovaného jedince a nastaví se jednotlivé parametry pro měření. Kyvety se temperují 3 minuty a poté se do kyvety s PRP připipetuje induktor s příslušnou 45

46 koncentrací a ihned se spustí měření. Podrobný postup přidávání jednotlivých koncentrací induktorů zahrnují následující tabulky 6 a 7. Přibližně po 10 minutách bylo měření ukončeno. Primární křivky byly vyhodnoceny softwarem přístroje a uloženy do databáze vzorků v počítači. (65) Tabulka 6: Postup pro pipetování ADP ve třech koncentracích. 1. měření 1. kyveta 2. kyveta Výsledná PPP PRP ADP koncentrace ADP vzorek (μl) µl 50 µl 2,5 μmol/l blank (μl) 500 µl měření 1. kyveta 2. kyveta Výsledná PPP PRP ADP koncentrace ADP vzorek (μl) µl 50 µl 1,0 μmol/l blank (μl) 500 µl měření 1. kyveta 2. kyveta Výsledná PPP PRP ADP koncentrace ADP vzorek (μl) µl 25 µl 0,5 μmol/l blank (μl) 500 µl Zdroj: SOPV 515 (Agregace ADP) Tabulka 7: Postup pro pipetování EPI ve třech koncentracích. 1. měření 1. kyveta 2. kyveta Výsledná PPP PRP EPI koncentrace EPI vzorek (μl) µl 50 µl 10 μmol/l blank (μl) 500 µl měření 1. kyveta 2. kyveta Výsledná PPP PRP EPI koncentrace EPI vzorek (μl) µl 50 µl 1,0 μmol/l blank (μl) 500 µl měření 1. kyveta 2. kyveta Výsledná PPP PRP EPI koncentrace EPI vzorek (μl) µl 25 µl 0,5 μmol/l blank (μl) 500 µl Zdroj: SOPV 539 (Agregace EPI) 46

47 7.3.2 Centrifuga Universal 320 Pro stočení vzorku byla použita centrifuga UNIVERSAL 320. Centrifugy jsou zkonstruovány k separaci látek o různé hustotě s využitím odstředivé síly. Řídicí systém centrifug je mikroprocesorový a umožňuje nastavit počet otáček za minutu, stupeň akcelerace a brzdění, čas centrifugace. Technické parametry jsou uvedeny v tabulce 8. (66) Tabulka 8: Technické parametry centrifugy UNIVERSAL 320. Rozměry Hmotnost Napájení Síťová frekvence Kapacita: max. Počet otáček (RPM) Provozní teplota 395 x 520 x 346 mm 31 kg V Hz 4 x 100 ml C Zdroj: SOPT 417 (Centrifugy) Cytomics FC 500 Pro vyšetření aktivace trombocytů měřením exprese P-selektinu byl použit průtokový cytometr Cytomics FC 500, výrobce Beckman Coulter, Inc., USA. Pro detekci excitace buněk je použit argonový laser (488 nm) a následně je detekován přímý a kolmý rozptyl laserového světla a také fluorescenční signál rozdělený do pěti barevných pásem se středem přibližně při 252, 575, 610, 675 a 755 nm, přičemž měřené fluorescenční světlo pochází z fluorochromů použitých protilátek. Na vyhodnocení byl použit CXP analysis software. (67) 47

48 Reagencie IsoFlow Sheath Fluid (REF Beckman Coulter Inc. USA) je nosná kapalina. Její laminární průtok v kyvetě zajišťuje průtok měřených částic v jedné řadě za sebou. Fyziologický roztok slouží k naředění vzorku. Specifické protilátky jsou protilátky umožňující stanovení exprese jednotlivých antigenů na buňkách. Konkrétně byly použity CD41-PC7 (REF Beckman Coulter Inc. USA), která se váže na povrch trombocytů a CD62p-PE (REF IM1759U Beckman Coulter Inc., USA), která je znakem aktivace trombocytů. (67) Spotřební materiál Zkumavky o rozměru 12x75 mm, špičky k pipetám Pracovní postup Vyšetření aktivace trombocytů pomocí průtokového cytometru se provádí z plné krve s protisrážlivým činidlem citrátem sodným. Do cytometrické zkumavky se pipetuje 5 μl protilátky CD45-PC7 a 10 μl protilátky CD62p-PE a následně se přidá 1,2 μl krve. Po 15minutové inkubaci a průběžném promíchávání se ke vzorku přidá 200 μl fyziologického roztoku a takto upravený vzorek se změří na průtokovém cytometru. Výběrem trombocytů z naměřených elementů a následným výběrem aktivovaných trombocytů se stanoví jejich procento. (67) Coulter DxH 800 Pro stanovení krevních obrazů byl použit analyzátor krevních buněk Beckman Coulter DxH 800. Systém UniCel DxH 800 je kvantitativní, multiparametrický automatizovaný hematologický analyzátor sloužící k diagnostickým účelům in vitro při vyšetření základních morfologických vyšetření pacientů v klinické laboratoři. Rozsah vyšetření: počet leukocytů, erytrocytů, trombocytů, hematokrit, hemoglobin, střední objem erytrocytů, barvivo v erytrocytu, koncentrace hemoglobinu v erytrocytu, distribuční šíře erytrocytů, střední objem destičky, absolutní a relativní počty neutrofilů, lymfocytů, 48

49 eosinofilů, bazofilů, monocytů, retikulocytů a normoblastů. Přístroj se skládá ze samotného analyzátoru, ručního snímače čárového kódu, kompresoru, počítače a tiskárny. (68) Reagencie Coulter DxH Diluent ředicí roztok. Coulter DxH Cell Lyse činidlo, které lyzuje červené krvinky. Coulter DxH Diff Pack lyzační činidlo Erythrolyse a konzervační činidlo Stabillyse. Coulter DxH Retic Pack- činidlo k barvení a činidlo k čištění retikulocytů. Coulter DxH Cleaner činidlo, které odstraňuje zbytkové materiály. (68) Pracovní postup pro stanovení krevního obrazu Zkumavky Vacutainer se vloží do kazety. Modul STM magneticky posouvá kazety do míchací stanice a následně po naskenování čárového kódu na zkumavce je nasávací sondou odebrán vzorek. Výsledky jsou automaticky odesílány do laboratorního informačního systému. (68) 7.4 Referenční hranice pro diagnostiku SPS V hematologické laboratoři Nemocnice Pelhřimov se pro vyhodnocení agregace využívá maximální amplituda. Pro stanovení diagnózy SPS musí být maximální amplituda vyšší než je uvedená hranice (viz tabulka 9) s nejméně dvěma koncentracemi induktoru. Podle toho, s kterým induktorem maximální amplituda přesahuje danou hranici, rozlišujeme typy SPS. Zvýšená agregace po epinefrinu i ADP představuje typ I, po samotném epinefrinu typ II a po samotném ADP typ III. Referenční hranice byly stanoveny vyšetřením souboru zdravých dárců krve. (63,64) 49

50 Tabulka 9: Referenční hranice agregace po ADP a EPI používané v hematologické laboratoři Nemocnice Pelhřimov. Induktor Maximální amplituda ADP 2,5 µmol/l 45 % ADP 1,0 µmol/l 23 % ADP 0,5 µmol/l 15 % EPI 10 µmol/l 55 % EPI 1,0 µmol/l 28 % EPI 0,5 µmol/l 15 % Zdroj: SOPV 515 (Agregace ADP); SOPV 539 (Agregace EPI) 7.5 Vyhodnocení a zpracování výsledků měření Pro zpracování a statistické vyhodnocení výsledků byl použit software Statistica CZ verze 12 od firmy StatSoft CS s.r.o. K vyhodnocení rozdílů četností nominálních proměnných byl použit chí-kvadrát test. K vyhodnocení normality rozdělení výběrů proměnných byl použit Shapiro-Wilkův test. K vyhodnocení rozdílu rozptylů v případě normálního rozdělení obou výběrů byl použit Brown-Forsytheův test. K vyhodnocení rozdílů kvantitativních proměnných byl použit v případě normálního rozdělení obou výběrů proměnných nepárový Studentův T-test (v případě nálezu rozdílných rozptylů Brown-Forsyteovým testem byl použit t-test s oddělenými odhady rozptylů pro každý výběr.) a v případě jiného než normálního rozdělení aspoň jednoho výběru proměnných Mann-Whitneyův test. K vyhodnocení závislostí kvantitativních znaků byla použita korelační matice. 50

51 8. VÝSLEDKY 8.1 Základní demografické charakteristiky Soubor pacientů: 40 žen, léčených pro karcinom prsu endokrinní léčbou, průměrného věku 61,7 let. Soubor zdravých dobrovolnic: 30 žen, bez anamnézy zhoubného nádoru, neužívajících protidestičkové léky ani nesteroidní antirevmatika, průměrného věku 64,0 let. Bližší údaje jsou uvedeny v tabulce 10. Tabulka 10: Věkové charakteristiky pacientek a zdravých dobrovolnic. Průměr Sm. odch. Min. Max. Pacientky 61,7 11,8 31,8 82,8 Dobrovolnice 64,0 3,7 57,6 73,0 Zdroj: autor Věk v obou porovnávaných souborech byl vyhodnocen t-testem s oddělenými odhady rozptylů pro každý výběr, průměry se statisticky významně nelišily (p = 0,29661). 8.2 Primární cíl Pro vyhodnocení statistické významnosti rozdílů četností výskytu zvýšené agregability s nejméně 2 koncentracemi induktorů byl použit chi kvadrát test, neboť očekávané četnosti byly dostatečné pro použití tohoto testu. Zvýšená agregabilita s nejméně 2 koncentracemi nejméně 1 induktoru byla pozorována u 86,6 % zdravých dobrovolnic a u 62,5 % pacientek, rozdíl byl statisticky významný (p = 0,0245). Zvýšená agregabilita s nejméně 2 koncentracemi ADP byla pozorována u 46,7 % zdravých dobrovolnic a u 17,5 % pacientek, rozdíl byl statisticky významný (p = 0,0084). Zvýšená agregabilita s nejméně 2 koncentracemi epinefrinu byla pozorována u 80% zdravých dobrovolnic a u 60 % pacientek, rozdíl nebyl statisticky významný. Výsledky jsou sumarizovány v tabulce

52 Tabulka 11: Výskyt zvýšené agregability s nejméně 2 koncentracemi induktorů. Induktor Soubor Kritéria splnilo kritéria nesplnilo p ADP a/nebo EPI dobrovolnice ,0245 pacientky ADP EPI Zdroj: autor dobrovolnice pacientky 7 33 dobrovolnice 24 6 pacientky ,0084 0,0745 Obrázek 8: Ukázka agregační křivky pacienta, který splnil laboratorní kritéria SPS. Modrá agregační křivka znázorňuje EPI 1,0 µmol/l (maximální amplituda 95 %) a černá křivka EPI 0,5 µmol/l (maximální amplituda 66 %). Pro vyhodnocení rozdílů výsledků amplitudy agregační křivky s jednotlivými koncentracemi induktorů byl použit Mann-Whitneyův test, neboť Shapiro-Wilkovým testem bylo v každém případě zjištěno, že rozdělení aspoň jednoho výběru nebylo 52