UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. 3. lékařská fakulta

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 3. lékařská fakulta DIZERTAČNÍ PRÁCE MUDr. Zuzana Wedellová Praha 2013

2 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 3. lékařská fakulta Dizertační práce Úloha adiponektinu a natriuretického peptidu typu B v regulaci lipolýzy v tukové tkáni MUDr. Zuzana Wedellová Školitel: Doc. MUDr. Vladimír Štich, PhD. Praha 2013

3 Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Zuzana Wedellová Název dizertační práce: Úloha adiponektinu a natriuretického peptidu typu B v regulaci lipolýzy v tukové tkáni Název dizertační práce anglicky: Role of adiponectin and B-type natriuretic peptide in the regulation of adipose tissue lipolysis Doktorské studijní programy v biomedicíně Studijní obor: Preventivní medicína Školitel: Doc. MUDr. Vladimír Štich, PhD. Rok obhajoby: 2013 Klíčová slova v češtině: tuková tkáň, adiponektin, natriuretický peptid typ B, lipolýza Klíčová slova v angličtině: adipose tissue, adiponectin, B-type natriuretic peptide, lipolysis

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem tuto dizertační práci vypracovala (pod vedením školitele) samostatně a uvedla jsem všechny použité prameny a literaturu. Studie shrnuté v dizertační práci byly podpořeny z finančních zdrojů Grantové agentury Univerzity Karlovy (grant GAUK 1269/08/C/2008), Výzkumného záměru Ministerstva školství (grant MSMT , MSMT -1MO510), projektu Rámcového programu EU HEPADIP (grant LSHM -CT a LSH ), projektu Rámcového programu EU ADAPT (grant HEALTH -F ), projektu Ministerstva zdravotnictví (MZO , NS /2009) a z finančních zdrojů Grantové agentury Akademie věd České republiky (305/09/1390). Praha 2013 MUDr. Zuzana Wedellová

5 PŘEDMLUVA A PODĚKOVÁNÍ Předkládaná dizertační práce je založena na čtyřech studiích provedených na Ústavu tělovýchovného lékařství Centra preventivního lékařství 3. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze (studie č. 1-4) a částečně ve spolupráci s Klinikou kardiologie Institutu pro klinickou a experimentální medicínu (IKEM) (studie č. 3). Chtěla bych poděkovat svému školiteli Doc. Vladimíru Štichovi, že mě přijal jako svého žáka a nabídl mi podporu ke studiu metabolismu a fyziologie tukové tkáně. Děkuji za jeho ochotu a připravenost být mi vždy nablízku radou, stimulací. Děkuji za jeho optimismus, radostnou mysl. Za přátelské prostředí, které je na jeho pracovišti. Moc si vážím četných příležitostí k účastem na vědeckých kongresech. Děkuji za to mnohé, čím ovlivnil formování mého pohledu na studium, na vědeckou práci. Děkuji kolegovi Janu Polákovi za trpělivost, kterou se mnou měl při zaškolení v laboratoři. Děkuji za jeho inspirující přesvědčení, nadšení a optimismus, s nimiž se věnuje úkolům v oblasti vědy. Za jeho příkladnou píli, pracovitost a opravdovost! Velký dík patří mým kolegyním Zuzaně Kováčové, Evě Klimčákové, Michaele Tencerové, Michaele Šiklové, Lence Rossmeislové a Katrien Koppo za přátelskou atmosféru a za jejich ochotu kdykoliv mi poradit a pomoci. Zuzaně Pařízkové a Hance Gregorové bych zde chtěla poděkovat především za technickou podporu při provádění studií. Mé díky patří rodině za zájem o mé studium a především stimulující dotazy týkající se postupu psaní dizertace. Lukášovi, mému nejbližšímu člověku, milovanému příteli, manželu a tatínkovi našich dvou dětí bych chtěla poděkovat za duševní i technickou podporu. Též za jeho pochopení všeho mého počínání a za humor a nadhled, kterými nás přenáší přes obtížné životní situace. Děkuji Hospodinu, že mě přivedl ke všem výše jmenovaným, za zdraví a sílu ke studiu.

6 SHRNUTÍ Obezita je celosvětově nejrozšířenější metabolické onemocnění. Prevalence obezity v posledních letech stoupá ve všech světadílech. Alarmující je především trvalý vzestup výskytu obezity u dětí. Obezita je spojena se zvýšeným rizikem diabetu 2. typu, hyperlipidemie, kardiovaskulárních chorob, některých chorob nádorových a onemocnění pohybového systému. Náklady na péči chorob sdružených s obezitou každoročně stoupají a obezita tak představuje velmi významnou zátěž zdravotního systému v rozvinutých a v poslední době i rozvíjejících se zemích. Tato skutečnost podtrhuje nezbytnost výzkumu v oblasti prevence a léčby obezity. K rozvoji metabolických chorob sdružených s obezitou přispívá zásadní měrou dysfunkce tukové tkáně. Jejími projevy jsou: 1) změna sekrece specifických působků hormonální či parakrinní povahy (nazývaných obecně adipokiny) v tukové tkáni a 2) zvýšená mobilizace nenasycených mastných kyselin (NEMK) z tukové tkáně a následně jejich zvýšené uvolňování do krevního oběhu (1). Ve studiích shrnutých v této dizertační práci jsme se zaměřili na studium regulace lipolýzy, tj. procesu uvolňování NEMK z tukové tkáně. Pozornost jsme věnovali úloze adiponektinu a B-natriuretického peptidu ( BNP) v regulaci lipolýzy u dvou patologických stavů, u nichž je lipolýza narušena: u obezity a srdečního selhání. V našich prvních dvou studiích (studie č. 1 a 2) jsme prokázali, že adiponektin, hormon vytvářený v adipocytech tukové tkáně, ovlivňuje v adipocytech autokrinním resp. parakrinním způsobem lipolýzu. Ve studii č. 1 jsme ukázali, že celkový adiponektin inhibuje spontánní i katecholaminy indukovanou lipolýzu u neobézních jedinců a tento účinek není patrný u obézních jedinců. Protože adiponektin je sekretován z adipocytu v několika polymerických formách s odlišným biologickým účinkem, zaměřili jsme se ve studii č. 2 na působení jednotlivých polymerických forem na regulaci lipolýzy v podkožní a viscerální tukové tkáni. Ukázali jsme, že globulární adiponektin inhiboval lipolýzu v podkožní tukové tkáni (subcutaneous adipose tissue, SAT) zatímco trimerický adiponektin inhiboval lipolýzu ve viscerální tukové tkáni (visceral adipose tissue, VAT) obézních žen. Při zkoumání mechanismů podmiňujích tyto účinky jsme ukázali, že globulární adiponektin indukuje aktivitu AMP-aktivované proteinové kinázy (AMPK) v SAT. V další studii (studie č. 3) přinášíme zcela prioritní poznatky o poruchách regulace lipolýzy u pacientů s chronickým srdečním selháním (ChSS). Charakteristicky trvale zvýšená lipolýza u

7 ChSS může přispívat k přetížení myokardu NEMK, k inzulínové rezistenci a ke kardiální kachexii. Mechanismy zvýšené lipolýzy u ChSS nejsou zatím zřejmé. V naší studii jsme se zaměřili na zkoumání úlohy BNP v tukové tkáni u ChSS a ukázali jsme, že BNP 1-32 působí lipolyticky v SAT, a indukce lipolýzy bioaktivním BNP je zvýšená u pacientů s ChSS oproti zdravým kontrolám. BNP je tak pravděpodobně hormonem přispívajícím ke zvýšené lipolýze u ChSS, patrně důležitějším než jsou katecholaminy (za fyziologických okolností nejvýznamnější stimulátory lipolýzy). Ve studii č. 4 jsme předchozí studium parakrinních účinků izoforem adiponektinu v podkožní a viscerální tukové tkáni doplnili zkoumáním jejich sekrece z adipocytů SAT a VAT. Zjistili jsme, že množství celkového adiponektinu secernovaného z SAT bylo vyšší než z VAT, a u obézních byl pokles sekrece adiponektinu významnější v SAT než v VAT v porovnání s neobézními. Dle našich výsledků se SAT zdá být významnějším určujícím faktorem změn produkce adiponektinu při obezitě než VAT. Výše zmíněné poznatky přispívají k pochopení patogeneze metabolických komplikací u obezity a chronického srdečního selhání a mohou přispět v budoucnu k rozvoji prevence a terapeutického ovlivnění metabolických a kardiovaskulárních komplikací obezity.

8 SUMMARY Obesity is a most common metabolic disorder worldwide. Prevalence of obesity is consistently growing in all continents during last years. Primarily the increase of incidence of obesity in children is alarming. Obesity is linked to elevated risk of type 2 diabetes, hyperlipidemia, cardiovascular diseases, some cancers and disorders of musculoskeletal system. The cost of the treatment of diseases linked to obesity is annually increasing and obesity represents very important part of costs of health system in developed and recently also developing countries. This fact shows the necessity of research in the area of preventive and therapeutic procedures. The development of metabolic disturbances linked to obesity is associated with dysfunction of adipose tissue. Its two main features are: 1) altered secretion of specific substance with hormonal or paracrinne charakter (called adipokines) and 2) elevated mobilization of nonesterified fatty acids (NEMK) from adipose tissue and subsequently their increased release into the circulation (1). In our studies we paid attention to the study of lipolysis. The rate of lipolysis is the primary factor that determines the release of NEFA from adipose tissue. We focused to a role of adiponectin and natriuretic peptid type B (BNP) in the regulation of lipolysis in two pathological states with disorder of lipolysis obesity and chronic heart failure (HF). In the first two studies we show that adiponectin, hormon produced in adipocytes of adipose tissue, influences the lipolysis in adipocytes by autocrine respectively paracrine manner. In study No. 1 we showed that adiponectin inhibits spontaneous and catecholamine-induced lipolysis in non-obese but not in obese subjects. Adiponectin is secreted from adipocyte in several polymeric forms with different biological effect: therefore, in study No. 2 we investigated the role of polymeric forms in regulation of lipolysis in subcutaneous and visceral adipose tissue (SAT and VAT, respectively). We showed that globular adiponectin inhibited lipolysis in SAT and trimeric adiponectin inhibited lipolysis in VAT in obese women. We explored the mechanisms underlying these lipolytic actions and showed that globular adiponectin induces an activity of AMP-activated protein kinase (AMPK) in SAT. In the next study ( study No. 3) we present original findings on disturbances of lipolysis regulation in patiens with HF. The enhanced lipolysis in advanced HF can contribute to the overload of myocardium with the flow of non-esterified fatty acids and to the whole-body insulin resistance and cardiac cachexia. Mechanisms of increased adipose tissue lipolysis in

9 HF patients are incompletely understood. We investigated the effects of natriuretic peptides in adipose tissue and showed that BNP 1-32 contributes to lipolysis in SAT and that induction of lipolysis by bioactive form of BNP is enhanced in HF patiens in comparison with healthy control group. This suggests that BNP is a hormone that contributes to the enhanced lipolysis in HF patiens. It is, presumably, more important than catecholamines (in physiological conditions the most important stimulators of lipolysis). In study No. 4 we examined secretion of adiponectin isoforms from adipocytes in SAT and VAT. We found that total adiponectin quantity secreted from adipose tissue explants was higher in SAT than in VAT. When compared to non-obese, the adiponectin secretion was reduced in obese subjects, the reduction being more significant in SAT than in VAT. According to our results, SAT seems to be more important when compared with VAT determinant of the altered adiponectin production in obesity. The above mentioned findings contribute to the understanding of pathogenesis of metabolic complications of obesity and HF and can contribute to the development of preventive and therapeutic measures influencing metabolic and cardiovascular complications of obesity.

10 1

11 SEZNAM ZKRATEK ACC Acetyl-CoA-karboxyláza (Acetyl-CoA carboxylase) Acrp30 (Adipocyte complement-related protein of 30 kda) AdipoR Receptor pro adiponektin (Adiponectin receptor) AICAR 5 Aminoimidazol 4-karboxyamid-ribonukleotid (5 aminoimidazole 4- carboxamide riboside) AMP Adenosinmonofosfát (Adenosine monophosphate) AMPK AMP-aktivovaná protein kináza (AMP-activated protein kinase) ANP Natriuretický peptid typ A (A-type natriuretic peptide) apm1 (Adipose most abundant gene transcript 1) ATP Adenosin trifosfát (Adenosin triphosphate) ATGL Tuková triacylglycerolová lipáza (Adipose triglyceride lipase) BMI Index tělesné hmotnosti (Body mass index) BNP Natriuretický peptid typ B (B-type natriuretic peptide) camp Cyklický adenosinmonofosfát (Cyclic adenosin monophosphate) cgmp Cyklický guanosinmonofosfát (Cyclic guanosine monophosphate) CNP Natriuretický peptid typ C (C-type natriuretic peptide) CRP C-reaktivní protein (C-reactive protein) DAG Diacylglycerol (Diacylglycerol) DNP Natriuretický peptid typ D (D-type natriuretic peptide) GBP28 (Gelatin-binding protein of 28 kda) HMW Vysoká molekulární hmotnost (High molecular weight) HSL Hormon senzitivní lipáza (Hormone sensitive lipase) ChSS Chronické srdeční selhání ibnp Imunoreaktivní BNP (Immunoreactive BNP) IFN-γ Interferon-γ (Interferon- γ) IGF Inzulínu podobný růstový faktor (Insulin-like growth factor) IL Interleukin (Interleukine) LMW Nízká molekulární hmotnost (Low molecular weight) LPL Lipoproteinová lipáza (Lipoprotein lipase) MAPK Mitogenem aktivovaná proteinkináza (Mitogen activated protein kinase) 2

12 MCP-1 (Macrophage chemoattractant protein) MGL Monoglyceridová lipáza (Monoglyceride lipase) MMW Střední molekulární hmotnost (Medium molecular weight) MONICA (Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Diseases) NEMK Neesterifikované mastné kyseliny (Non-esterified fatty acids) NFκB Jaderný faktor kappa B (Nuclear factor kappa B) NYHA New York Heart Association PDE3B Cyklická nukleotidová fosfodiesteráza 3B (Cyclic nukleotide phosphodiesterase 3B) PKA Protein kináza A (Protein kinase A) PKG cgmp-dependentní protein kináza (cgmp-dependent protein kinase) PPAR Receptor aktivovaný peroxisomovým proliferátorem (Peroxisome proliferatoractivated receptor) SAT Podkožní tuková tkáň (Subcutaneous adipose tissue) TAG Triacylglycerol (Triacylglycerol) TGF-β Transformující růstový faktor beta (Transforming growth factor- β) TGH2 Triacylglycerol hydroláza 2 (Triacylglycerol hydrolase 2) TNF-α Tumor nekrotizující faktor alfa (Tumor necrosis factor alpha) VAT Viscerální tuková tkáň (Visceral adipose tissue) VEGF Vaskulární endotelový růstový faktor (Vascular endothelial growth factor) VLDL Lipoprotein o velmi nízké hustotě (Very-low-density lipoprotein) VNP Natriuretický peptid typ V (V-type natriuretic peptide) 3

13 KAPITOLA 1: ÚVOD Předkládaná dizertační práce zahrnuje čtyři studie prováděné na Ústavu tělovýchovného lékařství Centra preventivního lékařství 3. LF UK a částečně ve spolupráci s Klinikou kardiologie Institutu pro klinickou a experimentální medicínu (IKEM). Práce je tématicky rozdělena do dvou částí. V první části je společným tématem zkoumání regulace lipolýzy adiponektinem a natriuretickým peptidem typu B. Ve studii č. 1 jsme zkoumali vliv adiponektinu na spontánní a katecholaminy stimulovanou lipolýzu v izolovaných adipocytech SAT in vitro. Studie č. 2 sleduje úlohu celkového, trimerického a globulárního adiponektinu v regulaci lipolýzy v adipocytech izolovaných z SAT a VAT in vitro. Sledována byla i úloha aktivace AMPK v regulaci lipolytických procesů adiponektinem. Studie č. 3 využívá mikrodialyzační techniku k in vivo studiu účinku natriuretického peptidu typu B v tukové tkáni u pacientů se srdečním selháním. V druhé části jsme se věnovali sekreci multimerních izoforem adiponektinu v SAT a VAT, zahrnuto ve studii č. 4. 4

14 KAPITOLA 2: LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Obezita Obezita je chronické metabolické onemocnění definované zvýšenou tělesnou hmotností podmíněnou zvětšením objemu bílé tukové tkáně. Je určena pomocí indexu tělesné hmotnosti (body mass index, BMI), který je vyjádřen jako podíl tělesné hmotnosti a druhé mocniny výšky. Hodnota pro obezitu je 30 kg/m 2 a více. Obezita je rizikovým faktorem ke vzniku řady metabolických a kardiovaskulárních onemocnění (inzulínová rezistence, diabetes mellitus 2. typu, dyslipidemie, arteriální hypertenze, ateroskleróza, ischemická choroba srdeční, hypertrofie a dilatace levé komory srdeční, cévní mozkové příhody a tromboembolické choroby), některých nádorových onemocnění, chorob pohybového aparátu (artrózou nosných kloubů, vertebrogenními obtížemi), psychickými obtížemi a dalšími. Obezita přináší nejen zdravotnické komplikace, které vedou ke zhoršení kvality života, a jejichž terapie představuje významnou ekonomickou zátěž, ale je problémem též sociálním v naší kultuře jsou nadváha a obezita společensky hůře tolerovány Aktuální epidemiologická situace Ačkoliv jsou dnes dobře popsány komplikace obezity, a nadváha a obezita byly určeny jako jedny nejrozšířenějších rizikových faktorů ohrožujících zdravotní stav populace, pacientů s nadváhou a obézních celosvětově přibývá. Na základě výsledků multicentrické studie MONICA (Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Diseases), která byla realizována v průběhu 80. a 90. let minulého století v řadě států světa včetně České republiky, prohlásila Světová zdravotnická organizace obezitu za epidemii 21. století. Aktuální situaci v České republice mapují uvedené studie: 1. Studie MONICA, která sledovala kardiovaskulární rizikové faktory v reprezentativním vzorku populace ČR v období /2008. Ve sledovaném období byl signifikantní nárůst hmotnosti u mužů (z 81,7 ± 12,8 na 90,0 ± 15,8 kg; p < 0,001) a BMI u mužů (z 27,0 ± 4,0 na 28,5 ± 4,6 kg/m 2 ; p < 0,001). Nárůst počtu obézních mužů (BMI 30) byl alarmující (19,7 % v roce 1985 na 33,6 % v 2007/2008). BMI žen bylo v roce ,3 ± 5,4 a v 2007/ ,3 ± 5,7. Procento obézních žen vzrostlo v letech /2008 z 28,0 % na 30,1%. Z dat je patrné, že v letech 5

15 /2008 byl signifikantní nárůst hmotnosti a BMI jen u mužů a u žen ne, ale na konci studie, tedy při měření 2007/2008, bylo obézních mužů 33,6% a obézních žen 30,1% (2). 2. Epidemiologické šetření STEM/MARK v letech Z výzkumu, který byl proveden na reprezentativním vzorku dospělé české populace (n = 2058) vyplývá, že v České republice bylo celkem 23 % dospělé populace s obezitou a 34 % osob s nadváhou (3). 3. Data Ústavu zdravotnických informací a statistiky ČR (ÚZIS, z roku Nadváhu (tzn. BMI 25 29,99) mělo 54 % osob, z toho 63 % mužů a 46 % žen. Obézních respondentů (BMI > 30) bylo 17,4 % osob, z toho 17,4 % mužů a 17,5 % žen. V šetření byly výpovědi respondentů subjektivní, nedocházelo k měření lékařem ani tazatelem, Otázka zjišťující výšku byla pokládána ve znění: Jaká je vaše výška bez bot? a otázka zjišťující hmotnost ve znění: Kolik vážíte bez šatů a bot? Počet respondentů: 940 mužů a 1015 žen, ve věku od 15 let výše. Prevalenci obezity v Evropě sleduje studie, ve které byly vyhledány a zpracovány publikace z let (4). Prevalence obezity u mužů se pohybovala mezi 4 % a 28,3 % a u žen od 6,2 % do 36,5 %. Nejvyšší prevalence (tzn. větší než 25 %) byla v Itálii a Španělsku u obou pohlaví, a v Portugalsku, Polsku, České republice, Rumunsku a Albánii u žen. Tato data ilustrují obrázky 1 a 2. 6

16 Obrázek 1: Prevalence obezity (BMI 30 kg/m 2 ) u mužů v Evropě. Data jsou uvedena v %. Zdroj: Berghofer A, Pischon T, Reinhold T, Apovian CM, Sharma AM, Willich SN. Obesity prevalence from a European perspective: a systematic review. BMC Public Health, 2008, 8:200 (4) 7

17 Obrázek 1: Prevalence obezity (BMI 30 kg/m 2 ) u žen v Evropě. Data jsou uvedena v %. Zdroj: Berghofer A, Pischon T, Reinhold T, Apovian CM, Sharma AM, Willich SN. Obesity prevalence from a European perspective: a systematic review. BMC Public Health, 2008, 8:200 (4) 8

18 Prevalence obezity v Evropě signifikantně vzrostla v několika minulých dekádách. V 80. letech minulého století bylo 15 % mužů a 17 % žen obézních (BMI 30 kg/m 2 ), což znamená, že míra obezity vzrostla asi o 30 % v posledních 10 až 15 letech (4). Z dat je patrné, že incidence obezity má přes veškeré poznatky o jejích škodlivých dopadech na zdraví stoupající tendenci. Celosvětové rozšíření obezity a přidružených chorob vedoucí ke snížené kvalitě života a ke snížené očekávané době života je aktuální problém Léčba obezity Historické okénko. Pravděpodobně prvním, kdo popsal souvislost mezi obezitou a přidruženými metabolickými a kardiovaskulárními chorobami, byl Indický lékař Sushruta v 6. století př.n.l. (5). K léčbě obezity doporučoval cvičení (6). Staří Egypťané zase doporučovali v prevenci obezity pravidelný půst (7). Zajímavostí z české historie jsou režimová doporučení lékařů královského dvoru v pozdním středověku. Vhodná strava a náležitý způsob života byl považován za nejvýznamnější lék i prevenci chorob. Tehdejším králům (Janu Lucemburskému, Karlovi IV. a jeho synům) radili lékaři, aby jedli střídmě, tak, aby se jim neměnil dech ani pulz, jídlo jim nenarušovalo spánek ani bdění, nezpůsobovalo nadýmání, škytání, říhání a nevolnost, neměnilo obvyklé množství moči ani stolice. Důraz kladli lékaři na to, aby se jedly čerstvé potraviny, nedoporučovala se uzená masa, solené ryby a slanina (8). Doporučení tehdejších lékařů se tak příliš nelišila od těch dnešních. Léčba dietou je v terapii obezity zásadním postupem, většinou se kombinuje s psychoterapií a pohybovou léčbou. Mezi další postupy využívané v terapii obezity je farmakoterapie a chirurgická léčba. Možností zařazení farmak v terapii obezity není mnoho v současnosti jsou u nás na trhu dostupné pouze inhibitory střevních lipáz (orlistat), Elsinorské prášky (kombinace kofeinu a efedrinu) a phentermin (anorektikum, tlumí chuť k jídlu zvýšením sekrece dopaminu a noradrenalinu). Vývoj nových léčebných možností je proto velmi žádoucí Teorie spořivých genů Všímáme-li si dat mapujících incidenci obezity, zmíním se i o alternativách, které se zabývají vysvětlením současné epidemie obezity. Dle teorie spořivých genů (9) byli naši předci vystaveni opakovaným obdobím hladovění, během kterých byli silnější jedinci s tukovými zásobami evolučně ve výhodě. Jedinci s geny podporujícími efektivní ukládání tuku 9

19 v obdobích nedostatku potravy ( spořivé geny ) byli upřednostňováni. Dnes však tato genetická predispozice v oblastech, kde je dostatek potravy, vede k rozvoji obezity, diabetu 2. typu a dalších zdravotních komplikací. Teorii evolučního zvýhodnění silnějších jedinců zpochybňuje řada autorů (10;11). Například Speakman oponuje tím, že těžké hladomory s vysokou mortalitou jsou velmi vzácné, a i při nejhorších hladomorech nezemřelo více než 10% obyvatelstva za rok, a z těch jen 5-20% z důvodu hladovění. Téměř vždy byla mortalita omezena na velmi mladé a velmi staré jedince, což neodpovídá předpokladu distribuce úmrtnosti upřednostňující obézní před hubenými. Také prevalence obezity mezi hladomory byla nízká, že by se spořivé geny nemohly rozšířit v lidské populaci. Přes intenzivní výzkum nebyly navíc dosud žádné spořivé geny objeveny (11). Druhým zajímavým příkladem oponenta je Riccardo Baschetti. Přináší teorii, že za současnou epidemii obezity může změna našeho jídelníčku oproti krmi našich předků, resp. nejíme již stravu, na kterou jsme geneticky naprogramováni (10). Zavedení nové, tzv. západní stravy, je tak možnou příčinou chronických degenerativních chorob jako je ateroskleróza, hypertenze nebo diabetes (12). Byly pozorovány skupiny obézních Aboriginiů (původní obyvatelé Austrálie) a obézních Havajců, které po příjmu své původní stravy ad libitum opět zhubly (13). Ať přijmeme rozšířenou a snad respektovanou teorii spořivých genů anebo ne, jisté je, že v současné době přírodní selekce upřednostňuje jedince, kteří nehromadí příliš tuku, zvláště ve viscerální oblasti. Viscerálně obézní jsou ohroženi četnými zdravotními komplikacemi, ve svém důsledku předčasným úmrtím Bílá tuková tkáň Bílá tuková tkáň je významný orgán, který plní v organismu řadu funkcí. Kromě funkce tepelného a mechanického izolátoru má zásadní roli v kontrole energetické rovnováhy organismu (14). V 90. letech minulého století došlo k revolučnímu objevu tukové tkáně jako endokrinního orgánu, který syntetizuje a secernuje některé hormony a řadu signálních proteinů a faktorů souhrnně nazývaných adipocytokiny (15) nebo adipokiny. Patří mezi ně bílkoviny, které se účastní metabolismu tuků a sacharidů, regulace tlaku krve, angiogeneze, zánětlivých pochodů, procesů imunitního systému a dalších důležitých pochodů v organismu. Podíl bílé tukové tkáně v celkové hmotnosti jedince představuje fyziologicky přibližně 8 20 % u mužů a % u žen, a procento zastoupení vzrůstá s přibývajícím věkem ( U více než poloviny české populace je však 10

20 procento zastoupení tuku v těle daleko vyšší, neboť většina české populace se potýká s nadváhou nebo obezitou, jak bylo demonstrováno. Základními jednotkami bílé tukové tkáně jsou adipocyty a tzv. stromavaskulární frakce, kterou tvoří makrofágy, fibroblasty, endoteliální buňky a preadipocyty. Mezi adipocyty probíhají kapiláry drénující tukovou tkáň a vlákna sympatického nervového systému. Zralý, tj. plně diferencovaný bílý adipocyt má kulatý tvar, a téměř celý objem buňky vyplňuje lipidová kapénka s úzkým lemem cytoplazmy. Na periferii buňky jsou uloženy jádro a buněčné organely (mitochondrie, endoplazmatické retikulum a lyzozomy). Cytoplazmatická membrána adipocytu je bohatá na malé invaginace zvané caveoly. Zvláštností adipocytu oproti jiným buňkám je jeho proměnlivá velikost v závislosti na fyziologických okolnostech. Průměr buňky může měřit přibližně od 10 do 180 μm. Při nadměrném příjmu energie se nezužitkovaná energie v organismu ukládá mimo jiné ve formě triacylglycerolů (TAG) do tukové tkáně. Při rostoucí potřebě ukládat TAG může bílá tuková tkáň zvětšovat svůj objem dvojím mechanismem, hypertrofií (zmnožováním intracelulárních lipidů) nebo hyperplazií (zvýšením počtu adipocytů). Hypertrofický adipocyt se stává dysfunkčním, respektive probíhá v něm zvýšená lipolýza a tak secernuje více NEMK, a ve zvýšené míře secernuje také tumor nekrotizující faktor α (tumor necrosis factor α, TNF-α). Oba faktory vedou k rozvoji inzulínové rezistence (16;17). Inzulín je hlavním regulátorem hormon senzitivní lipázy (HSL) a lipoproteinové lipázy (LPL). Dle některých prací jsou výše zmíněné lipázy více senzitivní k působení inzulínu a mají tak větší schopnost akumulace NEMK a tím brání jejich ukládání do netukových tkání (18;19). Tuková tkáň má ale omezenou schopnost zvětšovat svůj objem. Nestačí-li při rostoucí potřebě ukládat TAG, ty se pak ukládají ve větší míře v kosterním svalu, játrech a pankreatu, což přispívá k rozvoji inzulínové rezistence v těchto orgánech Podkožní a viscerální tuková tkáň Topicky i pro jejich odlišné metabolické vlastnosti rozlišujeme dva druhy bílé tukové tkáně, podkožní a nitrobřišní (viscerální) tukovou tkáň (SAT a VAT). Podkožní tukové tkáně je většina, asi 80% (20;21). Hlavní oblasti pro ukládání podkožního tuku jsou femorogluteální oblast a břišní stěna. Viscerální tuk je tuk uložený v břišní dutině. Tvoří přibližně % celkového tuku u mužů a 5-8 % u žen (21). Relativní podíl viscerálního tuku na tuku celkovém stoupá s přibývajícím věkem u obou pohlaví (21). Při zvětšování objemu tukové tkáně viscerální tuk roste především hypertrofií, podkožní tuk hypertrofií i hyperplazií (22). Srovnání endokrinní funkce SAT a VAT nevede k jednoznačným závěrům, dle řady prací je 11

21 snad VAT metabolicky aktivnější, obsahuje více makrofágů (žírných buněk) ve srovnání s SAT (23;24). Produkuje více prozánětlivých faktorů (zejména TNF-α a interleukin 6, IL-6). Viscerální tuk je rezistentní vůči antilipolytickému účinku inzulínu, což může vést k vyššímu uvolňování NEMK. Ty se dostávají portální drenáží viscerální tukové tkáně přímo do jater, kde se spolu s adipokiny secernovanými viscerálními adipocyty a dalšími mechanismy podílejí na vzniku inzulinorezistence Obezita a zánět Na chronické stresové prostředí při obezitě odpovídá organismus charakteristickou systémovou zánětlivou reakcí (25-28), která pravděpodobně podmiňuje rozvoj inzulínové rezistence a dalších metabolických komplikací (27;29;30). Ačkoliv se předpokládá, že zánět je následkem obezity a že primárně souvisí s místními změnami uvnitř tukové tkáně (viz dále), objevila se také hypotéza, že obezita by mohla být vpodstatě důsledkem již existujícího zánětu (25). Klíčovým spouštěcím mechanismem zánětu je pravděpodobně hypoxie vznikající při zvětšování objemu bílé tukové hmoty, kdy dochází ke zvýšené nekróze hypertrofických adipocytů s následnou zvýšenou infiltrací tkáně makrofágy (31;32). Makrofágy ovlivňují endokrinní aktivitu tukové tkáně zvýšením produkce prozánětlivých cytokinů a dalších faktorů vyvolávajících subklinický zánět. U obézních je tak v cirkulaci zvýšená hladina některých markerů zánětu v cirkulaci, prozánětlivých cytokinů a proteinů akutní fáze. Patří mezi ně IL-6, TNF-α (33), C-reaktivní protein (CRP), haptoglobin, monocytový chemoatraktant-protein-1 (MCP-1), leptin a další (25;27;34;35). Některé z těchto faktorů jsou přímo secernovány tukovou tkání, tuková tkáň však přispívá k rozvoji zánětu pravděpodobně také nepřímo - některé adipokiny mohou aktivovat jaterní imunitní mechanismy s produkcí zánětlivých mediátorů, například zvýšené uvolňování IL-6 z adipocytů stimuluje jaterní produkci CRP (18;36) Lipolýza v bílé tukové tkáni Základními pochody řídícími ukládání lipidů v tukových buňkách jsou lipogeneza a lipolýza. Lipolýza je hydrolýza TAG cestou diacylglycerolu a monoacylglycerolu na tři molekuly volných mastných kyselin a jednu molekulu glycerolu. Odehrává se intra- i extracelulárně ve všech tkáních, které jsou schopné skladovat TAG, především v tukové tkáni, játrech a ve svalech. Lipolýza v játrech a ve svalech poskytuje mastné kyseliny k lokální oxidaci. 12

22 Naprostá většina triglyceridů (> 95 %) se nachází v adipocytech tukové tkáně. NEMK, uvolněné při hydrolýze těchto triglyceridů jsou v určité míře zabudovány zpět do triglyceridů v procesu reesterifikace. Glycerol nemůže být takto využit, protože v adipocytech chybí potřebný enzym glycerolkináza. Glycerol je dále využit převážně v játrech. NEMK jsou důležitým energetickým substrátem pro kosterní sval v klidovém stavu, srdeční sval, játra a kůru ledvin (37-41). Jsou prekurzory pro tvorbu TAG esterifikací v tukové tkáni, játrech a svalu. Dále jsou využívány jako esenciální prekurzory pro syntézu lipidů a membrán, a jsou mediátory v procesech buněčné signalizace. Jsou také zahrnuty v regulaci množství metabolických procesů v těle, kontrolují například expresi genů kódujících uncoupling protein 3 v kosterním svalu (42;43) a svalovou karnitine palmitoyl transferázu 1 v myocytech (43;44). Cirkulujícímu poolu NEMK přispívá hlavně SAT (45-48), zatímco NEMK uvolněné z VAT přispívají k systémovým koncentracím jen velmi málo Regulace lipolýzy za fyziologických podmínek Lipolýza v tukové tkáni kryje denní energetickou potřebu z %, a tak se velmi významně podílí na dodávce energie pro organismus. Pro udržení celotělové energetické rovnováhy je důležitá správná regulace lipolýzy, interakcí mezi lipolyticky a antilipolyticky působícími látkami. Přímými regulátory lipolýzy jsou hormony a aktivátory nebo inhibitory adenylátcyklázy a enzymů kontrolujících hladiny cyklického adenosinmonofosfátu (cyclic adenosin monophosphate, camp) a cyklického guanosinmonofosfátu (cyclic guanosine monophosphate, cgmp) v buňce. Za fyziologických okolností jsou nejdůležitějšími hormony regulujícími lipolýzu (aktivaci a inhibici lipáz) katecholaminy (adrenalin a noradrenalin), atriální natriuretický peptid (ANP) a inzulín. Lipolytické hormony stimulují lipolýzu prostřednictvím aktivace lipolytických enzymů Lipolytické enzymy Dosud jsou známy tři hlavní enzymy zavzaté do procesu hydrolýzy TAG: tuková triglyceridová lipáza (adipose triglyceride lipase, ATGL), hormon-senzitivní lipáza (hormonesensitive lipase, HSL) a monoglyceridová lipáza (monoglyceride lipase, MGL). ATGL je zodpovědná za iniciaci lipolýzy - selektivně hydrolyzuje TAG za uvolnění diacylglycerolů a NEMK (49). ATGL je fosforylovaná na dvou serinových zbytcích Ser404 a Ser428 (50;51). Na rozdíl od HSL fosforylace ATGL nezahrnuje PKA. Nepřímým regulátorem ATGL 13

23 v odpovědi na β-adrenergní stimulaci je perilipin-1 a CGI-58. Perilipin-1 a CGI-58 jsou proteiny na povrchu lipidové kapénky. Perilipin-1 kontroluje aktivaci ATGL v bílé tukové tkáni interakcí s koaktivátorem CGI-58 za fosforylace camp-dependentní protein kinázou A (PKA) (51). Diacylglyceroly následně postupují k dalšímu štěpení hormon senzitivní lipázou. HSL je multifunkční enzym schopný hydrolyzovat acylestery včetně TAG, diacylglycerolů a monoacylglycerolů. V kaskádě hydrolýzy TAG je rychlost-limitujícím enzymem pro katabolismus diacylglycerolů (52;53). Fosforylace HSL protein kinázou A na fosforylačních místech Ser 659 a Ser 660 (54) vede k aktivaci enzymu. Kromě PKA mohou fosforylovat HSL i jiné protein kinázy extracelulárně aktivovaná kináza, glykogen syntáza kináza-4 (51;55), Ca2+/kalmodulin-dependentní kináza II a AMPK (51;56). Translokace fosforylovaného enzymu na lipidovou kapénku v bílé tukové tkáni je zprostředkováno perilipinem-1. ATGL je zásadní pro bazální lipolýzu, HSL je hlavní lipázou pro katecholaminy a natriuretickými peptidy stimulovanou lipolýzu (57). Zatímco HSL a ATGL jsou hormon senzitivní lipázy (ATGL je aktivovaná β-adrenergními stimuly), zatím není žádný důkaz, že mrna MGL nebo aktivita enzymu jsou regulovány buď hormony anebo energetickým stavem buňky (51). MGL štěpí monoglyceroly na glycerol a NEFA (58). ATGL, HSL a MGL se podílejí z více než 95 % na lipolýze v bílé tukové tkáni. Jsou ještě jiné minoritní lipázy, které mají na procesu lipolýzy podíl, například lipáza Ces 3 nebo triacylglycerolová hydroláza 2 (TGH2) (59;60) Hormony regulující lipolýzu Katecholaminy (produkované dření nadledvin nebo lokálně adrenergními postgangliovými neurony sympatiku) stimulují lipolýzu aktivací β1 a β2 adrenoreceptorů a inhibují lipolýzu prostřednictvím aktivace α2 adrenoreceptorů. Navázání katecholaminů na receptory β1 a β2 aktivuje Gs protein adenylát cyklázu za vzestupu hladin camp a zvýšené aktivity PKA. Po navázání na α2 adrenoreceptory se aktivuje inhibiční Gi protein za snížení hladin camp a snížené aktivity PKA. Relativní zastoupení α a β adrenoreceptorů v orgánu tak určuje lipolytickou aktivitu. Příkladem, kdy se v regulaci lipolýzy uplatňují katecholaminy, je fyzické cvičení, při kterém zvýšená hladina cirkulujících katecholaminů, snížená sekrece inzulínu a dílem snad i zvýšená hladina sympatiku aktivuje β receptory. V regulaci lipolýzy během cvičení se uplatňují i α2 adrenoreceptory. Při mikrodialyzačním experimentu vedla blokáda α2 adrenoreceptorů ke zvýšené lipolytické odpovědi během cvičení (61). Dalším 14

24 příkladem, kdy se uplatňuje zvýšená lipolýza stimulovaná katecholaminy jsou stresové situace jako operace, zranění, těžké popáleniny, psychický stres (47) a srdeční selhání (62). Natriuretické peptidy patří mezi další známé regulátory lipolýzy (63;64). Natriuretický peptid typ A (natriuretic peptide type A, ANP) a natriuretický peptid typ B (natriuretic peptide type B, BNP) stimulují lipolýzu (47;65-67) v lidských adipocytech. Po navázání ANP na receptor (47;67) dochází k aktivaci GMP-dependentní protein kinázy G (PKG) a produkci cyklického guanosin monofosfátu (cgmp) a fosforylaci HSL (67-69). Zvýšená hladina intracelulárního cgmp vede k fosforylaci HSL a perilipinu cgmp-dependentní protein kinázou (70). Fosforylace perilipinu indukuje důležitou alteraci povrchu lipidové kapénky a usnadňuje účinek HSL. Fosforylace perilipinu navíc pomáhá i aktivitě ATGL. Stimulace lipolýzy natriuretickými peptidy je tak nezávislá na produkci camp a aktivitě PKA. Tato dráha je důležitá například při chronické léčbě antagonisty β-receptorů, které inhibují katecholaminyindukovanou lipolýzu (71;72). Méně bylo dosud známo o úloze BNP v regulaci lipolýzy bylo sice prokázáno, že BNP stimuluje lipolýzu in vitro (47;67), v in-vivo experimentech za fyziologických podmínek a u pacientů s ChSS zatím však tento efekt nebyl ověřen. Inzulín a inzulínu podobný růstový factor (insulin-like growth factor, IGF) jsou nejvýznamnějšími inhibitory lipolýzy v lidských adipocytech (73;74). Receptory pro inzulín a IGF patří mezi tyrozinkinázové receptory. Po navázání na receptor se aktivuje cyklická nukleotidová fosfodiesteráza 3B (cyclic nukleotide phosphodiesterase 3B, PDE3B). To vede k degradaci camp na 5 AMP, inaktivaci PAK a snížené fosforylaci HSL a perilipinů a tím k inhibici lipolýzy. Zvýšení hladin inzulínu s inhibicí HSL v tukové tkáni je typické pro postprandiální stav. Hyperinzulinémie navíc snižuje lipolýzu stimulující účinek katecholaminů (75). Inzulín také stimuluje reesterifikaci NEMK uvolňovaných z adipocytů. Postprandiální hyperinzulinémie stimuluje LPL v cévách, která je zodpovědná za intravaskulární lipolýzu. Naopak snížení hladin inzulínu, které je patrné v tzv. postabsorpčním stavu (při lačnění), je hlavním stimulem pro zvýšení lipolýzy. Během hladovění, při stresu a při cvičení je lipolýza stimulovaná růstovým hormonem za účelem úspory glukózy a proteinů za výdeje lipidů (76). Mezi další minoritní regulátory lipolýzy patří například kyselina nikotinová (antilipolytický efekt), adrenomedulin (antilipolytický efekt), prostaglandin E2 (antilipolytický efekt) (47;77), perilipin 1 ( protein na povrchu lipidové kapénky, nezbytný pro β-adrenergně stimulovanou lipolýzu v tukové tkáni, tedy pro aktivaci ATGL a HSL) a další. Některé látky secernované tukovou tkání, tzv. 15

25 adipokiny, hrají také roli v regulaci lipolýzy: byl objeven silný lipolytický efekt prozánětlivých cytokinů TNF-α a IL-6 (78) Porucha regulace lipolýzy u obézních Ačkoliv určující v rozvoji obezity je nerovnováha mezi příjmem a výdejem energie, jedním z dalších faktorů vedoucích k nadměrné akumulaci tukové tkáně může být také porucha v lipolytické regulaci. Obézní mají zvýšenou spontánní lipolýzu v SAT in-vitro a in-vivo (79) a sníženou lipolýzu stimulovanou cvičením nebo lokálním in-situ podáváním katecholaminů v porovnání se zdravými jedinci, částečně díky zvýšenému antilipolytickému účinku v SAT zprostředkovanému α2-adrenergními receptory (75;80;81). Ve VAT je naopak zvýšený účinek katecholaminů díky zvýšené odpovědi β adrenergních receptorů a snížené funkci α2 adrenoreceptorů (47;82). Dále mají obézní poruchu exprese HSL v SAT (47;81;83), β- adrenoreceptoru (84) a dalších regulačních jednotek, některé studie dokumentují i poruchu exprese ATGL (85), zatímco jiné studie našly hladinu ATGL mrna bez ovlivnění obezitou (86-88). Pokles v expresi HSL je také u inzulin-rezistentních a pacientů s diabetem 2. typu (47;84;89). Snížená exprese HSL je dokonce i u neobézních s rodinnou anamnézou obezity (47;90). Lipolytický účinek ANP je snížen v SAT obézních (47;91). Byl dokumentován snížený antilipolytický účinek prostaglandinů a adenosinu v podkožních adipocytech u obézních (47;92;93). Nejnápadnější abnormalitou v metabolismu NEMK u obézních je neschopnost potlačovat lipolýzu v tukové tkáni v odpovědi na postprandiální hyperinzulinémii (47;94-96). Antilipolytický účinek inzulínu je ale obtížné studovat, protože inzulínem indukované antilipolýza je vždy měřena proti isoproterenolem nebo katecholaminy indukové lipolýze, které mohou být u obézních také změněny. A tak byly nalezeny různé závěry normální, snížená i zvýšená antilipolýza u obézních. Obézní mají sníženou hladinu cirkulujícího růstového hormonu ve srovnání s jedinci s normální hmotností (97;98), což je možná jedním z faktorů přispívajících k obezitě, neboť tukové zásoby jsou hůře odbouratelné (97). Je otázkou, zda zvýšená lipolýza, kterou pozorujeme u obezity, je vlastním adaptačním mechanismem organismu ke snížení zánětu v tukové tkáni, uvolňování mastných kyselin a zabránění jejich škodlivým účinkům na systémový metabolismus v indukci inzulínové rezistence (99;100). 16

26 2.3.3 Porucha regulace lipolýzy u srdečního selhání Srdeční selhání je dalším příkladem patologické situace, u které pozorujeme poruchu regulace lipolýzy. Mechanismus zvýšené lipolýzy v tukové tkáni pacientů s ChSS není zcela znám. Dosud je přičítán stimulačním účinkům hyperadrenergního stavu u ChSS (62) a TNF-α (101), případně sníženému antilipolytickému účinku inzulínu při inzulínové rezistenci, která je často přítomná u pacientů s ChSS. Výsledná zvýšená koncentrace NEMK vede ke sníženému vstupu glukózy do myocytů (102) a zvýšené glukoneogenezi. Tyto změny v glukózovém metabolismu spolu s vysokými NEMK a následnou stimulací zánětlivého systému (16) mohou mít nežádoucí účinky na srdeční funkci (72) snížením inzulínové senzitivity, snížením kardiální účinnosti (103), a přispívají k myokardiální lipotoxicitě ( ). Zvýšená lipolýza u ChSS přispívá také k poklesu tělesné hmotnosti a kardiální kachexii, která je spojena s horší prognózou srdečního selhání (68;72;107;108) Metody měření metabolismu tukové tkáně Ke studii metabolismu tukové tkáně slouží řada in vivo a in vitro metod In vitro metody Isolované adipocyty. Revolučním krokem pro studium hormonální regulace a metabolizmu adipocytu in vitro byla izolace adipocytu z tkáně digescí kolagenázou (109). Adipocyty se izolují ze vzorků tukové tkáně odebraných buď perkutánně jehlovou biopsií (SAT) nebo během chirurgických operací (i VAT). Isolované adipocyty jsou inkubovány s látkami, které ovlivňují lipolýzu. Jako ukazatel lipolýzy je následně měřena koncentrace glycerolu v mediu suspenze adipocytů. Ve vzorcích z biopsií tukové tkáně lze dále určovat aktivitu proteinů zahrnutých v regulaci lipolýzy, nebo genové exprese enzymů a receptorů podílejících se na regulaci lipolýzy (například (110) ). In vitro metody použité v našich studiích jsou podrobně popsány v publikacích (Publikace č. 1, 2, 4). Použití in vitro studií při studiu hormonální regulace lipolýzy umožňuje oproti in vivo metodám kontrolu tkáňového prostředí, zase má ale nevýhody oproti in vivo metodám tkáň je vyňata z přirozeného prostředí, kde je ovlivňovaná lokálními faktory (například průtok krve tkání nebo lokální sympatická inervace). 17

27 2.4.2 In vivo metody Pro systémové měření obratu NEMK a glycerolu in vivo slouží detekce molekul značených izotopy. Nevýhodou je, že některé lipolýzou produkované metabolity nedosáhnou systémové cirkulace, jako například produkty lipolýzy viscerální tukové tkáně uvolňované do portální žíly a metabolizované játry dřív, než mohou být detekovány. Dalším problémem je reutilizace části mastných kyselin lokálně tkáněmi před dosažením systémové cirkulace. In vivo pokusy však ukazují, že reesterifikace NEMK je tak minimální, že pro odraz metabolismu lze použít i značených NEMK (39; ). Glycerol oproti NEMK nemůže být adipocytem reutilizován, protože v tukové tkáni je jen malá aktivita glycerol kinázy, a tak se koncentrace glycerolu používá jako ukazatel lipolýzy. Glycerol však může pocházet nejen z hydrolýzy tkáňovou HSL, ale také cévní LPL (39), a tak pravděpodobně měřená koncentrace glycerolu pochází z aktivit obou hormonů. Analýza značených NEMK nebo glycerolu se provádí plynovou chromatografií s hmotnostně spektrometrickou detekcí anebo vysoce účinnou kapalinovou chromatografií. Regionální/lokální lipolýza in vivo může být měřena měřením arterio-venózního rozdílu koncentrace metabolitů v krvi drénující orgán nebo tkáň (používáno primárně v SAT). Měření arterio-venózního rozdílu koncentrace TAG umožňuje rozlišit účinek LPL (která hydrolyzuje triacylglyceroly pro vstup lipidů do buněk) od účinku HSL (jež mobilizuje zásoby lipidů z buněk do cirkulace). Tyto metody však neposkytují přesné informace o funkci buněk in situ, neboť není sledován extracelulární prostor v tukové tkáni. Přesnější metodou pro sledování regionální lipolýzy (pouze v SAT) je mikrodialýza. Mikrodialýza je metoda, při které je jedna nebo více dialyzačních sond vpravena do tkáně. Sonda obsahuje dialyzační katetr s dvěmi lumen, a na konci sondy je dialyzační membrána. Do vnitřního lumen katetru je velmi pomalu vháněna tekutina (~ 0,5 μl/min) a v dialyzátu vytékajícím z vnějšího lumen jsou měřeny intersticiální koncentrace metabolitů. Mikrodialýza je vhodná pro sledování malých ve vodě rozpustných molekul, například pro měření purinů, aminokyselin, glukózy, laktátu, pyruvátu a glycerolu, které snadno projdou přes mikrodialyzační membránu (114). Dle velikosti sledované molekuly lze užít různé typy sond s odlišně velikými otvory v membráně. V podkožní tukové tkáni mohou být touto metodou studovány lokální farmakologické nebo fyziologické účinky látek nebo hormonů. Jako odraz lipolytického efektu je měřena intersticiální koncentrace glycerolu (39;115;116). Tato technika nemůže být použita pro studování metabolismu NEMK, protože NEMK se v cirkulaci váží na albumin, a nejsou tak dialyzovatelné při použití standardní dialyzační membrány (117). Mikrodialyzační technikou může být nepřímo sledován místní tok krve při 18

28 přidání ethanolu do rozpouštědla a únik ethanolu do tkáně je určován měřením změny koncentrací vpouštěného a vytékajícího ethanolu. Tento rozdíl odráží změny v místním průtoku krve (114). Metoda mikrodialýzy použitá v naší studii je podrobně popsána v publikaci č AMPK Fyziologicky je v klidu pool TAG v adipocytech v rovnovážném stavu. Mastné kyseliny jsou průběžně uvolňovány z uskladněných TAG a mohou být opět reesterifikovány. Stále probíhající hydrolýza a resyntéza TAG vytváří tzv. cyklus substrátů, který umožňuje adipocytům pohotově reagovat, jsou-li v periferii potřeba mastné kyseliny (118). Reesterifikace TAG je energeticky náročná, spotřebovává ATP (adenosin trifosfát) a generuje AMP (adenosin monofosfát). Zvýšený poměr AMP/ATP aktivuje systém AMPK (119), enzymového komplexu složeného z katalytické α-podjednotky a dvou regulačních podjednotek (β, γ). AMPK udržuje rovnováhu mezi produkcí a spotřebou ATP, a je tak klíčovým regulátorem energetické rovnováhy na buněčné i celotělové úrovni. AMPK je aktivována v odpovědi na metabolické podněty jako je hypoglykémie (120), ischémie (121), svalová kontrakce (122;123) nebo hypoxie (124) a modulována hormony a cytokiny, které ovlivňují celotělovou energetickou rovnováhu jako leptin, adiponektin (125), resistin, ghrelin a kanabioidy. AMPK v tukové tkáni reguluje lipogenezi, β-oxidaci a lipolýzu (126;127). Fosforylovaná AMPK obecně aktivuje katabolické dráhy, které produkují ATP a inhibuje anabolické procesy spotřebovávající ATP. K těmto účinkům dochází několika mechanismy: 1. přímou fosforylací anabolických enzymů (inhibice syntézy cholesterolu fosforylací 3-hydroxy-3-metylglutaryl- CoA reduktázy), fosforylace HSL, 2. déletrvajícím účinkem cestou změny genové exprese (např. upregulace oxidace glukozy a tuku díky zvýšené expresi mitochondriálních genů, downregulace genů glukoneogeneze), 3. kombinovaným účinkem (např. inhibice syntézy mastných kyselin cestou fosforylace ACC 1 isoformy acetyl-coa karboxylázy (ACC 1), kombinovaný s inhibicí exprese ACC 1 a genů syntézy mastných kyselin). Bylo demonstrováno, že aktivace AMPK v SAT i VAT působí antilipolyticky (128;129). Omezením lipolýzy a snížením cirkulujících koncentrací mastných kyselin, potenciálně pro buňku toxických, tak pravděpodobně vykazuje svým působením pro buňku výhodné účinky. 19

29 2.6. Adipokiny Jak jsem výše zmínila, jedním z cytokinů aktivujícím AMPK v tukové tkáni je adiponektin. Tento cytokin patří mezi adipokiny, skupiny proteinů syntetizovaných a secernovaných tukovou tkání. Adipokiny se navzájem liší ve struktuře a funkci. Účinkují buď lokálně (autokrinními nebo parakrinními účinky) nebo endokrinní cestou nebo působí více cestami (například leptin a IL- 6). Adipokiny se dají různě kategorizovat, například dle těchto kritérií: 1. faktory přímo ovlivňující metabolismus (například adiponektin, insulin-like growth factor [IGF-1], leptin, omentin, resistin, visfatin, retinol-binding protein), 2. prozánětlivé faktory a reaktanty akutní fáze (například IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, TNFα), 3. složky extracelulární matrix (například collagen I, collagen III, collagen IV, collagen VI, fibronektin), 4. promitogenní a proangiogenní faktory (například angiopoietin 1 a 2, tkáňový faktor, transforming growth factor- β [TGF-β], VEGF) (130). Dalším třídícím kritériem adipokinů by mohl být zdroj jejich produkce. Některé adipokiny jsou produkovány hlavně adipocyty (například adiponektin a leptin), některé převážně buňkami stroma-vaskulární frakce tukové tkáně (například TNFα, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1) (131) Adiponektin Objev adiponektinu Adiponektin byl poprvé popsán v polovině 90. let 20. století nezávisle na sobě čtyřmi výzkumnými skupinami ( ). Hormon se dle svých objevitelů jmenoval také Acrp30, AdipoQ, apm1 a GBP28. Jako první publikoval ve své práci v roce 1995 izolaci DNA nového adipocytárního proteinu Acrp30 (adipocyte complement-related protein of 30 kda) Philips Scherer. Popsal strukturální podobu proteinu k faktoru komplementu C1q a k hibernation-specific proteinu izolovanému z plazmy sibiřských veverek. Protein je složený z 247 aminokyselin, s karboxy-terminální doménou, která je homologní k mnoha proteinům, například globulární doméně kolagu VIII a X a podjednotkám faktoru komplementu C1q. Acrp30 tvoří homo-oligomery, které podstupují post-translační modifikace. Sekrece Acrp30 je zvyšována inzulínem. Acrp30 byl definován jako možný faktor, který se účastní na udržování energetické homeostázy zahrnující příjem potravy a katabolismus cukrů a tuků (135). Skupina Erdinga Hu publikovala v roce 1996 práci popisující objev proteinu identického k Acrp30. Izolovaná cdna, kódující polypeptid obsahující 247 aminokyselin se sekreční 20

30 signální sekvencí na amino konci řetězce, kolagenním řetězcem a globulární doménou, byla nazvaná adipoq. Byla popsána homologie globulární domény (COOH terminální oblasti) s podjednotkou faktoru komplementu C1q, kolagenem α1 (X) a s faktorem cerebellinem. Popsali signifikantně sníženou expresi adipoq mrna v tukové tkáni obézních myší a lidí (132). Japonská skupina Kazuhisa Maeda a spol. se zabývala analýzou genů aktivních v tukové tkáni a v roce 1996 publikovala práci popisující cdna klonující a exprimující nový adipocytární faktor podobný kolagenu, apm1 (adipose most abundant gene transcript 1), polypeptid o 244 aminokyselinách. Tato skupina stejně jako předchozí skupiny definovala protein jako specifický pro tukovou tkáň, a též podobnost s kolagenem X a VIII a s faktorem komplementu C1q (133). Další japonská skupina Yasuko Nakano a spol. publikovala rovněž v roce 1996 práci popisující izolaci proteinu GBP28 (gelatin-binding protein of 28 kda). Popisují GBP28 jako protein patřící do rodiny proteinů mající kolagen-like doménu, prostřednictvím které formují homo-trimery, které se dále formují do oligomerických komplexů (134) Známé účinky adiponektinu Adiponektin byl původně definován jako hormon produkovaný výlučně zralými adipocyty, z výsledků studií na zvířecích modelech se ale zdá, že syntetizovat a sekretovat adiponektin jsou schopné i buňky kosterního svalu ( ) a na zvířecích modelech i u lidí kardiomyocyty (140;141). Adiponektin má důležitou úlohu v regulaci energetické rovnováhy, má prokázané insulinsenzitizující, protizánětlivé a antiaterosklerotické účinky (142;143). Široká distribuce adiponektinových receptorů v periferních tkáních a orgánech značí, že adiponektin má pleiotropní účinky na celotělový metabolismus (144;145). Adiponektin zvyšuje příjem glukózy a oxidaci mastných kyselin v kosterním svalu(143;146;147) a v tukové tkáni (148), což vede ke snížení cirkulujících volných mastných kyselin. V játrech adiponektin zvyšuje účinek inzulínu (zvyšuje schopnost inzulínu v subfyziologických dávkách potlačovat produkci glukózy v játrech), a snižuje vstup mastných kyselin do jater (149;150), čímž snižuje plazmatickou hladinu glukózy. V hypothalamu adiponektin zvyšuje chuť k jídlu a snižuje energetický výdej u myší (151). Adiponektin má důležitou protektivní úlohu při procesu karcinogeneze (152). Adiponektin působí protizánětlivě (153), snižuje aktivaci a proliferaci T buněk, inhibuje uvolňování NF-κB dependentních cytokinů a expresi molekul včetně TNF-α a 21

31 IL-6 (154), inhibuje fagocytózu. Indukuje také produkci protizánětlivých mediátorů IL-10 v lidských monocytech, makrofázích a dendritických buňkách a signifikantně snižuje produkci prozánětlivých cytokinů IFN-γ (155). Adiponektin dále vykazuje vaskuloprotektivní účinky stimulací proliferace endoteliálních buněk (156). Adiponektin stimuluje proliferaci, diferenciaci a mineralizaci osteoblastů (157;158). Adiponektin je označován za kardioprotektivní hormon, působí antiateroskleroticky (pravděpodobně modulací koncentrace HDL cholesterolu), inhibuje hypertrofickou remodelaci srdečního svalu a apoptózu kardiomyocytů Receptory pro adiponektin Dosud byly popsány tři receptory pro adiponektin: adiponectin receptor 1 a 2 (AdipoR1, AdipoR2) a T-cadherin (144;159). AdipoR1 a AdipoR2 jsou exprimovány v mnoha tkáních včetně kosterního svalu (zde převážně AdipoR1), jater (převážně AdipoR2), pankreatu, centrální nervové soustavě, osteoblastech a v podkožní i viscerální tukové tkáni (zde v adipocytech a makrofázích) (150;151;157; ). Exprese mrna AdipoR1 a AdipoR2 se signifikantně neliší mezi oběma depy tukové tkáně, a exprese AdipoR2 mrna ve viscerálním i podkožním tuku je pozitivně asociovaná s cirkulující hladinou adiponektinu (160). Po navázání adiponektinu na receptory dochází ke stimulaci AMP-aktivované protein kinázy, PPAR-α ligand aktivity a aktivace NF-κB signální dráhy (143;165). T-cadherin váže hexamer adiponektinu a HMW adiponektin, ale ne trimerický a globulární adiponektin. Globulární a trimerický adiponektin se vážou přednostně na AdipoR1 receptor, zatímco multimerní izoforma se váže na AdipoR1 a AdipoR2 víceméně stejnoměrně (166). Bylo popsáno, že T-cadherin může vázat adiponektin v C2C12 myoblastech. Protože však tento receptor není exprimován v játrech (144), nejdůležitějším cílovém místě adiponektinu, a nemá intracelulární doménu, neúčastní se pravděpodobně na účincích adiponektinu, a je jen jedním z proteinů vázajících adiponektin (166) Multimerní izoformy adiponektinu a jejich biologická aktivita Adiponektin je intracelulárně a v cirkulaci přítomen v několika multimerních izoformách. Základním multimerem je adiponektin o nízké molekulové hmotnosti (low-molecular weight, LMW), trimer složený ze tří molekul adiponektinu spojených hydrofobními vazbami. Další jednotkou je adiponektin o střední molekulové hmotnosti (middle-molecular weight, MMW), což je hexamer, složený ze dvou trimerů spojených disulfidickými vazbami. Adiponektin o 22

32 vysoké molekulární hmotnosti (high-molecular weight, HMW) je multimer spojený z monomerů (134;135;167;168). V nízké koncentraci cirkuluje i jako globulární adiponektin, produkt proteolytického štěpení adiponektinové molekuly obsahující C-terminální globulární doménu (146;167;169). Stav polymerizace proteinu ovlivňuje biologickou aktivitu adiponektinu (143;146;147;149;170;171). Předpokládá se, že jednotlivé formy adiponektinu po vazbě na receptor aktivují odlišné signální transdukční dráhy a mají pak rozdílné funkce v cílových orgánech. Globulární adiponektin je považován za aktivní formu adiponektinu ve svalu (146;169;172). Bylo popsáno, že globulární (143;146;147;171) a trimerický adiponektin (171) zvyšují oxidaci mastných kyselin ve svalu, což nedělá celková molekula adiponektinu ani HMW forma (147;171). Jiná studie (173) uvádí, že HMW je nejvíce aktivní formou adiponektinu ve snižování glykémie u myší. Dle další studie (174) pouze HMW adiponektin selektivně suprimuje apoptózu endoteliálních buněk, zatímco hexamer ani trimer tento účinek nemají. HMW adiponektin zvyšoval a LMW adiponektin snižoval uvolňování IL-6 z monocytů, tím se zdá, že HMW adiponektin má prozánětlivé účinky a LMW adiponektin má protizánětlivé účinky (154). Jsou známé rozdíly mezi SAT a VAT v kapacitě syntetizovat a uvolňovat adiponektin, nicméně aktuální poznatky nejsou jednotné. V lidské VAT byly nalezeny nižší mrna adiponektinu a hladiny hormonu než v SAT (175), zatímco v jiné studii je popisována vyšší sekrece adiponektinu omentálními adipocyty než podkožními adipocyty (176). Při porovnání sekrece celkového adiponektinu a HMW adiponektinu z explantů SAT před a po dietní intervenci vedoucí k úbytku hmotnosti nebyl nalezen rozdíl v sekreci proteinu (177). U řady patologických stavů, například u srdečního selhání, u kachexie a anorexia nervosa je vyšší koncentrace adiponektinu v plazmě. Naopak snížené koncentrace adiponektinu nacházíme například u viscerálně obézních, pacientů s inzulínovou rezistencí a diabetes mellitus 2. typu, u pacientů s ischemickou chorobou srdeční, hypertenzí, u některých karcinomů a jaterní steatózy ( ). Obezita snižuje nejen plazmatickou hladinu adiponektinu, ale také expresi AdipoR1 a AdipoR2 receptorů, a tím snižuje senzitivitu adiponektinu a vede k rozvoji inzulínové rezistence (181). Jaké mechanismy vedou ke snížené hladině adiponektinu v plazmě u obézních není zatím zřejmé. Zdá se, že zvýšený oxidační oxidační stres v tukové tkáni by mohl přispívat k inhibici exprese adiponektinu (166;182). Plazmatické hladiny adiponektinu jsou ale ovlivněny celou řadou faktorů včetně pohlaví, stáří a životního stylu. 23

33 2.7 Chronické srdeční selhání Chronické srdeční selhání je stav postižení srdce, kdy srdce není schopno vyhovět oběhovým nárokům organismu, tj. není schopno krýt metabolické potřeby tkání. Nejčastějšími příčinami ChSS je ischemická choroba srdeční, kardiomyopatie, hypertenze a srdeční vady. Ke stanovení tíže nebo funkční závažnosti srdečního selhání se používá klasifikace NYHA (New York Heart Association). Tab. 2: Funkční klasifikace srdečního selhání podle New York Heart Association (NYHA). Modifikace z roku Autor: (Internetové stránky České kardiologické společnosti). NYHA definice činnost Třída I Třída II Třída III Třída IV Bez omezení činnosti. Každodenní námaha nepůsobí pocit vyčerpání, palpitace nebo anginu pectoris. Menší omezení tělesné činnosti. Každodenní námaha vyčerpává, způsobuje dušnost, palpitace nebo anginu pectoris. Značné omezení tělesné činnosti. Již nevelká námaha vede k vyčerpání, dušnosti, palpitacím nebo anginózním bolestem. V klidu bez obtíží. Obtíže při jakékoliv tělesné činnosti invalidizují. Dušnost, palpitace nebo angina pectoris se objevují i v klidu. Nemocní zvládnou práci, jako je shrabování sněhu, rekreační hru odbíjené či lyžování, běh 8 km/hod.. Nemocní zvládnou práci na zahradě, se-xuální život bez omezení, chůzi 6 km/hod. Nemocní zvládnou základní domácí práce, obléknou se bez obtíží, chůzi 4 km/hod. Nemocní mají klidové obtíže a jsou neschopni samostatného života. VO2 max (orientačně) >20 ml/kg/min ml/kg/min ml/kg/min <10 ml/kg/min Subjektivní příznaky a objektivní známky srdečního selhání jsou dány: 1. Sníženým srdečním výdejem a zhoršenou perfuzí periferních tkání. 2. Zvýšením tlaku a městnáním před selhávající levou komorou. 3. Kompenzačními mechanismy (aktivace sympatoadrenálního systému, reninangiotenzin-aldosteronového systému a dalších). 4. Primární vyvolávající chorobou Neurohumorální změny u ChSS Při ChSS je aktivována řada endokrinních systémů, které můžeme rozdělit na vazokonstrikční, vazodilatační a cytokiny. Hlavními jsou systémy renin-angiotenzin- 24

34 aldosteron a sympatoadrenální systém. Kromě nich byly prokázány účinky mnohých dalších. Z nich mezi vazokonstrikční patří vazopresin, endotelin, prostaglandin F2, neuropeptid Y a tromboxan A2, mezi vazodilatační prostaglandiny E2 a I2, dopamin, natriuretické peptidy, endoteldependentní relaxační faktor, adrenomedulin, kalikrein-kininový systém, adenozin a vazoaktivní intestinální peptid. V souhrnu svých účinků mívají vazokonstrikční působky převahu. Hlavními představiteli cytokinů jsou TNF-α a interleukiny (183). 2.8 Natriuretické peptidy Natriuretické peptidy jsou endogenní peptidové hormony. Rozdělují se na typ A (ANP), typ B (BNP), typ C (CNP), typ D (DNP), typ V (VNP) a renální peptid urodilatin (65). Jsou známy tři druhy receptorů pro natriuretické peptidy, receptor A (má vysokou afinitu pro ANP a BNP) a receptor B (specifický pro CNP), receptory spojené s guanylyl cyklázou, které jsou zodpovědné za biologické účinky peptidů, a receptor C, který zodpovídá za clearance peptidu a pravděpodobně regulaci buněčné proliferace. Endokrinně v kardiovaskulárním systému působí ANP, BNP, DNP a VNP. Ačkoliv všechny peptidy jsou exprimovány i v jiných buňkách (včetně adipocytů) než jen kardiomyocytech, většina natriuretických peptidů je secernována primárně srdečním svalem. CNP, který je secernován primárně endoteliálními buňkami, účinkuje endokrinní a parakrinní cestou v mozku a cévách (65). Natriuretické peptidy mají úlohu v regulaci krevního tlaku, propustnosti cév a intravaskulárního objemu (68). ANP, BNP a CNP v ledvinách ovlivňují mesangiální buňky a tubuly a zvyšují natriurézu a diurézu. Mají také přímý vazodilatační účinek a nepřímý vazodilatační účinek (suprimují aktivitu vazokonstrikčního systému renin-angiotenzinaldosteron, endotelinu a sympatického nervového systému). Také ovlivňují rychlost relaxace myokardu (68;184) a vykazují cytoprotektivní, antihypertrofické a antifibrotické účinky na kardiomyocyty a kardiální fibroblasty (68) BNP BNP je exprimován více v srdeční síni než v komoře, ale pro větší velikost komor pochází 70 % kardiálního BNP právě z nich. V malých koncentracích pochází BNP z extrakardiálních zdrojů, a to z mozku, plic, ledvin, aorty a nadledvin. Po translaci genu pro BNP je primárním produktem pre-pro BNP 1-134, ze kterého se po odštěpení signálního proteinu stává prohormon o 108 aminokyselinách, probnp 1-108, který je skladován v granulech myocytů. Tento prohormon je dále štěpen proteázami na biologicky 25

35 neaktivní NT-proBNP 1-76 a biologicky aktivní BNP V cirkulaci je BNP 1-32 dále zpracováván a degradován na různé cirkulující formy včetně BNP 3-32, méně biologicky aktivní formy než BNP 1-32 (65). V plazmě se mohou nacházet probnp 1-108, NT-proBNP 1-76, a všechny formy BNP (BNP 1-32, BNP 3-32, BNP 7-32 ). U pacientů se srdečním selháním je hlavní formou v cirkulaci neaktivní pro-bnp (185). Hlavním stimulem pro sekreci BNP je napnutí stěny síní a komor při zvýšeném intravaskulárním objemu. BNP má poločas rozpadu 22 minut (68). BNP se váže na natriuretický receptor A v cílových orgánech, aktivuje vnitřní aktivitu guanylyl cyklázy receptoru a generuje intracelulární cgmp. BNP antagonizuje systém reninangiotenzin-aldosteron, inhibuje sekreci endotelinu a snižuje systémovou a renální aktivitu sympatiku a tím zvyšuje natriuretickou, diuretickou a vazorelaxační aktivitu (185). BNP pravděpodobně snižuje fibrotizaci srdečního svalu (65; ). Plazmatické hladiny BNP jsou zvýšené u pacientů s hypertrofií levé komory (68;189), symptomatickou komorovou dysfunkcí (68;190;191), městnavým srdečním selháním (68;192;193), chronickým renálním selháním (68;194), cirhózou (68;195) a sepsí (68;196;197). Obézní a lidé s nadváhou mají snížené hladiny BNP v plazmě (68;198). ANP a BNP jsou důležitými biomarkery v diagnostice a určení prognózy pacientů s městnavým srdečním selháním (185;199) Natriuretické peptidy a regulace lipolýzy ANP a BNP stimulují lipolýzu v lidských adipocytech (67) prostřednictvím PKG nezávisle na produkci camp a aktivitě PAK (68) jak bylo podrobně popsáno v kapitole Hormony regulující lipolýzu. 26

36 KAPITOLA 3: CÍLE PRÁCE V dizertační práci se věnuji sledování účinků adiponektinu a BNP v regulaci lipolýzy v tukové tkáni. Výsledky našich studií rozšiřují stávající poznatky o regulaci lipolýzy v SAT a VAT a přispívají k osvětlení patogeneze řady chorobných stavů způsobených nebo souvisejících s lipotoxicitou (včetně inzulínové rezistence). Poznatky získané uvedenými studiemi naznačují potenciální nové směry v prevenci a léčbě metabolických a kardiovaskulárních komplikací obezity. V jednotlivých studiích jsme sledovali tyto cíle: Část 1: Regulace lipolýzy adiponektinem a BNP. - Objasnit vliv adiponektinu na spontánní a katecholaminy stimulovanou lipolýzu v izolovaných adipocytech SAT (Studie č. 1) a popsat tak možný nový mechanismus, který přispívá k regulaci celotělového lipidového metabolismu. - Objasnit možné rozdíly v úloze jednotlivých izomerů adiponektinu při regulaci lipolýzy. Objasnit mechanismus regulace lipolýzy adiponektinem: specificky úlohu AMPK. (Studie č. 2). - Studovat účinek BNP na lipolýzu u pacientů se srdečním selháním (Studie č. 3) a objasnit tak jeho možný podíl na kachexii pacientů se srdečním selháním. Část 2: Sekrece multimerních izoforem adiponektinu v VAT a SAT. - Objasnit úlohu viscerálního a podkožního tukového depa v tvorbě jednotlivých izomerů adiponektinu u obézních jedinců (Studie č. 4). 27

37 KAPITOLA 4: VÝSLEDKY 4.1 SEZNAM ZAHRNUTÝCH STUDIÍ Studie č. 1: Wedellova Z, Ditrich J, Siklova-Vitkova M, Kolostova K, Kovacikova M, Duskova M, Broz J, Vedral T, Stich V, Polak J. Adiponectin inhibits spontaneous and catecholamine-induced lipolysis in human adipocytes of non-obese subjects through AMPKdependent mechanisms. Physiol Res. 2011;60(1): Studie č. 2: Wedellova Z, Kovacova Z, Tencerova M, Vedral T, Rossmeislova L, Siklova- Vitkova M, Stich V, Polak J. The effect of globular, trimeric and full-length adiponectin on lipolysis in subcutaneous and visceral adipocytes of obese subjects. Článek odeslaný k publikaci v European Journal of Endokrinology. Studie č. 3: Polak J, Kotrc M, Wedellova Z, Jabor A, Malek I, Kautzner J, Kazdova L, Melenovsky V. Lipolytic effects of B-type natriuretic peptide 1-32 in adipose tissue of herart failure patiens compared with healthy controls. J Am Coll Cardiol Sep 6;58(11): Studie č. 4: Kovacova Z, Tencerova M, Roussel B, Wedellova Z, Rossmeislova L, Langin D, Polak J, Stich V. The impact of obesity on secretion of adiponectin multimeric isoforms differs in visceral and subcutaneous adipose tissue. Int J Obes (Lond) Oct;36(10):

38 4.2 VÝSLEDKY PŘEDLOŽENÝCH PRACÍ Studie 1: Adiponektin potlačuje spontánní a katecholaminy indukovanou lipolýzu v lidských adipocytech neobézních subjektů AMPK-dependentními mechanismy Ve studii jsme zjišťovali vliv adiponektinu na regulaci lipolýzy in-vitro v adipocytech izolovaných z SAT neobézních a obézních jedinců. Vzorky SAT byly získány během plánovaných chirurgických operací (cholecystektomie, hernioplastika) nebo liposukcí od 16 neobézních a 17 obézních subjektů. Ze vzorků tukové tkáně byly izolovány adipocyty, které byly následně inkubovány s 1) adiponektinem v koncentraci 20 μg/ml nebo 2) 0,5 mm AICAR aktivátorem AMPK. Následně byl do zkumavek přidán izoprenalin (c = 10-6 M), pro zjištění vlivu adiponektinu a AICAR na katecholaminy-indukovanou lipolýzu. Jako marker lipolýzy byla měřena koncentrace glycerolu ve třech časových bodech: 1) po inkubaci samotných adipocytů v mediu (pro určení spontánní lipolýzy), 2) po inkubaci adipocytů s adiponektinem nebo AICAR a 3) po inkubaci s izoprenalinem. Pozorovali jsme snížení spontánní i katecholaminy indukované lipolýzy adiponektinem o 21 % (p = 0,06) resp. 14 % (p = 0,03) v adipocytech neobézních subjektů. Snížení nebylo prokázáno u obézních jedinců, nicméně vzhledem k počtu vyšetřovaných subjektů rozdíl mezi obézními a neobézními nebyl statisticky významný. Aktivaci AMPK jsme nepřímo prokazovali za použití Compound C (6-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a] pyrimidine), který účinně brání aktivaci AMPK v různých tkáních včetně adipocytů ( ). Izolované adipocyty ze vzorků SAT byly po pre-inkubaci s Compound C (0,5 mmol/l) následně inkubovány s adiponektinem nebo AICAR. Antilipolytický účinek obou, AICAR i adiponektinu, byl zrušen inkubací s Compound C. Dle výsledků první studie je adiponektin pravděpodobně jednou z látek regulujících lipolýzu v SAT neobézních osob. V další studii jsme se zabývali úlohou specifických multimerů adiponektinu v SAT a VAT: Studie 2: Účinky globulárního, trimerického a celkového adiponektinu na lipolýzu v podkožních a viscerálních adipocytech obézních subjektů Ve druhé studii jsme zjišťovali vliv celkového adiponektinu (tj. směs multimerické, hexamerické a trimerické izoformy), trimerického adiponektinu a globulárního adiponektinu na regulaci lipolýzy v izolovaných adipocytech SAT a VAT. Vzorky SAT (n = 10) a VAT (n 29

39 = 6) byly získány během plánovaných laparoskopických operací (cholecystektomie, hernioplastika) od obézních žen. Izolované adipocyty byly inkubovány s celkovým adiponektinem o koncentraci 20 μg/ml, trimerickým nebo globulárním adiponektinem (c = 20 μg/ml) nebo 0,5 mm AICAR. Glycerol uvolňovaný do media kultury byl určen kolorimetricky před a po inkubaci. Globulární adiponektin inhiboval lipolýzu o 27 % v SAT a trimerický adiponektin inhiboval lipolýzu v VAT (obojí p < 0,05), zatímco celkový adiponektin neměl účinek na lipolýzu ani v jednom ze sledovaných depot. AICAR inhiboval lipolýzu o 48 % a 49 % v SAT, resp. VAT (p < 0,05). Abychom zjistili, zda je AMPK v tukové tkáni aktivovaná multimery adiponektinu, byly v jiném experimentu diferencované preadipocyty z SAT inkubovány s AICARem, celkovým adiponektinem, trimerickým a globulárním adiponektinem. Po skončení inkubace byly buňky lyzovány, proteiny separovány a následně inkubovány s těmito protilátkami: 1) anti-phospho- Ser79-ACC rabbit polyclonal antipody, 2) anti-phospho-ser565-hsl rabbit polyclonal antibody, 3) anti-tubulin antibody. Globulární adiponektin indukoval Ser-79 p-acc o 32 % (p < 0,05) a Ser565 p-hsl z 52 % (p = 0,08). Nezaznamenali jsme žádný účinek celkového nebo trimerického adiponektinu na fosforylaci ACC nebo HSL. Aktivace AMPK AICARem zvýšila Ser79 p-acc o 60,9 % (p < 0,001) a Ser565 p-hsl o 50 % (p = 0,09), zatímco celkový a trimerický adiponektin byl bez účinku. Zvýšená lipolýza v tukové tkáni může přispívat k přetížení myokardu lipidy, k inzulínové rezistenci a kachexii u pacientů se srdečním selháním. Nedávno bylo rozpoznáno, že natriuretické peptidy, jejichž hladina je u pacientů se srdečním selháním zvýšena, stimulují lipolýzu u zdravých subjektů. Studie 3: Lipolytický účinek B-natriuretického peptidu v tukové tkáni pacientů se srdečním selháním v porovnání se zdravými kontrolami V této studii jsme se zaměřili na zkoumání účinku BNP na lipolýzu u pacientů se srdečním selháním. Použita byla metoda mikrodialýzy podkožní tukové tkáně. Do studie bylo zařazeno 10 pacientů se srdečním selháním (NYHA III, etiologie z 50 % ischemická choroba srdeční, 50 % neischemické etiologie) a 13 zdravých subjektů podobného věku, pohlaví a tělesné kompozice. Do SAT v oblasti břicha byly zavedeny čtyři mikrodialyzační sondy. Sondy byly promývány po dobu nejprve 80 minut Ringerovým roztokem pro zjištění bazální lipolýzy a poté 60 minut těmito farmaky: První sonda byla promývána 0,1 μm BNP 1-32, druhá sonda 30

40 byla promývána 10 μm BNP 1-32, třetí sonda 10 μm norepinefrinem a čtvrtá sonda Ringerovým roztokem (kontrola). Koncentrace glycerolu v dialyzátu byla měřena jako odraz lipolýzy. Pro zjištění relativní recovery (parametr popisující propustnost membrány sondy) byl proveden dodatečný in-vitro experiment, ve kterém relativní recovery pro BNP 1-32 vyšlo 20±2 % při perfuzi 1 μl/min. Spontánní lipolýza u pacientů se srdečním selháním byla vyšší o 19 % než u zdravých dobrovolníků (p < 0,01). Zvýšení lipolýzy po podání norepinefrinu bylo podobné u pacientů se srdečním selháním a u zdravých kontrol (p = 0,35). Po podání 10 μm BNP 1-32 došlo ke stejnému zvýšení lipolýzy u obou sledovaných skupin - pacientů se srdečním selháním i zdravých kontrol, zatímco odpověď na podání 0,1 μm BNP 1-32 byla více vyjádřena u pacientů se srdečním selháním (p = 0,02). U pacientů se srdečním selháním spontánní lipolýza korelovala s inzulínovou rezistencí a odpověď na podání BNP 1-32 negativně korelovala s adipozitou. Studie 4: Vliv obezity na sekreci multimerních izoforem adiponektinu je rozdílný ve viscerální a v podkožní tukové tkáni V poslední studii jsme zjišťovali sekreci izoforem adiponektinu z explantů derivovaných z párových vzorků VAT a SAT obézních (n = 13) a neobézních (n = 10) pacientů, kteří podstoupili elektivní břišní operaci. Předpokládali jsme, že uvolňování izoforem adiponektinu je rozdílné jednak v SAT a VAT, a jednak u obézních v porovnání s neobézními jedinci. Explanty tukové tkáně byly inkubovány v Krebs/Ringem fosfátovém pufru s albuminem a glukózou a po 4 hodinách inkubace bylo sebráno medium a zamraženo v -80 C do provedení analýzy. Množství celkového adiponektinu v mediích kultur bylo měřeno metodou EIA. Množství izoforem adiponektinu secernovaných do media kultury i množství izoforem adiponektinu v plazmě bylo měřeno analýzou Western blot. Hladina celkového adiponektinu v plazmě byla nižší u obézních než u neobézních subjektů (p < 0,05). Relativní zastoupení jednotlivých multimerních izoforem (tj. poměrné zastoupení jednotlivých izoforem ve vztahu k celkovému adiponektinu) v plazmě, tj. LMW/celkový adiponektin, MMW/celkový adiponektin a HMW/celkový adiponektin se nelišilo mezi obézními a neobézními. Množství celkového adiponektinu secernovaného z explantů tukové tkáně do media bylo nižší v SAT u obézních v porovnání s SAT neobézních osob( p < 0,05). Ve VAT nebyl významný rozdíl mezi neobézními a obézními subjekty. V SAT i VAT byl HMW adiponektin nejvíce zastoupenou formou uvolňovanou do media. Relativní zastoupení HMW adiponektinu ku celkovému adiponektinu bylo vyšší v mediu explantů z obou tukových dep ve srovnání 31

41 s plazmou (p < 0,001). Ve skupině neobézních byl poměr HMW/celkový adiponektin secernovaný explanty VAT významně vyšší než sekrece z explantů SAT (p < 0,01), zatímco u obézních nebyl nalezen rozdíl mezi oběma depy v poměru secernovaného HMW/celkovému adiponektinu. Při srovnání profilu cirkulujících a secernovaných izoforem adiponektinu jsme našli významný rozdíl v distribuci izoforem mezi plazmou a mediem explantů SAT a VAT (p<0,001). V mediu kultury explantů SAT i VAT byla nejvíce zastoupenou HMW forma. 32

42 Studie č. 1 Wedellova Z, Ditrich J, Siklova-Vitkova M, Kolostova K, Kovacikova M, Duskova M, Broz J, Vedral T, Stich V, Polak J. Adiponectin inhibits spontaneous and catecholamine-induced lipolysis in human adipocytes of non-obese subjects through AMPK-dependent mechanisms. Physiol Res. 2011;60(1):

43 Physiol. Res. 60: , 2011 Adiponectin Inhibits Spontaneous and Catecholamine-Induced Lipolysis in Human Adipocytes of Non-Obese Subjects Through AMPK-Dependent Mechanisms Z. WEDELLOVÁ 1,4, J. DIETRICH 6, M. ŠIKLOVÁ-VÍTKOVÁ 1, K. KOLOŠTOVÁ 2, M. KOVÁČIKOVÁ 1,3, M. DUŠKOVÁ 5, J. BROŽ 4, T. VEDRAL 7, V. ŠTICH 1,3,4, J. POLÁK 1,4,8 1 Department of Sport Medicine, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Czech Republic, 2 Center of Biomedical Sciences, Division of Cell and Molecular Biology, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Czech Republic, 3 Franco-Czech Laboratory for Clinical Research on Obesity, Third Faculty of Medicine and INSERM Unite 586, Charles University, Prague, Czech Republic, 4 Second Internal Medicine Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic, 5 Plastic Surgery Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic, 6 University of Applied Sciences Wildau, Germany, 7 General Surgery Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic, 8 Center for Research of Diabetes, Metabolism and Nutrition, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Czech Republic Received July 20, 2009 Accepted May 26, 2010 On-line October 15, 2010 Summary Adiponectin is an adipokine increasing glucose and fatty acid metabolism and improving insulin sensitivity. The aim of this study was to investigate the role of adiponectin in the regulation of adipocyte lipolysis. Human adipocytes isolated from biopsies obtained during surgical operations from 16 non-obese and 17 obese subjects were incubated with 1) human adiponectin (20 µg/ml) or 2) 0.5 mm AICAR activator of AMPK (adenosine monophosphate activated protein kinase). Following these incubations, isoprenaline was added (10-6 M) to investigate the influence of adiponectin and AICAR on catecholamine-induced lipolysis. Glycerol concentration was measured as lipolysis marker. We observed that adiponectin suppressed spontaneous lipolysis by 21 % and isoprenaline-induced lipolysis by 14 % in non-obese subjects. These effects were not detectable in obese individuals, but statistically significant differences in the effect of adiponectin between obese and non-obese were not revealed by two way ANOVA test. The inhibitory effect of AICAR and adiponectin on lipolysis was reversed by Compound C. Our results suggest, that adiponectin in physiological concentrations inhibits spontaneous as well as catecholamine-induced lipolysis. This effect might be lower in obese individuals and this regulation seems to involve AMPK. Key words Obesity Adiponectin Lipolysis Adipose tissue AMPK Corresponding author Jan Polak, Third Faculty of Medicine of Charles University, Sport Medicine Department, Center of Preventive Medicine, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic. Fax: jan.polak@lf3.cuni.cz Introduction Obesity characterized by excessive lipid accumulation in adipose tissue as well as in ectopic localizations (especially muscle and liver) was shown to increase the risk of developing insulin resistance, type 2 diabetes mellitus, hypertension, cardiovascular diseases, several types of cancer and other chronic diseases (Hayes et al. 2008). Among the major mediators possibly contributing to a development of insulin resistance, pancreatic endocrine dysfunction, atherosclerosis and whole body pro-inflammatory state belong the excessive flux of non-esterified fatty acids (NEFA) from adipose PHYSIOLOGICAL RESEARCH ISSN (print) ISSN (online) 2011 Institute of Physiology v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic Fax , physres@biomed.cas.cz, 34

44 140 Wedellová et al. Vol. 60 tissue and a family of proteins produced in adipose tissue, collectively named adipokines (Boden et al. 2008). Non-esterified fatty acids represent primary energy source for metabolically active tissues, including skeletal muscle (Bickerton et al. 2007), however increasing amount of evidence suggests, that the excessive flux of NEFA from adipose tissue of obese individuals (Baldeweg et al. 2000) is an important factor in the etiopathogenesis of obesity-related metabolic impairments, mainly insulin resistance (Frayn et al. 2001). Insulin resistance-inducing effect of NEFA in muscle has been firstly conceptualized by Randle (Randle et al. 1998) who noticed the substrate competition between fatty acids and glucose in myocytes. This concept was further investigated and mechanisms of NEFA-induced impairments of insulin signaling were described at the molecular level in muscle as well as liver. Furthermore, NEFA play an important role also in this process of endocrine pancreatic dysfunction, which represents the second step in the development of type 2 diabetes, and contribute thus to diminished insulin output from pancreas in response to glucose stimulus (Yaney et al. 2000). Adipose tissue lipolysis is regulated by a complex interaction between lipolytic and anti-lipolytic hormones. Under physiological circumstances, catecholamines and atrial natriuretic peptide (ANP) are the most important lipolysis stimulating factors (Lafontan et al. 2008), while insulin is a potent anti-lipolytic agent. During fasting, stress and exercise is lipolysis stimulated by growth hormone to spare glucose and proteins at the expense of lipids (Moller et al. 2009). Obese individuals have been shown to suffer from several dysregulations in lipolysis regulation, including increased rate of spontaneous lipolysis in subcutaneous adipose tissue in vitro as well as in vivo (Arner et al. 2005) and decreased stimulation of lipolysis during exercise or following local in-situ catecholamine administration, compared to healthy subjects, partially due to enhanced anti-lipolytic effect mediated through α 2 -adrenergic receptors (Stich et al. 2003). Obesity is associated with suppressed levels of circulating growth hormone compared with normalweight subjects (Veldhuis et al. 1991, Laessle et al. 1997), what may contribute to maintenance of obesity, because fat deposits are maintained (Laessle et al. 1997). Recently, the role of adipokines in lipolysis regulation has been investigated and the strong lipolytic effect of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) was established together with their physiological role in pro-inflammatory state induction (TNF-α) and substrate flux regulation during exercise (IL-6) (Cawthorn et al. 2008). Adiponectin is a unique adipokine produced in mature adipocytes with profound insulin-sensitising, antiinflammatory and anti-atherosclerotic effects (Yamauchi et al. 2002, Haluzik et al. 2004, Nedvidkova et al. 2005). Adiponectin increases glucose uptake and fatty acid oxidation in muscle and reduces hepatic gluconeogenesis (Yamauchi et al. 2002). Its cellular effects in muscle and liver are at least partially mediated by the activation of 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) (Yamauchi et al. 2002). Adiponectin receptors are ubiquitously expressed on several human tissues including muscle, liver, pancreas and adipocytes (Yamauchi et al. 2003). However, the paracrine/endocrine role of adiponectin on adipocytes has never been thoroughly investigated. Available literature identified AMPK as a key regulator of cellular energy metabolism including regulation of lipogenesis, β-oxidation and lipolysis (Daval et al. 2006). We hypothesized that adiponectin stimulates AMPK also in human adipocytes and participates in the regulation of lipolysis at the tissue level by paracrine and (via systemic circulation) also endocrine mechanisms. The main aim of this study was to investigate the in-vitro effect of adiponectin at physiological concentrations on the spontaneous and catecholaminestimulated lipolysis using isolated adipocytes from subcutaneous adipose tissue. Subsequently we investigated whether lipolytic response of adipocytes from obese and non-obese individuals is different following adiponectin administration. Methods Subjects The samples of adipose tissue were obtained during planned laparoscopic operations (cholecystectomy, hernioplastics) or plastic surgery (liposuction). The samples of tissue were taken by the surgeons during laparoscopy surgery under direct vision from the abdominal adipose tissue located immediately under the skin, at the beginning of the surgery. During liposuction the tissue had been taken at the beginning of the surgery as well, before the tissue was infiltrated by adrenaline, to avoid the contamination of the tissue by any pharmaceuticals. All samples were taken from the abdominal area. No sample of adipose tissue in this study had been taken by transcutaneous biopsy. The samples of adipose tissue were given to a saline solution and immediately transported to the laboratory for 35

45 2011 Adiponectin Inhibits Lipolysis in Humans 141 experiments. The adipose tissue was obtained from 17 obese women (BMI=37.6±5.6 kg/m 2, age=41.9±10.9 years) and 16 non-obese subjects (4 men, 12 women, BMI=23.6±2.2 kg/m 2, age=45.4±15.9 years). Before including the patients to the study we were informed about their concomitant diseases and only patients without any acute or chronic disease except of obesity were included to the study and the sample of adipose tissue had been taken during the surgery. However, in the group of non-obese patients two of them were on thyroid substitution. The hypothyreosis was in both cases stationary, so we do not suppose any effect on the metabolism of adipocytes. For the additional experiment (Indirect evidence of AMPK activation using Compound C, see below) we used the adipose tissue obtained from 3 human non-obese subjects (females, BMI 23.4±2.0 kg/m 2 ). All participants gave written informed consent before starting the study. All aspects of the study were performed in accordance with the Declaration of Helsinki and were approved by the Ethical committee of the Third Faculty of Medicine, Charles University (Prague, Czech Republic). Adipocyte isolation Immediately after the biopsy was taken, the tissue was transported to the laboratory for experiments. Isolated adipocytes were obtained as previously described by Rodbell (Rodbell M 1964). Briefly, the whole tissue was cut into small pieces and subsequently digested by 1.25 mg/ml collagenase (Sigma Collagenase from Clostridium histolyticum, Prod. No. C6885) in Krebs Ringer Bicarbonate buffer containing 10 mmol/l Hepes, 2 % fatty acid free bovine serum albumin (KRBHA) and 6 mmol/l glucose at ph 7.4, under shaking at 100 cycles/min at 37 C during 30 min. Adipocytes were filtered through a silk screen (250 µm) and washed 3 times with KRBHA buffer to eliminate collagenase. In-vitro incubation and lipolysis determination The freshly isolated fat cells were divided in 4 batches, each containing 95 µl of cell suspension and 80 µl of KRBHA buffer. Cells in each batch were left resting for one hour prior to following experiments to enable cells recover after collagenase digestion and manipulation. Four different incubations were performed in parallel with cells obtained from each subject: the first batch (control) was than incubated for 4 hours without any pharmacological intervention, second batch was incubated without pharmacological substances for first 2 hours and subsequently isoprenaline was added at the final concentration of 10-6 mol/l for last 2 hours, third batch was incubated with the final concentration of 20 µg/ml of adiponectin for 2 hours and subsequently with isoprenaline (10-6 M), fourth batch was incubated for 2 hours in the final concentration of 0.5 mmol/l AICAR (aminoimidazole carboxamide ribonucleotide, activator of AMPK) and subsequently with isoprenaline (10-6 M) for last 2 hours. Glycerol was determined by colorimetric assay (Glycerol kit, Randox laboratories, Crumin, United Kingdom) in cultivation media after one hour of rest and subsequently following 2 hours of incubation with adiponectin or AICAR and finally, after 2-hour incubation with isoprenaline in all the batches. Following the incubations, total lipid content in each tube was extracted with heptane and isopropylalcohol and subsequently quantified using the Dole method. Values of glycerol concentration in media were expressed as per 100 mg of lipids. Determination of AMPK involvement Indirect evidence of AMPK activation was evaluated using a specific cell-permeable agent named Compound C (6-[4-(2-Piperidin-1-yl-ethoxy)-phenyl)]-3- pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a] pyrimidine), which was shown to effectively block AMPK activation in several tissues including adipocytes (Zhou et al. 2001, Gao et al. 2008, Koh et al. 2007). For these experiments, adipose tissue of non-obese subjects was processed as described above and isolated cells were firstly pre-incubated for 2 hours with Compound C (0.5 mmol/l). After this period of pre-incubation, subsequent 2-hour incubations with adiponectin 20 mg/l or 0.5 mm AICAR were performed. Statistical analysis Statistical analysis was performed using SPSS 13.0 for Windows SPSS Inc., Chicago, IL). The effect of pharmacological substances was evaluated using paired Student s t-test. Differential effects of treatments between groups (obese versus non-obese) were tested using Twoway ANOVA analysis where treatment and obesity status were considered as independent variables in the model. Data are presented as mean values ± SD. A level of p 0.05 was considered statistically significant in all tests. Results Spontaneous lipolysis Data were expressed in absolute values of glycerol concentration in media normalized to 100 mg of 36

46 142 Wedellová et al. Vol. 60 Fig. 1. Glycerol concentration in media following 2-hour incubation. Adipocytes of obese and non-obese subjects were incubated for 2 hours without any treatment (spontaneous lipolysis) or with the presence of 20 mg/l adiponectin or 0.5 mm AICAR. Data are expressed as the mean glycerol concentration in media following the incubation period. * p<0.05 for comparison between spontaneous and pharmacological incubation (AICAR); # p=0.06 for comparison between spontaneous and pharmacological incubation (Adiponectin) Fig. 2. Isoprenaline-induced lipolysis following 2-hour incubation. Adipocytes of obese and non-obese subjects were incubated for 2 hours with 10-6 M isoprenaline without any other treatment (Isoprenaline) and with the presence of 20 mg/l adiponectin or 0.5 mm AICAR. Data are expressed as the relative change of mean glycerol concentration in media during the incubation period. * p<0.05 for comparison between spontaneous and pharmacological incubation (Adiponectin or AICAR) lipids. The cumulative 2-hour glycerol concentration representing spontaneous lipolytic rate was 458.4±365.7 µmol/l/100 mg lipids in the control tube, while incubation with adiponectin led to a suppression of lipolysis by 21 % (p=0.06) and co-incubation with AICAR suppressed lipolysis by 64 % (p=0.005), in non-obese individuals. Spontaneous lipolysis was 2.6 times higher in obese individuals (p=0.02). Incubation with AICAR inhibited spontaneous lipolysis by 35 % (p<0.001) in obese subjects, while the effect of adiponectin was diminished (inhibition by 2 %, p=0.43). However no statistically significant differences between obese and non-obese individuals were observed for AICAR as well as adiponectin treatments, according to two-way ANOVA testing. These data are displayed in Figure 1. Catecholamine-induced lipolysis 2-hour incubation with isoprenaline stimulated lipolysis 4.4 times in non-obese and 2.4 times obese individuals (both p<0.05). Adiponectin inhibited isoprenaline-induced lipolysis in non-obese by 14 % (p=0.03), while AICAR inhibited isoprenaline-induced stimulation of lipolysis by 71 % and 35 % in non-obese and obese subjects (p=0.006 and p=0.04, resp.). Despite lower inhibitory effect of adiponectin in obese individuals, no statistical differences were observed between obese and non-obese individuals for AICAR as well as adiponectin treatments, according to two-way ANOVA test. Data are summarized in Figure 2. AMPK inactivation by Compound C In additional experiment cells were incubated for 2 hours separately with AICAR or adiponectin and in Fig. 3. Glycerol concentration after 4-hour co-incubation of adiponectin or AICAR with Compound C. Adipocytes of non-obese subjects were incubated with 20 mg/l adiponectin or 0.5 mm AICAR in the presence or absence of 0.5 mm Compound C (inhibitor of AMPK). Data are expressed as the mean glycerol concentration in media following the incubation period. * p<0.01 for comparison between spontaneous and pharmacological incubation (Adiponectin or AICAR) parallel with addition of AMPK inactivator (Compound C). Anti-lipolytic effect of both, AICAR as well as adiponectin was reversed by Compound C. Addition of Compound C increased lipolysis by 37.8 % (p<0.001) when co-incubated with adiponectin and by 49.5 % (p<0.001) following the co-incubation with AICAR. Data are summarized in Figure 3. Discussion This study investigates for the first time the role of adiponectin in the regulation of lipolysis in human adipocytes. The major finding is that adiponectin moderately inhibits spontaneous as well as catecholamine-induced lipolysis in non-obese individuals, while this effect seems to be diminished in obese subjects. Furthermore, we suggest, that AMPK is involved in the effect of adiponectin on lipolysis in 37

47 2011 Adiponectin Inhibits Lipolysis in Humans 143 human adipocytes. Adiponectin was shown to activate AMP-kinase in human liver and muscle by specific phosphorylation of Thr-172 residue through yet not fully clarified mechanisms. After binding of adiponectin to membrane receptors (AdipoR1, AdipoR2) that were also identified in human adipose tissue (Tan et al. 2006), activation of APPL1 (Adaptor protein with plecthrin homology) was described in liver, muscle and adipocytes (rat) (Saito et al. 2007, Deepa et al. 2009, Mao et al. 2006) with subsequent involvement of several signaling cascades, including PPARα, MAPK and AMP-kinase pathway (Kadowaki et al. 2006). However, it remains unclear, whether APPL1 is mediating adiponectin-induced effects in human adipose tissue as well. Activated AMP-kinase subsequently phosphorylates hormone sensitive lipase (HSL), a key regulator of adipocyte lipolysis, at the Ser- 565 position, also referred as Site-2 (Garton et al. 1990, Garton et al. 1989). Phosphorylation at this position was shown to prevent HSL phosphorylation at Ser-563 position, also referred as Site-1 (Carmen et al. 2006, Holm et al. 2003), which is a common substrate for camp-dependent lipolysis-activating pathways (e.g. β-adrenergic stimulation) and leads to HSL activation and lipid hydrolysis (Langin et al. 2005, Arner et al. 1990). AMPK activation thus inhibits/prevents HSL activation. Additional possible mechanism explaining adiponectin anti-lipolytic effect might represent interaction between adiponectin signaling and insulin signaling pathways. It has been shown, that APPL1 interacts with key parts of the insulin-signaling pathway in adipocytes (as well as myocytes and endothelial cells) (Deepa et al. 2009), especially PI3K and Akt/PKB (Yang et al. 2003), and is essential for insulin-mediated metabolic effects in adipocytes (including Akt phosphorylation, glucose uptake, GLUT 4 translocation) (Saito et al. 2007, Mitsuuchi et al. 1999). It can be hypothesized, that adiponectin-induced activation of APPL1 in human adipocytes leads to subsequent activation of Akt and to anti-lipolytic effect through well described mechanisms identical to insulin-mediated anti-lipolytic cascade. Our finding that stimulation of AMPK by AICAR and to a smaller extent by adiponectin in our study inhibits spontaneous as well as catecholamineinduced lipolysis in lean subjects is congruent with the evidence obtained mainly in animal models and suggests that this regulation is present also in human adipocytes. Furthermore, we showed that the anti-lipolytic effect of adiponectin can be reversed by Compound C, a potent AMPK inactivator, suggesting that AMPK activation plays a role in adiponectin signaling in adipose tissue, which is in line with previously published study showing that Compound C blocks AMPK in hepatocytes (Zhou et al. 2001). The present study supports the concept of adiponectin paracrine effects in adipose tissue. Subcutaneous abdominal, femoral and visceral adipose tissues have different expression of adiponectin gene and possibly also protein production. As plasma levels of adiponectin are rather high, a true endocrine effect can be suggested as well. Adiponectin might serve as a messenger regulating lipolysis between different adipose tissue depots. Additionally, other tissues, especially skeletal muscle and liver, were shown to posses the ability of lipolysis, mediated through similar mechanisms as in adipose tissue (including the activation of HSL) (Qvisth et al. 2006, Jocken et al. 2008). It can be thus speculated, that adiponectin might serve as inter-organ regulator of lipolysis, influencing also lipid degradation localized in muscle and liver. Whether this regulation has some physiological relevance needs to be investigated in future studies. Based on recent literature showing that effects of adiponectin in muscle are diminished in obesity (Bruce et al. 2005, Mullen et al. 2009), we hypothesized that adiponectin might inhibit lipolysis in adipose tissue of lean subjects, while adipose tissue of obese individuals might be adiponectin resistant and thus the effect of adiponectin decreased or absent. Adiponectin resistance in adipose tissue, together with decreased levels of adiponectin in obese individuals and insulin resistance of adipocytes (Arner et al. 2005, Large et al. 1998), might subsequently contribute to elevated plasma levels NEFA (non-esterified fatty acids) in obese individuals. Higher NEFA participate in the induction of the insulin resistance, pancreatic dysfunction and related metabolic disturbances (Yaney et al. 2000, Paolisso et al. 1995, Chen et al. 1999, Diaz-Guerra et al. 1991). Unfortunately, based on our data, we cannot unequivocally confirm this hypothesis. We observed suppression of spontaneous and catecholamine-induced lipolysis in lean subjects and absent effect of adiponectin in obese individuals when this effect was tested in each group separately; however, two-way ANOVA test failed to show significant differences in response to adiponectin treatment between both groups. This lack of significance is due to large inter-individual variability of both spontaneous as well as catecholamine-induced lipolysis 38

48 144 Wedellová et al. Vol. 60 in human isolated adipocytes. Interestingly, we observed that the effect of AICAR on lipolysis is preserved in obese as well as nonobese individuals. This observation is in agreement with previously published findings in skeletal muscle (Steinberg et al. 2004, Hojlund et al. 2004), and suggests that potentially insufficient suppression of lipolysis by adiponectin in obese individuals might be due to defect localized upstream of AMPK. Both, receptor and postreceptor processes can be involved. Indeed, the expression of AdipoR1 and AdipoR2 in myocytes was found to be negatively influenced by obesity and elevated insulin levels in humans as well as animal models (Tsuchida et al. 2004, Civitarese et al. 2004), however these findings were not uniformly replicated and other authors claim that triglycerides, growth hormone or firstphase insulin secretion are more important determinants of adiponectin receptors expression (Fasshauer et al. 2004, Staiger et al. 2004). Additionally, impaired ability of adiponectin to simulate AMPK was found in muscle of obese and type 2 diabetic subjects by mechanisms independent of adiponectin receptors, suggesting a postreceptor defect (Chen et al. 2005). Our study has several limitations that need to be taken into account. First, we have not explicitly (using two-way ANOVA) shown that the effect of adiponectin is different between obese and lean subjects. Our hypothesis, that adipocytes from obese subjects are resistant to the effect of adiponectin is based on simple paired comparisons in each group separately and thus need to be interpreted as preliminary and with caution. Future studies are needed to definitely clear this issue. Second, there exists an inherent limitation to the interpretation of this study resulting from the in-vitro nature of experiments and the use of AICAR for AMPK activation. Despite the use of AICAR for in-vivo as well as in-vitro experiments, it needs to be noted, that AICAR does not have exclusive specificity to AMPK and subsequently, activation of other enzymes dependent on camp appears in parallel. However, specific activators of AMPK are not available so far and the above mentioned limitation could be probably solved by transgenic animal models and/or gene expression manipulations in other studies. Third, we used samples of subcutaneous abdominal adipose tissue from both men and women in the group of non-obese subjects. At the present time it is not fully understood if there are any differences in metabolism of adipose tissue between men and women so we do not know if using of both gender can influence our results. In the literature can be found studies considering an in-vitro lipolysis where the study groups were either homogenous: only men (Hoffstedt et al. 1997, Polak et al. 2007) or women, or men and women together (Kolehmainen et al. 2000, Van Harmelen et al. 1997). Few studies describe the gender variations in adipose tissue lipolysis. It had been described no difference in basal and catecholamine stimulated lipolysis in vitro between men and women (Mauriege et al. 1999, Lundgren et al., 2008), and no difference in gender in maximal lipolytic responses to isoprenaline (Mauriege et al. 1999), in another study is described higher basal lipolysis of isolated adipocytes in men than in women (Aguado et al. 2008). Another author presents data that catecholamine regulation of lipolysis in subcutaneous adipocytes from men tends to be higher than in women (Lundgren et al. 2008). In the future, it would be necessary to study the effect of adiponectin on lipolysis in men in comparison to women. In conclusion, our study showed that adiponectin interacts with lipolytic regulation in human adipocytes under basal conditions as well as after catecholamine stimulation. These effects seem to be at least partially mediated by the activation of AMPK and subsequent interaction with intracellular signaling cascades. Furthermore, we provide some indirect indices suggesting, that adiponectin-mediated anti-lipolytic effect might be diminished in obese individuals. Further studies are necessary to definitely confirm presumed lower effect of adiponectin in obesity as well as to elucidate the role of adiponectin in lipolysis regulation in other tissues, especially muscle as well as the role of physical training and diet intervention on the suggested adiponectin resistance. Conflict of Interest There is no conflict of interest. Acknowledgements This study was supported by the grant of The Grant Agency of Charles University in Prague No. GAUK 1269/08/C/2008 and by The Research Project of the Czech Ministry of Education MSM , by project HEPADIP, supported by the European Commission as Integrated Projects under the 6th Framework Programme (Contract LSHM-CT ) and by project ADAPT, supported under the seventh Framework Programme of European Union (HEALTH-F ). 39

49 2011 Adiponectin Inhibits Lipolysis in Humans 145 References AGUADO M, MARTINEZ-URBISTONDO D, SOLOMON A, MARTINEZ JA: Gender-dependent differences in the response of human adipocytes to leptin lipolytic action. Methods Find Exp Clin Pharmacol 30: 7-11, ARNER P: Human fat cell lipolysis: biochemistry, regulation and clinical role. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 19: , ARNER P, KRIEGHOLM E, ENGFELDT P, BOLINDER J: Adrenergic regulation of lipolysis in situ at rest and during exercise. J Clin Invest 85: , BALDEWEG SE, GOLAY A, NATALI A, BALKAU B, DEL PRATO S, COPPACK SW: Insulin resistance, lipid and fatty acid concentrations in 867 healthy Europeans. European Group for the Study of Insulin Resistance (EGIR). Eur J Clin Invest 30: 45-52, BICKERTON AS, ROBERTS R, FIELDING BA, HODSON L, BLAAK EE, WAGENMAKERS AJ, GILBERT M, KARPE F, FRAYN KN: Preferential uptake of dietary Fatty acids in adipose tissue and muscle in the postprandial period. Diabetes 56: , BODEN G: Obesity and free fatty acids. Endocrinol Metab Clin North Am 37: , BRUCE CR, MERTZ VA, HEIGENHAUSER GJ, DYCK DJ: The stimulatory effect of globular adiponectin on insulin-stimulated glucose uptake and fatty acid oxidation is impaired in skeletal muscle from obese subjects. Diabetes. 54: , CARMEN GY, VICTOR SM: Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cell Signal 18: , CAWTHORN WP, SETHI JK: TNF-alpha and adipocyte biology. FEBS Lett 582: , CHEN MB, MCAINCH AJ, MACAULAY SL, CASTELLI LA, O'BRIEN PE, DIXON JB, CAMERON-SMITH D, KEMP BE, STEINBERG GR: Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. J Clin Endocrinol Metab 90: , CHEN X, IQBAL N, BODEN G: The effects of free fatty acids on gluconeogenesis and glycogenolysis in normal subjects. J Clin Invest 103: , CIVITARESE AE, JENKINSON CP, RICHARDSON D, BAJAJ M, CUSI K, KASHYAP S, BERRIA R, BELFORT R, DEFRONZO RA, MANDARINO LJ, RAVUSSIN E: Adiponectin receptors gene expression and insulin sensitivity in non-diabetic Mexican Americans with or without a family history of Type 2 diabetes. Diabetologia 47: , DAVAL M, FOUFELLE F, FERRE P: Functions of AMP-activated protein kinase in adipose tissue. J Physiol 574: 55-62, DEEPA SS, DONG LQ: APPL1: role in adiponectin signaling and beyond. Am J Physiol Endocrinol Metab 296: E22- E36, DIAZ-GUERRA MJ, JUNCO M, BOSCA L: Oleic acid promotes changes in the subcellular distribution of protein kinase C in isolated hepatocytes. J Biol Chem 266: , FASSHAUER M, KLEIN J, KRALISCH S, KLIER M, LOSSNER U, BLUHER M, PASCHKE R: Growth hormone is a positive regulator of adiponectin receptor 2 in 3T3-L1 adipocytes. FEBS Lett 558: 27-32, FRAYN KN: Adipose tissue and the insulin resistance syndrome. Proc Nutr Soc 60: , GAO Y, ZHOU Y, XU A, WU D: Effects of an AMP-activated protein kinase inhibitor, compound C, on adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells. Biol Pharm Bull 31: , GARTON AJ, CAMPBELL DG, CARLING D, HARDIE DG, COLBRAN RJ, YEAMAN SJ: Phosphorylation of bovine hormone-sensitive lipase by the AMP-activated protein kinase. A possible antilipolytic mechanism. Eur J Biochem 179: , GARTON AJ, YEAMAN SJ: Identification and role of the basal phosphorylation site on hormone-sensitive lipase. Eur J Biochem 191: , HALUZIK M, PARIZKOVA J, HALUZIK MM: Adiponectin and its role in the obesity-induced insulin resistance and related complications. Minireview. Physiol Res 53: ,

50 146 Wedellová et al. Vol. 60 VAN HARMELEN V, LONNQVIST F, THORNE A, WENNLUND A, LARGE V, REYNISDOTTIR S, ARNER P: Noradrenaline-induced lipolysis in isolated mesenteric, omental and subcutaneous adipocytes from obese subjects. Int J Obes 21: , HAYES C, KRISKA A: Role of physical activity in diabetes management and prevention. J Am Diet Assoc 108: S19- S23, HOFFSTEDT J, ARNER P, HELLERS G, LONNQVIST F: Variation in adrenergic regulation of lipolysis between omental and subcutaneous adipocytes from obese and non-obese men. J Lipid Res 38: , HOJLUND K, MUSTARD KJ, STAEHR P, HARDIE DG, BECK-NIELSEN H, RICHTER EA, WOJTASZEWSKI JF: AMPK activity and isoform protein expression are similar in muscle of obese subjects with and without type 2 diabetes. Am J Physiol Endocrinol Metab 286: E239-E244, HOLM C: Molecular mechanisms regulating hormone-sensitive lipase and lipolysis. Biochem Soc Trans 31: , JOCKEN JW, SMIT E, GOOSSENS GH, ESSERS YP, VAN BAAK MA, MENSINK M, SARIS WH, BLAAK EE: Adipose triglyceride lipase (ATGL) expression in human skeletal muscle is type I (oxidative) fiber specific. Histochem Cell Biol 129: , KADOWAKI T, YAMAUCHI T, KUBOTA N, HARA K, UEKI K, TOBE K: Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome. J Clin Invest 116: , KOH HJ, HIRSHMAN MF, HE H, LI Y, MANABE Y, BALSCHI JA, GOODYEAR LJ: Adrenaline is a critical mediator of acute exercise-induced AMP-activated protein kinase activation in adipocytes. Biochem J 403: , KOLEHMAINEN M, OHISALO JJ, KAARTINEN JM, TUONONEN V, PAAKKONEN M, POIKOLAINEN E, ALHAVA E, UUSITUPA MI: Concordance of in vivo microdialysis and in vitro techniques in the studies of adipose tissue metabolism. Int J Obes Relat Metab Disord 24: , LAESSLE RG, WURMSER H, PIRKE KM: A comparison of resting metabolic rate, self-rated food intake, growth hormone, and insulin levels in obese and nonobese preadolescents. Physiol Behav 61: , LAFONTAN M, MORO C, BERLAN M, CRAMPES F, SENGENES C, GALITZKY J: Control of lipolysis by natriuretic peptides and cyclic GMP. Trends Endocrinol Metab 19: , LANGIN D, DICKER A, TAVERNIER G, HOFFSTEDT J, MAIRAL A, RYDEN M, ARNER E, SICARD A, JENKINS CM, VIGUERIE N, VAN HERMELEN V, GROSS RW, HOLM C, ARNER P: Adipocyte lipases and defect of lipolysis in human obesity. Diabetes 54: , LARGE V, ARNER P: Regulation of lipolysis in humans. Pathophysiological modulation in obesity, diabetes, and hyperlipidaemia. Diabetes Metab 24: , LUNDGREN M, BUREN J, LINDGREN P, MYRNAS T, RUGE T, ERIKSSON JW: Sex- and depot-specific lipolysis regulation in human adipocytes: interplay between adrenergic stimulation and glucocorticoids. Horm Metab Res 40: , MAO X, KIKANI CK, RIOJAS RA, LANGLAIS P, WANG L, RAMOS FJ, FANG Q, CHRIST-ROBERTS CY, HONG JY, KIM RY, LIU F, DONG LQ: APPL1 binds to adiponectin receptors and mediates adiponectin signalling and function. Nat Cell Biol 8: , MAURIEGE P, IMBEAULT P, LANGIN D, LACAILLE M, ALMERAS N, TREMBLAY A, DESPRES JP: Regional and gender variations in adipose tissue lipolysis in response to weight loss. J Lipid Res 40: , MITSUUCHI Y, JOHNSON SW, SONODA G, TANNO S, GOLEMIS EA, TESTA JR: Identification of a chromosome 3p gene, APPL, encoding an adaptor molecule that interacts with the oncoproteinserine/threonine kinase AKT2. Oncogene 18: , MOLLER N, JORGENSEN JO: Effects of growth hormone on glucose, lipid, and protein metabolism in human subjects. Endocrine reviews 30: , MULLEN KL, PRITCHARD J, RITCHIE I, SNOOK LA, CHABOWSKI A, BONEN A, WRIGHT D, DYCK DJ: Adiponectin resistance precedes the accumulation of skeletal muscle lipids and insulin resistance in high-fatfed rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 296: R243-R251, NEDVIDKOVA J, SMITKA K, KOPSKY V, HAINER V: Adiponectin, an adipocyte-derived protein. Minireview. Physiol Res 54: ,

51 2011 Adiponectin Inhibits Lipolysis in Humans 147 PAOLISSO G, GAMBARDELLA A, AMATO L, TORTORIELLO R, D'AMORE A, VARRICCHIO M, D'ONORFIO F: Opposite effects of short- and long-term fatty acid infusion on insulin secretion in healthy subjects. Diabetologia 38: , POLAK J, MORO C, BESSIERE D, HEJNOVA J, MARQUES MA, BAJZOVA M, LAFONTAN M, CRAMPES F, BERLAN M, STICH V: Acute exposure to long-chain fatty acids impairs α 2 -adrenergic receptor-mediated antilipolysis in human adipose tissue. J Lipid Res 48: , QVISTH V, HAGSTROM-TOFT E, ENOKSSON S, MOBERG E, ARNER P, BOLINDER J: Human skeletal muscle lipolysis is more responsive to epinephrine than to norepinephrine stimulation in vivo. J Clin Endocrinol Metab 91: , RANDLE PJ.: Regulatory interactions between lipids and carbohydrates: the glucose fatty acid cycle after 35 years. Diabetes Metab Rev 14: , RODBELL M: Metabolism of isolated fat cells. I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis. J Biol Chem 239: , SAITO T, JONES CC, HUANG S, CZECH MP, PILCH PF: The interaction of Akt with APPL1 is required for insulinstimulated Glut4 translocation. J Biol Chem 282: , STAIGER H, KALTENBACH S, STAIGER K, STEFAN N, FRITSCHE A, GUIRGUIS A, PETERFI C, WEISSER M, MACHICAO F, STUMVOLL M, HARING HU: Expression of adiponectin receptor mrna in human skeletal muscle cells is related to in vivo parameters of glucose and lipid metabolism. Diabetes 53: , STEINBERG GR, SMITH AC, VAN DENDEREN BJ, CHEN Z, MURTHY S, CAMPBELL DJ, HEIGENHAUSER GJ, DYCK DJ, KEMP BE: AMP-activated protein kinase is not down-regulated in human skeletal muscle of obese females. J Clin Endocrinol Metab 89: , STICH V, PELIKANOVA T, WOHL P, SENGENES C, ZAKAROFF-GIRARD A, LAFONTAN M, BERLAN M: Activation of alpha2-adrenergic receptors blunts epinephrine-induced lipolysis in subcutaneous adipose tissue during a hyperinsulinemic euglycemic clamp in men. Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E599-E607, TAN BK, CHEN J, DIGBY JE, KEAY SD, KENNEDY CR, RANDEVA HS: Upregulation of adiponectin receptor 1 and 2 mrna and protein in adipose tissue and adipocytes in insulin-resistant women with polycystic ovary syndrome. Diabetologia 49: , TSUCHIDA A, YAMAUCHI T, ITO Y, HADA Y, MAKI T, TAKEKAWA S, KAMON J, KOBAYASHI M, SUZUKI R, HARA K, KUBOTA N, TERAUCHI Y, FROGUEL P, NAKAE J, KASUGA M, ACCILI D, TOBE K, UEKI K, NAGAI R, KADOWAKI T: Insulin/Foxo1 pathway regulates expression levels of adiponectin receptors and adiponectin sensitivity. J Biol Chem 279: , VELDHUIS JD, IRANMANESH A, HO KK, WATERS MJ, JOHNSON ML, LIZARRALDE G: Dual defects in pulsatile growth hormone secretion and clearance subserve the hyposomatotropism of obesity in man. J Clin Endocrinol Metab 72: 51-59, YAMAUCHI T, KAMON J, ITO Y, TSUCHIDA A, YOKOMIZO T, KITA S, SUGIYAMA T, MIYAGISHI M, HARA K, TSUNODA M, MURAKAMI K, OHTEKI T, UCHIDA S, TAKEKAWA S, WAKI H, TSUNO NH, SHIBATA Y, TERAUCHI Y, FROGUEL P, TOBE K, KOYASU S, TAIRA K, KITAMURA T, SHIMIZU T, NAGAI R, KADOWAKI T: Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects. Nature 423: , YAMAUCHI T, KAMON J, MINOKOSHI Y, ITO Y, WAKI H, UCHIDA S, YAMASHITA S, NODA M, KITA S, UEKI K, ETO K, AKANUMA Y, FROGUEL P, FOUFELLE F, FERRE P, CARLING D, KIMURA S, NAGAI R, KAHN BB, KADOWAKI T: Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Nat Med 8: , YANEY GC, KORCHAK HM, CORKEY BE: Long-chain acyl CoA regulation of protein kinase C and fatty acid potentiation of glucose-stimulated insulin secretion in clonal beta-cells. Endocrinology 141: , YANG L, LIN HK, ALTUWAIJRI S, XIE S, WANG L, CHANG C: APPL suppresses androgen receptor transactivation via potentiating Akt activity. J Biol Chem 278: ,

52 148 Wedellová et al. Vol. 60 ZHOU G, MYERS R, LI Y, CHEN Y, SHEN X, FENYK-MELODY J, WU M, VENTRE J, DOEBBER T, FUJII N, MUSI N, HIRSHMAN MF, GOODYEAR LJ, MOLLER DE: Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Invest 108: ,

53 Studie č. 2 Wedellova Z, Kovacova Z, Tencerova M, Vedral T, Rossmeislova L, Siklova-Vitkova M, Stich V, Polak J. The effect of globular, trimeric and full-length adiponectin on lipolysis in subcutaneous and visceral adipocytes of obese subjects. Článek odeslaný k publikaci v European Journal of Endokrinology. 44

54 The effect of globular, trimeric and full-length adiponectin on lipolysis in subcutaneous and visceral adipocytes of obese subjects Z. Wedellova 1,2, Z. Kovacova 1, M. Tencerova 1, Vedral T 3., L. Rossmeislova 4, M. Siklova- Vitkova 1, V. Stich 1,4 and J. Polak 1,2,5 1 Department of Sport Medicine, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Czech Republic 2 2 nd Internal Medicine Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic 3 General Surgery Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic 4 Franco-Czech Laboratory for Clinical Research on Obesity, Third Faculty of Medicine and INSERM Unite 586, Charles University, Prague, Czech Republic 5 Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland, USA Corresponding author and reprint requests: Jan Polak, MD, PhD Third Faculty of Medicine of the Charles University Sport Medicine Department, Prague 10, , Czech Republic Phone: , Fax: , jan.polak@lf3.cuni.cz Word count: Abstract: 248, main text: 2616 Key words: adiponectin, lipolysis, visceral adipose tissue, subcutaneous adipose tissue Funding: This study was supported by the grant of The Grant Agency of Charles University in Prague 1269/08/C/2008 and by the Research Project of the Czech Ministry of Education MSM Disclosure Summary: The authors have nothing to disclose Abstract Context: Contribution of individual adiponectin polymeric isoforms to the paracrine regulation of lipolysis is unknown. Objective: 1) To investigate the impact of full-length, trimeric and globular adiponectin on spontaneous lipolysis in adipocytes isolated from subcutaneous abdominal (SCAAT) and visceral adipose tissues (VAT). 2) Define the role of AMPK (5'-AMP-activated protein kinase) activation in this process. Design: Cross sectional study, ex-vivo experiments. Setting: Public university setting Patients or Other Participants: Sixteen obese women (BMI=36.8±1.6 kg/m 2, age 48.1±3.9 years), without any underlying metabolic impairment, free of any medication. Adipocytes were isolated from SCAAT (n=10) and VAT (n=6). 45

55 Interventions: Ex-vivo incubation with 20 µg/ml of: A) full-length adiponectin, B) trimeric adiponectin, C) globular adiponectin, D) 0.5 mm AICAR (aminoimidazole carboxamide ribonucleotide) and E) Krebs-Ringer`s buffer (control experiment). Main Outcome Measure: 1) Glycerol in media as a marker of lipolysis. 2) Adiponectin-induced AMPK activation assessed in differentiated preadipocytes through Acetyl-Coenzyme A Carboxylase (Ser79 p-acc) and hormone sensitive lipase (Ser565 p-hsl) phosphorylation. Results: Globular isoform inhibited lipolysis by 27% in SCAAT and trimeric isoform inhibited lipolysis by 21% in VAT (both p<0.05), while full-length adiponectin had no effect on lipolysis in either depot. AICAR inhibited lipolysis by 48% and 49% in SCAAT and VAT, respectively (p<0.05). Furthermore, globular adiponectin induced Ser79 p-acc by 32% (p<0.05) and Ser565 p-hsl by 52% (p=0.08) in SCAAT differentiated preadipocytes. Conclusions: Adiponectin-induced inhibition of lipolysis in isoform- and specific and depot-specific. While no effect of full-length adiponectin was observed, globular and trimeric isoforms inhibited lipolysis in SCAAT and VAT, respectively. Abbreviations: AMPK 5'-AMP-activated protein kinase AICAR Aminoimidazole carboxamide ribonucleotide ACC Acetyl-Coenzyme A Carboxylase FFA Free fatty acids HSL Hormone sensitive lipase SCAAT Subcutaneous abdominal adipose tissue VAT Visceral adipose tissue Introduction Excessive accumulation of adipose tissue is associated with development of multiple metabolic and cardiovascular abnormalities including insulin resistance and type 2 diabetes (1,2). Even though exact pathogenesis of metabolic impairments in obesity is not fully elucidated, elevated plasma levels of free fatty acid (FFA) has been recognized as a possible causal link (3,4). Higher plasma FFA levels were repeatedly observed in obese and insulin-resistant subjects compared to lean individuals, probably due to increased delivery of FFA from enlarged adipose tissue (5,6,7). Several impairments in the control of lipolysis were documented in obese subjects including altered sensitivity to major regulators of lipolysis such as catecholamines, insulin and natriuretic peptides (8,4). Moreover, cytokines secreted directly from adipose tissue have been recognized as potent paracrine regulators of lipolysis. Tumor necrosis factor-α and interleukin-6 were shown to stimulate lipolysis in-vitro and in-vivo (9,10,11,12). Recently, our group has shown that adiponectin - a cytokine 46

56 with marked anti-inflammatory, anti-atherogenic and insulin-sensitizing properties (13), inhibits spontaneous as well as catecholamine-induced lipolysis in non-obese subjects, while this effect was lost in obesity (14). During production in adipocytes, individual adiponectin molecules (monomers with molecular weight of ~30 kda) form distinct polymeric isoforms detectable subsequently in human plasma. Multimeric isoforms composed of monomers together with hexameric and trimeric isoforms are abundant in circulation (14,15,16), while a globular fragment produced by proteolytic cleavage of adiponectin is detectable in small quantities (17,13,18). Although the biological function of individual isoforms is not sufficiently understood, it has been reported that adiponectin-induced activation of 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK), a central effector in adiponectin signaling cascade, is differentially modulated by individual polymeric isoforms in various tissues (19,20,21). For example: multimeric isoform, but not globular fragment, effectively decreased blood glucose through inhibition of hepatic glucose output and stimulation of glucose uptake in muscle (22). Furthermore, multimeric isoform is associated with insulin sensitivity indices and improvements in glucose metabolism induced by thiazolidinedione treatment (22). In contrast, globular fragment, but not multimeric isoform, enhanced fatty acid oxidation in skeletal muscle (22,17,23,21). Multiple metabolic pathways, including lipid and glucose metabolism, are regulated through AMPK. Upon activation, AMPK specifically phosphorylates several downstream enzymes, such as hormone sensitive lipase and acetyl-coenzyme A carboxylase leading to stimulation of lipogenesis and inhibition of lipolysis (14,24). Although adiponectin-induced activation of AMPK was documented in human and mouse adipocytes (14,24,25), the role of individual adiponectin isoforms remains unknown. We designed this study to elucidate the role of adiponectin isoforms in paracrine lipolysis regulation. First, we investigated the impact of globular, trimeric and full-length adiponectin on spontaneous lipolysis in adipocytes derived from subcutaneous and visceral adipose tissue. Second, we explored whether AMPK activation induced by individual polymeric isoforms is involved in the control of lipolysis mediated by adiponectin. Methods: Subjects Samples of subcutaneous abdominal (N = 10, weight = 3.5 ± 0.6 g) and visceral (N = 6, weight = 3.5 ± 0.9 g) adipose tissue were obtained during planned laparoscopic surgery (cholecystectomy, hernioplasty) from obese women (BMI = 36.8 ± 1.6 kg/m 2, age = 48.1 ± 3.9 years). All subjects were without any chronic medication and free of any disease-related symptoms as assessed during physical examination by a physician. All participants gave written informed consent before participation in the study and the study was performed in accordance with the Declaration of Helsinki. The study was 47

57 approved by the Ethics Committee of the Third Faculty of Medicine, Charles University (Prague, Czech Republic). Adipocyte isolation Following biopsy, samples were immediately submerged in sterile saline and transported to the laboratory for subsequent experiments. Isolation of primary adipocytes followed previously described protocol (14). Briefly, the whole tissue was cut into ~ 1-2 mm pieces and subsequently digested for 30min at 37 C under gentle shaking (100 cycles/min) using 1.25 mg/ml collagenase (Collagenase from Clostridium histolyticum, Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) dissolved in KRBHA buffer (Krebs Ringer Bicarbonate buffer with 10 mm HEPES, 2% fatty acid free bovine serum albumin (Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) and 6 mm glucose, ph 7.4). After digestion, adipocytes were filtered through a 250 µm silk screen and washed 3 times with KRBHA buffer to eliminate undigested tissue and dead cells. In-vitro incubations and lipolysis determination Freshly isolated adipocytes were divided into five aliquots, each containing 95 µl of cell suspension and 80 µl of KRBHA buffer. Cells were left to recover from digestion for one hour and subsequently incubated for 2 hours as follows: A) KRHBA buffer without any pharmacological intervention (control experiment), B) KRHBA buffer + 20 µg/ml of full-length adiponectin representing a mixture of multimeric, hexameric and trimeric isoforms (Adiponectin Human, Biovendor, Brno, Czech Republic), C) KRHBA buffer + 20 µg/ml of trimeric adiponectin isoform (Adiponectin Human, Trimeric form, Biovendor, Brno, Czech Republic, D) KRHBA buffer + 20 µg/ml of globular adiponectin representing 16.6 kda C-terminal globular fraction of adiponectin (Recombinant Human gacrp30/adipolean, Peprotech, Inc., Princeton Business Park, USA) and E) KRHBA buffer mm AICAR (pharmacological AMPK activator, aminoimidazole carboxamide ribonucleotide, Sigma- Aldrich, Prague, Czech Republic). Glycerol released into culture media was determined by colorimetric assay (Glycerol kit, Randox laboratories, Crumlin, United Kingdom) before and after incubations. Glycerol values were expressed per 100mg of lipids determined by the Dole lipid extraction method and used as a marker of lipolysis. Human preadipocytes differentiation Human preadipocytes were derived from SCAAT biopsies obtained as described above. Cells were grown in 12-well collagen-coated plates at 5% CO 2 and 37 C in DMEM/F12 Ham`s medium supplemented with 15 mm HEPES, 2.5mM L-glutamine, 5% fetal calf serum and Preadipocyte Growth Medium Supplement Pack (Promocell, Heidelberg, Germany). Antibiotic Antimycotic Solution (Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) was added to all media used. Preadipocytes were cultured until confluence and subsequently differentiated into adipocytes using DMEM/F12 Ham`s 48

58 medium supplemented with 15 mm HEPES, 2.5mM L-glutamine, 3% fetal calf serum, 33 µm biotin, 17 µm pantothenate, 1 µm dexamethasone, 0.2 nm isobutylmethylxanthine, 100 nm insulin and 10 µm rosiglitazone. Differentiation medium was removed after 3 days and cells were grown in identical medium but without rosiglitazone. Adipocytes were fully differentiated into mature adipocytes and used for experiments on the 10 th day after beginning of the differentiation protocol. Acetyl Co-A Carboxylase Ser-79 and hormone sensitive lipase Ser-565 phosphorylation Four independent experiments were performed after 24-hour starvation in fresh serum-free DMEM/F12 Ham`s medium supplemented with 15 mm HEPES, 2.5mM L-glutamine, 33 µm biotin and 17 µm pantothenate. Cells were pre-incubated for 1 hour in culture medium followed by 24 hours of treatment with pharmacological substances (i.e. AICAR, full-length, trimeric and globular adiponectin). Control experiment was conducted without any pharmacological stimulation. After incubations, adipocytes were washed with ice-cold buffer composed of 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm EDTA, 100 mm NaF, 10 mm pyrophosphate and 2 mm sodium orthovanadate, ph 7.4. Cells were lysed in identical buffer with 1% Triton X-100 and Phosphatase/protease inhibitors (Complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche, Basel, Switzerland). Cell homogenates were centrifuged and infranatant used for protein quantification (BCA Assay, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). After SDS-PAGE separation, proteins were transferred to a PVDF membrane and incubated overnight with primary antibodies diluted 1:1000 in 2% bovine serum albumin in 0.1% TBS (0.1% Tween in Phosphate Buffered Saline). Following antibodies were used: 1) anti-phospho-ser79-acc rabbit polyclonal antibody, (Millipore, Billerica, MA, USA), 2) anti-phospho-ser565-hsl rabbit polyclonal antibody, (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) and 3) anti-tubulin antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Secondary antibody (HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) was diluted 1:5000 in 5% milk in 0.1% TBS and membrane incubated for 1 hour at room temperature. Chemiluminescence was developed using the Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL USA) and detected on Fujifilm Las-3000 apparatus (Fujifilm Life Science, Courbevoie, France). Band intensities were quantified using MultiGauge software (Fujifilm Europe GmbH, Dusseldorf, Germany) and expressed as relative values normalized to tubulin band intensity. Blood analysis Blood samples were obtained before surgery from an indwelling intravenous catheter and stored at - 80 C until analysis. Full-length plasma adiponectin was measured using DuoSet Human Adiponectin ELISA (R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA). Plasma glycerol and FFA levels were determined by colorimetric assay (Glycerol kit and NEFA kit, Randox laboratories, Crumlin, United Kingdom). Plasma insulin concentration was determined using radio-immuno assay (Insulin IRMA KIT IM 3210, 49

59 Beckman coulter-immunotech, Czech republic). Plasma glucose, triglycerides, high-density lipoprotein and total cholesterol were determined photometrically using Glucose Hexokinase II, Cholesterol 2, Direct HDL Cholesterol and Triglycerides reagents (ADVIA 1800 Chemistry System Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY, USA). Statistical analysis Statistical analysis was performed using SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL,USA). The effect of pharmacological substances was tested with non-parametric Wilcoxon`s test. Data are expressed as mean values ± SEM. A level of p 0.05 was considered statistically significant in all tests. Results: The effect of AICAR and adiponectin isoforms on spontaneous lipolysis As summarized in Figure 1, globular isoform inhibited lipolysis in SCAAT ( ± versus ± µmol/l/100mg lipids, p<0.05) and trimeric isoform inhibited lipolysis in VAT (838.9 ± versus ± µmol/l/100mg lipids, p<0.05), while no effect of full-length adiponectin on lipolysis was observed. Treatment with AICAR suppressed lipolysis in both SCAAT and VAT by 48% and 49%, respectively (p<0.05). Spontaneous lipolysis in SCAAT but not VAT was positively associated with BMI (r = 0.56, p<0.05). Basic anthropometric and biochemical characteristics of subjects enrolled in this study are summarized in Table 1. The effect of AICAR and adiponectin isoforms on AMPK-induced ACC and HSL phosphorylation Among the investigated adiponectin isoforms, globular isoform induced Ser79 p-acc by 32% (p<0.05) and Ser565 p-hsl by 52% (p=0.08). No effect of full-length or trimeric isoforms on ACC or HSL phosphorylation was detected (Figure 2). Similarly, AMPK-activation by AICAR increased Ser79 p-acc by 60.9% (p<0.001) and Ser565 p-hsl by 50% (p=0.09), while full-length or trimeric isoforms had no effect (Figure 2). Discussion The purpose of this study was to elucidate paracrine regulation of spontaneous lipolysis by full-length, trimeric and globular adiponectin isoforms in obese subjects. Furthermore, depot-specific differences were investigated in subcutaneous and visceral adipose tissue. The major finding is that lipolysis is specifically inhibited by globular adiponectin in SCAAT and by trimeric isoform in VAT, while no effect of full-length adiponectin was observed in either depot. We also showed that in differentiated human preadipocytes only globular adiponectin treatment induced ACC and HSL phosphorylation at amino-acid residues specific for AMPK activity. 50

60 Adiponectin is secreted in adipose tissue predominantly in a multimeric form (26) and subsequently circulates in plasma as multimeric, hexameric, trimeric and globular isoforms (17,13). Although the biological significance of individual isoforms is not sufficiently understood, it has been shown that several metabolic effects are dependent on adiponectin polymerization state. For example, full-length adiponectin induced AMPK activation both in muscle and liver (21), while trimeric and globular isoforms were effective only in muscle (17,13,27,23). Differential biological effects of individual adiponectin isoforms are further demonstrated by studies showing that globular isoform, but not fulllength adiponectin, induced specific intracellular signaling, prevented cell adhesion and reduced hyperglycemia induced damage in endothelial cells (28,29). Indeed, even mutually opposite effects of globular and full-length adiponectin on reactive oxygen species production in phagocytes (30) were reported. In the present study, we observed that adiponectin-induced inhibition of lipolysis is also dependent on its polymerization state with globular adiponectin being effective in SCAAT and trimeric in VAT. Such isoform specificity explains why full-length adiponectin was unable to suppress lipolysis in obese individuals, as recently reported (14). Important differences in lipolysis regulation between SCAAT and VAT were described previously (20,14,31), however, we provided evidence that also adiponectin-mediated lipolysis regulation is modified by adipose tissue localization. Mechanisms mediating adiponectin isoform-specificity and depot-specificity have not been clarified so far. Among these, tissue-specific expression of adiponectin receptors might play a role as both types of adiponectin receptors are expressed in adipocytes (32). Importantly, globular and trimeric isoforms bind preferentially to AdipoR1 receptor (adiponectin receptor type 1), while multimeric isoforms bind AdopiR1 and AdipoR2 (adiponectin receptor type 2) more equally (33). However, two important findings need to be noted here: 1) SCAAT and VAT show similar expression of AdipoR1 and AdipoR2 (34,35) and 2) pharmacological activation of AMPK by AICAR in our study efficiently suppressed lipolysis in both fat depots documenting preserved functionality of signaling mechanisms downstream of AMPK. We thus speculate that either compromised adiponectin receptor function, modified receptor affinity to individual adiponectin isoforms or signaling events following receptor activation but located upstream of AMPK mediate the depot- and isoform-specificity of adiponectin isoforms. Furthermore, availability of globular adiponectin in various tissues might be regulated locally by the activity of monocyte-derived elastase releasing globular fraction from higher molecular form isoforms (36). It has also been suggested that multimeric adiponectin might compete with trimeric isoform for receptor binding (22), which might explain why we observed no anti-lipolytic effect of the full-length adiponectin. Metabolic effects of adiponectin are mediated through activation of multiple intracellular signaling cascades including PPARα, MAPK and AMPK pathways (33). We were particularly interested in AMPK pathway because several metabolic processes in the cell including lipolysis are regulated by this master energy switch (33,24,22). Activated AMPK phosphorylates serine residues of its downstream target proteins, including Ser79 on ACC and Ser565 on HSL molecules (24,37). AMPK- 51

61 induced phosphorylation of HSL represents a crucial step in lipolysis regulation because it prevents subsequent phosphorylation at the regulatory Ser563 position (7) necessary for HSL-induced lipolytic activity. In agreement with our lipolytic data, only globular adiponectin induced AMPK activation (evaluated by Ser79 p-acc) and Ser565 HSL phosphorylation in differentiated preadipocytes, providing thus molecular explanation for adiponectin anti-lipolytic activity. Interestingly, AMPK activation by globular isoform was observed in rat adipocytes; however other isoforms were not tested in that report (20,7). Based on our data and available literature, we hypothesize that lower molecular weight adiponectin isoforms (globular and trimeric) are involved in the regulation of plasma FFA levels through the suppression of adipose tissue lipolysis and increased fatty acid utilization in muscle (17,27,23). As elevated plasma FFA levels were causally linked to the pathogenesis of insulin resistance and β-cell dysfunction, adiponectin-induced inhibition of lipolysis represents additional mechanism of adiponectin anti-diabetic effects, (3,38,4). The strength of this study is that it directly compared effects of three adiponectin isoforms; however our ex-vivo study has clear limitations. First, experiments in isolated adipocytes do not fully reflect the physiological situation in-vivo, where complex interactions exist between adipocytes, other cell types in adipose tissue and multiple hormones. Second, adiponectin concentrations used in our incubations were ~2-3 times higher than plasma levels typically observed in obese individuals, however, interstitial adipose tissue concentration (determining paracrine effects) of adiponectin as well as other adipokines are typically significantly higher compared plasma levels (7,39). It should also be noted, that adipocytes release de-novo synthesized adiponectin into the culture media. Based on our previous studies, we calculated that the secreted adiponectin represented ~12-15% of the exogenous adiponectin in media at the end of incubations (40). Third, it should be noted that the full-length adiponectin used in our study represents a mixture multimeric, hexameric and trimeric isoform. Purified recombinant multimeric or hexameric isoform is not commercially available and we were not successful in chromatography-based isolation of these isoforms in a sufficient purity suitable for in-vitro studies. Finally, our observations were made in a group of obese women and it is not currently known, whether our results can be extrapolated to other groups of subjects. Future studies focusing on the role of adiponectin in stimulated lipolysis regulation (e.g. during exercise or prolonged fasting) are warranted. In conclusion, we documented that lipolysis inhibition induced by adiponectin is preferentially exerted by globular isoform in SCAAT and trimeric isoform in VAT. We suggest that these differences reflect isoform-specific ability to activate AMPK in adipocytes, as only globular adiponectin induced AMPK activity in SCAAT. Supposedly, modifying the quantity of adiponectin isoforms by pharmacological compounds would provide a future tool for the lipotoxicity prevention and treatment in obese subjects. Acknowledgements: Authors would like to thank Zuzana Parizkova and Hana Gregorova for their excellent technical assistance. 52

62 Table 1: Anthropometric and biochemical variables Age (years) 48.1 ± 3.9 BMI (kg/m 2 ) 36.8 ± 1.6 Adiponectin (µg/ml) 2.0 ± 0.1 Glycerol (µmol/l) ± 11.9 FFA (µmol/l) ± 55.6 Insulin (mu/l) 12.8 ± 2.0 Glucose (mmol/l) 6.4 ± 0.6 Total cholesterol (mmol/l) 4.9 ± 0.3 HDL-cholesterol (mmol/l) 1.2 ± 0.1 Triglycerides (mmol/l) 1.9 ± 0.1 Figures` legend Figure 1. The effect of AICAR, full-length, trimeric and globular adiponectin isoforms on spontaneous lipolysis Glycerol concentration in media after 2-hour incubation of adipocytes derived from subcutaneous abdominal adipose tissue (A) or visceral/omental adipose tissue (B) with 0.5 mm AICAR, 20 µg/ml full-length adiponectin, 20 µg/ml trimeric adiponectin and 20 µg/ml globular adiponectin * p<0.05 for comparison with the control experiment Figure 2. The effect of AICAR, full-length, trimeric and globular adiponectin isoforms on Ser79 ACC and Ser565 HSL phosphorylation Levels of phospho-ser79-acc (A) and phospho-ser565-hsl (B) were investigated in differentiated preadipocytes derived from SCAAT after 24-hour treatment with 2mM AICAR, 10 µg/ml full-length adiponectin, 10 µg/ml trimeric adiponectin and 10 µg/ml globular adiponectin expressed as % change over the control experiment * p<0.05 for comparison with the control experiment Figure 1. 53

63 Figure 2. Reference List 1. Klein S, Burke LE, Bray GA, Blair S, Allison DB, Pi-Sunyer X, Hong Y, Eckel RH 2004 Clinical implications of obesity with specific focus on cardiovascular disease: a statement for professionals from the American Heart Association Council on Nutrition, Physical Activity, and Metabolism: endorsed by the American College of Cardiology Foundation. Circulation 110: Zhang H, Cui J, Zhang C 2010 Emerging role of adipokines as mediators in atherosclerosis. World J Cardiol 2: Arner P 2002 Insulin resistance in type 2 diabetes: role of fatty acids. Diabetes Metab Res Rev 18 Suppl 2:S5-S9 4. Kolditz CI, Langin D 2010 Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 13: Opie LH, Walfish PG 1963 Plasma free fatty acid concentrations in obesity. N Engl J Med 268: Karpe F, Dickmann JR, Frayn KN 2011 Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a reevaluation. Diabetes 60: Lafontan M, Langin D 2009 Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res 48: Arner P 2005 Human fat cell lipolysis: Biochemistry, regulation and clinical role 1. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism 19: Langin D, Arner P 2006 Importance of TNFalpha and neutral lipases in human adipose tissue lipolysis. Trends Endocrinol Metab 17: Laurencikiene J, van H, V, Arvidsson NE, Dicker A, Blomqvist L, Naslund E, Langin D, Arner P, Ryden M 2007 NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research 48: Trujillo ME, Sullivan S, Harten I, Schneider SH, Greenberg AS, Fried SK 2004 Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. J Clin Endocrinol Metab 89:

64 12. van Hall G, Steensberg A, Sacchetti M, Fischer C, Keller C, Schjerling P, Hiscock N, Moller K, Saltin B, Febbraio MA, Pedersen BK 2003 Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. J Clin Endocrinol Metab 88: Maeda N, Shimomura I, Kishida K, Nishizawa H, Matsuda M, Nagaretani H, Furuyama N, Kondo H, Takahashi M, Arita Y, Komuro R, Ouchi N, Kihara S, Tochino Y, Okutomi K, Horie M, Takeda S, Aoyama T, Funahashi T, Matsuzawa Y 2002 Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/acrp30. Nat Med 8: Wedellova Z, Dietrich J, Siklova-Vitkova M, Kolostova K, Kovacikova M, Duskova M, Broz J, Vedral T, Stich V, Polak J 2011 Adiponectin inhibits spontaneous and catecholamine-induced lipolysis in human adipocytes of non-obese subjects through AMPKdependent mechanisms. Physiol Res 60: Waki H, Yamauchi T, Kamon J, Ito Y, Uchida S, Kita S, Hara K, Hada Y, Vasseur F, Froguel P, Kimura S, Nagai R, Kadowaki T 2003 Impaired multimerization of human adiponectin mutants associated with diabetes. Molecular structure and multimer formation of adiponectin. J Biol Chem 278: Polak J, Kovacova Z, Jacek M, Klimcakova E, Kovacikova M, Vitkova M, Kuda O, Sebela M, Samcova E, Stich V 2007 An increase in plasma adiponectin multimeric complexes follows hypocaloric diet-induced weight loss in obese and overweight premenopausal women. Clin Sci (Lond) 112: Fruebis J, Tsao TS, Javorschi S, Ebbets-Reed D, Erickson MR, Yen FT, Bihain BE, Lodish HF 2001 Proteolytic cleavage product of 30-kDa adipocyte complement-related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight loss in mice. Proc Natl Acad Sci USA 98: Tsao TS, Lodish HF, Fruebis J 2002 ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose metabolism. European Journal of Pharmacology 440: Kubota N, Yano W, Kubota T, Yamauchi T, Itoh S, Kumagai H, Kozono H, Takamoto I, Okamoto S, Shiuchi T, Suzuki R, Satoh H, Tsuchida A, Moroi M, Sugi K, Noda T, Ebinuma H, Ueta Y, Kondo T, Araki E, Ezaki O, Nagai R, Tobe K, Terauchi Y, Ueki K, Minokoshi Y, Kadowaki T 2007 Adiponectin stimulates AMP-Activated protein kinase in the hypothalamus and increases food intake. Cell Metabolism 6: Wu XD, Motoshima H, Mahadev K, Stalker TJ, Scalia R, Goldstein BJ 2003 Involvement of AMP-activated protein kinase in glucose uptake stimulated by the globular domain of adiponectin in primary rat adipocytes. Diabetes 52: Yamauchi T, Kamon J, Minokoshi Y, Ito Y, Waki H, Uchida S, Yamashita S, Noda M, Kita S, Ueki K, Eto K, Akanuma Y, Froguel P, Foufelle F, Ferre P, Carling D, Kimura S, Nagai R, Kahn BB, Kadowaki T 2002 Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Nat Med 8:

65 22. Pajvani UB, Hawkins M, Combs TP, Rajala MW, Doebber T, Berger JP, Wagner JA, Wu M, Knopps A, Xiang AH, Utzschneider KM, Kahn SE, Olefsky JM, Buchanan TA, Scherer PE 2004 Complex distribution, not absolute amount of adiponectin, correlates with thiazolidinedione-mediated improvement in insulin sensitivity. J Biol Chem 279: Tsao TS, Tomas E, Murrey HE, Hug C, Lee DH, Ruderman NB, Heuser JE, Lodish HF 2003 Role of disulfide bonds in Acrp30/adiponectin structure and signaling specificity. Different oligomers activate different signal transduction pathways. J Biol Chem 278: Hardie DG 2011 AMP-activated protein kinase: an energy sensor that regulates all aspects of cell function. Genes Dev 25: Liu Q, Gauthier MS, Sun L, Ruderman N, Lodish H 2010 Activation of AMPactivated protein kinase signaling pathway by adiponectin and insulin in mouse adipocytes: requirement of acyl-coa synthetases FATP1 and Acsl1 and association with an elevation in AMP/ATP ratio. FASEB J 24: Kovacova Z, Tencerova M, Roussel B, Wedellova Z, Rossmeislova L, Langin D, Polak J, Stich V 2011 The impact of obesity on secretion of adiponectin multimeric isoforms differs in visceral and subcutaneous adipose tissue. Int J Obes (Lond) doi: /ijo Tomas E, Tsao TS, Saha AK, Murrey HE, Zhang CC, Itani SI, Lodish HF, Ruderman NB 2002 Enhanced muscle fat oxidation and glucose transport by ACRP30 globular domain: Acetyl-CoA carboxylase inhibition and AMP-activated protein kinase activation. Proc Natl Acad Sci U S A 99: Addabbo F, Nacci C, De BL, Leo V, Tarquinio M, Quon MJ, Montagnani M 2011 Globular adiponectin counteracts VCAM-1-mediated monocyte adhesion via AdipoR1/NFkappaB/COX-2 signaling in human aortic endothelial cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 301:E1143-E Xiao X, Dong Y, Zhong J, Cao R, Zhao X, Wen G, Liu J 2011 Adiponectin protects endothelial cells from the damages induced by the intermittent high level of glucose. Endocrine 40: Chedid P, Hurtado-Nedelec M, Marion-Gaber B, Bournier O, Hayem G, Gougerot-Pocidalo MA, Frystyk J, Flyvbjerg A, El BJ, Marie JC 2012 Adiponectin and its globular fragment differentially modulate the oxidative burst of primary human phagocytes. Am J Pathol 180: Ibrahim MM 2010 Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews 11: Tan BK, Chen J, Digby JE, Keay SD, Kennedy CR, Randeva HS 2006 Upregulation of adiponectin receptor 1 and 2 mrna and protein in adipose tissue and adipocytes in insulin-resistant women with polycystic ovary syndrome. Diabetologia 49:

66 33. Kadowaki T, Yamauchi T, Kubota N, Hara K, Ueki K, Tobe K 2006 Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome. J Clin Invest 116: Bluher M, Williams CJ, Kloting N, Hsi A, Ruschke K, Oberbach A, Fasshauer M, Berndt J, Schon MR, Wolk A, Stumvoll M, Mantzoros CS 2007 Gene expression of adiponectin receptors in human visceral and subcutaneous adipose tissue is related to insulin resistance and metabolic parameters and is altered in response to physical training. Diabetes Care 30: Nannipieri M, Bonotti A, Anselmino M, Cecchetti F, Madec S, Mancini E, Baldi S, Santini F, Pinchera A, Rossi M, Ferrannini E 2007 Pattern of expression of adiponectin receptors in human adipose tissue depots and its relation to the metabolic state. Int J Obes (Lond) 31: Waki H, Yamauchi T, Kamon J, Kita S, Ito Y, Hada Y, Uchida S, Tsuchida A, Takekawa S, Kadowaki T 2005 Generation of globular fragment of adiponectin by leukocyte elastase secreted by monocytic cell line THP-1. Endocrinology 146: Garton AJ, Yeaman SJ 1990 Identification and role of the basal phosphorylation site on hormone-sensitive lipase. European Journal of Biochemistry 191: Guilherme A, Virbasius JV, Puri V, Czech MP 2008 Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol 9: Dostalova I, Kavalkova P, Haluzikova D, Housova J, Matoulek M, Haluzik M 2009 The use of microdialysis to characterize the endocrine production of human subcutaneous adipose tissue in vivo. Regul Pept 155: Kovacova Z, Vitkova M, Kovacikova M, Klimcakova E, Bajzova M, Hnevkovska Z, Rossmeislova L, Stich V, Langin D, Polak J 2009 Secretion of adiponectin multimeric complexes from adipose tissue explants is not modified by very low calorie diet. Eur J Endocrinol 160:

67 Studie č. 3 Polak J, Kotrc M, Wedellova Z, Jabor A, Malek I, Kautzner J, Kazdova L, Melenovsky V. Lipolytic effects of B-type natriuretic peptide 1-32 in adipose tissue of herart failure patiens compared with healthy controls. J Am Coll Cardiol Sep 6;58(11):

68 Journal of the American College of Cardiology Vol. 58, No. 11, by the American College of Cardiology Foundation ISSN /$36.00 Published by Elsevier Inc. doi: /j.jacc Lipolytic Effects of B-Type Natriuretic Peptide 1 32 in Adipose Tissue of Heart Failure Patients Compared With Healthy Controls Jan Polak, MD, PHD,* Martin Kotrc, MD,* Zuzana Wedellova, MD, Antonin Jabor, MD, PHD,* Ivan Malek, MD, PHD,* Josef Kautzner, MD, PHD,* Ludmila Kazdova, PHD, Vojtech Melenovsky, MD, PHD* Prague, Czech Republic; and Baltimore, Maryland Objectives Background Methods Results Conclusions Our goal was to examine the role of B-type natriuretic peptide (BNP) in lipolysis regulation in heart failure (HF) patients. Enhanced adipose tissue lipolysis can contribute to myocardial lipid overload, insulin resistance, and cachexia in advanced HF. Natriuretic peptides were recently recognized to stimulate lipolysis in healthy subjects. Ten nondiabetic HF patients (New York Heart Association functional class III, 50% nonischemic etiology) and 13 healthy subjects (control subjects) of similar age, sex, and body composition underwent a microdialysis study of subcutaneous abdominal adipose tissue. Four microdialysis probes were simultaneously perfused with 0.1 M BNP 1 32, 10 M BNP 1 32,10 M norepinephrine (NE) or Ringer s solution. Outgoing dialysate glycerol concentration (DGC) was measured as an index of lipolysis. Spontaneous lipolysis was higher in HF patients compared with control subjects (DGC: mol/l vs mol/l, p 0.01). Response to NE was similar (p 0.35) in HF patients and control subjects (DGC increase of fold vs fold). BNP M markedly increased lipolysis in both HF patients and control subjects (DGC increase of fold vs fold), whereas the response to 0.1 M BNP 1 32 was more pronounced in HF patients (p 0.02). In HF patients, spontaneous lipolysis positively correlated with insulin resistance and the response to BNP 1 32 negatively correlated with adiposity. BNP 1 32 exerts strong lipolytic effects in humans. Despite marked elevation of plasma immunoreactive BNP, the responsiveness of adipose tissue to BNP 1 32 is not attenuated in HF, possibly reflecting a deficiency of endogenous bioactive BNP. Lipolytic effects of BNP can contribute to excessive fatty acid mobilization in advanced HF. (J Am Coll Cardiol 2011;58: ) 2011 by the American College of Cardiology Foundation A chronic heart failure (HF) state triggers a neuroendocrine response that stimulates the release of free fatty acids (FFAs) from adipose tissue (AT) (1). Although FFAs are From the *Department of Cardiology, Institute of Clinical and Experimental Medicine, IKEM, Prague, Czech Republic; Department of Metabolism and Diabetes, Institute of Clinical and Experimental Medicine, IKEM, Prague, Czech Republic; Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, The Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland; Department of Sport Medicine, Third Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic; and the 2nd Internal Medicine Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic. This work was supported by Ministry of Health (MZO to Dr. Melenovsky, NS /2009 to Drs. Melenovsky and Pola); Ministry of Education (MSMT-1MO510 to Dr. Melenovsky and MSMT to Drs. Polak and Wedellova) and the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (305/09/1390 to Dr. Melenovsky). Dr. Kautzner is on the advisory boards of Biosense Webster, Boston Scientific, GE Healthcare, Medtronic, and St. Jude Medical. All other authors have reported that they have no relationships relevant to the contents of this paper to disclose. Manuscript received January 17, 2011; revised manuscript received May 3, 2011, accepted May 31, the major substrate for cardiac metabolism, persistently increased FFA efflux from AT might have adverse effects on cardiac function (2) by impairing insulin sensitivity (3), diminishing cardiac efficiency (4), and contributing to myocardial lipotoxicity (5 7). Enhanced lipolysis also contributes to body weight loss and cardiac cachexia, which are linked with a particularly poor outcome in HF (2,8 10). Increased adrenergic-fatty acid load in HF has been suggested as a potential therapeutic target (11 14). See page 1126 Mechanisms of increased AT lipolysis in HF patients are incompletely understood. Lipolysis in HF patients is stimulated by increased catecholamines (15) and tumor necrosis factor- (16). Recently, it was recognized that natriuretic peptides (NPs) are also capable of stimulating lipolysis in

69 1120 Polak et al. JACC Vol. 58, No. 11, 2011 BNP-Induced Lipolysis in Heart Failure September 6, 2011: Abbreviations and Acronyms ANP atrial natriuretic peptide AT adipose tissue BNP B-type natriuretic peptide DGC dialysate glycerol concentration FFA free fatty acid HF heart failure ibnp immunoreactive B-type natriuretic peptide NP natriuretic peptide adipocytes (17,18). Lipolytic role of atrial natriuretic peptide (ANP) was first suggested by in vitro experiments (19,20) and subsequently confirmed by in vivo studies by our and other groups (20,21). ANP appears to be a major regulator of lipolysis during prolonged exercise (22) in healthy subjects, surpassing the contribution of catecholamines (14,23). ANP is also responsible for the regulation of residual lipolysis in situations of pharmacological beta-adrenergic blockade (2,23). Much less is known about the role of B-type natriuretic peptide (BNP) in lipolysis regulation. Importantly, no studies have examined the lipolytic role of BNP in HF patients, despite important links between NP system activation, enhanced lipolysis, and possible progression of HF. BNP is released from the heart as inactive pro-bnp in response to increased wall stress (6,9,24) and is then cleft into the bioactive form BNP 1 32 by specific proteases (9,10,14,17). Despite the fact that circulating immunoreactive BNP (ibnp) is typically increased in HF and serves as a hallmark of the disease (25,26), the functional effects of BNP on target tissues are influenced by abnormal processing/decreased generation of bioactive BNP species (active- BNP deficiency) or by attenuated tissue response (BNP resistance). Which of these 2 mechanisms prevail in AT of HF patients is currently unknown; however, this question can be addressed by examining in vivo lipolytic responses by the administration of exogenous bioactive BNP BNPmediated lipolysis would be attenuated if the latter mechanism prevails or preserved if the former mechanism is operational. The aim of this study was to examine the effects of BNP 1 32 on regulation of lipolysis in vivo and to compare healthy subjects with advanced HF patients. We used the unique technique of microdialysis, which allows tissue delivery of pharmacological substances into subcutaneous AT with simultaneous sampling of extracellular fluid for metabolite analyses. Methods Subjects. Men with symptomatic HF (n 10) were recruited at the Cardiology Department of IKEM, Prague, Czech Republic. HF was defined by Framingham criteria as a history of HF hospitalization, documented systolic dysfunction (left ventricular ejection fraction 35%), and persistent symptoms (New York Heart Association functional class of II or higher for 3 months). Importantly, we excluded patients with diabetes mellitus and hemodynamic instability, infection, severe renal failure or anemia (creati- 60 nine 300 mol/l, hemoglobin 100 g/l), endocrine disease, restrictive or hypertrophic cardiomyopathy. HF etiology was coronary artery disease in 50% and nonischemic in the rest. All patients were treated with furosemide (54 8 mg/day), 9 with beta-blockers and 7 with angiotensinconverting enzyme inhibitors or angiotensin receptor antagonists. Healthy male controls (n 13), free of any disease or medication, were recruited by advertisement. All subjects were nonsmokers. The study was approved by the local ethics committee, and all subjects signed informed consent. Clinical measurements. Symptoms were quantified using a Minnesota Living With Heart Failure Questionnaire, body composition was assessed using dual-energy X-ray absorptiometry (Lunar Prodigy, GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin), and skinfold thickness was measured with Best s calipers (nondominant triceps, biceps, subscapular, and supra-iliac region). Patients were weighed (Omron HBF510W, Tokyo, Japan), underwent cardiac ultrasonography (Vivid7, GE Healthcare), and their height was measured with a stadiometer. For biochemical tests, venous blood samples were obtained after an overnight fast and plasma was stored at 80 C until analysis. An oral glucose tolerance test was performed on a separate day (75 g of glucose/300 ml of water), with sampling of venous blood at 0, 30, 60, and 120 min. All variables were collected within 5 days from the microdialysis experiment. Microdialysis protocol. Microdialysis is a mini-invasive method evaluating AT metabolism in vivo (27). Semipermeable membrane probes are perfused (with or without pharmacological substances) at low flow rates until equilibrium is established between interstitial tissue fluid and dialysate solution in the probe. Glycerol released from adipocytes after triglyceride hydrolysis is used as a lipolysis marker. Microdialysis perfusions with 2 different concentrations of BNP 1 32 (0.1 M and 10 M) were based on previous in vitro data (28) showing maximum lipolytic response with 10 M and 50% of maximum effect with a 0.1- M concentration (2,8,29,30). The subjects entered the research unit at 8:00 AM after an overnight fast. All heparin was withheld for more than 24 h before tests. At 8:30 AM, 4 microdialysis probes (20,000-kDa cutoff, CMA Microdialysis, Stockholm, Sweden) were inserted in the subcutaneous abdominal AT. The probes were connected to a microperfusion pump (Harvard Apparatus, Les Ulis, France) and perfused with Ringer s solution (Baxter, Prague, Czech Republic). Ethanol (1.7 g/l) was added to the perfusate to estimate changes in the blood flow, as described previously (9,10,14). The first probe was perfused with Ringer s solution (control probe), the second probe with 10 M norepinephrine (Leciva, Prague, Czech Republic), the third probe with 10 M of human recombinant BNP 1 32 (nesiritide-noratak, Janssen-Cilag, Baar, Switzerland) and the fourth probe with 0.1 M BNP The study consisted of 80-min baseline sampling and 60 min of pharmacological stimulation. Dialysate samples were collected at 20-min intervals at a flow rate of 1 l/min

70 JACC Vol. 58, No. 11, 2011 September 6, 2011: Polak et al. BNP-Induced Lipolysis in Heart Failure 1121 Anthropometric Table 1 Anthropometric and Clinical and Parameters Clinical of Parameters HF Patients of HF andpatients Control Group and Control Group HF Patients Control Group p Value* Age, yrs NYHA functional class MLHFQ score Systolic/diastolic BP, mm Hg 102 8/ / /0.013 Heart rate, beats/min Anthropometric variables Body mass index, kg/m Waist circumference, cm Skinfold thickness, mm Fat mass, DEXA, kg Lean mass, DEXA, kg Echocardiography LV end-diastolic diameter, mm LV ejection fraction, % RV dysfunction grade (0 4) Mitral regurgitation grade (0 4) Values are mean SD. *p value for comparison of HF and control groups (Mann-Whitney test). Skinfold thickness is a sum of 4 skinfolds. BP blood pressure; DEXA dual-energy X-ray absorptiometry; HF heart failure; LV left ventricular; MLHFQ Minnesota Living With Heart Failure Questionnaire; NYHA New York Heart Association; RV right ventricular. throughout the experiments. The dialysate glycerol concentration (DGC) was measured as a marker of lipolysis. To evaluate the relative recovery of microdialysis probes (a parameter describing permeability characteristics of the membrane), 4 probes were submerged in a vial containing 0.1 M BNP 1 32 dissolved in saline solution. After 3-h equilibration, probes were perfused with saline solution and 0.1% albumin at flow rates 0.5, 1, 2, 3.5, and 5 l/min. BNP 1 32 was measured in dialysate and in surrounding BNP 1 32 solution and log-transformed concentrations were plotted against perfusion rates to calculate the relative recovery at each perfusion rate. This experiment demonstrated a relative recovery of 20 2% for BNP 1 32 at perfusion rate 1 l/min. Biochemical analysis. The ibnp concentrations were measured by chemiluminescent microparticle immunoassay (Architect BNP, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois), insulin by IRMA assay (Immunotech, Prague, Czech Republic), FFA by immunoturbidimetry (Wako, Richmond, Virginia), and glycerol by Randox Glycerol Kit (Randox Laboratories Ltd., Antrim, United Kingdom). Statistical analysis. Statistical analysis was performed using SPSS version 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois). The response of AT to pharmacological perfusions was evaluated in the HF and control groups separately using Student s paired t test. Differential responses to BNP 1 32, norepinephrine, or Ringer s solution perfusion between groups were evaluated using an ordinary t test. Betweengroup differences in anthropometric and biochemical variables (Tables 1 and 2) were evaluated using the Mann- Whitney test. Associations between variables were investigated using the Spearman method. Data are presented as mean SEM unless stated otherwise. A level of p 0.05 was considered statistically significant. Biochemical Table 2 Biochemical and Insulin Sensitivity and InsulinParameters Sensitivity of Parameters HF Patients of HF andpatients Control Group and Control Group HF Group Control Group p Value* BNP, pg/ml ( ,838.6) 27.6 ( ) BNP, pmol/l ( ) 6.1 ( ) Fasting glucose, mmol/l Fasting insulin, miu/l HOMA-IR HbA 1c,% Oral glucose tolerance test Glucose AUC, mmol/l/120 min 6,056 3,525 6,057 2, Insulin AUC, miu/ml/120 min Glucose 120 min, mmol/l Insulin 120 min, miu/l Values are median (interquartile range) or mean SEM. *p value for comparison of heart failure and control groups (Mann-Whitney test). AUC area under the curve; BNP B-type natriuretic peptide; HbA 1c glycosylated hemoglobin A1c; HF heart failure; HOMA-IR homeostasis model assessment of insulin resistance. 61

71 1122 Polak et al. JACC Vol. 58, No. 11, 2011 BNP-Induced Lipolysis in Heart Failure September 6, 2011: Results Spontaneous lipolysis. Spontaneous lipolysis at baseline was evaluated by analyzing DGC in all samples obtained throughout the last hour of a baseline period. HF patients had higher spontaneous lipolytic rate by 19% than control subjects ( mol/l vs mol/l, p 0.01) (Fig. 1A). Spontaneous lipolysis (DGC in a control probe) remained unchanged in healthy volunteers, but decreased by 22% in the HF group (p 0.01) during the experiment period. Response to BNP 1 32 and norepinephrine. Compared with baseline DGC, the perfusion with 10 M BNP 1 32 increased lipolysis by fold and fold (both p 0.05) in control and HF subjects, respectively. The increment in lipolysis induced by 10 M BNP 1 32 was similar between groups (p 0.61). The lipolytic response to the lower BNP 1 32 concentration (0.1 M) differed between HF and control subjects (p 0.02); lipolysis increased by 17% (p 0.056) in HF subjects, but remained unchanged in the control group (p 0.39). No differences were observed between the HF and control groups (p 0.35) in norepinephrine-induced lipolysis ( fold and fold increase in controls and HF, p 0.04 and p 0.06, respectively). Analysis of absolute differences in DGC (in mol/l) after BNP 1 32 perfusions revealed a trend toward a higher response in HF than in control subjects both at low and high BNP 1 32 concentrations (by 23% and 41%, respectively, p 0.1 and p 0.07, respectively). Data are summarized in Figures 2 and 3. Determinants of spontaneous lipolysis and response to BNP Differential regulation of lipolysis was observed between HF and control groups. Spontaneous DGC was associated with adiposity and insulin resistance evaluated as the area under the plasma insulin curve (AUC insulin ) during the oral glucose tolerance test (r 0.67, p 0.01 and r 0.88, p 0.01) in the control group, whereas these associations were absent in the HF subjects (r 0.31, Figure 2 Dialysate Glycerol Concentrations After Pharmacological Stimulation Values were calculated as the percentage of change in dialysate glycerol concentration at time 140 min over averaged values of spontaneous lipolysis obtained at time points (0 to 80 min). Differences between control and heart failure (HF) groups were analyzed using a t test. *p BNP B-type natriuretic peptide. p 0.5 and r 0.52, p 0.18). No associations were observed between basal lipolytic rate and plasma ibnp in the HF or control group (r 0.41, p 0.24 and r 0.5, p 0.1, respectively) (Fig. 4A). However, lipolytic response to 10- M BNP 1 32 perfusion was inversely related to fat mass (%) in the HF group (r 0.90, p 0.01), but no relationship with fat mass or other investigated variables (fasting plasma insulin, homeostasis model assessment of insulin resistance, INS 120 ) was observed in the control group (Fig. 4B). Changes in AT blood flow and AT cyclic guanosine monophosphate production during BNP 1 32 administration. Blood flow in AT was evaluated using the ethanol concentration outflow/inflow ratio, as described previously (14,31). No differences were observed in the HF and control groups at baseline or after 10- M BNP 1 32 perfusion, which induced vasodilation in both groups. In contrast, norepinephrine administration led to vasodilation in control subjects only (Fig. 1B). Additionally, after the 10- M BNP 1 32 perfusion A B Figure 1 Spontaneous Adipose Tissue Lipolysis and Blood Flow in Control and Heart Failure Subjects (A) Dialysate glycerol concentrations reflecting baseline lipolytic rate in adipose tissue. (B) Changes in ethanol outflow/inflow concentration ratio reflecting adipose tissue blood flow at baseline and after pharmacological stimulation (10 M B-type natriuretic peptide [BNP] 1 32 and 10 M norepinephrine). A paired t test was used to compare values before and after perfusions, and an ordinary t test was used when comparing differences between groups. *p 0.05 between groups, N 5; #p 0.05 versus baseline. 62

72 JACC Vol. 58, No. 11, 2011 September 6, 2011: Polak et al. BNP-Induced Lipolysis in Heart Failure 1123 A B Figure 3 Dialysate Glycerol Concentrations in Individual Probes During Pharmacological Perfusions Dialysate glycerol concentrations after stimulation with B-type natriuretic peptide [BNP] 1 32 or norepinephrine. *p 0.05, paired t test. (A) Control subjects. (B) Heart failure subjects. in a separate group of 4 healthy volunteers, we observed a fold increase (p 0.05) in AT cyclic guanosine monophosphate concentration that was associated with a concomitant increase in DGC (r 1, p 0.001). These results indicate that cyclic guanosine monophosphate dependent lipolytic pathway is activated in adipocytes during BNP administration. Discussion We present several new findings concerning the regulation of lipolysis in AT in HF. In nondiabetic advanced HF patients, spontaneous lipolysis is enhanced compared with body composition matched healthy controls. In both groups, administration of BNP 1 32 leads to a strong lipolytic response. Moreover, the responsiveness of AT to BNP 1 32 is not attenuated, but rather increased in HF, and it is inversely proportional to body fat mass. Increased spontaneous lipolysis in HF. Humoral factors including NPs (23), catecholamines (14,32), insulin (33), and drugs (e.g., beta-blockers) contribute to lipolysis regulation in HF. The finding of increased spontaneous lipolysis in HF is consistent with a report of increased plasmatic FFA Figure 4 Associations Between Lipolysis Regulation and the BNP System in Control and HF Subjects Association between plasma immunoreactive B-type natriuretic peptide (ibnp) levels and spontaneous lipolysis (A). Association between lipolytic response to 10- M B-type natriuretic peptide (BNP) 1 32 perfusion and fat mass (percentage of body weight) (B). HF heart failure. 63

73 1124 Polak et al. JACC Vol. 58, No. 11, 2011 BNP-Induced Lipolysis in Heart Failure September 6, 2011: flux in the HF state (1). Lipolysis is physiologically inhibited by insulin, and altered insulin action thus regulates lipolytic rate. Indeed, insulin resistance is frequently observed in nondiabetic HF patients (30). Furthermore, higher plasma insulin levels during the oral glucose tolerance test (representing a dynamic test of glucose metabolism) were associated with greater spontaneous lipolysis in the HF group but not in the control group in our study, indicating that insulin resistance and the attenuated antilipolytic effect of insulin might contribute to greater lipolysis in HF. BNP 1 32 induced strong lipolytic effects in both control and HF subjects. The effect of bioactive BNP 1 32 on AT lipolysis of both groups is in line with previous experiments using local, systemic, or in vitro administration of ANP (14,34,35). The magnitude of lipolysis induced by 10 M BNP 1 32 is comparable to that observed after administration of 10 M ANP (14); however, because the subjects in this study differ from the previous in several cofounders (e.g., body composition, age) further BNP 1 32 studies are needed to directly compare in vivo lipolytic potency of ANP and BNP. Importantly, because the effects of catecholamines are attenuated in HF by beta-blocker therapy, NPs might be even more important regulators of lipolysis in HF subjects than in control subjects. Despite the fact that HF is often associated with resistance of vascular and renal tissues to the effects of NPs due to multiple mechanisms (36), we did not observe diminished lipolysis induced by BNP 1 32 in the HF group, suggesting that NP resistance in HF is not ubiquitous in all tissues. Heightened AT responsiveness to BNP A perfusion with 2 concentrations of BNP 1 32 allowed us to partly evaluate the BNP sensitivity of AT. Although the response was similar in both groups with 10- M perfusion, lipolysis activation with 0.1 M was higher in HF subjects, indicating increased sensitivity of AT to BNP. How then can most of the HF patients maintain their stable fat mass, regardless of a large increase in ibnp? This contradiction could be explained by the notion that bioactive BNP species are actually deficient in HF subjects (36). Mass spectrometry analysis showed that circulating ibnp in HF patients contains mostly biologically inactive BNP pro-forms (20,37). Here we show higher AT sensitivity to BNP 1 32 despite elevated circulating ibnp and thus provide indirect in vivo support for the hypothesis of active BNP deficiency in HF. Additionally, the absence of an association between ibnp and spontaneous lipolysis in our study further supports this hypothesis. Interestingly, we observed an inverse association between BNP induced lipolysis and fat mass in HF. In obese subjects, lower lipolytic responsiveness to NPs and therefore lower FFA flux may translate into fewer detrimental effects on cardiac function (5 7) and could underlie a paradoxical association between increased fat mass and better HF prognosis (38). Increased NP clearance receptors in AT of obese subjects (39) or the effects of a high-fat diet (40) can explain lower lipolytic BNP 1 32 responses in obese subjects 64 (40). Furthermore, the ability of BNP to regulate wholebody energy homeostasis (41) via enhanced mitochondrial biogenesis and lipid oxidation in skeletal muscle (40) might also modify plasma FFA levels; however, it remains unclear how these mechanisms are operational in HF. Subsequently, AT might become more sensitive to BNP 1 32 as body fat is decreasing (e.g., during the weight loss or in cardiac cachexia), further perpetuating the vicious cycle of weight loss. Effects of BNP 1 32 on AT blood flow. Because changes in AT blood flow affect DGC, we evaluated AT blood flow during perfusions. Neither AT blood flow at baseline nor the vasodilatory response to 10 M BNP 1 32 differed between groups. No effect of norepinephrine on AT blood flow was observed in the HF group, whereas vasodilation occurred in control subjects. Study limitations. Our work has identifiable limitations. First, it was limited to advanced HF in middle-aged men without diabetes and the number of examined subjects is rather small. Second, concentrations of BNP 1 32 used in microdialysis perfusions were substantially higher than physiological levels in AT, and it is thus possible that using lower doses would provide additional information in a more physiological range. Third, the HF group was somewhat older than control subjects. Because aging is typically associated with diminished lipolysis (33,42), our results might underestimate the lipolysis of HF compared with younger controls. Future studies using systemic BNP 1 32 infusion at more physiological concentrations are needed to extend our findings, help to delineate the real cause-andeffect relationship, and describe other endocrine and metabolic changes induced by BNP (e.g., changes in adipokine levels and substrate use). Additionally, studies comparing patients with different HF severity across a range of adiposity and insulin resistance will provide important and clinically relevant information. Conclusions Our observations suggest that the lipolytic rate is increased in patients with HF. Furthermore, induction of lipolysis by BNP 1 32 is increased in HF patients compared with control subjects, which suggests that BNP might play an important role in excessive FFA mobilization and related metabolic abnormalities including cardiac cachexia. Acknowledgments The authors thank Zuzana Parizkova and Hana Gregorova for their excellent technical assistance, nurse coordinators Hana Podlesakova and Josef Halaxa, and Dr. Petr Tuma, PhD, for his help with biochemical analyses. Reprint requests and correspondence: Dr. Vojtech Melenovsky, Department of Cardiology, Institute of Clinical and Experimental Medicine, Videnska 1958/9, Prague , Czech Republic. vome@ikem.cz.

74 JACC Vol. 58, No. 11, 2011 September 6, 2011: Polak et al. BNP-Induced Lipolysis in Heart Failure 1125 REFERENCES 1. Lommi J, Kupari M, Yki-Jarvinen H. Free fatty acid kinetics and oxidation in congestive heart failure. Am J Cardiol 1998;81: Opie LH, Knuuti J. The adrenergic-fatty acid load in heart failure. J Am Coll Cardiol 2009;54: Nuutila P, Koivisto VA, Knuuti J, et al. Glucose-free fatty acid cycle operates in human heart and skeletal muscle in vivo. J Clin Invest 1992;89: Mjos OD. Effect of free fatty acids on myocardial function and oxygen consumption in intact dogs. J Clin Invest 1971;50: Sharma S, Adrogue JV, Golfman L, et al. Intramyocardial lipid accumulation in the failing human heart resembles the lipotoxic rat heart. FASEB J 2004;18: von Haehling S, Lainscak M, Springer J, Anker SD. Cardiac cachexia: a systematic overview. Pharmacol Ther 2009;121: Anker SD, Ponikowski P, Varney S, et al. Wasting as independent risk factor for mortality in chronic heart failure. Lancet 1997;349: Ashrafian H, Frenneaux MP, Opie LH. Metabolic mechanisms in heart failure. Circulation 2007;116: Lafontan M, Moro C, Berlan M, Crampes F, Sengenès C, Galitzky J. Control of lipolysis by natriuretic peptides and cyclic GMP. Trends Endocrinol Metab 2008;19: Moro C, Crampes F, Sengenès C, et al. Atrial natriuretic peptide contributes to physiological control of lipid mobilization in humans. FASEB J 2004;18: Sengenès C, Berlan M, De Glisezinski I, Lafontan M, Galitzky J. Natriuretic peptides: a new lipolytic pathway in human adipocytes. FASEB J 2000;14: Polak J, Moro C, Klimcakova E, et al. The atrial natriuretic peptideand catecholamine-induced lipolysis and expression of related genes in adipose tissue in hypothyroid and hyperthyroid patients. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007;293:E Moro C, Pillard F, De Glisezinski I, et al. Training enhances ANP lipid-mobilizing action in adipose tissue of overweight men. Med Sci Sports Exerc 2005;37: Moro C, Polak J, Richterova B, et al. Differential regulation of atrial natriuretic peptide- and adrenergic receptor-dependent lipolytic pathways in human adipose tissue. Metabolism 2005;54: Lamba S, Abraham WT. Alterations in adrenergic receptor signaling in heart failure. Heart Fail Rev 2000;5: von Haehling S, Schefold JC, Lainscak M, Doehner W, Anker SD. Inflammatory biomarkers in heart failure revisited: much more than innocent bystanders. Heart Fail Clin 2009;5: Moro C, Pillard F, De Glisezinski I, et al. Exercise-induced lipid mobilization in subcutaneous adipose tissue is mainly dependent on natriuretic peptides in overweight men. Am J Physiol Endocrinol Metab 2008;295:E Moro C, Pasarica M, Elkind-Hirsch K, Redman LM. Aerobic exercise training improves atrial natriuretic peptide and catecholaminemediated lipolysis in obese women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2009;94: Moro C, Polak J, Hejnova J, et al. Atrial natriuretic peptide stimulates lipid mobilization during repeated bouts of endurance exercise. Am J Physiol Endocrinol Metab 2006;290:E Martinez-Rumayor A, Richards AM, Burnett JC, Januzzi JL Jr. Biology of the natriuretic peptides. Am J Cardiol 2008;101: Dickstein K, Cohen-Solal A, Filippatos G, et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2008: the Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2008 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association of the ESC (HFA) and endorsed by the European Society of Intensive Care Medicine (ESICM). Eur J Heart Fail 2008;10: Arner P, Bolinder J. Microdialysis of adipose tissue. J Intern Med 1991;230: Fellander G, Linde B, Bolinder J. Evaluation of the microdialysis ethanol technique for monitoring of subcutaneous adipose tissue blood flow in humans. Int J Obes Relat Metab Disord 1996;20: Langin D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res 2006;53: Xu-Cai YO, Wu Q. Molecular forms of natriuretic peptides in heart failure and their implications. Heart 2010;96: Floras JS. Sympathetic nervous system activation in human heart failure: clinical implications of an updated model. J Am Coll Cardiol 2009;54: Heck PM, Dutka DP. Insulin resistance and heart failure. Curr Heart Fail Rep 2009;6: Pilz S, Marz W. Free fatty acids as a cardiovascular risk factor. Clin Chem Lab Med 2008;46: Pilz S, Scharnagl H, Tiran B, et al. Free fatty acids are independently associated with all-cause and cardiovascular mortality in subjects with coronary artery disease. J Clin Endocrinol Metab 2006;91: Doehner W, Rauchhaus M, Ponikowski P, et al. Impaired insulin sensitivity as an independent risk factor for mortality in patients with stable chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2005;46: Sengenes C, Stich V, Berlan M, et al. Increased lipolysis in adipose tissue and lipid mobilization to natriuretic peptides during low-calorie diet in obese women. Int J Obes Relat Metab Disord 2002;26: Birkenfeld AL, Boschmann M, Moro C, et al. Lipid mobilization with physiological atrial natriuretic peptide concentrations in humans. J Clin Endocrinol Metab 2005;90: Toth MJ, Tchernof A. Lipid metabolism in the elderly. Eur J Clin Nutr 2000;54 Suppl 3:S Galitzky J, Sengenès C, Thalamas C, et al. The lipid-mobilizing effect of atrial natriuretic peptide is unrelated to sympathetic nervous system activation or obesity in young men. J Lipid Res 2001;42: Sengenès C, Zakaroff-Girard A, Moulin A, et al. Natriuretic peptidedependent lipolysis in fat cells is a primate specificity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2002;283:R Chen HH. Heart failure: a state of brain natriuretic peptide deficiency or resistance or both! J Am Coll Cardiol 2007;49: Hawkridge AM, Heublein DM, Bergen HR III, Cataliotti A, Burnett JC Jr., Muddiman DC. Quantitative mass spectral evidence for the absence of circulating brain natriuretic peptide (BNP-32) in severe human heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102: Lavie CJ, Milani RV, Ventura HO. Obesity and cardiovascular disease: risk factor, paradox, and impact of weight loss. J Am Coll Cardiol 2009;53: Wang TJ, Larson MG, Levy D, et al. Impact of obesity on plasma natriuretic peptide levels. Circulation 2004;109: Miyashita K, Itoh H, Tsujimoto H, et al. Natriuretic peptides/cgmp/ cgmp-dependent protein kinase cascades promote muscle mitochondrial biogenesis and prevent obesity. Diabetes 2009;58: Moro C, Smith SR. Natriuretic peptides: new players in energy homeostasis. Diabetes 2009;58: Klein S, Young VR, Blackburn GL, Bistrian BR, Wolfe RR. Palmitate and glycerol kinetics during brief starvation in normal weight young adult and elderly subjects. J Clin Invest 1986;78: Key Words: B-type natriuretic peptide y free fatty acids y heart failure y insulin resistance y lipolysis. 65

75 Studie č. 4 Kovacova Z, Tencerova M, Roussel B, Wedellova Z, Rossmeislova L, Langin D, Polak J, Stich V. The impact of obesity on secretion of adiponectin multimeric isoforms differs in visceral and subcutaneous adipose tissue. Int J Obes (Lond) Oct;36(10):

76 International Journal of Obesity (2011) 1-6 & 2011 Macmillan Publishers Limited All rights reserved /11 ORIGINAL ARTICLE The impact of obesity on secretion of adiponectin multimeric isoforms differs in visceral and subcutaneous adipose tissue Z Kovacova 1,2, M Tencerova 1,2, B Roussel 3,4, Z Wedellova 1,2,5, L Rossmeislova 1,2, D Langin 3,4, J Polak 1,5 and V Stich 1,2 OBJECTIVE: Hypoadiponectinemia observed in obesity is associated with insulin resistance, diabetes and atherosclerosis. The aim of the present study was to investigate secretion of adiponectin and its multimeric isoforms by explants derived from subcutaneous adipose tissue (SAT) and visceral adipose tissue (VAT) in obese and non-obese subjects. DESIGN: Paired samples of SAT and VAT and blood samples were obtained from 23 subjects (10 non-obese and 13 obese) undergoing elective abdominal surgery. Total adiponectin quantities and adiponectin isoforms were measured in conditioned media of explants derived from SAT and VAT using enzyme-linked immunosorbent assay and non-denaturing western blot, respectively. RESULTS: Total adiponectin plasma levels were lower in obese than in non-obese subjects (Po0.05). Secretion of total adiponectin in adipose tissue (AT) explants was lower in obese than in non-obese subjects in SAT (Po0.05) but not in VAT. In both, SAT and VAT, the most abundant isoform released into conditioned media was the high-molecular weight (HMW) form. Its relative proportion in relation to total adiponectin was higher in conditioned media of explants from both fat depots when compared with plasma (Po0.001). The proportion of secreted HMW vs total adiponectin was higher in VAT than in SAT explants in the group of non-obese individuals (49.3±3.1% in VAT vs 40.6±2.8% in SAT; Po0.01), whereas no difference between the two depots was found in obese subjects (46.2±3.0 % in VAT vs 46.0±2.4 % in SAT). CONCLUSION: Obesity is associated with the decrease of total adiponectin secretion in SAT. The profile of adiponectin isoforms secreted by SAT and VAT explants differs from that in plasma. Secretion of total adiponectin and HMW isoform of adiponectin are different in obese and non-obese subjects in relation to AT depot. International Journal of Obesity advance online publication, 6 December 2011; doi: /ijo Keywords: adiponectin; body fat distribution; adipose tissue INTRODUCTION The excess of body fat may lead to the development of insulin resistance and other features of the metabolic syndrome. It has previously been reported that the excess of visceral fat located in the abdominal cavity is associated with obesity-related disorders and, ultimately, with cardiovascular risk, more closely than excess of subcutaneous fat. 1-4 The deleterious effects of an accumulation of visceral fat are attributed to its anatomical position with direct portal drainage to the liver and, also, to different molecular and functional characteristics of visceral adipose tissue (VAT) when compared with subcutaneous adipose tissue (SAT). 5 Obesity and metabolic syndrome have been shown to be associated with lower plasma levels of adiponectin, 6-8 an adipokine predominantly secreted by adipocytes. The production of metabolically active cytokines produced by adipose tissue (AT)---adipocytokines, in obesity is affected in a depot-related manner. 2,9 Indeed, differences in protein production or gene expression of a number of adipocytokines, including adiponectin, 3,10-13 were demonstrated between SAT and VAT. Adiponectin is a protein abundantly secreted by AT and is present intracellularly and in the plasma in different multimeric isoforms. 14,15 Polypeptides of 30 kda are assembled into different multimers. The basic adiponectin multimer is represented by low-molecular weight (LMW) trimers formed through hydrophobic interactions. The oxidizing environment within the lumen of endoplasmic reticulum favors disulfide bond formation through which trimers can further associate into middle-molecular weight (MMW) hexamers and high-molecular weight (HMW) multimers composed of monomers. 16,17 Mechanisms that regulate formation and distribution of adiponectin complexes in human AT and the contribution of different AT depots to circulating levels of particular isoforms are not known so far. The major biological effects of adiponectin in liver, muscle and endothelium have been attributed to HMW isoform of adiponectin. 17,18 Plasma levels of the HMW isoform and the ratio of HMW to total adiponectin are more closely associated with glucose tolerance and insulin sensitivity than total adiponectin. 19,20 Taking into account the selective decreased levels of circulating HMW adiponectin in individuals with obesity 21,22 and the different endocrine activity of SAT and VAT, 23 the fat depot-specific alterations of adiponectin isoforms production may be expected. Up to date, no studies have focused on comparing secretion of adiponectin isoforms in human SAT and VAT. We studied the secretion of adiponectin isoforms in explants derived from paired samples of human VAT and SAT obtained in a group of obese as well as non-obese individuals undergoing elective abdominal 1 Department of Sport Medicine, Third Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic; 2 Franco-Czech Laboratory for Clinical Research on Obesity, Third Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic; 3 Franco-Czech Laboratory for Clinical Research on Obesity, Inserm, U1048, Toulouse, France; 4 Laboratoire de recherches sur les Obésités, Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (I2MC), UMR 1048 Inserm, Université Paul Sabatier; Laboratoire de biochimie, Institut Fédératif de Biologie, CHU Toulouse, Toulouse, France and 5 2nd Internal Medicine Department, University Hospital of Kralovske Vinohrady, Prague, Czech Republic. Correspondence: Dr Z Kovacova, Department of Sport Medicine, Third Faculty of Medicine, Charles University, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic. zuzana.kovacova@post.lf3.cuni.cz Received 1 June 2011; revised 28 September 2011; accepted 10 October

77 2 Adiponectin isoform secretion from subcutaneous and visceral fat Z Kovacova et al surgery. We hypothesized that the adiponectin isoform release differs in subcutaneous and visceral fat depot and, in a depot-specific manner, varies in respect to obesity. METHODS Subjects A total of 23 subjects (15 women and 8 men) (BMI range kg m 2 ) scheduled to have abdominal surgery were recruited for the study. The entire group was stratified according to BMI into two groups: non-obese (n ¼ 10, BMI p24.9 kg m 2 ) and obese (n ¼ 13, BMI X30 kg m 2 ). Written informed consent to participate in the study was obtained from each subject. All aspects of the study were performed according to the Declaration of Helsinki and approved by the Ethical committee of the Third Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic. Protocol Paired samples of abdominal subcutaneous (SAT) and omental/visceral (VAT) fat were obtained during abdominal surgery (laparoscopic or laparotomic cholecystectomy, hysterectomy or gastric banding) and transferred to laboratory for immediate processing. Anthropometric indices were measured and blood samples were drawn at fasting condition during the patients admission to the hospital. Blood samples were stored at 80 1C until analysis. Adipose tissue explants The samples of AT were washed in saline solution and cut into small pieces. In all, 100 mg of these AT fragments, that is, explants, were incubated in 1 ml Krebs/Ringer phosphate buffer (ph 7.4) supplemented with 40 g l 1 of bovine serum albumin, and 1 g l 1 of glucose at 37 1C ina shaking water bath with air as the gas phase. After 4 h of incubation, the conditioned medium was collected from each sample and immediately frozen and stored at 80 1C until analysis The experiment was set up in respect to maintain the ratio between AT weight and medium volume for every sample (AT weight normalization). The length of incubation of AT explants with respect to adiponectin secretion was selected according to our previous experiments showing that the kinetic of total adiponectin secretion from AT explants is close to linearity in the interval between 1 h and 6 h of incubation. 26 Given the above mentioned kinetic, concentration at 4 h of AT explants incubation was chosen as representative for analysis of adiponectin isoforms secretion from different AT depots. Western blot analysis (WB) WB analysis of adiponectin isoforms was performed as previously described. 26,27 Briefly, proteins from plasma and conditioned media of explants were separated by native polyacrylamide gel electrophoresis (without b-mercaptoethanol and SDS) and transferred to nitrocellulose membranes. Membranes were incubated with anti-human adiponectin antibody (Rabbit Polyclonal Antibody, Biovendor Laboratory Medicine Inc., Modrice, Czech Republic), and with horseradish peroxidase - coupled goat anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Cambridge, UK). Band detection using a chemiluminescent substrate (Luminol, Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) was developed on a CL-XPosure Film (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products, Rockford, IL, USA) and digitized on HP ScanJet Band intensity and relative proportions of the isoforms were analyzed using Image J software (Java-based image processing program developed at the National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signal intensities from the duplicate samples were averaged, normalized to signal for recombinant adiponectin standard and used for statistical analysis. Distribution of adiponectin isoforms in plasma and secreted by human AT was expressed as a ratio (%) of each isoform to total adiponectin amount (intensity of all isoforms expressed together as 100%). Plasma analysis and calculations The conventional laboratory variables were analyzed using commercial kits. The HOMA (homoeostasis model assessment) index was calculated using the following equation: [fasting glucose (mmol l 1 ) fasting insulin (miu l 1 )]/ Total adiponectin levels in plasma and conditioned media from AT explants were measured by commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit Adiponectin/Acrp30 (Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Statistical analysis Statistical analysis was performed using SPSS and 17.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The differences between the groups were tested using the Mann -Whitney test and differences between the SAT and VAT using Wilcoxon Signed Ranks test. Values are presented as means±s.e.m. Differences at the level of Po0.05 were considered statistically significant. RESULTS Clinical characteristics Anthropometric and biochemical characteristics of subjects are shown in Table 1. Obese subjects had lower insulin sensitivity expressed as increased HOMA-IR, lower plasma HDL cholesterol Table 1. Clinical characteristics of the entire group of subjects and groups of non-obese and obese subjects Entire group (n ¼ 23) Non-obese (n ¼ 10) Obese (n ¼ 13) Non-obese vs obese P-value Age (years) 44±3 47±6 42± Weight (kg) 91.4± ± ± BMI (kg m 2 ) 32.5± ± ± WC (cm) 107.8± ± ± WHR 0.93± ± ± Glucose (mmol l 1 ) 5.5± ± ± Insulin (miu l 1 ) 10.0± ± ± HOMA-IR 2.4± ± ± Total cholesterol (mmol l 1 ) 4.5± ± ± HDL-C (mmol l 1 ) 1.0± ± ± Triglycerides (mmol l 1 ) 1.4± ± ± NEFA (mmol l 1 ) 649±58 542±79 731± Adiponectin (mgml 1 ) 2.4± ± ± Abbreviations: BMI, body mass index; HDL-C, high-density lipoprotein cholesterol; HOMA-IR, homeostasis model assessment of the insulin resistance index; NEFA, non-esterified fatty acid; WC, waist circumference; WHR, waist to hip ratio. Values are represented as means±s.e.m. Non-obese vs obese column show P-values of Mann - Whitney test applied to differences between non-obese and obese subjects. P-values highlighted in bold indicate the statistical significance of the comparison. International Journal of Obesity (2011) & 2011 Macmillan Publishers Limited

78 and higher plasma triglyceride levels when compared with non-obese individuals. Plasma levels of total and multimeric forms of adiponectin Plasma levels of total adiponectin were higher in non-obese than in obese subjects (Table 1). Relative proportions of each of the three isoforms (that is, the proportion of particular isoforms related to total adiponectin) in plasma analyzed by WB, that is, LMW/total adiponectin, MMW/total adiponectin and HMW/total adiponectin, were not different between obese and non-obese subjects (Figure 1). Total adiponectin secretion from AT explants Total adiponectin quantity (mgml 1 per 100 mg AT) secreted from AT explants into conditioned media was lower in SAT in obese when compared with SAT of non-obese individuals (Figure 2). In VAT, there was no significant difference between non-obese and obese subjects. No significant difference in the secretion of total adiponectin was found between SAT and VAT in the entire group, as well as in the group of non-obese or obese individuals. Adiponectin multimeric isoform secretion from AT explants An example of WB analysis of the adiponectin isoforms secreted by SAT and VAT explants of non-obese and obese subject is shown in Figure 3. In the entire group, we found no difference in the proportion of secreted isoforms between SAT and VAT. In the group of non-obese subjects, proportion of HMW/total adiponectin secreted by VAT was significantly higher when compared with the secretion by SAT, and proportion of LMW/total adiponectin was lower in VAT than in SAT (Figure 1). However, in the obese group no difference in the proportion of HMW and other isoforms (MMW and LMW) between SAT and VAT was observed (Figure 1). These results were not affected when gender was considered into the analyses. Assessment of the isoform secretion in absolute terms in respect to fat depot and adiposity may be expressed using the data from semiquantitative WB analysis (absolute values of band quantification). These data are explaining the relative changes of secreted isoforms showing differences in profiles between depots and groups (Figure 4). Comparison of adiponectin multimeric isoforms: secretion rate vs plasma levels When comparing circulating and secretion profile of adiponectin isoforms, we found a significant difference in their distribution Adiponectin isoform secretion from subcutaneous and visceral fat Z Kovacova et al between plasma and conditioned media of VAT and SAT explants (Po0.001) (Figure 1). In both, culture media of SAT and VAT explants, the most abundant isoform was the HMW. These data show that HMW is the predominant form secreted from both SAT and VAT, and that, in both AT depots, the profile of adiponectin multimeric isoforms secreted from AT is different from that of plasma. DISCUSSION This study investigates the secretion of adiponectin multimeric isoforms by different body fat depots in non-obese and obese adiponectin (µg/ml) SAT VAT * VAT SAT VAT non-obese obese entire group *p<0.05 for comparison non-obese vs. obese subjects Figure 2. Total adiponectin concentrations measured by ELISA in conditioned media from SAT and VAT explants. NON-OBESE OBESE SAT VAT SAT VAT plasma SAT HMW MMW LMW Figure 3. A representative western blot of adiponectin multimeric complexes in culture media from SAT and VAT explants of non-obese and obese people. A representative plasma sample is also shown % % of total adiponectin 100% 80% 60% 40% 20% 0% ** ** # 53.9 # # # 22.9 # SAT VAT plasma SAT VAT plasma LMW/total % MMW/total % HMW/total % non-obese obese ** p<0.01 for comparison SAT vs. VAT # p<0.001 for comparison plasma vs. SAT and VAT Figure 1. Profile of secretion of adiponectin isoforms related to secretion of total adiponectin in SAT and VAT explants and plasma isoform profiles in non-obese and obese subjects. & 2011 Macmillan Publishers Limited 69 International Journal of Obesity (2011) 1-6