MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE BRNO 2013 PAVLÍNA ŠOBROVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Diagnostické biosenzory pro encefalopatie způsobené priony Disertační práce Vedoucí práce: prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Vypracovala: Ing. Pavlína Šobrová Brno 2013

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Diagnostické biosenzory pro encefalopatie způsobené priony vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis.

4 Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/ z Evropského fondu regionálního rozvoje a mezioborového doktorandského projektu DOC CEITEC 01/2012 s názvem Preparation and testing of quantum dots-protein complex as a label for in vitro and in vivo imaging of prions.

5 Holder of Brno PhD Talent Financial Aid Sponsored by Brno City Municipality Tato práce vznikla za podpory Jihomoravského centra pro mezinárodní mobilitu (JCMM) a finanční podpory statutárního města Brna.

6 Zpracovaná disertační práce byla finančně podpořena z prostředků specifického vysokoškolského výzkumu prostřednictvím projektu IGA AF č. IP 5/2012 s názvem Moderní metody detekce prionových proteinů.

7 To live is the rarest thing in the world. Most people just exist. Oscar Wild

8 Poděkování Ve své práci bych velmi ráda poděkovala svému školiteli prof. Ing. Renému Kizekovi, Ph.D. za skvělé vedení a možnost působit ve skupině po celou dobu mého studia a mít tak možnost si vyzkoušet práci vědce od A až po Z. Dále bych pak ráda poděkovala všem členům Laboratoře metalomiky a nanotechnologií nejen za jejich všestrannou pomoc, ale zejména za skvělou atmosféru a zázemí, které vytváří. Děkuji také spoluautorům za pomoc a cenné připomínky při přípravě publikací. Jmenovitě Ing. Janě Chomoucké, Ph.D., Ing. Janě Drbohlavové Ph.D. a doc. Ing. Jaromíru Hubálkovi, Ph.D. z Vysokého učení technického v Brně za spolupráci v oblasti nanomateriálů a Mgr. Vladimíru Pekaříkovi, Ph.D. z Masarykovy univerzity za spolupráci v oblasti prionových proteinů. Největší dík patří skvělému člověku, Vojtěchu Adamovi, který mě provázel světem vědy již od mých prvních krůčků až po první úspěchy. Byl mojí oporou, když věci nevycházely a byl mou velkou podporou a inspirací. Člověk, kterého mám stále po boku. Děkuji, Vojtíšku. V neposlední řadě bych taky chtěla poděkovat svým rodičům za obrovskou podporu nejen při studiu, ale za způsob, kterým mě provází životem a jak mě ho naučili žít.

9 Anotace Prionové onemocnění jsou lidské a živočišné fatální přenosné neurodegenerativní onemocnění charakterizované strukturální změnou buněčného prionového proteinu na jeho pozměněnou isoformu. Hlavním cílem této práce bylo sumarizovat současné poznatky o prionových onemocnění a možnostech jejich detekce se zaměřením na elektrochemické metody a in vitro a in vivo detekci za použití kvantových teček. Pro účely elektrochemického měření byla použita cyklická voltametrie, diferenční pulzní voltametrie, diferenční pulzní voltametrie ve spojení s Brdičkovou reakcí a chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza. Limity detekce jednotlivých technik byly stanoveny na 32 µg/ml u cyklické voltametrie, 16 µg/ml u diferenční pulzní voltametrie, 16 µg/ml u Brdičkovy reakce a 8 µg/ml u chronopotenciometrické rozpouštěcí analýzy. Dále byl sledován vliv denaturační teploty. Jak jasně vyplývá z výsledků, získané signály prionových proteinů lineárně klesaly v závislosti na délce trvání denaturační teploty (99 C) po dobu: 0, 15, 30, 45 a 60 min. Dále jsme se zaměřili na studium prionových proteinů a jejich interakce s CdTe kvantovými tečkami za použití elektrochemie. Primárně jsme elektrochemicky charakterizovali kvantové tečky a stanovili jejich detekční limit na 100 fg/ml. Následně jsme se zaměřili na elektrochemické studium interakcí kvantových teček s prionovým proteinem. Detekční limit byl stanoven na 1 fg v 5 µl při 3S/N. Toto by mohlo hrát důležitou úlohu při značení prionových proteinů kvantovými tečkami kvůli velmi snadné aplikovatelnosti a možnosti miniaturizace zařízení, které může být použitelné in situ a otevřít tak nové možnosti stanovení přítomnosti prionových proteinů na chirurgických nástrojích a jiných materiálech. Klíčová slova: prion; transmisní spongiformní encefalopatie; elektrochemie, kvantové tečky; in vivo zobrazení

10 Annotation Prion diseases are fatal transmissible neurodegenerative and infectious disorders (TSEs) of humans and animals characterized by structural transition of the host-encoded cellular prion protein (PrP C ) into the aberrantly folded pathologic isoform PrP Sc. The main aim of this thesis is to summarize present information about prion diseases and their possibilities of determination pointed to electrochemical techniques. For this purpose cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, differential pulse voltammetry Brdicka reaction and chronopotentiometric stripping analysis were used. The estimated detection limits were 32 µg/ml by cyclic voltammetry, 16 µg/ml by differential pulse voltammetry, 16 µg/ml by differential pulse voltammetry Brdicka reaction and 8 µg/ml by chronopotentiometric stripping analysis. Subsequently, the influence of heat denaturation was observed. It clearly follows from the obtained results that signals of prion decreased linearly depending on the duration of the heat treatment at 99 C for various time intervals: 0, 15, 30, 45, and 60 min. Moreover, we aimed our attention on studying of prion protein interaction with CdTe quantum dots using electrochemistry. Primarily, we characterized electrochemical properties of quantum dots and the detection limit as 100 fg/ml was estimated. Further, electrochemical study of prion and quantum dots interactions was carried out to find the most suitable conditions for sensitive detection of prion proteins. Detection limit (3 S/N) was estimated as 1 fg in 5 µl. This makes labelling of proteins with quantum dots of great importance due to easy applicability and possibility to use in miniaturized devices, which can be used in situ. This should open new possibilities how to determine the presence of these proteins on surgical equipment and other types of materials, which could be contagious. Key words: prion, transmissible spongiform encephalopathies; electrochemistry, quantum dots; in vivo imaging

11 Obsah I. Úvod II. Cíle práce III. Teoretická část Prion Molekulární podstata prionového proteinu PrP C Molekulární podstata prionového proteinu PrP Sc Vznik PrP Sc Prionová onemocnění Historie prionových onemocnění Prionová onemocnění u zvířat Scrapie Přenosná encefalopatie norků (TME) Chronické chřadnutí jelenovitých (CWD) Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) Exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců (EUE) Spongiformní encefalopatie koček (FSE) Nehumánní primáti (NHP) Prionová onemocnění u lidí Kuru Creutzfeldt-Jakobova nemoc (CJD) Gertsmanův-Strausslerův-Schenkerův syndrom Fatální familiární insomnie (FFI) Sporadická fatální insomnie (sfi) Prionům podobná onemocnění Alzheimerova choroba (AD) Parkinsonova choroba (PD)... 48

12 2.4.3 Huntigtonova choroba (HD) Elektrochemické techniky pro detekci proteinů Voltametrie a polarografie Cyklická voltametrie Diferenční pulzní polarografie a voltametrie Brdičkova reakce Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza, H-pík Adsorptivní přenosová technika IV. Materiál a metody Chemikálie Metody Mikrovlnná příprava kvantových teček Elektrochemická analýza Adsorptivní přenosová technika Cyklická voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Brdičkova reakce Pík H In vivo zobrazování Deskriptivní statistika a stanovení detekčního limitu V. Praktická část Analytické metody pro stanovení prionových proteinů Diagnostika onemocnění Imunologické metody Western blot Elektroforetické metody Spektroskopické metody Využití buněčných linií... 71

13 6.6 In vitro amplifikační technologie Elektrochemické metody Cyklická voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Brdičkova reakce Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza Nativní a denaturovaný prion In vivo detekce prionových proteinů Kvantové tečky Techniky pro charakterizaci QD Elektrochemické stanovení kvantových teček Cyklická voltametrie QD CdTe Diferenční pulzní voltametrie QD CdTe Stabilita QD In vitro aplikace QD Sledování prionového proteinu za pomocí elektrochemie In vivo aplikace QD VI. Seznam článků VII. Závěr VIII. Použitá literatura IX. Seznam obrázků X. Seznam tabulek XI. Seznam zkratek

14 Seznam zkratek ACE AD AdS AdTS Aβ BSE CDI CJD CE CNS CPSA CT CV CWD DELFIA DLS DPV ELISA ER EUE f/gcjd FFI FMB FRET FSE FTIR GPI kotvy GSS HD icjd ICP-AES MBA Afinitní chromatografie Alzheimerova choroba Adsorptivní technika Adsorptivní přenosová technika Amyloid beta Bovinní spongiformní encefalopatie Zobrazení proudové hustoty Creutzfeldt-Jakobova nemoc Kapilární elektroforéza Centrální nervová soustava Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza Počítačová tomografie Cyklická voltametrie Chronické chřadnutí jelenovitých Disociačně-zvýšená lanthanidová fluorescenční imunoassay Dynamický rozptyl světla Diferenční pulzní voltametrie Enzymová imunoadsorbční analýza Endoplazmatické retikulum Exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců Familiární/genetická Creutzfeldt-Jakobova nemoc Fatální familiární insomnie Průtoková mikrokapková imunoassay Fluorescenční resonance energetického přechodu Spongiformní encefalopatie koček Infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací Glykosylfosfatidylinositol Gerstmann-Straussler syndrom Huntingtonova choroba Iatrogenní Creutzfeldt-Jakobova nemoc Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem Masokostní moučka 14

15 MPA MRI NFT NHP PCR PD PET PMCA PrP C PrP Sc QD RT-QUICK scjd SEM sfi SPECT TEM TGGE TME TSE vcjd VPSPr XRD Merkaptopropionová kyselina Magnetická resonance Neurofibrilární změť Nehumánní primáti Polymerázová řetězová reakce Parkinsonova choroba Pozitronová emisní tomografie Cyklická amplifikace pozměněného proteinu Buněčný prionový protein Infekční prionový protein Kvantové tečky Real-time quaking-induced conversion Sporadická Creutzfeldt-Jakobova nemoc Skenovací elektronová mikroskopie Sporadická fatální insomnie Jedno fotonová emisní počítačová tomografie Transmisní elektronová mikroskopie Gradientová gelová elektroforéza Přenosná encefalopatie norků Transmisní spongiformní encefalopatie Variantální Creutzfeldt-Jakobova nemoc Variabilní proteáza-senzitivní prionpathie Rentgenová difrakce 15

16 I. ÚVOD Alfred Nobel možná netušil, jak dobře udělal, když se zasloužil o veřejné oceňování mimořádných vědeckých výkonů. Bez cen, které se udílejí již od roku 1901, by se široká veřejnost možná ani nedozvěděla, že se za dveřmi pracoven a laboratoří něco děje. Nobelovy ceny udělované v oblasti přírodních věd patří k nejvyšším oceněním vědeckých úspěchů. Laureáti získají kromě diplomu a vzácné medaile také peněžitý obnos, jenž jim má pomoci v práci bez nutnosti ohlížet se na finance. O tom, že Nobelova cena je prestižní záležitostí, svědčí kromě jiného i fakt, že nepsané pravidlo klade velké překážky udělení dvou Nobelových cen za výzkum na jednom a témže tématu. Jednou z mála výjimek bylo udělení tohoto prestižního ocenění Carletonovi Gajdůškovi v roce 1976 a Stanleymu Prusinerovi v roce 1997 za výzkum na poli prionových chorob. Říká se, že pokud někdo objeví na tyto nemoci lék nebo naopak tuto teorii popře, sáhne Nobelova nadace po zlaté medaili potřetí. Daniel Carleton Gajdůšek se narodil v roce 1923 v americkém Yonkers a už jako chlapec se pod vlivem knihy Paula de Kruifa Lovci mikrobů rozhodl věnovat medicíně a mikrobiologii. Ambice měl vysoké. Na schody vedoucích do jeho klukovské laboratoře v podkroví si napsal jména hrdinů de Kruifovy knihy, např. Roberta Kocha a Louise Pasteura. Poslední schod nechal volný. Hodlal tam napsat své vlastní jméno, až dostane Nobelovu cenu a vyrovná se tak svým slavným vzorům. Gajdůšek se stal předním virologem, ale měl rozsáhlé znalosti i z chemie a imunologie. V roce 1957 začíná Gajdůškovo nejslavnější dobrodružství. Jede na Novou Guineu za místním lékařem Vincentem Zigasem, který jako první běloch narazil na případy choroby kuru. Gajdůšek se od samého počátku domníval, že se ženy a děti nakazí při obřadních kanibalských hodech, při kterých byl konzumován mozek nebožtíka. V roce 1961 zahájil spolu s virologem Clarencem Josephem Gibbsem Jr. základní pokusy, které testovaly infekční povahu kuru a staly se východiskem pro definování přenosných spongiformních encefalopatií, ke kterým patří kromě kuru i Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), bovinní spongiformní encefalopatie známá jako nemoc šílených krav, ovčí klusavka čili scrapie nebo chorobné chřadnutí jelenovitých. Gajdůšek a Gibbs prokázali přenos kuru na šimpanze v roce 1966, přenos CJD na šimpanze v roce 1968 a přenos scrapie na opice v roce Zároveň Gajdůšek v roce 1980 prokázal, že Alzheimerova choroba není přenosná, i když nese s CJD celou řadu shodných znaků a je spolu s ní řazena k amyloidózám. V roce 1982 izoloval Američan Prusiner prion - 16

17 infekční protein bez dědičné informace a jeho objev prakticky potvrdil platnost teorie o vzniku spongiformních chorob. Vzhledem ke zvyšující se kvalitě lékařské péče a prodlužujícím se životě lidí v rozvinutých i rozvojových zemích je očekáván nárůst počtu diagnostikovaných pacientů s neurodegenerativním onemocněním. Není proto žádným překvapením, že výzkum v této oblasti je opravdu intenzivní. Když se podíváme do minulého století, neurodegenerativní onemocnění jsme studovali, objevovali a postupně identifikovali. Ve století nynějším je naším hlavním cílem onemocnění pochopit a poznat přesně jejich příčinu. Teprve poté můžeme začít bojovat s tímto tichým, ale zároveň smrtícím nepřítelem, který dříme v každém z nás. A proto každý střípek do skládačky, kterou začali bez znalosti celkového obrazu skládat velikáni vědy prof. Gajdůšek a prof. Prusiner, může být tím, který nám přiblíží zlomový objev, na který tak netrpělivě čekáme. 17

18 II. CÍLE PRÁCE Cílem disertační práce bylo studium chování prionových proteinů za pomocí elektrochemických technik. Práce byla rozdělena na několik částí, jejich hlavním cílem byla identifikace, separace a detekce prionového proteinu a jeho konformačně pozměněné formy. Následně byly sledovány konformační změny prionového proteinu působením denaturačních teplot za použití nejcitlivější metody. Další krok zahrnoval in vitro a in vivo detekci prionového proteinu za pomocí kvantových teček, čemuž předcházela optimalizace přípravy kvantových teček, sledování interakce prionových proteinů s kvantovými tečkami a jejich následná in vitro a in vivo aplikace. Sumarizace dostupných informací o stanovení prionových proteinů. Identifikace, separace a detekce přirozeného (PrP C ) a pozměněného (PrP Sc ) prionového proteinu na základě elektrochemických technik (cyklická voltametrie, square-wave voltametrie, diferenční pulzní voltametrie, Brdičkova reakce a chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza). Sledování teplotní stability prionového proteinu za použití elektrochemických technik. In vitro a in vivo detekce prionových proteinů za pomocí kvantových teček. 18

19 III. 1 Prion TEORETICKÁ ČÁST Prionový protein je velmi dobře znám pro jeho roli u přenosných spongiformních encefalopatií (transmisní spongiformní encefalopatie, TSE) neboli prionových onemocnění, které patří mezi lidské a živočišné neurodegenerativní onemocnění zahrnující Creutzfeldt-Jakobovu nemoc u lidí, scrapii u ovcí a koz a bovinní spongiformní encefalopatii u dobytka (Dodelet a Cashman, 1998, Prusiner, 1991). Prionový protein je přirozený protein živočišných buněk. Tento protein je přítomen ve všech savčích buňkách a je exprimován zvláště v nervových buňkách a buňkách imunitního systému. Jeho fyziologická funkce je nejasná, avšak se zřejmě podílí na synaptickém přenosu a diferenciaci buněk. Naprosto unikátní a zásadní je fakt, že se tento protein může stát infekční. Přirozená a infekční forma proteinu se od sebe liší pouze prostorovým uspořádáním (Legname, a kol., 2004). Konformační změna z alfa struktury u přirozeného proteinu (PrP C, Obr. 1) na strukturu beta skládaného listu u pozměněného proteinu (PrP Sc, Obr. 1) významně ovlivňuje činnost proteinu. Tato mutovaná forma je vysoce odolná vůči degradačním procesům uvnitř buňky, může se vázat na další PrP C proteiny a vyvolávat i u nich konformační změnu na PrP Sc. Nedostatek fyziologického PrP C a toxické působení téměř nedegradovatelného PrP Sc se pak spolupodílejí na vzniku prionových onemocnění s klinickým obrazem progresivní neurodegenerativní choroby (Ji a Zhang, 2010). Obr. 1: Struktura přirozeného buněčného prionového proteinu (PrP C ) a struktura pozměněného infekčního proteinu (PrP Sc ). 19

20 1.1 Molekulární podstata prionového proteinu PrP C Normální buněčná isoforma PrP C je povrchový buněčný protein, exprimovaný především v mozku, zejména v neuronech, gliových buňkách, leukocytech ale taky v okolní tkáni zahrnující periferní jednojaderné krevní buňky (Cashman, a kol., 1990, Dodelet a Cashman, 1998). V mozku je množství PrP C asi 50 vyšší než u ostatních tkání (Dormont, 2002). Prionový protein je kódován vysoce konzervativním genem PRNP, který je u člověka lokalizován na chromozomu 20 (Parchi a Gambetti, 1995). Protein je tvořen 253 aminokyselinami a jeho molekulová hmotnost je přibližně kda (Dormont, 2002). Skládá se z několika zřetelně odlišitelných domén zahrnujících N-terminální signální peptid, řadu pěti oktapeptidových repeticí bohatých na prolin a glycin, vysoce konzervativní centrální hydrofobní segment a C-terminální hydrofobní oblast, která slouží k napojení glykosylfosfatidylinositolu (GPI kotvy) (Harris, 1999). Stejně jako ostatní membránové proteiny je i PrP C syntetizován na drsném endoplazmatickém retikulu (ER) a transportován přes Golgiho systém na buněčný povrch. Během biosyntézy podstupuje řadu post-translačních úprav, mezi něž patří odštěpení N-terminálního signálního peptidu, připojení dvou oligosacharidových řetězců N-glykosidovou vazbou v pozicích 181 a 197, tvorba disulfidové vazby mezi cysteiny v pozicích 179 a 214 (Yuan, a kol., 2005) a připojení GPI kotvy po odštěpení C-terminální hydrofobní oblasti (Haraguchi, a kol., 1989). Na usnadnění těchto a jiných procesů se podílejí lipidové membránové domény nazývané "rafty", které jsou často ve spojení i s jinými povrchovými proteiny (Brown a London, 1998) Zralý lidský PrP tedy obsahuje 209 aminokyselin (Yuan, a kol., 2005). Je složen z dlouhé flexibilní N-terminální domény, která obsahuje vazebná místa pro měďnaté ionty a C-terminální domény tvořené dvěma β-skládanými listy (β1 a β2) a třemi α- šroubovicemi (α1, α2 a α3). Protein obsahuje také dva cysteiny v pozicích 179 a 214, které tvoří disulfidovou vazbu, dva oligosacharidy v pozicích 181 a 197 a GPI kotvu připojenou na aminokyselinu 231. Cirkulární dichroismus a infračervená spektroskopie ukázaly, že sekundární struktura zralého PrP C, který má tendenci tvořit dimery (Knaus, a kol., 2001), a je tvořena ze 42 procent α-šroubovicí a z 3 procent strukturou β-skládaného listu (Harris, 1999). Terciární struktura proteinu obsahuje na C-terminálním konci globulární doménu tvořenou třemi α-šroubovicemi a dvěma malými β-skládanými listy. N-terminální část 20

21 obsahující oktapeptidové repetice má podobu dlouhého flexibilního konce, jehož konformace závisí na biofyzikálních parametrech prostředí (Dormont, 2002). Jakmile PrP C dosáhne buněčného povrchu, naváže se na plazmatickou membránu pomocí GPI kotvy a je neustále pohlcován zpět do buňky prostřednictvím jamky obložené kladhrinem, ve kterém je pravděpodobně ukotven transmembránovým PrP C receptorem. Extracelulární doména receptoru je navázána na N-terminální část PrP C, která je nezbytná pro účinnou endocytózu (Harris, 1999). Kandidátem na tento transmembránový protein je lamininový receptor. Na pohlcování prionového proteinu se mohou kromě clathrinových vezikul podílet i rafty a kaveolin (Campana, a kol., 2005). Pohlcený PrP C se dostává přes raný endozom zpět na cytoplazmatickou membránu, nebo postupuje přes pozdní endozom do lyzozomu, kde je degradován (Shyng, a kol., 1993). V neuronech můžeme prionový protein najít také na všech biosyntetických a endocytických transportních membránových strukturách a u neuronů hipokampu, talamu a neokortexu také v cytosolu (Campana, a kol., 2005). Součástí normálního metabolismu PrP C mohou být i dvě posttranslační štěpení. První se uskutečňuje zřejmě na povrchu buňky uvnitř GPI kotvy a uvolňuje polypeptidový řetězec do mimobuněčného prostoru. Druhé štěpení je proteolytické a probíhá ve vysoce konzervativní hydrofobní oblasti v blízkosti pozice 110. Tato reakce pravděpodobně nastává uvnitř malého procenta endocytovaných molekul. Obě štěpení probíhají relativně pomalu a jejich fyziologický význam je zatím nejasný (Harris, 1999). Normální buněčný protein může být za určitých podmínek štěpen i v blízkosti pozice 90 (Mange, a kol., 2004). Toto druhořadé místo štěpení je citlivé k působení peroxidu vodíku za přítomnosti kovů. Produktem štěpení je fragment, který má schopnost zahájit polymerizaci PrP C a naznačuje tak možný mechanismus vzniku prionového onemocnění (Abdelraheim, a kol., 2006). K odhalení normální funkce PrP C byly použity myši postrádající gen PRNP (Bueler, a kol., 1993). U těchto knokautovaných myší byly pozorovány jen nepatrné abnormality (Aguzzi a Polymenidou, 2004). Jejich společným znakem byla necitlivost k prionovým infekcím, což prokazuje klíčovou roli PrP v TSE (Bueler, a kol., 1993). Přesná funkce normálního prionového proteinu však zůstává stále neznámá. Předpokládá se ale jeho účast na mnoha důležitých fyziologických procesech. Řadíme mezi ně metabolismus či transport zinečnatých nebo měďnatých iontů, membránové 21

22 dráždění a synaptický přenos, buněčnou signalizaci a apoptózu (Campana, a kol., 2005) a ochranu před oxidativním stresem (Brown, 2001, Kozlowski, a kol., 2012). 1.2 Molekulární podstata prionového proteinu PrP Sc PrP Sc je konformační izomer PrP C, který se od normálního prionového proteinu odlišuje v sekundární a terciární struktuře. Sekundární struktura obsahuje 45 procent β- skládaného listu a 30 procent α-šroubovice (Caughey, a kol., 1991). Protože je PrP SC přístupný pouze metodám detekce struktury s nízkým rozlišením, nebyla ještě přesně stanovena jeho terciární struktura. Předpokládá se ale, že na vzniku izomeru se podílí především úsek mezi aminokyselinovými zbytky 144 a 154, který je u PrP C tvořen α- šroubovicí a u PrP Sc pravděpodobně přechází do struktury β-skládaného listu (Yuan, a kol., 2005). Tento abnormální protein vzniklý posttranslační modifikací má velikost asi kda. Od PrP C se odlišuje také svou rezistencí k proteináze K, fosfolipáze C a k vysokým teplotám. Je metabolicky stálý, nerozpustný v detergentech a má silnou tendenci agregovat a polymerizovat (Dormont, 2002). Díky nedostatku protilátek specifických pro PrP Sc je obtížné přesně stanovit rozložení tohoto proteinu v buňce. Studie naznačují, že se může nacházet jak na plazmatické membráně, tak i v endolyzozomálních strukturách. Možný je také výskyt v cytosolu nebo exozomech infikované buňky (Campana, a kol., 2005). Posttranslační štěpení PrP Sc, které má za následek odstranění části N-terminální oblasti, se uskutečňuje blízko pozice 89. Tato reakce probíhá zřejmě v endozomech či lyzozomech a na rozdíl od proteolytického postranslačního štěpení PrP C nenarušuje amyloidogenní a neurotoxickou oblast polypeptidového řetězce (Chen, a kol., 1995). Při studiu infekčního materiálu ze zvířat a lidí postižených prionovým onemocněním bylo zjištěno, že PrP Sc se vyskytuje v několika variantách označovaných jako prionové kmeny. Předpokládá se, že tyto prionové kmeny jsou určeny dvěma faktory: podílem glykosylace a konformací PrP molekuly. Přičemž konformace muže být ovlivněna polymorfismem v PrP sekvenci (Collinge, 2001). Collinge a jeho kolegové popsali čtyři odlišné typy PrP Sc. Typy 1, 2 a 3 se vyskytují u případů sporadické a získané CJD a typ 4 u všech případů vcjd (Collinge, 2001). Dřívější studie rozlišují u klasické CJD jen dva typy PrP Sc. 22

23 1.3 Vznik PrP Sc Místo a způsob konformační přeměny PrP C na PrP Sc nejsou dosud přesně známy. U dědičných forem prionového onemocnění se PrP Sc vytváří zřejmě v ER, a to jako následek mutace v aminokyselinové sekvenci proteinu (Harris, 1999, Prusiner, 1998). Při infekčním průběhu choroby je pro vznik prionů vyžadován kontakt mezi endogenním PrP C a exogenním PrP Sc (Prusiner, 1998). Zatímco první kontakt se zřejmě uskutečňuje na plazmatické membráně, následující transformace může probíhat přímo na plazmatické membráně, nebo až po endocytóze v endolyzozomálních strukturách či ER. Několik studií také naznačuje, že přeměna PrP C může nastat teprve tehdy, až tento nově vzniklý protein dosáhne buněčného povrchu (Campana, a kol., 2005). Významnou roli při konformační přestavbě hrají i lipidové rafty, které mají zřejmě ve spojení s PrP Sc odlišný charakter než ve spojení s PrP C. Současné studie předpokládají, že lipidové rafty se podílejí nejen na zrání a skládání normální PrP molekuly, ale i na stabilizaci její struktury a tím i na její ochraně v procesu změny konformace. Některé práce naznačují, že patologická přeměna nastane snadněji, když PrP C opustí při endocytóze lipidový raft a je vystaven negativně nabité membráně (Sanghera a Pinheiro, 2002). O roli raftů při formování prionů jsou ale i jiné představy. Tyto membránové lipidové domény mohou působit jako plošiny, na nichž se hromadí PrP C, a tím podporují setkání s patogenní formou a následnou prionovou konverzi. Nebo může být každý izomer lokalizovaný na jiném raftu a následným spojením těchto dvou specifických domén dojde k zahájení konformační přeměny. Lipidové rafty mohou také obsahovat pomocný faktor zvaný protein X nebo lipidový chaperon, který usnadní přeměnu PrP C na PrP Sc za přítomnosti obou molekul na raftu. A v neposlední řadě mohou tyto lipidové domény působit jako transportní prostředky pro přepravu prionových proteinů do nitrobuněčných struktur, ve kterých proběhne změna konformace (Campana, a kol., 2005). Pro představu o vzniku prionů byly navrženy dva modely konverze PrP C na PrP Sc. Matricový model předpokládá vzájemné působení mezi exogenním PrP Sc a endogenním PrP C, které vyvolá přeměnu normálního prionového proteinu v patogenní. Spontánní konverzi je zabráněno vysokou energetickou bariérou (Campana, a kol., 2005). PrP Sc zde slouží jako katalyzátor nebo jako matrice, která vtiskne svou strukturu do PrP C. Tato reakce může probíhat i za účasti hypotetického chaperonu (Huang, a kol., 1996). Druhý, nukleačně polymerizační model předpokládá reverzibilní termodynamickou 23

24 rovnováhu mezi PrP C a PrP Sc (Campana, a kol., 2005). Spontánní konverze těchto dvou molekul probíhá zřejmě přes rozloženou strukturu PrP (Collinge, 2001). Teprve až se několik monomerů PrP Sc shromáždí a vytvoří vysoce uspořádané jádro (agregát), mohou se k němu přidávat další monomery PrP Sc. Patogenní prionové molekuly se uvnitř jádra stabilizují a postupně vytvářejí amyloid. Fragmentací tohoto agregátu se zvyšuje počet infekčních jader, která mohou získávat další PrP Sc (Campana, a kol., 2005). Tato fragmentace je nezbytná pro tvorbu prionů (Piening, a kol., 2005). 2 Prionová onemocnění Prionové proteiny způsobují celou řadu neurodegenerativních onemocnění nazvaných transmisní spongiformní encefalopatie (TSE). Tyto onemocnění jsou charakterizovány morfologickou změnou mozkové tkáně v podobě tvorby buněčných vakuol, odumíráním nervových buněk a hromaděním proteázou K neštěpitelných prionových proteinů PrP Sc. Veškerá tato onemocnění jsou fatální a nevraná onemocnění mozku s velmi dlouhou inkubační dobou. V současné době je známo 16 prionových onemocnění, z čehož bylo popsáno 7 u zvířat a 9 u lidí a jsou uvedena v Tab. 1 (Imran a Mahmood, 2011a, Imran a Mahmood, 2011b). 2.1 Historie prionových onemocnění První zmínky o TSE pochází ze začátku 19. století, kdy bylo jako první popsáno smrtelné onemocnění postihující ovce a kozy. Jeho název, scrapie neboli kulhavka, byl odvozen od chování postižených zvířat, které se vyznačovalo útlumem na začátku onemocnění s následným silným svěděním a narušenou koordinací pohybu vlivem poškození nervové soustavy a následnou smrtí (Hunter, 1993, Liberski, 2012, Prusiner, 1982). V roce 1920 doktor Hans Gerhard Creutzfeldt a nezávisle na něm Alfons Maria Jakob začali pracovat na výzkumu nového fatálního onemocnění, u kterého byla hlavním symptomem houbovitě vypadající mozková tkáň. Hans Gerhard Creutzfeldt prvně popsal změny u 23 leté pacientky, u které objevil zvláštní uzliny v nervové soustavě. Odvodil pak příznaky onemocnění od roztroušené sklerózy a onemocnění pojmenoval jako pseudoskleróza. V roce 1921 publikoval Jakob detailní popis třech dalších případů, které pojmenoval spastickou pseudosklerózou. Podle objevitelů se později ujal název onemocnění jako Creutzfeldt-Jakobova nemoc. 24

25 Tab. 1: Prionové onemocnění u zvířat a lidí. TME (přenosná encefalopatie norků); CWD (Chronické chřadnutí jelenovitých); BSE (Bovinní spongiformní encefalopatie), EUE (exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců); FSE (spongiformní encefalopatie koček); NHP (nehumánní primáti); scjd (sporadická Creutzfeld- Jakobova nemoc); f/gcjd (familiární/genetická CJD); GSS (Gerstmann-Straussler syndrom); icjd (iatrogenní CJD); FFI (Fatální familiární insomnie); vcjd (variantální CJD); sfi (sporadická fatální insomnie); VPSPr (variabilní proteáza-senzitivní prionpatie) Prionová onemocnění zvířat Nemoc Hostitel Etiologie Rok objevení Scrapie Ovce, kozy, Infekce priony neznámého původu 1732 mufloni TME Norci Infekce priony původem z ovcí či skotu 1947 CWD Jelenovití Infekce priony neznámého původu 1967 BSE Skot Infekce priony neznámého původu 1986 EUE Nyala, Kudu Infekce priony původem BSE 1986 (kopytnatci) FSE Kočky Infekce priony původem BSE 1990 TSE u NHP Lemur Infekce priony původem BSE 1995 Prionová onemocnění lidí Nemoc Hostitel Etiologie Rok objevení Kuru Člověk Rituální kanibalismus 1957 scjd Člověk Spontánní konverze PrP c PrP Sc nebo 1920 buněčná mutace f/gcjd Člověk Mutace v PRNP 1924 GSS Člověk Mutace v PRNP 1936 icjd Člověk Infekce priony lidského původu 1974 FFI Člověk PRNP haplotyp 178N-129M 1986 vcjd Člověk Infekce priony původem BSE 1996 sfi Člověk Spontánní konverze PrP C PrP Sc nebo 1999 buněčná mutace VPSPr Člověk Spontánní konverze PrP C PrP Sc nebo buněčná mutace 2008 V padesátých letech 20. století byla popsána profesorem Gajdůškem další verze tohoto onemocnění u kmenu Fore v Papua Nové Guiney, kde ženy a děti konzumovaly mozek zemřelé objeti při rituálním kanibalismu. I přesto, že inkubační doba prionových onemocnění trvá ve většině případů roky, v tomto případě byla inkubační doba u dětí významně kratší, přičemž se první příznaky objevili do 4 let od konzumace infekční tkáně (Gajdusek a Zigas, 1957, Liberski, 2009, Liberski, 2012). V následujících letech 25

26 byla potvrzena přenosnost i dalších neurodegenerativních onemocnění jako je Gertsmanův-Strausslerův-Schenkerův syndrom a Fatální familiární insomnie a začaly být označovány jako přenosné demence. Mezi nejčastěji zmiňované prionové onemocnění posledních desetiletí patří bezesporu bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) tzv. nemoc šílených krav, která byla rozpoznána v roce Kromě vysokých ekonomických ztrát je toto onemocnění spojováno s možným přenosem na člověka ve formě variantální Creutzfeldt-Jakobovy nemoci. Existují i hypotézy, že priony mohou mít vztah k dalším neurodegenerativním onemocněním, jako je Alzheimerova, Parkinsonova nebo Huntingtonova choroba (Yokoyama a Mohri, 2008). 2.2 Prionová onemocnění u zvířat Scrapie Scrapie neboli klusavka je zcela nepochybně nejdéle známá prionová choroba a zřejmě i nejlépe prozkoumaná. Byla objevena kolem roku 1732 a její výskyt byl popsán u ovcí, koz a muflonů (Jeffrey a Gonzalez, 2007). Klinickopatologické fenotypy scrapie se jako i v případě jiných prionových onemocnění liší podle druhu prionu a genetické výbavy zvířete. V jednom izolátu scrapie může být zastoupeno více typů prionů a zároveň může být PrP Sc u jednoho plemene nedostatečně zastoupen a u jiného může být zcela dominantní (Thackray, a kol., 2011, Yokoyama, a kol., 2010). Klinické příznaky zahrnují změnu chování, oslepnutí, ataxii, poruchy koordinace, podrážděnost a třes. Nejčastějším příznakem, který je pro toto onemocnění typický, je intenzivní svědění, které vede vlivem tření se a škrábání se ke ztrátě vlny na hřbetu a pod ocasem. Inkubační doba scrapie je 2-5 let a smrt nastává mezi 2 týdny až 6 měsíci po rozpoznání prvních příznaků. Mezi neuropatologické znaky patří houbovitá vakuolizace, astroglióza a depozice PrP Sc amyloidních plaků v centrální mozkové soustavě. Amyloid je patologická fibrilární forma proteinu v beta struktuře (struktuře skládaného listu). Ke vzniku amyloidu dochází agregací původně solubilní (degradovatelné) formy proteinu s primárně nebo sekundárně výrazně zastoupenou beta strukturou do formy fibrilární (resistentní na degradaci). Polypeptid složený do struktury skládaného listu je v extendované neboli rozvinuté či napřímené konformaci. Stabilizace nastává především interakcí mezi jednotlivými polypeptidickými řetězci. Dochází tak, na rozdíl od alfa helixu, kde stabilizace probíhá uvnitř šroubovice, nejen k intramolekulární interakci mezi vzdálenými částmi polypeptidického řetězce, ale i k i intermolekulární agregaci mezi jednotlivými proteiny. PrP Sc byl detekován v centrální nervové soustavě, 26

27 mandlích, slezině, lymfatických uzlinách, v membránách, svalech, placentě, ileu a tlustém střevě. Infekční prion PrP Sc byl rovněž rozpoznán v sekretech a exkrementech, což umožňuje přenos mezi jednotlivými zvířaty. Průměrně 3-5 % zvířat v nakaženém stádu zemře, byl ale zaznamenán i 20 % úhyn v nakaženém stádu (Jeffrey a Gonzalez, 2007, Maddison, a kol., 2010, Novakofski, a kol., 2005, O'Rourke, a kol., 2011, van Keulen, a kol., 2008). Výše uvedené skutečnosti jsou typické pro klasické příznaky scrapie. U ovcí a koz byly rovněž popsány atypické příznaky. U atypických případů jsou hlavnímu klinickými příznaky ataxie a nekoordinace pohybů. Svědění je neobvyklé. Klinické příznaky kozí scrapie se překrývají s těmi u ovcí a mohou zahrnovat podrážděnost, ztrátu zvědavosti, neobvyklou ostražitost, neklid, zhoršené vidění, hyperestezii, poruchy koordinace, abnormální držení těla, třes a skřípání zubů, slinění, nebo opakované vyvržení obsahu bachoru (Benestad, a kol., 2008, Goldmann, 2008, Vaccari, a kol., 2009). Polymorfismus některých aminokyselin u obou ovčích i kozích kódujících genů (PRNP) je spojován s citlivostí vůči scrapii. Bylo prokázáno, že ovce vystavené přírodní nebo experimentální infekci PrP Sc jsou rezistentní v přítomnosti Q171R polymorfismu a maximálně citlivé vůči scrapii v přítomnosti polymorfismu A136V. Tři kodonový systém založený na A136V, R154H a Q171R/H polymorfismu byl vyvinut s použitím pěti alel (ARQ, VRQ, AHQ, ARR a ARH). Těchto pět alel může být kombinováno do 15 genotypů, tj. ARR/ARR nebo VRQ/ARQ, které mohou být podle pořadí rozděleny do pěti skupin (R1-R5) a to v závislosti na citlivosti vůči onemocnění. Nejodolnější je R1 genotyp ARR/ARR a nejcitlivější R5 genotypy jsou VRQ/VRQ, VRQ/ARQ, VRQ/ARH a VRQ/AHQ. Zbývající genotypy jsou průměrně citlivé. Tento systém klasifikace rizika pomohl mnoha evropským státům při šlechtění ovcí s rezistencí proti scrapii. Selektivní šlechtění ovcí rezistentních vůči scrapii nezpůsobila žádné značné negativní dopady na produkci, reprodukci a zdraví zvířat (Dawson, a kol., 2008, Sweeney a Hanrahan, 2008). Přítomnost ARR/ARR u ovcí nebo jejich plodů zabraňuje hromadění PrP Sc v placentě (Goldmann, 2008, Novakofski, a kol., 2005). Jelikož byl polymorfismus PRNP u ovcí hojně spojován s rizikem scrapie, bylo provedeno několik studií zabývající se analýzou genu PRNP u koz s ohledem na to, že prevalence typické scrapie je u koz mnohem nižší než u ovcí. Nicméně polymorfismus PrP u koz I142M, H143R, N146S/D, R154H, R211Q a Q222K ukázal, že je polymorfismus spojen s nízkým rizikem scrapie. Atypická scrapie je rovněž ovlivněna změnami v PRNP a byl 27

28 hlášen výskyt u zvířat nesoucích genotyp propůjčující odolnost vůči typickým případům scrapie (Benestad, a kol., 2008, Goldmann, 2008, Imran a Mahmood, 2011a, Vaccari, a kol., 2009) Přenosná encefalopatie norků (TME) Přenosná encefalopatie norků (TME) je vzácné TSE vyskytujících se u těchto zvířat chovaných na farmách. TME byla poprvé pozorována ve Wisconsinu a v Minnesotě v roce V 60. a 70. letech propukla epidemie TME v USA a nejnovější případ epidemie byl zaznamenán v roce TME byla rovněž pozorována u norků chovaných na farmách v Kanadě, Finsku, východním Německu a zemích bývalého Sovětského svazu (Marsh a Hadlow, 1992). Ačkoliv původ TME je stále neznámý, za hlavní zdroj infekce původce scrapie se pokládají kontaminovaná krmiva. U norků naočkovaných různými druhy scrapie byl pozorován vývoj TME. Orální nákaza norků klasickou BSE způsobila také TME, ale zvířata projevovala spíše poslušné než agresivní chování. Byl popsán L-typ BSE jako nejpravděpodobnější činitel způsobující TME (Baron, a kol., 2007, Sigurdson a Miller, 2003). Parenterální, intracerebrální a orální cestou je TME snadno přenosná na mývaly a intracerebrálně může být přenosná na skunky, fretky, soboly, kuny, křečky, ovce, kozy, skot a nehumánní opice, jako je makak. Non-transgenní myši nejsou náchylné k TME (Sigurdson a Miller, 2003). TME se ze skotu na norky přenáší jednak intracerebrálně a jednak orálně s inkubační dobou 4 až 7 měsíců (Marsh, a kol., 1991). U křečků inokulovaných TME byla pozorována bifurkace u klinických fenotypů s odlišnou inkubační dobou, neuropatologickými lézemi a biochemickým profilem. V závislosti na klinických příznacích byly rozeznány dva typy s názvem "hyper (HY)" a "ospalý (DY)" (Bessen a Marsh, 1992). DY poukazuje dominantní kompetici pro příjem buněčné PrP C do oligomerů, a může tak redukovat inkubační dobu, nebo dokonce blokovat schopnost HY způsobit onemocnění (Shikiya, a kol., 2010). Při umístění norků ve stejné kleci může docházet k přenosu infekce prostřednictvím kanibalismu nebo kousání do sebe. Nicméně při vypuknutí jedné epidemie mláďata umístěné se svými matkami nevykazovala známky onemocnění. Přirozené vystavení a vertikální přenos nebyly zjištěny jako příčina šíření infekce. TME byla zjištěna pouze u dospělých norků a může zapříčinit 60-90% nebo dokonce 100% úhyn během vypuknutí epidemie (Imran a Mahmood, 2011a). 28

29 Mezi klinické příznaky onemocnění patří změny chování, jako například zvýšená agresivita a hyperestézie, deprese, neklid, a zanedbávání rodičovské péče a péče o srst. Postižení norci špiní hnízda rozptýlením výkalů v kleci. V dřívějších stádiích nemoci mohou také vykazovat potíže s příjmem potravy a polykáním. Pozdějšími příznaky jsou poruchy chůze, ataxie, poruchy koordinace, třes, občasné zatínání čelisti, zakřivení ocasu jako veverky a nutkavé kousání se nebo zmrzačování se zejména u ocasu. Blízko konce průběhu nemoci se mohou objevovat křeče, norci se zdají být ospalí a nereagují na podněty, může být viděn tlak hlavami proti kleci po dobu několika hodin. Doba inkubace v přirozeně se vyskytující TME může být v rozmezí 6 až 12 měsíců a smrt obvykle dochází během 2-8 týdnů (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Mezi neuropatologické rysy TME norků patří rozsáhlé spongiformní degenerace mozku a astrocytóza. Spongiformní změny jsou velmi intenzivní v mozkové kůře, a to zejména ve frontální kůře, corpus striatum, thalamu a hypotalamu, ale méně závažné ve středním mozku, pons a medula, a obvykle nejsou patrné v mozečku a míše. Kromě CNS byli původci TME u infikovaných norků zjištěny ve slezině, střevě, mezenterických lymfatických uzlinách, brzlíku, ledvinách, játrech a slinných žlázách (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003) Chronické chřadnutí jelenovitých (CWD) CWD je TSE u jelenovitých žijících v zajetí jakož i volně se pasoucích. Od roku 1967 do dnešní doby byla CWD pozorována ve 14 státech USA, ve 2 kanadských provincií a u dovezených zvířat v Jižní Koreji. Nicméně dohled nad touto nemocí je zapotřebí po celém světě. Mezi postižené druhy patří jelenec ušatý, jelenec běloocasý, jelenec černoocasý, skalní jelen wapiti a los obecný. Původce CWD je stále neznámý, i když byl prokázán intracerebrální přenos klusavky, který měl za následek vyvolání tohoto onemocnění. U postižené populace může být pozorován více než jeden druh PrP CWD (Angers, a kol., 2010, Sigurdson a Miller, 2003, Tamguney, a kol., 2009). Epidemiologické a experimentální údaje poskytují důkaz, že k horizontálnímu přenosu CWD může efektivně dojít i při kontaktu s postiženým zvířetem nebo prostřednictvím vystavení se jeho expozici v životním prostředí (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson, 2008, Sigurdson a Miller, 2003). Doposud nebyl v přírodě prokázán přenos CWD na lidi, kteří se dlouhodobě vyskytovali v postižené oblasti a konzumovali CWD postiženou zvěřinu, a ani na hospodářská zvířata, jako jsou ovce a skot, kteří sdíleli 29

30 přirozené obývající prostředí s postiženými jelenovitými. Navíc se u transgenních myší exprimující buď lidské, ovčí či PrP kódovací rámce skotu nevyvinulo onemocnění po naočkování původce CWD (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Nicméně jiní jelenovití, jako je jelen a sob polární, jsou také náchylní k CWD po intracerebrálním a ústním přenosu, což může přispívat k přetrvávající epidemii CWD v Severní Americe (Balachandran, a kol., 2010, Martin, a kol., 2009). CWD je také intracerebrálně přenosná na skot, ovce, kozy, fretky, křečky, norníky rudé, norky a mývaly (Sigurdson, 2008). Infekční PrP CWD může být detekován v nervovém systému, lymforetikulárním systému, krvetvorném systému, kosterní a srdeční svalovině, slinivce, tuku, sítnici a nadledvinových a slinných žlázách u přirozeně anebo experimentálně infikovaných zvířat (Race, a kol., 2009, Sigurdson, 2008, Sigurdson a Miller, 2003, Spraker, a kol., 2010). Všeobecně můžeme říct, že u postiženého zvířete by se prakticky neměla vyskytovat tkáň prostá původce CWD. Citlivá zvířata mohou získat infekční PrP CWD na svých přirozených stanovištích během krmení z trávy nebo z pitné vody kontaminované PrP CWD, která byla zasažena exkrementy jelenovitých nebo jejich depozitem v životním prostředí, a to z asymptomatického nosičství, ve formě výkalů, moči, slin, krve, placenty či mrtvých těl (Nichols, a kol., 2009, Safar, a kol., 2008, Sigurdson, 2008, Sigurdson a Miller, 2003). Při vystavení PrP CWD může být infekčnost zvýšena přítomností ústních a nosní oděrek (Denkers, a kol., 2010, Denkers, a kol., 2011). Důležitým bodem je, že původce TSE se může vázat na částice zeminy a tak přetrvávat celé roky při ponechání infekčnosti a nemoc pak přenášet orální cestou s ještě větší účinností (Johnson, a kol., 2007, Johnson, a kol., 2006, Seidel, a kol., 2007). Tyto údaje poskytují přesvědčující vysvětlení pro vysoký výskyt CWD a efektivní přenos infekčnosti u jelenovitých. Rozšíření choroby v postižených stádech se může pohybovat v rozmezí 0,1 až 50% nebo někdy dokonce až 100%. CWD byla také zjištěna v USA v oblastech daleko od původní endemické oblasti a tím se vyskytla řada otázek: zdali byla infekčnost převezena do těchto oblastí nelegálně v podobě zkaženého materiálu nebo infikovaných zvířat, nebo nějakým jiným způsobem; zdali se původce klusavky přizpůsobil opakovanými přirozenými pasážemi až k jelenovi, nebo jestli je konverze PrP C u jelenovitých natolik zdatná, aby vedla k sporadickému výskytu choroby, což by mohlo vést až k vytvoření epidemie horizontálním přenosem. Vzhledem k tomu, že způsoby 30

31 přenosu PrP CWD jsou stále nejisté, tak možnost vymýcení tohoto onemocnění na základě dohledu nad obchodem se zvířaty, nařízení karantény nebo nařízené zničení napadených stád se zdá jako málo slibná. Lepší náhradou pro kontrolu epidemií CWD a scrapie by z tohoto důvodu mohl být terapeutický zásah na molekulární mechanismy způsobující patogenezi onemocnění (Sigurdson, 2008). PRNP polymorfismy S96G M132L a S225F u jelenovitých jsou spojovány s rezistencí na CWD a mohou alespoň v případě zvířat žijících v zajetí pomoci v managementu léčby selektivním chovem (Green, a kol., 2008, O'Rourke, a kol., 2007, Sigurdson, 2008, Spraker, a kol., 2010, White, a kol., 2010). U volně se pasoucích jelenovitých postižených chronickým chřadnutím je onemocnění spojeno s nižším přežitím nemocných zvířat vlivem predace horských lvů. Taková selektivní predace vede k nerovnováze v místní ekologické dynamice potravních sítí a recyklace živin (Krumm, a kol., 2010, Miller, a kol., 2008). Názvem "chronické chřadnutí" vzniklo na základě chronického chřadnutí skeletu nebo úbytku hmotnosti, které je velmi často pozorován u postižených jelenovitých. CWD může také způsobit, že tyto zvířata mají drsnou suchou srst a nerovnoměrnou retenci zimní srsti v letních obdobích. V subklinické nebo časné klinické CWD se u zasažených jelenovitých zejména losů také ukazují některé další velmi jemné příznaky zahrnující únavu, náhlou smrt, skloněnou hlavou a svěšenými uši a změnami chování, jako pevný pohled a ztráta strachu z lidí. S progresí onemocnění se mohou vyskytovat více znatelné příznaky jako ochablost až hypotoničnost obličejových svalů, ataxie, třes hlavy, skřípání zubů, opakující se pochodování v blízkosti oplocení, hyperexcitabilita, nadměrné slinění kvůli obtížnému polykání, dilatace jícnu nebo atonie bachoru, regurgitace bachorové tekutiny, polyurie, polydipsie, synkopa a aspirační pneumonie. Mnoho zvířat, než zemřou, je značně vyhublá. Inkubační období v CWD se nachází v rozmezí od 16 měsíců do 5 let a onemocnění postihuje stejně samce i samice. Smrt obvykle nastává v období 1 roku po nástupu klinických příznaků (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Při histopatologickém vyšetření CNS u CWD postižených jelenovitých byla pozorována mezineuronální vakuolizace, degenerace a ztráta neuronů, rozsáhlá spongióza, astrocytická hypertrofie a hyperplazie a příležitostné tvorba amyloidních plaků. Spongiformní léze jsou pozorované hlavně v thalamu, hypotalamu, středním 31

32 mozku, Varolově mostě, prodloužené míše, čichovém hrbolku a mozkové kůře. Nejshodnější histologické léze a imunohistochemické barvení PrP CWD jsou dobře pozorovány v dorzálním motorickém jádře u bloudivého nervu, který je považován za první místo akumulace PrP CWD. Mezi klinickými příznaky je rovněž nadměrné močení a nadměrná žíznivost a nízká specifická hmotnost moči vlivem nadměrné produkce antidiuretického hormonu (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003) Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) Začátkem roku 1986 propukla epidemie doposud neznámého prionového onemocnění pojmenovaná bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) neboli také nemoc šílených krav, která se vyskytovala u hovězího dobytka ve Velké Británii (Wells, a kol., 1987). V mozcích nakaženého hovězího dobytka byly nalezeny proteázou neštěpitelné prionové proteiny PrP Sc (Hope, a kol., 1988, Prusiner, a kol., 1993). K červnu roku 1990 bylo potvrzeno případů nakaženého dobytka z jeho celkové populace 10 milionů ve Velké Británii. V roce 1996 byl prezentován nárůst tohoto onemocnění na kusů, které se rozšířilo z Velké Británie do dalších 24 zemí včetně USA (Anderson, a kol., 1996). BSE představuje jakýsi zdroj běžné epidemie, což znamená, že zvířata jsou nakaženy základním činitelem, většinou stravou obsahující kontaminovanou složku. Krávy s mléčnou užitkovostí byly běžně krmeny masokostní moučkou (MBA) obsahující tepelně zpracované maso a kosti kontaminované mozky BSE postižených zvířat, často obohacenou spálenými vnitřnostmi ovcí a dobytka, užívaných jako nutriční suplement. Praxe zkrmování MBM infikovanou infekčními priony byla považována za pravděpodobnou příčinou epidemie BSE. Zákaz používání MBM v krmivu přežvýkavců nakonec vyústil v postupné snížení epidemie (Ducrot, a kol., 2008). Poslední statistické studie poukazují na to, že výskyt nemoci je od roku 1996 pod kontrolou. Klinické symptomy BSE zahrnují vadné držení těla a klopýtající chůzi, vysokou podrážděnost nervových stimulů, třes, ztrátu tělesné hmotnosti (více jak 75 % případů), agresi, tření se, nebo lízání se a pokles produkce mléka. Na rozdíl od scrapie není svědění a škrábání častým příznakem. V mozku se obvykle nachází akumulovaný PrP Sc a je zjevná spongiformní vakuolizace (Novakofski, a kol., 2005). V terminálním stádiu nemoci může PrP Sc být také zjištěn v míše, sítnici, ileu, nadledvinkách, mandlích, kostní dření, periferních nervech, hřbetních kořenových uzlinách, trojklaném ganglionu a 32

33 hrudních gangliích. Infekčnost BSE může být pozorována v případě mozkových tkáních již po 2 letech od inokulace. Epidemiologické a přenosové studie nepotvrdily žádné důkazy o výskytu PrP u BSE v mléce, spermatu ani u embryí a není znám žádný důkaz o jejich přenosu touto cestou. Nicméně potomci nakažených zvířat prokázali v některých případech až dvojnásobně zvýšené riziko vývoje nemoci. Průměrný věk výskytu klinických příznaků onemocnění BSE je 42 měsíců s inkubační periodou BSE 2-8 let a většina případů BSE bylo zjištěno během 4 až 5 let u dojnic (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Kromě klasického kmene způsobující BSE byly popsány ještě další dva kmeny (H-typ a L-typ) způsobující atypické BSE. Většina atypických případů BSE bylo zjištěno v průběhu aktivního dohledu zaměřených na poražená zvířata (Ducrot, a kol., 2008). U atypického L-kmene BSE se mohou vyskytovat amyloidní plaky, ačkoli nejsou typické pro klasické BSE (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Případy přenosu BSE byly popsány u ovcí a koz. Skot může být dodatečným zdrojem přenosu BSE na člověka (Houston, a kol., 2000, Vulin, a kol., 2011). Transgenní myši exprimující lidský PrP C jsou náchylnější k BSE než netransgenní myši (Plinston, a kol., 2011). Extrakty z mozku hovězího dobytka trpící BSE byly přeneseny do mozku myší, hovězího dobytka, ovcí a prasat. Přenos na myši a ovce potvrdil přednostní šíření u skotu (Bruce, a kol., 1994). Zvláštní význam byl zaznamenán u přenosu BSE prostřednictvím intracerebrální inokulace na kosmany a v nedávné době také na makaky (Baker, a kol., 1993, Lasmezas, a kol., 1996). Poslední studie poukazují rovněž na výskyt atypické CJD u třech dětí ve věku devíti let ve Velké Británii a Francii jako možný přenos BSE na člověka (Chazot, a kol., 1996, Will, a kol., 1996). Bylo zaznamenáno, že bovinní PrP je více homologní k lidskému PrP než k ovčímu PrP v oblasti mezi kodony 96 A 167 (Krakauer, a kol., 1996). Byla prokázána odlišnost v citlivosti lidského PrP k bovinnímu a ovčímu PrP, v závislosti na sekvenci aminokyselin v centrální doméně u bovinních a ovčích PrP. Je pozoruhodné, že epidemiologické studie po dobu přes tři desetiletí byly neúspěšné v hledání přesvědčivých důkazů o přenosu ovčích PrP na lidi (Cousens, a kol., 1990). Za pozornost stála velká incidence CJD u libyjských židů, kteří zpočátku konzumovali mírně vařené mozky ovcí. Nicméně se následně ukázalo, že geografický shluk CJD byl dán mutací v kodonu 200 u genu 66 u PRNP s rizikovou alelou 20p200Lys/Glut 33

34 (Prusiner, 1996). Patogeneticky byl zvažován autosomálně dominantní vertikální přenos s následnou vysokou familiární incidencí Exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců (EUE) EUE (Exotic Ungulate Spongiform Encephalopathy) je TSE exotických přežvýkavců z čeledi turovití (Bovidae) vyskytující se u zvířat chovaných v zoologické zahradě. Ve stejném období jako u výskytu epidemie BSE bylo ve Velké Británii diagnostikováno 6 případů EUE u kudu velkého, 6 u antilop koňských, 2 u přímorožců arabských a u dlouhorohého skotu ankole, 1 případ u přímorožce jihoafrického, antilopy nyaly, přímorožce šavlorohého a bizona. Postižená zvířata byla krmena masokostní moučkou pocházející z přežvýkavců. U myší naočkovaných homogenátem z mozku kudu a nyaly s EUE a skotu s BSE se vyvinula TSE s podobnými profily neuropatologických změn a inkubační dobou. Typologické studie kmenů u těchto myší také odhalila podobnost mezi kmeny EUE a BSE, podporující hypotézu, že EUE je způsobena infekcí s PrP z BSE. Průběh EUE a klinické příznaky se liší v závislosti na druhu a jsou odlišné od BSE a klusavky. Všechny zvířata trpící tímto onemocněním zahynula (Kirkwood, a kol., 1993, Sigurdson a Miller, 2003) Spongiformní encefalopatie koček (FSE) FSE je TSE domácích koček a v zajetí žijících divokých koček čeledi kočkovitých (Felidae). Od roku 1990 do současnosti bylo diagnostikováno téměř 100 případů u domácích koček většinou z Velké Británie z toho jeden případ nákazy ze Severního Irska, Norska, Lichtenštejnska a Švýcarska a 29 případů zajatých divokých koček z celé Evropy. Dále se pak potvrdila u 15 gepardů, 4 lvů, 3 ocelotů z rodu Leopardus, 3 pum, 3 tygrů a jedné asijské zlaté kočky. Případy FSE u divokých koček byly pozorovány v zoologických zahradách Velké Británii, Francii, Austrálii, Irsku a Německu. Všechny divoké kočky s diagnózou FSE pocházející ze zoo mimo Británii byly avšak původně z Velké Británie s výjimkou gepardice a jejího mláděte narozeného ve Francii, což vedlo k myšlence dalšího infekčního centra v Holandsku, kde byla gepardice narozena. Protože k většině případů FSE došlo paralelně s epidemií BSE, tak se předpokládá, že příčinou onemocnění pravděpodobně může být expozice postižených koček stravou kontaminovanou PrP Sc, která se považuje za původce onemocnění. U myší naočkovaných homogenátem z mozku koček trpícím FSE a skotem s BSE se vyvinula TSE s podobnými profily neuropatologických lézí a shodnou inkubační dobou. Typologické studie kmenů u těchto myší také odhalily podobnost mezi kmeny FSE a 34

35 BSE, což podporuje hypotézu, že FSE je způsobena infekcí prionů BSE (Bencsik, a kol., 2009, Eiden, a kol., 2010, Sigurdson a Miller, 2003). Nicméně, v roce 1998 se vyskytl případ u kočky domácí a jejího majitele, kde se ukázalo postižení stejným kmenem odlišujícím se od PrP z BSE. Bifurkací ve fenotypu byl u muže potvrzen fenotyp připomínající více scjd než vcjd a kočka vykazovala odlišný klinický fenotyp od FSE. Zůstává otázkou, zda tento výskyt je dílem náhody, či mezidruhovým přenosem mezi člověkem a kočkou anebo jestli obě onemocnění pochází ze stejného, neznámého zdroje (Zanusso, a kol., 1998). Prozatím nebyly hlášeny další případy onemocnění FSE koček tímto kmenem. Epidemie FSE rapidně poklesla díky zákazu použití krmiv pro domácí zvířata pocházejících z hovězí sleziny a tkáně CNS. Všechny případy FSE byly pozorovány u koček ve věku starších 2 roky (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Klinické příznaky onemocnění se projevují jako závažné změny v chování, depresemi, neklidem a v zanedbávání srsti. Behaviorální změny zahrnují strach, netypickou agresivitu nebo bázlivosti a neobvyklé skrývání se. Další charakteristikou FSE je abnormální nebo hypermetrická chůze a ataxie vycházejících zejména z pánevních končetin. Postižené kočky často vykazují špatný úsudek na dálku a hyperestézii na dotek a hluk, může také vyvinout třes, zírání do prázdna nebo v kruhu. Imran a Mahmúd rovněž popsali příznaky FSE zahrnující nadměrné slinění, polyfagii, polydipsii a rozšíření zornic. Na konci onemocnění může běžně docházet ke křečím. Smrt nastává po 3-8 týdnech po prvním klinickém projevu choroby u domácích koček a 8-10 týdnech u gepardů (Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). Neuropatologický profil FSE zahrnuje spongiformní degeneraci mozku a míchy, s převahou lézí u thalamu. Depozit PrP s původcem FSE byl imunohistochemicky detekován v centrální a periferní nervové soustavě, sítnici, lymforetikulárním systému, u ledvin a nadledvinek (Eiden, a kol., 2010, Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003) Nehumánní primáti (NHP) Od roku 1996 do roku 1999 byla v zoo a primátích zařízeních ve Francii diagnostikována TSE u dvou hnědých lemurů z Mayotte, jednoho hnědobílého lemura, lemura mongoz a makaka rhesus. Přestože je velký počet nehumánních primátů citlivý na experimentální expozici různých kmenů TSE, nikdy dříve nebyly hlášeny případy 35

36 nákazy TSE ve volné přírodě, i přes fakt že postižená zvířata byla krmena primátí stravou s kontaminovaným masem z Velké Británie. Ve skutečnosti byl u lemurů experimentálně naočkovaných homogenátem z mozku hovězího dobytka postižených BSE prokázán vývoj TSE se stejným profilem neurodegenerativních lézí jako u přirozeně infikovaných lemurů. Typologické studie kmenů také odhalily podobnosti mezi těmito dvěma kmeny. Dále imunologické vyšetření ukázalo u těchto přirozeně a experimentálně infikovaných lemurů podobné charakteristiky barvení a rozdělení PrP Sc v mozku, míše, mandlích, slezině a různých úsecích střeva a lymfatických tkáních (Bons, a kol., 1999, Imran a Mahmood, 2011a, Sigurdson a Miller, 2003). 2.3 Prionová onemocnění u lidí Kuru Kuru je prvním lidským neurodegenerativním onemocněním klasifikovaným jako transmisní spongiformní encefalopatie anebo prionové onemocnění v minulosti též označované jako pomalé nekonvenční virové onemocnění, které bylo jako první publikováno západní medicíně profesorem Carletonem Gajdůškem a profesorem Vincentem Zigasem v roce 1957 (Gajdusek a Zigas, 1957, Gajdusek a Zigas, 1959, Gajdusek, a kol., 1961). Onemocnění se vyskytovalo u příslušníků kmene Fore na Nové Guineji jako důsledek rituálního kanibalismu, zde konkrétně pojídání mozku zemřelých osob. Rituální kanibalismus (požívání pozůstalých jako součást smutečního obřadu) byl praktikován nejen u kmene Fore, ale rovněž v okolních východních oblastech, u kterých nebylo onemocnění kuru nikdy prokázáno (Alpers, 1968). Kanibalismus spočíval v požívání těl zemřelých. Když bylo tělo zemřelého určeno pro konzumaci, žádná z jeho částí nemohla zůstat nevyužita vyjímajíc žlučníku. Tělo nebožtíka bylo příbuzenstvem z matčiny strany naporcováno za pomocí bambusového nože a kamenné sekery. Prvně byly odňaty ruce a chodidla, následovalo nařezání paží a nohou aby mohly být odejmuty svaly. Po otevření hrudníku a dutiny břišní byl vyňat žlučník tak, aby nedošlo k jeho poškození a jeho úniku do dutiny břišní. Po oddělení hlavy, rozbili příbuzní lepku a odstranili mozek. Veškeré maso orgány a mozek byly určeny pro konzumaci. Morek ze zlámaných kostí stejně tak jako občas i nadrcené kosti v prach byly určeny ke konzumaci společně se zeleninou. U severních Forů, ale už ne u jižních, byla předem mrtvola na pár dní pohřbena, následně exhumována a uzrále maso snědeno s tím, že larvy hmyzu mohly být vařeny jako zvláštní delikatesa (Liberski a Brown, 2009). 36

37 Kuru má tři klinické fáze a to ambulantní (stále může chodit), sedavá (pouze sedí) a konečná (nemůže se sám posadit). Období, které předchází projevům nemoci je obvykle charakterizováno bolestí hlavy a nohou. Nápadnými klinickými příznaky jsou nekontrolovatelné škubavé pohyby. Silný třes a chlad byly příznaky, podle kterých byla nemoc pojmenována. Nejnápadnější klinické příznaky podobné s CJD se mohou rovněž vyskytnout v některých případech v posledních stádiích nemoci. Neuropatologicky jsou mozky zasažené kuru charakterizovány spongiózou, ztrátou neuronů a astrocytickou mikrogliózou, které mohou být pozorovány v centrální nervové soustavě (CNS) obvykle v šedé kůře mozkové. (Imran a Mahmood, 2011b). Nejvíce náchylní k tomuto onemocnění jsou homozygoti na kodonu 127 a 129 genu (PRNP) kódujícího prionový protein. Heterozygotnost na těchto kodonech PRNP je rezistenční faktor vůči kuru a může být vidět u značné většiny přeživších po epidemii kuru (Imran a Mahmood, 2011b, Mastrianni, a kol., 1999). Tyto rané poznatky byly v nedávné době rovněž potvrzeny imunohistologickými testy pro detekci tohoto onemocnění (Liberski, a kol., 2012). Pokles výskytu kuru u lidí kmene Fore byl zapříčiněn vyčerpáním náchylného genotypu a v neposlední řadě taky přerušením expozice prostřednictvím kanibalismu. Vyřešení záhady kuru vneslo nový pohled do oblasti biomedicínských věd a započalo tak čtvrtstoletí výzkumů, které vedly k udělení dvou Nobelových cen (Gajdůšek v roce 1976 a Prusiner v roce 1997) a návrhu na třetí Nobelovu cenu (Wüthrich, který v roce 2002 popsal strukturu prionového proteinu) (Liberski a Brown, 2009). Výzkum kuru měl značný vliv na pojmy nukleace-polymerace a konformační změny (Gajdusek, 1988) Creutzfeldt-Jakobova nemoc (CJD) Sporadická Creutzfeld-Jakobova nemoc (scjd) Sporadická Cruetzfeldt-Jacobova nemoc (scjd) tvoří 85 % všech případů CJD s celosvětovou roční incidencí 1-2 případů/milion obyvatel (Mead, a kol., 2003). Vyskytuje se vyrovnaně u obou pohlaví ve věku mezi 55 a 75 lety. Byly ale rovněž hlášeny případy v mladším (pod 20 let) a ve vyšším věku (nad 90 let). Mezi klinické příznaky patří rychle progresivní demence, cerebelární dysfunkce včetně svalové poruchy koordinace, abnormality v držení těla, poruchy řeči a vidění. Hlavním symptomem je demence s následnou spontánní nebo indikovanou myoklonií. V průběhu 37

38 onemocnění mohou přibývat příznaky, jako je dysfunkce reflexů, třes, křeče a tuhost, změny chování, zmatenost a deprese. Na konci průběhu nemoci většina pacientů přejde do stavu chorobné němoty a přestane reagovat na vnější podněty (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b). Charakteristickým znakem neuropatologického onemocnění u pacientů scjd je přítomnost spongiformních změn a distribuce PrP Sc v CNS. Rovněž byl zaznamenán depozit amyloidní plaků v 5-10 % případech (Belay, 1999, Mead, a kol., 2003). Na základě klinickopatologických zjištění byly popsány různé varianty scjd. Amaurotická nebo Heindenhainova varianta je charakterizována rychle progresivní demencí, myoklonií, poruchou zraku, jako jsou halucinace, vizuální agnosií a kortikální slepota s typickým krátkým trváním choroby. Brownellemova a Oppenheimerova varianta je charakterizována časnou a rozhodující ataxií mozečku s relativně pozdní demencí. Talamická forma se vyznačuje demencí a poruchami hybnosti, a panencefalická japonská varianta se vyznačuje vysokým podílem buněk v mozkomíšním moku, hlubokým poškozením bílé hmoty při velmi pomalém průběhu onemocnění (Belay, 1999, Cornelius, a kol., 2009, Imran a Mahmood, 2011b, Parchi, a kol., 2011). Na základě klinických, biologických, elektrofyziologických a neuropatologických nálezů mohou být případy scjd klasifikovány jako možné, pravděpodobné nebo definitivní. Možné případy jsou charakterizovány tím, že je pozorována rychle progresivní demence spolu s nejméně dvěma z následujících příznaků: myoklonie, symptomy na mozečku nebo vizuální symptomy, pyramidální nebo extrapyramidové příznaky, chorobná němota. Doba průběhu onemocnění je kratší 2 let. Pravděpodobnými příznaky jsou charakterizovány možné případy, které za pomocí elektroencefalografie dokládají přítomností proteinu v mozkomíšním moku. Definitivní případy jsou definovány přítomností spongiformních změn nebo přítomností PrP Sc v mozku. Symptomy scjd mohou být také viděny při poruchách, jako je Alzheimerova choroba, difuzní onemocnění Lewyho tělísek nebo frontální demence, paraneoplastický syndrom, nádor nebo cévní mozková příhoda. Počítačová tomografie může u některých případů odhalit mírné příznaky mozkové atrofie. Použití magnetické rezonance lebky může být užitečné při odhalování mozkové atrofie a ve více než 50 % případů může odhalit vysoké signály na T2, v bazálních gangliích, nebo v mozkové kůře nebo mozečku (Imran a Mahmood, 2011b). 38

39 Klinickopatologické a molekulární fenotypy scjd jsou do značné míry ovlivněny změnami PRNP. Polymorfismus PRNP v regulační, tak jako i kódující sekvenci byl spojen s predispozicí k rozvoji onemocnění (Bratosiewicz-Wasik, a kol., 2007, Palmer, a kol., 1991). Významným rizikovým faktorem pro rozvoj scjd je homozygotní polymorfismus M129V (Palmer, a kol., 1991). V Japonsku je rizikovým faktorem pro rozvoj scjd homozygotní polymorfismus E219K u PRNP (Shibuya, a kol., 1998). E219K byl nalezen jen v populaci asijské a tichomořské oblasti, které jsou více homozygotní pro methionin v kodonu 129 v porovnání se západní populací (Mead, a kol., 2003). Neefektivní interakce mezi molekulami PrP C kódovaných z různých PRNP alel (129 M a 129 V) může omezit konverzi PrP C do PrP Sc. Jakékoli omezení v procesu šíření prionů předpokládá zpomalení progresi onemocnění (Palmer, a kol., 1991). Klinická fenotypová heterogenita případů scjd může být vyvolána různými kmeny prionů. Kmen je biochemicky definován modelem a poměry fragmentů PrP Sc na Western blotu. Tři genotypy M129V (M129M, M129V a V129V) a 2 kmeny (typ 1 a typ 2) mohou být spojeny do 6 kombinací (MM1, MV1, VV1, MM2, MV2 a VV2), které odpovídají dobře odlišitelným klinickým fenotypům scjd. Na základě těchto 6 kombinací byly navrženy různé systémy klasifikace scjd (Brandner, 2011, Gambetti, a kol., 2011, Imran a Mahmood, 2011b, Wadsworth a Collinge, 2011) Familiární (genetická) Creutzfeld-Jakobova nemoc (f/g CJD) Familiární CJD (f/gcjd) je spojena s dominantně dědičnými bodovými mutacemi v PRNP. Uvnitř PrP je pětkrát opakující se oblast obsahující od 51 do 91 zbytků tvořených nonapeptidy PQGGGGWGQ a čtyřmi tandemovými oktapeptidovými repeticemi (PHGGGWGQ)4. Inserce 2-9 oktapeptidových repeticí (2-9-OPRI) a delecí 2 oktapeptidových repeticí (2-OPRD) v PRNP jsou také spojeny s náchylností k fcjd. Vzhledem k tomu, že více než 50 % z fcjd byl hlášen bez pozitivní rodinné anamnézy, byl termín familiární CJD (fcjd) nahrazen genetická CJD (gcjd). Existuje mnoho variant penetrací různých mutací, jak dokládá značná intrafamiliární a intragenerační fenotypová variabilita, někdy nemoc může přeskočit i celou generaci. Výskyt gcjd je 5-15 % všech případů CJD. Ačkoli familiární charakter gcjd je znám od roku 1920, byly mutace spojené s onemocněním poprvé popsány v roce 1989, pouze 2 roky po klonování cdna PRNP (Belay, 1999, Gambetti, a kol., 2011, Gambetti, a kol., 2003, Imran a Mahmood, 2011b, Kretzschmar, a kol., 1986). Četnost mutací se liší po celém světě, nicméně, zeměpisná nebo etnická uskupení případů gcjd s mutací E200K, 39

40 I210V, D178N a V180I byly hlášeny z Izraele, Slovenska, Chile, Itálii, Španělska a Japonska (Gambetti, a kol., 2011, Nozaki, a kol., 2010). Klinickopatologický fenotyp gcjd, podobně jako u CJD, dobře koreluje s genotypy kodonu 129 a PrP Sc, a navíc se zdá, že více než faktor citlivosti bude hrát klíčovou roli u tohoto onemocnění bodová mutace, avšak polymorfismus PRNP jiný než M129V, spojený se vznikem onemocnění, nebyl popsán. I přes velký zájem vědecké komunity o tuto otázku zůstávají mnohé kmeny neidentifikovány a mohou být zapojeny do patogeneze onemocnění. V některých případech gcjd mohou být nalezeny fragmenty o velikosti 12-18,5 kda a dále fragmenty 19 a 21 kda, které charakterizují typy 2 a 1 u PrP Sc. Mutace PRNP mohou hrát svou roli v patogenezi gcjd ve i) zvýšení náchylnosti PrP C a mutanta PrP k agregaci, ii) zvýšení retence agregovaných PrP molekul v sekrečních drahách, a iii) v modifikaci interakce intramolekulárních solných můstků a vodíkových vazeb. Je známo, že poruchou intramolekulární interakce přestaví hydrofobní aminokyseliny tak, že se protein stává nerozpustný (Capellari, a kol., 2011). S nárůstem každé oktapeptidové repetice se zvyšuje i schopnost mutanta PrP vázat dvojmocné ionty, jako je měď a tím vzrůstá závažnost klinickopatologického fenotypu. Biochemická typizace kmenů u gcjd často poukáže na nedostatečné zastoupení neglykosylovaných fragmentů. To je proto, že neglykosylované fragmenty jsou méně stabilní než mono-a diglykosylované fragmenty a jsou proto méně efektivní při jejich dopravě ze sekrečních cest k plazmatické membráně (Capellari, a kol., 2011, Corsaro, a kol., 2011, Gambetti, a kol., 2011). I přesto, že se klinické fenotypy týkající se většiny mutací překrývají s těmi u scjd (Gambetti, a kol., 2011), klinický fenotyp gcjd nese haplotyp T183A-129M a je mírně odlišný a zahrnuje změny osobnosti s následnou rychle progredující demencí, agresivní chování, hyperoralitu, verbální stereotypy a často parkinsonské příznaky (Nitrini, a kol., 1997) Iatrogenní Creutzfeld-Jakobova nemoc Iatrogenní CJD (icjd) byla poprvé popsána v roce 1974 u osoby, která obdržela transplantaci rohovky od zemřelého pacienta trpící CJD (Lugaresi, a kol., 1986). Od té doby bylo popsáno několik případů spojených s iatrogenním přenosem při použití stereotaktických intracerebrálních elektroencefalopatických jehel nebo neurochirurgických nástrojů. Nejvyšší podíl případů icjd je přičítáno léčbě lidského růstového hormonu (hgh) a Lyodurových štěpů vyrobené B. Braunem (Melsungen AG, Německo) a zpracovaných před květnem Většina případů CJN spojené s léčbou 40

41 hgh se vyskytovala ve Francii, zatímco ty, které souvisejí s léčbou štěpů, se objevily hlavně v Japonsku (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Nozaki, a kol., 2010, Will, 2003). Mezi pozdními padesátými léty 20. století a rokem 1985 bylo asi dětí léčených na hgh po celém světě, a celkový podíl případů CJN z léčené populaci se odhaduje asi na 1/100. Předpokládá se, že pravděpodobná infekce PrP Sc je odvozená přes hypofýzou derivovaný hgh. Před výrobou rekombinantní hgh bylo farmaceutickou praxí zpracováno hypofýz od zemřelých v jedné dávce při extrakci hormonu. Přítomnost hypofýzy s CJD v jedné dávce mohlo být zodpovědné za její infekci. S dostupností rekombinantní hgh a zahájením odděleného zpracování jednotlivých štěpů od roku 1987 je pravděpodobnost výskytu případů icjd případů velmi nízká. Přesto se může stát, že u případů icjd s dlouhou inkubační dobou dojde teprve k vrcholu incidence (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Will, 2003). Klinickopatologické rysy CJD, které jsou spojené s léčbou hgh, se podobají rysům kuru. Rizikovým faktorem je homozygotnost M129M v genu PRNP s inkubační dobou v rozmezí od 4,5 do více než 25 let s průměrem 12 let (Belay, 1999, Collinge, a kol., 1991, Imran a Mahmood, 2011b, Will, 2003). V kontrastu s klinickopatologickými rysy CJD spojenými s přenosem štěpů při použití kontaminovaných neurochirurgických nástrojů se podobají scjd. Průměrná doba trvání nemoci je 18 měsíců a inkubační doba může být v rozsahu od 1,5 až do 18 let s průměrem 6 let. V Japonsku se minimální riziko vzniku icjd odhaduje na cca 1/3000 štěpu na příjemci (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Will, 2003) Variantální Creutzfeld-Jakobova nemoc Prvních 10 pacientů, u kterých byla diagnostikována nová varianta CJD nebo jednoduše variantální CJD (nvcjd/vcjd), byly hlášeny v dubnu 1996 ve Velké Británii (Will, 2003, Will, a kol., 1996). Věk těchto pacientů byl relativně nižší, ve věku od 16 do 39 let, a projevovala se převaha psychiatrických symptomů místo ataxie mozečku nebo progresivní demence (Will, 2003). Okolo 219 případů vcjd byly hlášeny dosud z 8 evropských a 4 mimoevropských zemí (USA, Kanada, Saudská Arábie a Japonsko). Většina případů vcjd (172) byla hlášena ve Velké Británii (Imran a Mahmood, 2011b). Psychiatrické a behaviorální příznaky vcjd mohou zahrnovat neklid, agresivitu, depresi, úzkost, apatii, emoční labilitu, nespavost, špatnou koncentraci, paranoidní bludy nebo bezohlednost, přičemž se kombinace dvou nebo více z těchto příznaků objevila u většiny pacientů. Někteří pacienti také vykazovali známky smyslové 41

42 poruchy, jako je bolest, parestézie a dysestézie. Mezi neurologické příznaky, které nastoupí nejméně 6 měsíců po nástupu psychiatrických symptomů, zahrnují cerebelární ataxii, kognitivní poruchy, mimovolné pohyby připomínající pohyby tance svatého Víta nebo myoklonii. Znamením pozdního nástupu onemocnění je inkontinence moči, progresivní nehybnosti a akinetický mutismus. K úmrtí často dochází z důvodu přidružené infekce. Průměrný věk v době nástupu příznaků je 29 let a progrese nebo celková doba trvání nemoci zahrnuje 18 měsíců v průměru, který je podobný jako u onemocnění kuru a icjd spojené s léčbou hgh (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Will, 2003). Obecně zpomalení elektroencefalopatické aktivity a zvýšení hladiny proteinu v CNS může být typické pro diagnostiku vcjd ve více než 50 % případech (Brandner, 2011, Lukic, a kol., 2010). Neuropatologickým znakem vcjd je přítomnost amyloidních plaku podobných těm u kuru obklopených spongiformními lézemi "floridními plaky", které byly také pozorované u klusavky, ale nikdy u jiných lidských prionových onemocnění (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Will, 2003). Vztah vzniklých plaků a iontů kovů je také často diskutován a základní schéma je zobrazeno na Obr. 2. Spongiformní změny nastanou nejvíce v bazálních gangliích a thalamu s řídkou distribucí v mozkové kůře. Při imunohistochemickém barvení se floridní plaky a rezistentní PrP vyskytovaly převážně v mozečku (Belay, 1999). Nicméně dostatečné množství PrP Sc byla zjištěna v lymforetikulárním systému vcjd pacientů (Will, 2003). Detekce rezistentního PrP v lymforetikulárním systému byl s jistotou použit pro diagnostiku vcjd dokonce i u klinických zdravých jedinců (nosičů) (Ironside, 2010). Doposud všichni vcjd pacienti byli homozygoti M129M (Bishop, a kol., 2009). Velmi brzy po zprávě o 10 případech vcjd byla provedena epidemiologická studie, která se zaměřila na experimentální přenos choroby na makaky a myši (divoké, stejně jako transgenní) a biochemickou typizaci kmenů spojených s etiologií vcjd k infekci BSE priony (Will, 2003). Stejné nebo rozdílné fenotypy mohou rozvinout primární a sekundární přenos vcjd a BSE na myši exprimující lidský PrP v závislosti na zdroji inokula a sekvenci PrP příjemce. Heterozygoti M129V mohou být méně odolní vůči vcjd přenosu ve srovnání s přenosem BSE (Bishop, a kol., 2009, Wadsworth a Collinge, 2011). Heterozygotnost v E219K byla považována za rizikový faktor pro přenos BSE na člověka a může být podkladem vzniku rezistence k přenosu vcjd u lidí (Ironside, 2010). Navíc existují alespoň 4 patologicky potvrzené případy včetně 1 se subklinickou nebo potenciálně 42

43 preklinickou infekcí, které jsou spojovány se sekundárním přenosem vcjd přes krevní transfúze (Wroe, a kol., 2006). Tyto zprávy o sekundárním iatrogenním přenosu a možnosti výskytu vcjd s dlouhou inkubační dobou u jedinců s PrP genotypem V129N a V129V vyvolaly vážné znepokojení v oblasti veřejného zdraví (Bishop, a kol., 2009, Imran a Mahmood, 2011b, Ironside, 2010). Některé případy kuru a icjd se vyskytly až po inkubaci nemoci po více než 50 letech u kuru a 30 letech u icjd (Brandner, a kol., 2008, Brown, a kol., 2000, Collinge, a kol., 2006, Wroe, a kol., 2006). Obr. 2: Depozice iontů kovů v synaptické štěrbině. Peptid A je vylučován do synaptické štěrbiny pomocí APP proteolytického štěpení, kde dochází amyloid produkujícím procesům u Alzheimerovy choroby. Kovové ionty jsou tak uvolněny do synaptického prostoru. A) Vysoké koncentrace Zn 2+ a Cu 2+ jsou zodpovědné za tvorbu cytotoxických amorfních agregátů. B) Na druhé straně, ekvimolární koncentrace Zn 2+ a Cu 2+ řídí fibrilizaci peptidu A. C) Generace ROS a zapojení MT-3 je diskutováno Gertsmanův-Strausslerův-Schenkerův syndrom Dominantní autozomálně dědičné onemocnění vzniklé mutací PRNP, které vede k jiné formě lidské TSE, je pojmenováno jako Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrom (GSS). Incidence GSS je 1/100 milionů obyvatel za rok (Belay, 1999). GSS je charakterizován časným nástupem mezi 30 a 60 lety věku s pomalou progresí onemocnění mezi 3,5 až 9,5 roky. Klinické příznaky se mohou naznačit intrafamiliární a intragenerační variaci zahrnují cerebelární ataxii, poruchy chůze, demenci, dysartrii, 43

44 oční disymetrii, řídkou myoklonii, spastickou paraparézu, parkinsonické znaky a hyporeflexii nebo areflexii v dolních končetinách (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b). Nicméně v poslední době v Japonsku byla pozorována hyperreflexie nohou v raném stadiu nemoci u pacientů nesoucí mutaci P102L v PRNP. U GSS mohou být rovněž pozorovány změny ve spánku a rytmu teploty (Provini, a kol., 2009). Bylo prokázáno, že polymorfismus M129V u PRNP má vliv na fenotyp onemocnění. Spojení alely V129 a P102L, která je nejčastější příčinou GSS, vyúsťuje v převahu psychiatrických příznaků, jako je apatie a deprese (Bianca, a kol., 2003). Následující PRNP mutace byly prokázány v segregaci GSS: P102L, P105L, A117V, Y145X, Q160X, F198S, Q217R, Y218N, Y226X a Q227X (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Jansen, a kol., 2010). Y218N vykazuje klinické kritéria pro případnou Alzheimerovu chorobu a možnou frontotemporální demenci s neurofibrilární degenerací u neuropatologického profilu a přítomností různých fragmentů PrP Sc v rozpětí kda (Alzualde, a kol., 2010). Obecně platí, že neuropatologické rysy GSS pacientů, jsou četné amyloidní plaky, spongiformní změny, ztráta neuronů, astrocytická mikroglyóza a variabilní neurofibrilární změti (Belay, 1999, Imran a Mahmood, 2011b, Liberski a Brown, 2009) Fatální familiární insomnie (FFI) Fatální familiární insomnie (FFI) je autosomální dominantně dědičné prionové onemocnění, které bylo dříve známo jako demence thalamu, ale od roku 1986 bylo přejmenováno. FFI je způsobena mutací D178N u PRNP genově spojené s polymorfismem metioninem M129V u PRNP. Při spojení s valinem v kodonu 129 vede stejná mutace k rozmanitému fenotypu f/gcjd (Lugaresi, a kol., 1986, Montagna, a kol., 2003). Dosud bylo popsáno téměř 100 případů FFI u téměř 40 rodin v Itálii, Německu, Rakousku, Španělsku, Velké Británii, Francii, Finsku, Spojených státech Amerických, Austrálii, Japonsku, Číně a Maroku (Baldin, a kol., 2009). FFI se vyskytuje stejně u mužů jako u žen bez výrazného rozdílu mezi genotypy M129M a V129N. Nicméně se může lišit doba trvání onemocnění, kdy u fenotypu v129 MM je doba významně kratší. Případy FFI se vyskytují v období věku mezi 20 a 72 lety, s průměrem 49 let a po nástupu nemoci může pacient žít mezi 8-72 měsíci s průměrem 18,4 měsíce. Klinické příznaky jsou nespavost nebo narušený spánek. Dále může být zaznamenána myoklonie, ataxie, dysartrie, dysfagie a pyramidové příznaky a 44

45 autonomní hyperaktivace. Závažnost a průběh klinických příznaků se může lišit u genotypů M129M a V129N. Nespavost, myoklonie a autonomní dysfunkce jsou často mnohem závažnější u pacientů s M129M, zatímco ataxie, dysartrie a záchvaty často převládají u V129N (Belay, 1999, Capellari, a kol., 2011, Gambetti, a kol., 2003, Imran a Mahmood, 2011b, Montagna, a kol., 2003). Polysomnografie je velmi užitečná při diagnostice choroby. Zobrazení výrazné snížení doby spánku a nesourodý přechod mezi fázemi spánku poskytuje důkazy insomnie. Genotyp M129V je znám, že snižuje závažnost těchto příznaků u abnormálního spánku. V porovnání je genotyp M129V spojen s rozšířením hypometabolismu v thalamu a kortexu, což bylo zjištěno pomocí pozitronové emisní tomografie (PET). Proto může být PET dalším užitečným nástrojem pro diagnostiku FFI (Belay, 1999, Capellari, a kol., 2011, Gambetti, a kol., 2003, Imran a Mahmood, 2011b, Montagna, a kol., 2003) Sporadická fatální insomnie (sfi) Sporadická forma fatální insomnie (SFI) byla poprvé zaznamenána v roce Pacienti vykazovali klinické a neuropatologické příznaky podobné FFI, ale rodinná anamnéza mutace v PRNP nebyla prokázána. Všichni pacienti byli homozygoti M129M a biochemická typizace kmenů u těchto chorob odhalila jediný rozdíl v intenzitě neglykosylovaných fragmentu PrP Sc typu 2; neglykosylovaný fragment byl nedostatečně zastoupen u FFI (Imran a Mahmood, 2011b, Montagna, a kol., 2003, Parchi, a kol., 2011). Bylo popsáno, že v téměř 24 případech sfi převládali homozygoti M129M a šíření prostřednictvím PrP Sc typu 2 (Priano, a kol., 2009). sfi je také občas označována jako "scjd MM2 thalamu", ale klinicko-patologicky se značně odlišuje od scjd MM2. U scjd MM2 je nejvíce postižena mozková kůra oproti thalamu, kde jsou kontrolovány cyklu spánku (Gambetti, a kol., 2011). PrP Sc MM2 kóduje odlišné fenotypy u scjd a SFI, což je důvodem k obavám ukazujícím, že faktory, které doplňují genotyp kodonu 129 a typ PrP Sc mohou být také zapojeny do určování prionových kmenů. Nicméně konformery PrP Sc MM2 asociované s scjd a sfi mohou ukázat variace v intenzitě a velikosti jejich fragmentů při aplikaci více citlivé 2D elektroforetické separace a zlepšit tak podmínky stanovení (Gambetti, a kol., 2011). 45

46 2.4 Prionům podobná onemocnění Alzheimerova choroba (AD) Alzheimerova choroba (AD) je jednou z nejčastějších forem demence, která postihuje více než 37 milionů lidí na světě (Haass a Selkoe, 2007, Mount a Downton, 2006). Prevalence výskytu AD bude dále ještě narůstat se stárnoucí populací, což přinese široké sociální a ekonomické požadavky na péči a léčení pacientů s AD. Toto onemocnění je patologicky charakterizováno formací amyloidních plaků složených z peptidů amyloidu β (Aβ) a neurofiblilárních změtí složených z hyperfosforylovaného proteinu Tau. Akumulace Aβ v mozku se zdá být kritická pro patogenezi AD (Kellett a Hooper, 2009). V souvislosti s AD existuje celá řada neuropatologických souvislostí a genetických spojitostí ve spojení s prionovými onemocněními. Byla reportována koexistence patologie AD u CJD (Hainfellner, a kol., 1998) a PrP C se ukázal být lokalizován s Aβ plaky (Voigtlander, a kol., 2001). Přítomnost tohoto PrP C -Aβ komplexu byl přítomen u většiny pacientů s CJD. Dále bylo navrženo, že PrP C může podporovat formaci Aβ plaků. Genetická korelace mezi PrP C a AD byla rovněž již zdokumentována. Systematické meta-analýzy geneticky asociovaných studií AD odhalily, že gen kódující PrP C (PRNP) je potenciálně AD citlivý a byl popsán polymorfismus M129V u PRNP jako možný rizikový faktor pro časný počátek AD (Del Bo, a kol., 2006, Dermaut, a kol., 2003, Riemenschneider, a kol., 2004). I přesto, že doposud byly popsány spojitosti mezi patologickými a genetickými znaky u AD a PrP Sc, neexistují doposud žádné důkazy o interakci mezi proteiny způsobující toto onemocnění. V roce 2007 byla popsána interakce mezi PrP C a rychlost limitujícím enzymem BACE1 (β-sekretáza) produkující Aβ plaky (Parkin, a kol., 2007). V nedávné době byly provedeny další potvrzující studie (Benilova a De Strooper, 2010, Kellett a Hooper, 2009, Lauren, a kol., 2009). Z nich vyplynulo, že PrP C je receptor Aβ oligomerů (Lauren, a kol., 2009) a exprese PrP C je kontrolována amyloidní intracelulární doménou AICD) (Vincent, a kol., 2009). Aβ plaky jsou formovány proteolytickými procesy amyloidního prekurzorového proteinu (APP) (Obr. 3). Amyloidní cesty APP zahrnují počáteční štěpení β-sekretázou (BACE1; β-strana APP štěpícího enzymu 1) při uvolnění fragmentu aappβ u N konce. Zbytek po štěpení v membráně zabudovaný C-koncový fragment APP (C99) je nadále 46

47 štěpen γ-sekretázou a má za následek formaci Aβ a vznik amyloidní intracelulární domény (AICD). Amyloidní štěpení APP vede ke vzniku velkého počtu Aβ isoforem o délce od 39 do 43 aminokyselin. Z těchto isoforem jsou nejčastěji nacházeny isoformy Aβ 40 a Aβ 42. Aβ 42 je nejvíc amyloidní isoformou u agregátů a je to právě tato isoforma, která je nejčastěji nacházena v senilních placích. Peptidy Aβ se mohou sami sestavit do malých rozpustných oligomerů nebo delších protofibril a fibril. Zatímco monomerické Aβ jsou všeobecně netoxické, existují důkazy, že vzrůstající počet Aβ oligomerů je zodpovědný za synaptické dysfunkce, které se vyskytují u AD (Cleary, a kol., 2005, Lacor, a kol., 2004, Walsh, a kol., 2002). APP může být alternativně metabolizován neamyloidní cestou (Obr. 3), kde je štěpen α-sekretázou, členem rodiny ADAM (disintegrační a metaloproteinázový enzym) (Vardy, a kol., 2005). Toto α-štěpení je prováděno uvnitř regionu Aβ a tak předchází formací peptidů Aβ. Obr. 3: Proteolytické procesy APP. Amyloidní cesta postupného štěpení N-konce APP zahrnuje prvně štěpení pomocí enzymu BACE1 (β-sekretáza, β-strana APP štěpícího enzymu-1) s produkcí sappβ a v membráně ukotveného konce C99. Tento konec je nadále štěpen γ-sekretázou s následným vznikem Aβ a AICD (amyloidní intracelulární doména). Neamyloidní cesta zahrnuje štěpení pomocí α-sekretázy uvnitř APP, což zabraňuje formaci Aβ peptidů. 47

48 Hypotéza amyloidní kaskády byla formulována v roce 1991 (Hardy a Allsop, 1991) a zdůrazňuje, že amyloidní depozice je hlavním prekurzorem progrese Aβ a tudíž indikuje, že porozumění mechanismu tvorby Aβ, jejich degradace a odstraňování jsou kritické pro pochopení vývoje tohoto onemocnění. V normálním zdravém mozku jsou Aβ degradovány za pomocí celé řady peptidů včetně neprilysinu, endothelinkonvertující enzym a inzulín-degradující enzym (Carson a Turner, 2002). Zatímco se uvažuje, že Aβ jsou toxickým původcem AD, existují také nové důkazy o fyziologické roli peptidů v regulaci proudových kanálů vápníku a draslíku (Plant, a kol., 2006, Ramsden, a kol., 2001). Toto poukazuje na to, že Aβ by mohly být toxické pouze ve vyšším množství jako výsledek imbalance mezi produkcí a degradací, jak je tomu u AD (Kellett a Hooper, 2009) Parkinsonova choroba (PD) Parkinsonova choroba (PD) je porucha charakterizována neuropatologickou akumulací intraneuronálních proteinových agregátů (Lewiho tělíska a Lewiho neurity) v dendridech a axonech dopaminových nervů a zvládnutí pozměněného prionu hraje klíčovou roli v etiopatogenezi (Olanow, a kol., 2004). Pozornost je konkrétně zaměřena na protein α-synuklein, jako hlavní složku Lewiho patologie. Bodové mutace u genu α- synuklein způsobují vzácné familiární formy PD. Duplikace nebo ztrojení přirozeného genu α-synukleinu způsobuje rovněž formu PD poukazující na zvýšení hladiny normálního α-synukleinu a je dostačující pro vyvolání tohoto onemocnění. Hlubší forma patologie v počáteční fázi nemoci je spojována s pacienty se ztrojenou formou oproti pacientům se zdvojenou formu genu α-synukleinu. Cytoplazmatická hladina α- synukleinu se zvyšuje se stářím lidského mozku a věk je hlavním faktorem vývoje onemocnění PD. Následně polymorfismus jednotlivých nukleotidů u genu α-synukleinu je spojován s rostoucím rizikem vývoje sporadické PD (Satake, a kol., 2009, Simon- Sanchez, a kol., 2009). V poslední době se vyskytly důkazy o možnosti, že α-synuklein je prionu podobný protein, a že PD je prionům podobné onemocnění. Oba dva proteiny, PrP i α-synuklein, mají přirozenou α-helix konformaci (Bartels, a kol., 2011), ale mohou být konformačně pozměněny na protein bohatý na strukturu β-skládaného listu, zejména v přítomnosti vysoké koncentrace mutantní formy. V obou případech odolává nativní protein agregačním procesům, ale pozměněný protein je náchylný k tvorbě fibril, agregátů a amyloidních plaků spojených s procesem neurodegenerace. Navíc se zdá, že α- 48

49 synuklein může být transformován z postižených do zdravých buněk, kde mohou započít proces neurodegenerace. Jako u PrP nebyla normální funkce α-synukleinu doposud zcela objasněna. α-synuklein se primárně nachází v oblasti synapsí a předpokládá se, že hraje roli u vezikulárního transportu a u usnadňování uvolňování dopaminu (Norris, a kol., 2004). U myší s vyřazeným genem pro α-synuklein nebyly pozorovány významné změny v chování (Chandra, a kol., 2004). Důležitou otázkou však je, co indikuje změnu konformace α-synukleinu u PD. Mutantní forma prionu je náchylná ke změně konformace, ale mutace genu α- synukleinu je zodpovědná za velmi nízké množství familiárních případů a není zodpovědná za většinu případů, které se vyskytují sporadicky. Duplikace a ztrojení přirozených typů genů je rovněž spojována s familiární PD. Protože se takové případy vyskytují zřídkakdy, naznačují tak, že zvýšená hladina samotného normálního proteinu může způsobit onemocnění. U sporadických případů PD zvýšená hladina α-synukleinu může navodit následky poškození odstraňování nadbytku proteinu. α-synuklein je normálně štěpen a odstraňován autofágy (lysozomy a ubikvitinovým proteázovým systémem) (Bennett, a kol., 1999, Lee, a kol., 2004, Liu, a kol., 2003, Liu, a kol., 2005, Olanow a Brundin, 2013, Vogiatzi, a kol., 2008). Studie z pitev pacientů postižených pokročilým stádiem PD, kteří obdrželi transplantaci fetálních mesencefalických buněk, demonstrovali, že se typická Lewiho patologie vyvinula uvnitř transplantovaných neuronů (Kordower, a kol., 1995). Toto poukazuje na to, že α-synuklein, v patologické formě bohatý na konformaci β- skládaného listu, migruje z postižených neuronů do nepostižených. To potvrdily i laboratorní studie, kde se jeví, že pozměněný protein může sloužit jako templát pro propagaci pozměněného cizorodého α-synukleinu. Toto vede k formaci větších agregátů, neuronálních dysfunkcí a neurodegeneraci (Lee, a kol., 2005, Olanow a Brundin, 2013). Studie na myších demonstrovaly, že samotná intracerebrální inokulace pozměněným α-synukleinem může indukovat Lewimu podobnou patologii u buněk, které se mohou šířit z postižených regionů do nepostižených a tak indikovat neurodegeneraci s poruchou pohybu u obou transgenních i normálních myší. Dále inokulované deriváty z mozku postarších α-synukleinu nadbytečně exprimujících transgenních myší ukázaly, že dojde ke zvýšení rychlosti procesu onemocnění po injekci do mladých mozků 49

50 mladých transgenních zvířat (Luk, a kol., 2012). Tyto poznatky podporují hypotézu, že α-synuklein je prionu-podobný protein a může převzít samošířící změnu konformace, která způsobuje neurodegeneraci. Olanow a kol. navrhují, že tento mechanismus hraje důležitou roli ve vývoji onemocnění PD a poskytují tak nový pohled na neuroprotektivní terapie (Olanow a Brundin, 2013) Huntigtonova choroba (HD) Huntingtonova choroba (HD) je autozomální dominantní neurodegenerativní onemocnění charakterizované choreou, rigiditou a progresivní demencí. V současnosti není dostupný žádný léčebný proces tohoto devastujícího onemocnění a smrt nastává po letech po objevení se prvních příznaků. Mutace, která způsobuje HD, je známá jako abnormální expanse CAG repeticí v genu IT15 proteinu huntingtinu, který je velmi citlivým a specifickým markerem HD (Arrasate a Finkbeiner, 2012, Kremer, a kol., 1994). Protein huntingtin (Htt) má abnormální glutaminové repetice (polyq). Normální gen obsahuje 6 34 CAG, ale u osob nesoucí gen s neobyčejnými 40 repeticemi se nevyhnutelně rozvine HD. Věk počátku onemocnění koreluje nevratně s počtem CAG repetic. Zajímavé je, že expanze polyq repetic u jiných proteinů vede k odlišným neurodegenerativním onemocněním, rovněž ve stylu v závislosti na délce polyq. Další polyq závislé choroby zahrnují spinocerebrární ataxii (SCA1, SCA2, SCA3, SCA7), spinobulbarní muscularní atrofii (SBMA) a dentatorubropalidoluysiání atrofii (DRPLA) (Moore, a kol., 2001, Orr a Zoghbi, 2007). Nicméně byla popsána řada příkladů HD bez přítomnosti expanze huntingtinu (CAG)n, která ukazuje na mutace v dalších genech, které navozují HD podobné onemocnění (Andrew, a kol., 1994, Arrasate a Finkbeiner, 2012, Moore, a kol., 2001). Identifikace genů zodpovědných za tuto fenokopii mohou významně zlepšit spolehlivost genetických screeningů HSD a mohou poskytnout další pohled do neurodegenerativních onemocnění Moore a kol. prozkoumali rodokmen fenokopií HD vztažených k chromozomu 20p12 u mutace u genu prionového proteinu PRNP. Toto odhalilo, že postižení jedinci jsou heterozygoti na 192. nukleotidu uvnitř PrP kódujícího regionu, který kóduje rozšířený PrP s 8 extra oktapeptidovými repeticemi. To poukazuje na to, že fenokopie HD je familiárním prionovým onemocněním a kde opakující expanze mutací u PrP může vyprovokovat HD genokopii. Opakující se PrP expanze jsou dobře 50

51 charakterizované a navozují časný počátek onemocnění pomalého progresivního atypického prionového onemocnění s autosomálním dominantním znakem dědičnosti a pozoruhodným rozptylem klinických znaků, z nichž se celá řada překrývá s těmi u HD. Toto pozorování pozvedlo možnost brát v úvahu screening mutací PrP u individuálních HD podobným onemocněním, u kterých chybí expanze repetice CAG charakteristická pro HD (Moore, a kol., 2001). 51

52 3 Elektrochemické techniky pro detekci proteinů Pro vysoce citlivou, rychlou a selektivní detekci anorganických i organických látek ve složité biologické matrici je možné použít elektrochemické a elektroanalytické metody (Harris, 2003, Heyrovsky a Kuta, 1962, Klouda, 2003). Podstatou elektrochemických metod je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci. Objektem zkoumání je elektrochemický článek soustava, v níž je analyzovaný roztok v kontaktu s elektrodami. Elektrody zprostředkují jeho spojení s měřicím přístrojem, který sleduje některé z elektrických veličin (proud I, potenciál E, vodivost G, elektrický náboj Q, kapacitu C, aj.) (Garaj, a kol., 1977, Harris, 2003, Heyrovsky a Kuta, 1962, Markusova, 2000). 3.1 Voltametrie a polarografie Voltametrie a polarografie jsou elektrochemické metody založené na sledování intenzity proudu na velikosti proměnlivého vloženého napětí vkládaného mezi pracovní (polarizovatelnou) a referentní (nepolarizovatelnou) elektrodu dvouelektrodové zapojení. Z důvodu eliminace rušivých vlivů plynoucích z dvouelektrodového zapojení (např. proudového zatížení referentní elektrody) se v dnešní době používá kromě pracovní a referentní i elektroda pomocná tříelektrodové zapojení. Na pracovní elektrodě probíhá elektrodový proces, který sledujeme. Potenciál pracovní elektrody je kontrolovaný vůči elektrodě referentní s konstantním potenciálem. Vlastní referentní elektroda je od měřeného roztoku oddělena solným můstkem se zatavenou hustou skleněnou fritou. Proud protéká elektrodami pomocnou a pracovní. Metody, kde se stále využívá rtuťové kapkové elektrody, se nazývají polarografické (Heyrovsky a Kuta, 1962, Klouda, 2003, Markusova, 2000). Roztokem neprochází proud, pokud zkoumaný vzorek neobsahuje elektroaktivní látku, tzv. depolarizátor, který se v daném potenciálovém rozsahu oxiduje nebo redukuje. Přítomnost depolarizátoru se při určitém potenciálu projeví zvýšením proudu. Elektrodové děje (oxidace anebo redukce) způsobují změny jen ve velmi těsné blízkosti povrchu polarizovatelné elektrody. Samotný elektrodový proces zahrnuje děje, které jsou spojeny s transportem elektroaktivní látky (analytu) k elektrodě, vlastním elektrodovým dějem a vylučováním produktu na elektrodě, případně jeho transportem od elektrody (Garaj, a kol., 1977, Heyrovsky a Kuta, 1962, Sommer, a kol., 2000). Transport elektroaktivní látky je k elektrodě zprostředkován třemi pochody: 52

53 Difúzí, která je řízena koncentračním spádem v těsné blízkosti elektrody. Koncentrační spád je vyvolán úbytkem elektroaktivní látky u povrchu elektrody způsobeným jejím vylučováním na elektrodě. Migrací, kterou vyvolává elektrické pole mezi elektrodami svým působením na nabité částice. Konvekcí, kterou je tok částic vyvolaný mícháním. Cílem elektrochemické detekce je zjištění koncentrace elektroaktivní látky. Z tohoto důvodu je sledována především difúze, která na ní závisí, a naopak potlačena migrace elektroaktivní látky. Přidáme-li do zkoumaného roztoku nosný (indiferentní) elektrolyt v koncentraci řádově převyšující koncentraci elektroaktivní látky, převážnou část náboje přenášejí ionty nosného elektrolytu a migrace elektroaktivní látky je zanedbatelně malá. Současně je tím významně snížen elektrický odpor roztoku. Dále je nezbytné před samotným měřením odstranit z nosného elektrolytu veškerý kyslík, protože jeho vylučování na povrchu elektrody znemožňuje detekci ostatních elektroaktivních látek přítomných v roztoku, protože se sám zúčastňuje elektrodové reakce. Odstranění kyslíku se provádí probubláváním roztoku inertním plynem (např. dusík, argon) (Heyrovsky a Kuta, 1962, Sommer, a kol., 2000, Wang, 1994b). Dosáhneli potenciál polarizované elektrody hodnoty rozkladného potenciálu elektroaktivní látky, kdy začne její vylučování, snižuje se koncentrace této látky na povrchu elektrody v důsledku elektrodové reakce. Vylučovat se může jen ta látka, která se nachází těsně u povrchu elektrody, a tam se dostane difúzí (migraci eliminuje přítomnost nosného elektrolytu), proto je procházející proud označován jako difúzní. Zvyšuje-li se dále vložené napětí, narůstá vylučování elektroaktivní látky. Tento růst nastává pouze potud, pokud se nezačne vylučovat každá částice elektroaktivní látky, která je k povrchu elektrody difúzí transportována. Tím klesne koncentrace elektroaktivní látky u povrchu elektrody na nulovou hodnotu. Zvyšování napětí již neurychluje její vylučování, protože tato látka u povrchu elektrody není přítomna. Proud dosáhl hodnoty limitního difúzního proudu a jeho velikost je určena rychlostí difúze elektroaktivní látky k povrchu elektrody. Elektroda se polarizovala koncentrační polarizací (Bard a Faulkner, 1980, Garaj, a kol., 1977, Harris, 2003, Heyrovsky a Kuta, 1962, Klouda, 2003, Markusova, 2000, Mindl, 2000, Wang, 1994b). 53

54 Proudová odezva při aplikaci pulsu se skládá ze dvou složek: kapacitní proud (I C ) je potřebný k vytvoření elektrické dvojvrstvy na rozhraní rtuť roztok. Tento proud nesouvisí s přeměnou elektroaktivní látky. U DME dochází k neustálému obnovování povrchu, a proto se musí každá kapka nabít na daný potenciál a tak vzniká kapacitní proud, který je funkcí vloženého potenciálu, velikosti povrchu kapky a povahy základního elektrolytu. Tento proud snižuje citlivost měření. difúzní proud (I D ) má faradaický charakter a je rozhodující pro stanovení koncentrace depolarizátoru (viz. Cottrellova rovnice). Jeho velikost je dána: velikostí náboje vyměňovaného mezi polarizovanou elektrodou a roztokem za jednotku času, počtem elektronů vyměňovaných v elektrodové reakci, koncentrací depolarizátoru a rychlostí jeho přenosu z roztoku na povrch elektrody. 1 1 Cottrellova rovnice: i c = n F D A c ( + ) r π D t n (počet přenesených elektronů), F (Faradayova konstanta), D (difúzní koeficient), A (plocha elektrody), c (koncentrace analytu), t (čas pulsu), R (poloměr elektrody) (Markusova, 2000) 3.2 Cyklická voltametrie Při této metodě se po lineárním potenciálovém pulsu mění potenciál pracovní elektrody E λ na E i. Ve chvíli kdy je dosaženo potenciálu E i změní se směr polarizace pracovní elektrody a potenciál se vrací zpět k hodnotě E λ. Tvar proudové odezvy při cyklické voltamterii je zobrazen na Obr. 4. Při poklesu potenciálu se od hodnoty E i objeví pík odpovídající opačné elektrodové přeměně. Pokud je systém reverzibilní tak pro potenciály píků před a po obratu směru polarizace platí, že rozdíl těchto hodnot musí být menší než 57/z (Markusova, 2000). Pro reverzibilní elektrodovou reakci vytvořili Randles a Ševčík rovnici popisující tento proces. Proudové odezvy obou píků se v případě reverzibilních dějů rovnají, pro ireverzibilní děje je tento poměr složitější (Garaj, a kol., 1977, Heyrovsky a Kuta, 1962, Wang, 1994a). 54

55 Obr. 4: Cyklický voltampérogram převzato (Garaj, a kol., 1977, Markusova, 2000). π F Randles-Ševčíkova rovnice: = A D v c π X ( σt) i c R T n (počet přenesených elektronů), F (Faradayova konstanta), R (univerzální plynová konstanta), T (teplota), A (plocha elektrody), D (difúzní koeficient), c (koncentrace analytu), v (rychlost posunu potenciálu), π X ( σt) (bezrozměrná proudová funkce) (Markusova, 2000) 3.3 Diferenční pulzní polarografie a voltametrie Při diferenční pulzní polarografii (DPP) a voltametrii (DPV) jsou na lineární potenciálovou rampu aplikovány pulsy s konstantní amplitudou. Měřený signál odpovídá rozdílu proudů ( I), které jsou měřeny v krátkých intervalech, a to před začátkem napěťového pulsu a těsně před koncem napěťového pulsu. U DPP má závislost proudu na napětí tvar píku (Obr. 5). Při DME je doba kapky seřízená na určitý čas kratší než přirozená doba kapky. Délka doby kapky se užívá obvykle 2 až 3 s. Puls je vložen na kapku ve stejnou dobu jejího trvání. 3.4 Brdičkova reakce Metodu pro polarografické stanovení proteinů obsahujících SH skupiny na rtuťové elektrodě publikoval Brdička již v roce 1933 (Brdicka, 1933) a dále ji vyvíjeli Paleček a kol (Palecek, 1971). Jedná se o katalytické reakce proteinů v Brdičkově soluci, která se sestává z amoniakálního pufru (NH 4 OH + NH 4 Cl) a komplexu [Co(NH 3 ) 6 ]Cl 3 (Brdicka, 1936, Brdicka, a kol., 1965). Brdičkova metoda byla původně navržena pro analýzu sirných látek, jako jsou organické sloučeniny (2-merkaptopropionová kyselina,

56 2-diethylaminoethanthiol hydrochlorid), aminokyseliny (cystein, cystin) a proteiny (nejčastěji albuminy) (Kolthoff, a kol., 1975a, Kolthoff, a kol., 1975b). Možnosti stanovení MT prostřednictvím Brdičkových proudů publikoval Olafson (Olafson a Olsson, 1991). Obr. 5: Diferenční pulzní voltametrie/polarografie - Na elektrodu je přiváděn lineárně rostoucí potenciál. Na konci doby časového kroku je přiveden na elektrodu potenciálový puls s konstantní amplitudou. Proud je měřen před vložením potenciálového pulsu a před koncem tohoto pulsu. Převzato z (Markusova, 2000). V prostředí Brdičkovy soluce stanovované bílkoviny a peptidy způsobují potlačení proudového maxima komplexu Co(II) (díky povrchové aktivitě stanovovaných bílkovin nebo peptidů) a vznik jedné nebo dvou polarografických vln (nebo voltametrických píků) proteinu v oblasti potenciálů 1,2 až 1,5 V. Bylo prokázáno, že tuto reakci způsobují sulfidické skupiny (proteinů, peptidů i jednodušších látek) ve spojení s komplexy iontů kobaltu (Brdicka, a kol., 1965). Jak popisuje reakce č. 1, komplex [Co(H 2 O) 6 ] 2+ preferuje vazbu s SH skupinou. Za první katalytický signál je odpovědná redukce komplexu R(SH) 2 s Co(II) (RS 2 Co) a probíhá kolem E p 1,35 V. Výška prvního katalytického signálu odpovídá za koncentraci MT v analytu. [Co(H 2 O) 6 ] 2+ + R(SH) 2 RS 2 Co + 2 H + a RS 2 Co + 2 e Co 0 + R(S ) 2 (1) Mechanismus reakce je založen na katalytickém vylučování vodíku na rtuťové elektrodě v roztoku obsahující proteiny s -SH skupinou, amonný pufr a komplexu kobaltu (Co(NH 3 ) 6 Cl 3 ), známý jako Brdičkova soluce (Sobrova, a kol., 2012c). 56

57 Mechanismus elektrodového procesu Brdičkovy reakce není dodnes detailně znám, předpokládá se, že v katalytickém procesu hraje významnou roli komplex Co(II) s proteinem, peptidem nebo bazickou sloučeninou (Sobrova, a kol., 2012c). Interakce mezi kobaltnatým iontem a proteinem způsobuje pokles píku kobaltu a vznik dvou nových voltametrických píků při potenciálu od -1,2 do -1,5 V (Obr. 6A). Redukce komplexu R(SH) 2 a Co(II) při potenciálu od -1,2 V do -1,35 V odpovídají prvnímu katalytickému signálu (RS 2 Co). Další dva signály Cat1 a Cat2 odpovídají redukci vodíku na rtuťové elektrodě a mohou být použity pro kvantifikaci, protože jejich výška je přímo úměrná koncentraci. Signál nazvaný Co1 se může příležitostně vzniknout z redukce [Co(H 2 O) 6 ] 2+ (Sobrova, a kol., 2012c). Reakční schéma MT na rtuťové elektrodě v Brdičkově soluci je ilustrováno na Obr. 6. Obr. 6: Brdičkova reakce. A) Pravděpodobné schéma sekvence elektrochemických reakcí na rtuťové elektrodě. B) typický voltamogram (Sobrova, a kol., 2012c). Brdičkova reakce byla použita ke studiu fyziologických koncentrací MT u celé řady organizmů (Bebianno a Machado, 1997). Široké uplatnění nalezla Brdičkova reakce pro stanovení MT u řady mořských a sladkovodních živočichů (Olafson, 1988, Olafson a Olsson, 1991). Za poznámku bezesporu také stojí možnost využití Brdičkou navrženého postupu jako diagnostické metody v klinické medicíně a farmakologii (Brezina a Zuman, 1952, Brezina a Zuman, 1958) (Sobrova, a kol., 2012c). 3.5 Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza, H-pík Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza (chronopotentiometric stripping analysis, CPSA) (Andersen, 1997, Garai, a kol., 1992, Honeychurch a Ridd, 1995) byla vyvinuta před více než dvaceti lety pro stanovení iontů kovů v roztocích za pomoci 57

58 rtuťové filmové elektrody (Estela, a kol., 1995). CPSA vznikla kombinací klasické analytické potenciometrie a katodického rozpouštění kovů v materiálu pracovní elektrody (Bixler a Stafford, 1968). Při CPSA se zaznamenává potenciál pracovní elektrody jako funkce času v závislosti na potenciálu po derivaci obvykle dt/de křivka (2). de dt 1 = f (E (2) Elektrochemický děj na elektrodě přitom probíhá díky oxidaci (případně redukci) analytu chemickým činidlem přítomným v roztoku (kyslík, ionty rtuťnaté, atd.) (Jagner, 1982, Jagner a Aren, 1978, Jagner a Graneli, 1976). CPSA poskytovala od počátku oproti voltametrickým metodám některé výhody, zejména při stanovení stopových množství kovů anodickým rozpouštěním. Hlavní výhodou je, že jedním z výstupních signálů je čas, veličina měřitelná přesněji než proud. Další výhody, např. možnost měření bez odstranění kyslíku ze vzorku, jsou využívány jen při některých způsobech užití této metody. Při aplikaci negativních proudů (při CPSA) přítomnost kyslíku ve vzorku za určitých podmínek dokonce zesiluje signál poskytovaný redukcí analytu (Honeychurch a Ridd, 1995). Adsorpce analytu na elektrodě byla využita např. v pracích týkajících se CPSA sloučenin obsahujících adenin a jeho deriváty. Pro studium biopolymerů je CPSA využívána až v posledních několika letech. K analýze peptidů a proteinů na rtuťové elektrodě využil obou technik Honeychurch (Honeychurch a Ridd, 1995). Jeho práce se týkaly jak možnosti stanovení peptidů, proteinů nebo jejich složek (cystein, insulin, BSA apod.), tak i studia mechanismu přenosu náboje v těchto látkách. Nukleové kyseliny byly chronopotenciometricky stanoveny poprvé na uhlíkových elektrodách v roce 1995 (Cai, a kol., 1996). Uhlíkovou pastovou elektrodu modifikovanou DNA v kombinaci s CPSA použil Wang mimo jiné k hybridizačním experimentům a k detekci mnoha látek interagujících s DNA (aromatické aminy, hydraziny, daunomycin) (Wang, a kol., 1996a, Wang, a kol., 1996b, Wang, a kol., 1996c, Wang, a kol., 1998). Nověji bylo CPSA využito pro ultrasenzitivní stanovení thiolových sloučenin, především metalothioneinu (Kizek, a kol., 2001b, Strouhal, a kol., 2003, Trnkova, a kol., 2002). Prenátriová (někdy také presodiová) vlna je katodická odezva proteinů zaznamenaná na rtuťové elektrodě při negativních potenciálech předcházejících redukci sodných iontů 58

59 základního elektrolytu. Typ tohoto signálu byl poprvé pozorován Heyrovským a Babičkou (Heyrovsky a Babicka, 1930). Měření bílkovin v přítomnosti amonných iontů ukázalo, že katodické proudy odpovídající za prenátriovou vlnu souvisí s vylučováním vodíku. Celý elektrodový proces je katalyzován proteiny a bylo navrženo, že by tento signál mohl sloužit k jejich kvantitativní analýze. Později se také ukázalo, že původně použitý chlorid sodný nebo amonný pufr, který se mimo jiné zúčastňuje protonizace elektrodového procesu, může být zaměněn za jiný základní elektrolyt s podobnou aciditou. Prenátriovou vlnu lze pozorovat přibližně o 100 až 250 mv pozitivněji od potenciálu vylučování základního elektrolytu. Za katalytickou reakci jsou pravděpodobně odpovědné SH a NH 2 skupiny proteinu. Původní pokusy byly prováděny s proteiny krevního séra a později i s mnoha dalšími látkami jako jsou alkaloidy, pyrimidiny (Heyrovsky a Kùta, 1962) a jiné. Prenátriové vlny bylo Tomschikem a spolupracovníky využito pro stanovení vazopresinu a angiotenzinu (Tomschik, 1995). K měření byla použita derivační chronopotenciometrie s konstantním proudem (Chronopotentiometric Stripping Analysis CPSA). Chronopotenciometrický signál, ekvivalentní polarografické prenátriové vlně byl autory pracovně označen jako pík H (Tomschik, a kol., 1998). Píku H bylo použito pro stanovení MT izolovaného z králičích jater v prostředí borátového pufru (ph 8), který je pravděpodobně protonizován podle reakce (3) (Trnkova, a kol., 2002): MT + H 0 H + B(OH) 3 MT H + + B(OH) 4 Redukce je iniciována při 0 V a ukončena při potenciálu 1,9 V (Obr. 7). (3) Obr. 7: Elektrochemický signál katalytického vylučování vodíku ve velmi negativních potenciálech (pík H). 59

60 Metodou CPSA v kombinaci s adsorptivní přenosovou rozpouštěcí technikou (Adsorptive Transfer Stripping Technique AdTS) je možné detekovat až femtomolární množství MT ve velmi malých (5 µl) objemech vzorku (Kizek, a kol., 2001b). Dále bylo zjištěno, že jak výška, tak potenciál píku H je závislý na ph základního elektrolytu, což má pravděpodobně souvislost s izoelektrickou pohyblivostí danou pi proteinu, a že katalytický proces MT je značně ovlivněn koncentrací kyslíku v základním elektrolytu (Trnkova, a kol., 2002). Ukázalo se, že nepřítomnost kyslíku dramaticky snižuje výšku píku H a naopak přítomnost kyslíku je pro katalytický proces příznivá (Trnkova, a kol., 2002). Metoda AdTS CPSA byla použita pro studium produkce metalothioneinu u buněk kvasinky Yarrowia lipolytica, které byly vystaveny různým koncentracím iontů těžkých kovů (Zn, Co, Ni a Cd). Předběžné výsledky ukazují, že AdTS CPSA by mohla nalézt uplatnění i pro stanovení fytochelatinů (Vacek, a kol., 2002). Elektrodové procesy, které odpovídají za pík H, nebyly doposud detailně objasněny i přesto, že vylučování vodíku je jedním z nejdéle studovaných elektrochemických dějů. Proces vylučování vodíku na rtuťové elektrodě je charakteristický a je popsán Heyrovského reakcí: H(ads) + H 3 O + + e H 2 + H 2 O (4) Dále Tafelovou empirickou rovnicí (2 H(ads) H 2 ) a rovnicí adsorbovaného vodíkového atomu podle Volmera (H 3 O + + e H(ads) + H 2 O) (Dvorak, a kol., 1975). Vzhledem ke složitosti katalytického procesu, který zasahuje do vylučování vodíku je kromě katalyzujícího proteinu velmi důležitá koncentrace, složení, ph a teplota roztoku základního elektrolytu. Nové poznatky dosažené v derivační chronopotenciometrií s konstantním proudem naznačují možnost jejího širšího využití, s tím že se jedná o nejsenzitivnější elektrochemickou metodu pro stanovení proteinů (Kizek, a kol., 2001b) 3.6 Adsorptivní přenosová technika Ve skutečnosti tato technika spojuje dva procesy: i) akumulaci a ii) přenos. Analytický důvod akumulace byl objeven před více než padesáti lety při využití u oscilografické polarografie (Hynek, a kol., 2011, Kalvoda, 2000) a tato technika byla nazvána adsorptivní technikou (adsorptive stripping techniques; AdS). Visící rtuťová kapková elektroda byla polarizována se střídavým napětím tak dlouho, dokud kapka neodkápla. V tomto klidovém období byla elektroda držena při otevřeném 60

61 potenciálovém obvodu, při kterém dochází k adsorpci látek s adsorptivními vlastnostmi na povrch pracovní elektrody (Kalvoda, 1956, Kalvoda a Macku, 1956). Historie vývoje této metody byla popsána Kalvodou a kol. (Kalvoda, 2000). I přesto, že tato technika rapidně zvyšuje citlivost elektrochemického měření, klesají limity detekce cílových biomolekul vlivem vzniku různých interferencí. Z toho důvodu musí být kladen velký důraz na přípravu reálného vzorku, v případě, že bude použita tato technika. Pro zabránění interferencí publikoval pan profesor Paleček a jeho kolegové práci, kde výrazně zlepšuje AdS o takzvaný krok přenosu (Palecek a Postbieglova, 1986). Hlavní zlepšení je založeno na přenosu elektrody z roztoku obsahující vzorek po skončení jeho akumulace a přenosu do čistého elektrolytu, kde už nejsou přítomny žádné interference. Schéma adsorptivní přenosové techniky (AdTS) může být shrnuto v několika následných krocích: i) obnovení povrchu pracovní elektrody, ii) absorbování cílové molekuly na povrch pracovní elektrody, iii) opláchnutí pracovní elektrody pro odstranění nenavázaných molekul a iv) přenos omyté elektrody do měřícího elektrolytu a měření adsorbované cílové molekuly (Obr. 8). Obr. 8: Schéma adsorptivní přenosové techniky. (1) aplikace vzorku o objemu 5 µl na podložní sklíčko; (2) ponoření pracovní elektrody do vzorku a následná akumulace; (3) opláchnutí elektrody omytí nenavázaných molekul; (4) ponoření do nádobky s elektrolytem a následné měření. W pracovní elektroda, A pomocná elektroda, R referenční elektroda. 61

62 IV. MATERIÁL A METODY 4 Chemikálie Prionový protein β sheet breaker peptide fragment (Asp-Ala-Pro-Ala-Ala-Pro-Ala- Gly-Pro-Ala-Val-Pro-Val; M = 1597,9 g/mol) byl zakoupen od firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA) a rozpuštěn 8,77 M trifluoroctovou kyselinou. Chlorid kademnatý, telurid sodný, merkaptopropionová kyselina (MPA) a další chemikálie byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Zásobní roztok 50 µg/ml Cd 2+ a 500 µg/ml MPA byly připravovány denně a následně ředěny dle potřebné koncentrace. Jako základní elektrolyt byl použit acetátový pufr o ph rozpětí od 3,8 do 5,6, který byl připraven smícháním 0,2 M kyseliny octové a 0,2 M octanu sodného, fosfátový pufr v ph rozpětí od 5,59 od 8,04 byl přípraven smícháním 0,2 M NaH 2 PO 4 a 0,2 M Na 2 HPO 4 a borátový pufr v ph rozpětí od 7,09 do 9,11 byl připraven smícháním 0.2 M Na 2 B 4 O 7 a 0.2 M H 3 BO 3. Hodnoty ph byly měřeny za použití WTW inolab Level 3 (Weilheim, Německo), ovládané počítačovým programem (MultiLab Pilot; Weilheim, Německo). ph elektroda (SenTix- H, ph 0 14/3M KCl) byla pravidelně kalibrována pomocí kalibračních roztoků (Weilheim, Německo). 5 Metody 5.1 Mikrovlnná příprava kvantových teček Chlorid kademnatý (CdCl 2, 0,04 M, 4 ml) byl zředěn ultračistou vodou na 42 ml a následně byly za stálého míchání přidány dihydrát citrate trisodného (100 mg), Na 2 TeO 3 (0,01 M, 4 ml), MPA (119 mg) a NaBH 4 (50 mg). Molární poměr látek byl Cd 2+/ MPA/Te was 1:7:0.25. Deset mililitrů takto vzniklého roztoku bylo pipetováno do Teflonové nádobky. CdTe kvantové tečky byly připraveny při teplotě 95 C po dobu 30 minut za působení mikrovlnného záření (400 W, Multiwave3000, Anton-Paar GmbH, Rakousko). Poté byl roztok zchlazen na 50 C získané CdTe kvantové tečky byly purifikovány pomocí kondenzace isopropanolem, kdy byly získané tečky smíchány v poměru 1:2 s daným organickým rozpouštědlem a následně centrifugovány po dobu 10 minut při rpm (Eppendorf centrifuge 5417R), Superneatant obsahující čisté kvantové tečky byl zředěn fosfátovým pufrem o ph 8,5. 62

63 5.2 Elektrochemická analýza Elektrochemické analýzy byly prováděny se 747 VA Stand zařízením spojeným se 746 VA Trace analyzer a 695 Autosampler (Metrohm, Švýcarsko) v klasickém tříelektrodovém zapojení. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm 2 ; referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Byl použit program GPES 4.9 od EcoChemie pro zpracování naměřených dat Adsorptivní přenosová technika Princip AdTS je založen na silné adsorpci studovaného analytu na povrch elektrody při otevřeném elektrodovém obvodu. Nadbytek analytu byl opláchnut z povrchu pracovní elektrody. Adsorbovaný analyt byl detekován v přítomnosti indiferentního elektrolytu. Množství studovaného vzorku bylo 5 µl u všech vzorků prionů u všech metod. Doba adsorbování byla testována v rozpětí od 10 do 120 s Cyklická voltametrie Prionový protein byl studován za pomocí cyklické voltametrie. Množství adsorbovaného vzorku byl 5 µl. Doba akumulace byla optimalizována. Množství elektrolytu v elektrochemické cele byly 2 ml. Parametry CV byly následující: počáteční potenciál 0 V, koncový potenciál -1,9 V, potenciálový krok 2,44 mv, rychlost skenu od 20 do 640 mv/s. Všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě (22-24 C). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999% po dobu 120 s. Kvantové tečky byly analyzovány pomocí CV. Množství adsorbovaného vzorku byl 5 µl. Množství elektrolytu v elektrochemické cele byly 2 ml. Parametry CV byly následující: počáteční potenciál 0 V, koncový potenciál -1.9 V, potenciál obratu -1,9 V potenciálový krok 2.44 mv, rychlost skenu od 160 mv/s. Všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě (22-24 C). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999% po dobu 120 s Diferenční pulzní voltametrie Prionový protein byl měřen za pomocí AdTS DPV. Byly testovány následující základní elektrolyty: 0,5 M fosfátový pufr v ph rozpětí od 5,59 od 8,04, borátový pufr v ph rozpětí od 7,09 do 9,11 a acetátový pufr v ph rozpětí od 3,8 do 5,6. Parametry DPV byly následující: počáteční potenciál 0,2 V, koncový potenciál 0,8 V, modulační čas 63

64 0,057 s, časový interval 0.2 s, potenciálový krok 1,05 mv/s, modulační amplituda 250 mv, E ads = 0 V. Všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě (22 24 C). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999% po dobu 120 s. Množství kvantových teček bylo určováno pomocí diferenční pulzní voltametrie. Parametry DPV byly následující: počáteční potenciál 1,5 V, koncový potenciál 0 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0.2 s, potenciálový krok 1,05 mv/s, modulační amplituda 250 mv, E ads = 0 V. Všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě (22 24 C). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999% po dobu 120 s Diferenční pulzní voltametrie Brdičkova reakce Základní elektrolyt (1 mmol.dm -3 Co(NH 3 ) 6 Cl 3 a 1 mm amonný pufr; NH 3 (aq) + NH 4 Cl (Sigma Aldrich, ACS), ph = 9,6) byl po každých 5 analýzách automaticky vyměněn. Parametry Brdičkovy reakce byly následující: čas akumulace 240 s, počáteční potenciál 0,6 V, konečný potenciál 1,6 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 1 mv/s, modulační amplituda 250 mv, E ads = 0 V, teplota 4 C udržovaná pomocí termostatu JULABO F12/ED (Labortechnik GmbH, Německo). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999% po dobu 120 s Pík H Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza byla použita pro stanovení prionových proteinů. Byla zaznamenávána převrácená hodnota derivace času a potenciálu jako funkce potenciálu. Parametry CPSA byly následující: počáteční potenciál -1.9 V, I str 1 µa, max. doba měření 600 s, teplota 20 C, základní fosfátový elektrolyt (ph 7,38). 5.3 In vivo zobrazování In vivo zobrazování bylo provedeno pomocí in vivo systému Xtreme by Carestream, USA. Tento přístroj je vybaven 400 W xenononovým zdrojem světla a 28 excitační filtry ( nm). Emitované světlo je zachyceno 4 MP CCD kamerou. V tomto experimentu bylo použito 410 nm jako excitační vlnová délka a emise byla měřena při 535 nm. Doba expozice byla 5 sekund. Ostatní parametry byly stanoveny takto: Bin - 2 2, zorné pole 12 cm, fstop

65 X-ray snímek byl pořízen jako obrázek na pozadí pomocí následujícího nastavení: doba expozice - 1,2 s, filtr - 0,2 mm, bin 1x1, výkon 45 KVP. Mezi každým měřením byl zásobník s kuřecím stehnem udržován při teplotě 4 C. 5.4 Deskriptivní statistika a stanovení detekčního limitu Data byly procesovány za použití MICROSOFT EXCEL (USA). Výslekdy jsoiu vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka (S.D.) pokud není uvedeno jinak. Detekční linit byl stanoven podle Longa a Winefordnera (Long a Winefordner, 1983), přičemž N bylo vyjádřeo jako směrodatná odchylka šumu. 65

66 V. PRAKTICKÁ ČÁST Analytické metody pro stanovení prionových proteinů ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; ADAM, V.; KIZEK, R. Capillary electromigration based techniques in diagnostics of prion protein caused diseases. Electrophoresis, 2012, roč. 33. č. 24, s ISSN IF Elektrochemické stanovení prionových proteinů ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; HYNEK, D.; ADAM, V.; HUBÁLEK, J.; KIZEK, R. Electrochemical behaviour of native and denatured β-sheet breaker prion protein. Int. J. Electrochem. Sci., 2012, roč. 7. č. 2, s ISSN IF In vivo detekce prionových proteinů ŠOBROVÁ, P.; BLAŽKOVÁ, I.; CHOMOUCKÁ, J.; DRBOHLAVOVÁ, J.; VACULOVIČOVÁ, M.; KOPEL, P.; HUBÁLEK, J.; KIZEK, R.; ADAM, V. Quantum Dots and Prion Proteins, Is This New Challenge for Neurodegenerative Disease Imaging? Prion, 2013, roč. 7. č. 5. s ISSN , IF 2,850 ŠOBROVÁ, P.; VACULOVIČOVÁ, M.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Voltammetry as a tool for characterization of CdTe quantum dots. Int. J. Mol. Sci., 2013, č. 14, s , ISSN IF ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; PEKAŘÍK, V.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Femtogram electrochemical sensing of prion proteins using quantum dots. Int. J. Electrochem. Sci., 2013, roč. 8 s ISSN IF

67 6 Analytické metody pro stanovení prionových proteinů 6.1 Diagnostika onemocnění Diagnostika infekčních onemocnění je intenzivně studovanou a rozvíjenou oblastí. Základní metody využívají buď imunitních reakcí, nebo amplifikaci nukleové kyseliny pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) (Parchi, a kol., 2011). Nicméně, u TSE má infekční agens stejnou sekvenci jako přirozeně se vyskytující prionové proteiny a není tedy pozorována žádná reakce imunitní systému, která se běžně objevuje při přítomnosti jiných druhý infekčních agens. Navíc, protein neobsahuje žádnou nukleovou kyselinu, která by mohla být amplifikována. Obtížnost diagnostiky založené na detekci PrP Sc rovněž stoupá, že pro odhalení nemoci je potřeba velké množství patologické formy PrP Sc v mozku, které bývá až v pozdních stádiích onemocnění. Inkubační doba u některých lidských prionových onemocnění může být až 40 let (Huzarewich, a kol., 2010), přičemž inkubační doba první lidské TSE "Kuru" popsané prof. Gajdůškem v 50. letech 20. století byla odhadována v rozmezí 21 až 40 roků (Goldfarb, a kol., 2004, Liberski, 2009). Diagnostika prionových onemocnění proto představuje výzvu jak pro analytické chemiky, tak i molekulární biology (Soto, 2004). Infekční studie ukázaly, že prionové proteiny se vyskytují v malém množství v periferních tkáních, jako jsou lymfoidní orgány a krev, kde se vyskytují již v raném pre-symptomatickém období. U zvířat se pro stanovení používají vzorky mozkové tkáně odebrané post-mortem. Tyto vzorky jsou ihned po odebrání zamraženy a převezeny pro další analýzu na specializovaná pracoviště. V nedávné době byly představeny nové testy pro rutinní stanovení, které umožňují rychlé prověřování potencionálně infekčních vzorků. V současné době bylo schváleno Evropskou komisí pět komerčních testů pro detekci BSE (Prionics-Check Western test, Enfer testy, CEA / BioRad test, Prionics-Check LIA test, a na konformaci závislý imunologický test). Všechny tyto testy jsou založeny na imunodetekci patologické isoformy PrP Sc, čtyři z nich využívají proteolýzu proteinázou K, která tak od sebe odlišuje PrP c a pozměněný PrP Sc (Soto, 2004). Klíčovým krokem diagnostiky prionových chorob bývá použití proteinázy K, která rozštěpí fyziologické proteiny a umožní následnou imunochemickou detekci proteáza-rezistentního prionového proteinu. Je třeba poznamenat, že žádný z těchto testů není schopen identifikovat nakažené zvíře v pre-symptomatické fázi, a tím pádem není zcela vyloučeno riziko vstupu infekčních agens do potravinového řetězce. 67

68 V případě lidských onemocnění je diagnostika téměř vždy založena na klinických testech. Podle projevených příznaků a jejich rozsahu se pak usuzuje na možné onemocnění (Zsolnai, a kol., 2003). Z klinického hlediska je ale nesporně stále nejvíce citlivá a specifická metoda diagnostiky TSE za pomocí vyvolání infekce u laboratorních zvířat. Zvířeti se injektuje homogenát připravený z podezřelé tkáně a následně se sledují klinické příznaky. Onemocnění je pak potvrzeno použitím klasických imunochemických metod (histologie, imunohistochemicky, Western blot). Tyto metody jsou velmi pracné a časově náročné, aby byly využívány pro rutinní screening (Grassi, a kol., 2008). K dispozici jsou také komerční testy (TeSeETM CJD ELISA a TeSeETM) pro stanovení PrP Sc z mozku a lymfoidní tkáně pacientů postiženými TSE. Oba testy byly porovnány skupinou Ugnon-Cafe a kol. (Ugnon-Cafe, a kol., 2011) za použití vzorků od 54 vcjd postižených pacientů a 51 kontrol. Autoři dospěli k závěru, že tyto testy byly rychlé a robustní pro rutinní in vitro diagnostiku a charakterizaci lidské TSE. CJD může být také diagnostikována během pacientova života detekcí PrP Sc v mandlích. Pro ověření možnosti stanovení vcjd z mandlí byla provedena pilotní studie na mandlích zemřelých dárců postižených pacientů anebo kontrol. Mandle byly odebrány bezprostředně post-mortem, aby bylo zabráněno rigor mortis a tím znehodnocení biologického materiálu, kde by následně nebylo možné stanovit vcjd. Mandle byly vhodné pro rutinní analýzy pro zjištění přítomnosti prionového proteinu spojeného s vcjd u zemřelých dárců. Patrové a jazykové mandle tkáně je možno získat v párech, proto bylo možné ve většině případů použít dle potřeby kontrolní test (Warwick, a kol., 2012), avšak technologie není prozatím plošně využívána. 6.2 Imunologické metody Western blot Obecně platí, že většina analytických diagnostických metod je založená na proteolytickém štěpení endogenního PrP C oproti PrP Sc (Obr. 9). Zatímco PrP C je působením proteinázy K zcela rozštěpen, PrP Sc zůstává vůči proteolytickému štěpení relativně odolný. U PrP Sc působení proteinázy K vede odštěpení různého počtu aminokyselin z N-konce. To má za následek vznik tří odlišných skupin, které odpovídají di-, mono-, a neglykosylované formě PrP při použití Western blotingu. (Brown, a kol., 1999, Safar, a kol., 1998, Wadsworth, a kol., 2001). Kvalitativní Western blot analýza ukazuje na vysoké množství prionového protein v mozečku a míše. Střední množství bylo detekováno v brzlíku, střevech, nervech, srdci a slezině. Malé množství pak bylo pozorováno v plicích, svalech, ledvinách, lymfatických 68

69 uzlinách, kůži, slinivce a v játrech (Peralta a Eyestone, 2009). Western blot ve spojení s gelovou elektroforézou je jednou z imunologických metod úspěšně použitých pro detekce PrP Sc z tkáně (Aguzzi, a kol., 2004, Nunnally, 2002). Obr. 9: Metody používané pro stanovení prionových proteinů: Kapilární elektroforéza (CE), Assay buněčných kultur, infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FT-IR), imunohistochemie, bioassay, disociačně-zvýšená lanthanidová fluorescenční imunoassay (DELFIA), slot blot, fluorescenčně korelační spektroskopie, cyklická amplifikace pozměněného proteinu (PMCA), cell blot, Western blot, na parafinu provedený tkáňový blot, průtoková mikrokapková imunoassay (FMB), histoblot, enzymová imunoadsorbční analýza (ELISA), zobrazení proudové hustoty (CDI). Jak popsal Korth a kol., jedním z dalších pokusů diagnostiky prionového proteinu je výroba PrP Sc konformačně specifických protilátek. Jeho skupině se podařilo připravit protilátku 15B3, která specificky precipituje hovězí, myší nebo lidský PrP Sc, ale ne PrP C, což naznačuje, že rozpoznává epitop, tedy míst pro navázání protilátky, společný prionovým proteinům různých druhů, ale zároveň reagující pouze na přítomnost infekční formy prionového proteinu (Korth, a kol., 1997). Díky vysoké specifitě protilátek může tento přístup dokonce eliminovat použití proteinázy. I přesto, že tyto protilátky byly úspěšně testovány, tato práce v současné době nemá žádné komerční využití. Na druhé straně metoda amplifikace pozměněného proteinu (protein misfolding cyclic amplification; PMCA) má velký potenciál, a zdá se být velmi slibným přístupem 69

70 z hlediska využití v krevních testech. Tato metoda navozuje patologické procesy, a je podobná polymerázové řetězové reakce (Obr. 10). PrP Sc se inkubuje v přítomnosti endogenního PrP C za účelem jeho konverze na PrP Sc a následně je rozptylován za použití sonikace. Množství vytvořeného PrP Sc závisí na počtu prováděných opakujících se cyklech inkubace a sonikace (Castilla, a kol., 2006, Saa, a kol., 2006, Saborio, a kol., 2001, Soto, a kol., 2005). Tyto opakující se cykly mohou amplifikovat obsah prionového proteinu obsaženého ve vzorku 4 až 40 ve dvou týdnech (Soto, a kol., 2005, Soto, a kol., 2002). K dnešnímu dni nejsou dostupné žádné testy, které by poskytovaly spolehlivé výsledky pomocí snadno dostupných vzorků u živočichů nebo lidí, jako je krev nebo moč (Grassi, a kol., 2008), i přesto, že tyto tělní tekutiny obsahují stopová množství infekčního prionového protinu. Z tohoto důvodu jsou v současnosti hledány také non-prionové biomarkery, které by přispěly ke snadnější diagnostice prionových onemocnění. Obr. 10: Mechanismus amplifikace pozměněného proteinu. Přítomnost jednoho infekčního proteinu stačí pro přeměnu buněčných proteinů na jejich infekční formu. 6.3 Elektroforetické metody Elektroforetické metody zastoupeny gelovou elektroforézou jsou běžně používány pro detekci prionových proteinů zejména v kombinaci s Western blotem. V poslední době byla rovněž využita gradientová gelová elektroforéza (TGGE) v souvislosti sledování polymorfizmu 3 kodonů 136, 154 a 171 genu prionového proteinu. Metoda TGGE byla použita pro detekci bodové mutace u těchto kodonů odpovědných za citlivost nebo rezistenci ke scrapii (Fink, a kol., 1994, Jasik a Reichert, 2003, Jasik a Reichert, 2006, Wiese, a kol., 1995). V další studii autoři použili rekombinantní prionový protein PrP jako testovaný analyt pro použití dvou dimenzionální gelové elektroforézy a ionizace laserem za přítomnosti matrice ve spojení s hmotnostním detektorem doby letu (MALDI-TOF MS) pro identifikaci heterogenního jaderného 70

71 ribonukleoproteinu A2/B1 a aldosy C jako nového interakčního partnera pro PrP (Strom, a kol., 2006). Od roku 1992, kdy byla poprvé popsána afinitní chromatografie (ACE), se tato technika stala velmi používanou citlivou technikou pro studium neokovalentních interakcí biomolekul a disociačních konstant vytvořených komplexů. Byla popsána řada interakcí využívající ACE zahrnující vazbu protein-ligand (Hoffmann a Martin, 2010), peptid-kov (Moini, 2010), protein-protein (Nguyen a Moini, 2008), protilátka-antigen (Heegaard a Kennedy, 2002) a enzym-léčivo (Shmykov, a kol., 2008). Podskupinu ACE metod tvoří kapilární elektroforéza definovaná jako metoda, kde jsou využívány protilátky, nebo látky příbuzné protilátkám jako selektivní vazebný agens pro chemickou detekci (Moser a Hage, 2008). Tyto techniky byly úspěšně aplikovány pro analýzu prionových proteinů. Další separační metodou využitelnou pro studium prionových proteinů je kapilární elektroforéza, jejíž možnosti využití shrnula Šobrová a kol. (Sobrova, a kol., 2012a). 6.4 Spektroskopické metody Z důvodu vyhnout se používání protilátek bylo pro účely diagnostiky navrženo několik spektroskopických metod, jako je multispektrální ultrafialová fluorimetrie (Rubenstein, a kol., 1998), fluorescenční korelační spektroskopie (Birkmann, a kol., 2006, Fujii, a kol., 2007), spektroskopická magnetická rezonance (Galanaud, a kol., 2010, Lodi, a kol., 2009, Murray, a kol., 2005) nebo infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) (Beekes, a kol., 2007, Lasch, a kol., 2003). Hlavní nevýhodou těchto metod jsou vysoké finanční náklady a vysoce sofistikované zařízení a s tím spojený zkušený pracovník. Byla také použita Ramanova spektroskopie s použitím zlatých 3D-super krystalických nanotrubek pro detekci prionového proteinu (Alvarez- Puebla, a kol., 2011). V neposlední řadě bylo ukázáno, že použití hmotnostní spektrometrie založené na kvantifikaci prionového proteinu u různých druhů savců je další otevírající se možností ve studiu prionových proteinů (Silva, a kol., 2011). 6.5 Využití buněčných linií Další možností pro identifikaci prionových proteinů bylo vyvinutí vysoce citlivých buněčných linií citlivých na odhalení prionové infekce pomocí buněčně založených titračních procedur, které by vedly k náhradě používání živočichů, většinou myší nebo křečků. Nicméně většina z těchto buněčných linií byly tolerantní pouze k myším 71

72 prionovým proteinům a tak neumožňovaly titraci prionových bílkovin z jiných druhů. Ve své práci Arellano-Anaya a kol. (Arellano-Anaya, a kol., 2011) prokázali, že epitelové buněčné linie RK13, tolerantní k prionovému kmenu u myši a norníka rudého, a přirozený prionový protein u ovcí a jelenovitých umožňují robustní a citlivou detekci myších a ovčích prionových proteinů. 6.6 In vitro amplifikační technologie Nové in vitro amplifikační technologie jsou založené na "real-time quaking-induced conversion (RT-QUICK)", která byla popsána pro detekci infekční formy prionového proteinu (PrP Sc ) ve snadno dostupných vzorcích, jako je mozkomíšní mok. RT-QUICK metoda může být použita i na další prionové onemocnění včetně scrapie, chronického chřadnutí jelenovitých (CWD) a bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) a je schopna kvantifikovat prionové proteiny v počáteční aktivitě v kombinaci s koncovým bodem ředění vzorků (Atarashi, a kol., 2011). Polovodičové matrice jsou použity pro zachycení a koncentrování prionových proteinů způsobující onemocnění. Spojení této metody s přímou imunodetekcí na povrchově vázaném materiálu umožnilo rozlišit ředění u exogenní vcjd prionem infikovaného mozku z ředění 10-6 normálním mozku (chemiluminiscenční signál, 1, u vcjd vs 9, u normálního mozku což dokládá citlivost u vcjd o 71,4% a specificitu 100%) (Edgeworth, a kol., 2011). 7 Elektrochemické metody Jedním ze současných směrů výzkumu je zvýšení citlivosti metod umožňující rovněž použití malého množství vzorku (Foster, 2000). Vhodnou metodou pro stanovení prionového proteinu by tak mohla být i elektrochemie. Square-wave voltametrie a diferenční pulzní voltametrie jsou metody běžně používané pro stanovení proteinů a poskytují velmi nízké limity detekce (Rezaei-Zarchi, a kol., 2007). Mezi další elektrochemické metody používané pro stanovení proteinů je Brdičkova reakce ve spojení s diferenční pulzní voltametrií. Brdičkova reakce byla úspěšně použita pro studování fyziologických koncentrací proteinů v širokém rozpětí všech organismů (Brdicka, a kol., 1965). Další elektrochemickou metodou založenou na monitorování katalytických signálů je chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza. Tato metoda v kombinaci s adsorptivní přenosovou technikou je schopna stanovit femtomolární koncentraci analytu ve velmi nízkém objemu (5 µl) (Kizek, a kol., 2001a). Voltametrické metody byly rovněž použity pro analýzu prionových proteinů (Loksztejn, a kol., 2008), nicméně jejich detailní charakterizace nebyla doposud provedena. 72

73 7.1 Cyklická voltametrie Při použití CV ve spojení s AdTS pro stanovení prionových proteinů byly pozorovány pouze oxidační signály. V oxidační části cyklických voltamogramů byly detekovány tři píky při potenciálu -0,5 V pro Pík 1, -1,2 V pro Pík 2 a -1,8 V pro Pík 3 (Obr. 11), které indikují 3 elektroaktivní zbytky v molekule prionu. Prionový fragment obsahuje ve své primární struktuře NH 2 a OH skupiny, které podléhají oxidaci. Nicméně detekce 3 píků může být spojována rovněž se strukturálními změnami tohoto proteinu, jako je jeho β-konformace. Tato metoda byla následně optimalizována s použitím různých rychlostí skenu od 20 do 640 mv/s (vložený Obr. 11A). Bylo pozorováno, že při zvyšující se rychlosti skenu narůstá výška detekovaných píků. Logaritmus výšky píků byl proložen logaritmem rychlostí skenu. Získaná závislost prozrazuje, že pík 2 s nejvíce lineární rovnicí regrese (R 2 vyšší než 0,9) je difuzně řízený proces. Další píky (pík 1 a 3) jsou blízké logaritmické závislosti, která poukazuje na adsorpčně-desorpční proces a strukturně kontrolovaný proces. Kromě toho při zvyšování rychlosti skenu docházelo k poklesu detekovaných signálů, což může být dáno faktem, že redoxní procesy probíhají pomaleji a jsou tak strukturálně závislé. Pro účely sestrojení kalibrační křivky byla zvolena rychlost skenu 160 mv/s. Jako pík vhodný pro měření závislosti výšky píku na koncentraci prionu byl použit pík 2, který jako jediný vzniká difusně řízeným procesem a je tedy vhodný pro sestrojení kalibrační křivky. Se vzrůstající koncentrací prionového proteinu byl pozorován nárůst signálu u píku 2 (Obr. 11B). Stanovená kalibrační křivka měla R 2 vyšší než 0,9 a limit detekce byl stanoven na 32 µg/ml při 3S/N (Sobrova, a kol., 2012b). 7.2 Diferenční pulzní voltametrie V této práci byla použita DPV ve spojení s AdTS pro sledování elektrochemické charakterizace prionových proteinů jako metoda citlivější ve srovnání s cyklickou voltametrií. Primárně byla tato metoda optimalizována, aby bylo možno dosáhnout co nejlepších podmínek pro stanovení prionových proteinů. Zejména byly testovány podmínky, jako je čas akumulace, složení pufru a jeho ph. Při sledování závislosti výšky píku na době akumulace bylo pozorováno, že výška píku narůstá se zvyšující se dobou akumulace (Obr. 12A). Nejvyšší pík byl stanoven při době akumulace 100 s. Delší časy akumulace poskytovaly dostatečné velké odezvy, ale kvůli formaci polyvrstev, signály mírně poklesly (vložený Obr. 12A) (Sobrova, a kol., 2012b). 73

74 Obr. 11: Cyklická voltametrie. A) Závislost rychlosti skenu na výšce píku. Výška píku se úměrně zvyšuje s klesající se rychlostí skenu. B) Závislost výšky píku na koncentraci. Se vzrůstající koncentrací vzrůstá přímo úměrně výška píku. Kalibrační křivka. Dále byly u prionových proteinů testovány závislosti výšky píků na složení pufru a jeho ph. Pro tyto účely byl použit borátový, fosfátový a acetátový pufr. Rozpětí ph bylo od 6,24 do 8,04 u borátového pufru, od 7,09 do 9,11 u fosfátového pufru a od 3,8 do 5,6 u acetátového pufru. Celkově lze říci, že nejlepší výsledky byly pozorovány u fosfátového a borátového pufru avšak fosfátový pufr poskytoval při stejné koncentraci (125 µg/ml) prionového proteinu lepší signály ve srovnání s borátovým pufrem. Nejvyšší elektrochemická odpověď byla pozorována u fosfátového pufru při ph 7,38 (Obr. 12B). I přesto, že borátový pufr rovněž poskytoval nejlepší signály při ph 7,38, nedosahoval však již hodnot u fosfátového pufru (Obr. 12C). V případě acetátové pufru byl rovněž pozorován nárůst výšky píku při zvyšujícím se ph, ale výšky píků zdaleka nedosahovaly hodnot ostatních dvou pufrů (Obr. 12D). Nejvhodnější podmínky byly stanoveny podle nejvyšších píků, které byly pozorovány okolo neutrálního ph, které jsou pro jeho stanovení nejlepší, což může být spojeno s faktem, že struktura a náboj zbytků aminokyselin u prionových proteinů je závislá na ph a fyziologických podmínkách. Dále byla měřena závislost výšky píku na koncentraci, která již probíhala při optimálních podmínkách (fosfátový pufr při ph 7,38 a čas akumulace 100 s). Daná kalibrační závislost byla lineární s rovnicí regrese y = 0,162x 0,989 a korelačním koeficientem R 2 vyšším než 0,99. Toto poukazuje na velmi dobrou lineární závislost elektrochemického signálu v závislosti na koncentraci prionového proteinu. Vzhledem k tomu, že priony jsou stále předmět zájmu mnoha vědců, představuje DPV vhodnou metodu pro jejich stanovení v reálném vzorku po řádné před-přípravě. Detekční limit prionového proteinu byl stanoven na 16 µg prionového proteinu v 1 ml (3 S/N), což 74

75 odpovídá 50 pmol v 5 µl kapce (Obr. 13A). Dobře vyvinuté signály je možno vidět na Obr. 13B (Sobrova, a kol., 2012b). Obr. 12: Diferenční pulzní voltametrie. A) Závislost výšky píku na čase akumulace. Proudová odezva se zvýšila se zvyšujícím se dobou akumulace. Nejvyšší signál byl zaznamenán při akumulaci 100 s. Závislost výšky píku na ph B) fosfátového pufru, C) borátového pufru a D) acetátového pufru. Obr. 13: Diferenční pulzní voltametrie; A) Kalibrační křivka, B) Voltamogramy jednotlivých koncentrací. Se vzrůstající koncentrací vzrostla přímo úměrně výška píku 7.3 Diferenční pulzní voltametrie Brdičkova reakce Při stanovení prionových proteinů za použití Brdičkovy reakce ve spojení s DPV AdTS byly pozorován vznik třech signálů: Co1, RS 2 Co a Cat2 při potenciálech -0,9 V, - 1,2 V a -1,5 V (Obr. 8A). Signál Cat1 nebyl pozorován, což je zřejmě příčinou, že tento signál byl spojen s elektroaktivnějším signálem RS 2 Co. Jak jasně vyplývá z výsledků, se vzrůstajícím množstvím prionů se mění charakter jednotlivých píků. S rostoucí koncentrací prionového proteinu signál Co1 klesá a posouvá se směrem k pozitivnějším 75

76 potenciálům. Signál RS 2 Co se vzrůstající koncentrací poklesne, ale pozice se nemění (vložený Obr. 14A). Další zmíněný pík Cat2, je dobře vyvinutý a separovaný pík, který přímo odpovídá koncentraci prionového proteinu. Jak již bylo publikováno, výška katalytického signálu Cat2 je přímo úměrná koncentraci proteinu ve vzorku (Adam, a kol., 2008, Brdicka, a kol., 1965, Fabrik, a kol., 2008, Petrlova, a kol., 2007). Tento signál byl následně využit pro měření kalibrační závislosti výšky píku v závislosti na koncentraci. Pro měření byla využita koncentrace prionového proteinu 16, 32, 64, 125, 250 a 500 µg/ml. Výška píku se lineárně zvyšovala s rostoucí koncentrací. Dále byla sestrojena kalibrační závislost s rovnicí regrese y = 0,2758x + 12,02 a regresním koeficientem R 2 vyšším než 0,99 (Obr. 14B). Přepočet na plochu píku, která rovněž odpovídá koncentraci proteinu ve vzorku, byla stanovena rovnice lineární regrese y = 0,0257x + 1,3988 s R 2 vyšším než 0,99 (Obr. 14C). Detekční limit DPV AdTS Brdičkovy reakce byl stanoven na 50 pmol v 5µl kapce (3 S/N) (Sobrova, a kol., 2012b). Obr. 14: Diferenční pulzní voltametrie Brdičkova reakce A) Voltamogramy různých koncentrací prionových proteinů. Se vzrůstající koncentrací se zvyšuje 76

77 katalytický signál cat2. B) Závislost výšky píků (Co1, RS 2 SH a Cat2) na koncentraci. C) Závislost plochy píků na koncentraci. 7.4 Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza Pro stanovení prionového proteinu bylo použito CPSA ve spojení s AdTS při závislosti dt/de. Prion při této metodě dává jasný, ostrý signál, takzvanou chronopotenciometrickou vlnu, při velmi negativních potenciálech (okolo -1,5 V), takzvaný pík H (vložený Obr. 15). Pro měření výšky tohoto píku nebyla využita korekce na základní hladinu. Charakteristika koncentrační závislosti prionového proteinu byla měřena za optimálních podmínek ve fosfátovém pufru při ph 7,38, době akumulace 100 s a laboratorní teplotě (Obr. 15). Tato závislost byla lineární s rovnicí regrese y = 19, ,8 a R 2 vyšší než 0,99. Detekční limit byl určen na 25 pmol v 5 µl (3 S/N). CPSA je díky velmi nízkému detekčnímu limitu velmi citlivým nástrojem pro sledování chování prionových proteinů (Sobrova, a kol., 2012b). Obr. 15: Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza Kalibrační křivka prionového protein a CPSA záznamy různých koncentrací prionového proteinu. 7.5 Nativní a denaturovaný prion Denaturace proteinu je složitý komplex a jeho kompletní porozumění si vyžaduje brání v potaz mnoho aspektů, jako je náboj, struktura proteinu, podmínky prostředí, ve kterém se vyskytuje (např. ph elektrolytu a jeho koncentrace) stejně jako rovnováha 77

78 jednotlivých forem proteinu (Myers, a kol., 1995, Ostatna, a kol., 2010, Ostatna a Palecek, 2008, Teijeiro, a kol., 1993). Je dobře známo, že zvýšená teplota konvertuje velmi rychle a nevratně α-prp do jeho termodynamicky stabilnější formy β-prp (Sokolowski a Naumann, 2005, Zhang, a kol., 1997). Elektrochemie se tak zdá být velmi vhodnou metodou pro sledování proteinu, jeho denaturace a renaturace (Masarik, a kol., 2004, Ostatna, a kol., 2010, Ostatna, a kol., 2008, Ostatna a Palecek, 2008, Palecek a Ostatna, 2009, Palecek, a kol., 2008, Potesil, a kol., 2006). V této práci jsme se zabývali studiem chovaní nativního a denaturovaného prionového proteinu za použití všech výše zmíněných elektrochemických technik. Jak jasně vyplývá z výsledků, tak dochází k poklesu signálů v závislosti na trvání tepelné denaturaci při 99 C v intervalech 0, 15, 30, 45 a 60 minut. Korelační koeficienty měřených závislostí byly stanoveny na 0,9929 u CV AdTS (Obr. 16A), 0,9973 u DPV AdTS (Obr. 16B), 0,9965 u DPV AdTS Brdičkovy reakce (Obr. 16C) a 0,9957 u nejcitlivější CPSA (Obr. 16D). Elektrochemické signály poklesly u všech metod se vzrůstající dobou působení denaturační teploty. Z grafů je patrné, že agregační rychlost je daleko vyšší u metod DPV a CPSA, kde množství prionu pokleslo 6 oproti jeho nativní formě (0-tá minuta denaturace). Tento jev naznačuje, že tepelné zpracování vede ke značným změnám ve struktuře proteinu. Tepelná denaturace je tak zodpovědná za reverzibilní precipitaci, která vede k agregaci denaturované proteinové molekuly a tvorbu nedefinovaných polymerických struktur (Sobrova, a kol., 2012b). Obr. 16: Závislosti výšky píků prionových proteinů na čase jejich tepelné denaturace při 99 C měřených A) cyklickou voltametrií (CV), B) diferenční pulzní voltametrií (DPV), C) diferenční pulzní voltametrií - Brdičkova reakce (DPV Brdičkova reakce) a D) chronopotenciometrickou rozpouštěcí analýzou (CPSA). S delší dobou vlivu denaturační teploty došlo k významnému poklesu signálů. 78

79 8 In vivo detekce prionových proteinů Jak již bylo výše popsáno, neurodegenerativní nemoci mohou být prokázány histopatologickým vyšetřením post mortem přítomností vzniklých amyloidních plaků (Aβ) a neurofibrilární změtí (NFT) v mozku za použití barviv, které identifikují tyto mikroskopické struktury. Pokroky v in vivo detekci by mohly v budoucnu napomoci sledovat tvorbu a přítomnost Aβ plaků v živém mozku, a tak poskytnout vysoce důležité informace o progresi neurodegenerativních onemocnění. V současnosti je cílem celé řady výzkumných skupin zkoumání neurodegenerativních onemocnění s tím spojený vývoj nových biomarkerů pro vizualizaci a přímé zmapování přítomnosti Aβ plaků v mozku (Agdeppa, a kol., 2001, Cai, a kol., 2004, Klunk, a kol., 2003). Pro sledování těchto onemocnění in vivo se používá počítačová tomografie (CT) a to i přesto, že není dostatečně citlivá ani specifická, avšak může poskytnout informaci o atrofii v pokročilých stádiích onemocnění. Oproti tomu magnetická resonance (MRI) je daleko citlivější obzvláště s použitím moderních softwarových nástrojů pro vyhodnocení získaných signálů. MRI mozku pacientů trpící prionovým onemocněním může ukázat mírnou až střední atrofii v časných stádiích onemocnění a dramatickou difuzní atrofii po relativně krátké době trvaní tohoto onemocnění (Mastrianni, 2004). Použití pozitronové emisní tomografie (PET) nebo jedno-fotonové emisní počítačové tomografie (SPECT) by mohlo vylepšit diagnostiku při detekci samotných Aβ plaků a NFT in vivo a taky urychlit pochopení příčin tohoto onemocnění včetně nalezení vhodné léčby. Před více než 10 lety bylo úspěšně provedeno specifické zobrazení Aβ plaků v lidském organismu s klinickou diagnózou s možnou AD za pomocí PET s využitím 11 C-konec značený radiofarmaceutikem Pittsburgh Compound B (PiB; [ 11 C]-2-(4 -(methylaminofenyl)-6-hydroxybenzothiazol) (Ono a Saji, 2012). Od té doby byla již použita řada PET/SPECT zobrazovacích zkoušek jako [ 18 F]-2-(1-(2- (N-(2-fluoroethyl)-N-methylamino) naphthalene-6-yl)ethylidene)malononitril (FDDNP), [ 11 C]4-N-methylamino-4 -hydroxystilbene (SB-13) (Verhoeff, a kol., 2004), [ 11 C]2-(2-[2-dimethylaminothiazol-5-yl]ethenyl)-6-(2-[fluoro]ethoxy)benzoxazole (BF- 227) (Kudo, a kol., 2007) a [ 11 C]-2-[6-(methylamino)pyridin-3-yl]-1,3-benzothiazol-6- ol (AZD2184) (Johnson, a kol., 2009). Z toho jasně vyplývá, že tento typ diagnostiky prionových onemocnění má velký potenciál dále rozvíjet a tak objevit možný diagnostický zobrazovací test. Další z možností je použití kvantových teček jako zobrazovacího média, jak shrnula ve své práci Sobrova a kol (Sobrova, a kol., 2013a). 79

80 8.1 Kvantové tečky Pochopení foto-fyzikálních a polovodičových struktur bylo v 70. a 80. letech 20. století důležité pro široké spektrum elektronických aplikací. Předpokládalo se, že fyzikální vlastnosti struktur různých velikostí (od jednotlivých atomů až po velké rozměry) mohou být laditelné pouhou změnou jejich velikosti a tvaru. Velmi brzy bylo objeveno, že tyto nanometrové součástky nazvané kvantové tečky (QD) mohou mít daleko větší uplatnění než pouze elektronický průmysl. V současné době existuje celá řada uplatnění QD v biologické, biochemické a biomedicínské sféře. Kromě funkčnosti jako sensor (Li, a kol., 2011b, Li, a kol., 2012, Zhang, a kol., 2009) je hlavní funkce QD založena na jejich vynikajících fluorescenční vlastnostech, kdy se dají použít jako fluorescenční značky v biochemickém a biomedicínském výzkumu (Algar, a kol., 2010, Chen, a kol., 2010, Resch-Genger, a kol., 2008). Použití QD pro různé účely je shrnuto na Obr. 17. Obr. 17: Aplikace QD v oblasti chemie, biomedicíně a diagnostice. QD (velký zelený krystal) mohou být aplikovatelné pro biosensing, mapování biomarkerů, monitoring růstu buněk v reálném čase, dopravu léčiv, dopravu genů, detekci a diagnostiku, molekulární zobrazování a genovou léčbu. QD, polovodičové nano-krystaly natolik malé, že vykazují vlastnosti v závislosti na jejich velikosti, přináší velký zájem z důvodu jejich vynikajících optických vlastností 80

81 (Alivisatos, 1996, Bierman, a kol., 2007, Bouzigues, a kol., 2011, Drbohlavova, a kol., 2009, Yong, a kol., 2006) zahrnující široké excitační spektrum (Li, a kol., 2007), úzké, laditelné (Tracy, a kol., 2010) a symetrické a široké emisní spektrum od viditelné až po infračervenou oblast, excelentní fotostabilitu a velký kvantový výtěžek (Aldeek, a kol., 2011, Emin, a kol., 2010, Ma, a kol., 2011, Samadpour, a kol., 2011, Zhao, a kol., 2011). Dále je možné jejich povrch vhodně modifikovat pro zajištění požadované funkčnosti a dobré biokompatibility (Drbohlavova, a kol., 2009, Huang a Chen, 2008, Juzenas, a kol., 2008, Lu, a kol., 2010). Tyto částice mohou také být potenciálně užitečné pro trojrozměrnou multi-fotonovou mikroskopii (Jamieson, a kol., 2007) jako rapidně se vyvíjející obor pro biologické a biomedicínské aplikace. Tyto vlastnosti činí kvantové tečky jedním z nejslibnějších nanomateriálů pro biologické barvení, detekci biomakromolekul a imunohistochemii (Jin, a kol., 2011, Juzenas, a kol., 2008, Rosenthal, a kol., 2011). Nejpopulárnější typy QD zahrnují CdTe, CdSe, ZnSe a ZnS; nicméně mohou být použity další polovodičové kovy, jako je In a Ga (Green a O'Brien, 1998, Ryvolova, a kol., 2011). I přes velmi zajímavé vlastnosti QD hrozí při vpravení QD do živého organismu vyvolání oxidačního stresu vlivem jejich rozpadu při působení chemického rozpouštědla v biologických matricích. Z tohoto důvodu je nutná úprava povrchu QD teček tak, aby se staly biologicky inertní, aniž by došlo k porušení jejich optických vlastností. Pro tyto účely se používají jako modifikátory povrchu kvantových teček silikáty, thioly, organické kyseliny, peptidy, proteiny a nukleové kyseliny, které tvoří s QD biokonjugáty a redukují tak možný únik volného kadmia a dalších iontů kovů do okolí (Chomoucka, a kol., 2010, Juzenas, a kol., 2008, Weng, a kol., 2006). 8.2 Techniky pro charakterizaci QD Nejdůležitější charakterizace kvantových teček je studium jejich optických vlastností, které se zjišťují za pomocí UV-VIS a fotoluminiscenční spektroskopie poskytující rychlou, nedestruktivní a bezkontaktní možnost analýzy. Kromě sledování excitačního, absorpčního a emisního spektra, které se obvykle používá pro výpočet kvantového výtěžku, mohou být dále sledovány nefelometrická a turbidimetrická spektra. Velikost QD může být vypočítána z adsorpce za pomocí Hengleinovy empirické křivky, která odpovídá vlnové délce absorbance diameru QD (Das, a kol., 2011). Ve zvláštních případech bývá použita FTIR (Kumar, a kol., 2011). Jako jedna z nejlepších nedestruktivních metod může být pro charakterizaci QD využita Ramanova 81

82 spektroskopie, protože umožňuje zkoumat opticky aktivní foton a tak lokalizovat elektronickou strukturu QD (Gondal, a kol., 2011, Gu, a kol., 2003). Jak již bylo zmíněno dříve, optické vlastnosti (fluorescenční emise) QD může být volně laditelná podle velikosti QD, což je klíčový parametr, který určuje spektrální pozici a čistotu fotoluminescence. Velikosti a morfologie QD (tvar a struktura) jsou obvykle počítány s použitím konvenčních metod, jako je skenovací elektronová mikroskopie (SEM), transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a dynamický rozptyl světla (DLS). Pro tato měření se QD obvykle převedou do práškové formy a to buď jednoduchým vysušení roztoku QD nebo vysrážením (např. etanolem), následným odstředěním a usušením. Kromě těchto technik může být úspěšně použita frakcionace tokem v poli, která patří k technikám využívajícím vysoce účinnou kapalinovou chromatografií jako eluční metodu k oddělování velikosti (Rameshwar, a kol., 2006). Struktura QD je obvykle analyzována pomocí rentgenové difrakce (XRD) (Lin, a kol., 2011) a základní složení QD může být studováno energetickou disperzní rentgenovou analýzou (známou jako EDS, EDX a EDAX) (Kumar, a kol., 2011). Jiné metody, jako je atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-AES), jsou používány pro analýzu QD také, a to zejména z hlediska obsahu iontů kovů u QD (Huang, a kol., 2011). V poslední době byly také použity elektrochemické techniky pro studium chování QD (Khene, a kol., 2011, Li, a kol., 2011c, Sobrova, a kol., 2013c, Wang, a kol., 2011). 8.3 Elektrochemické stanovení kvantových teček Elektrochemické metody jsou vysoce citlivé techniky, které byly již v minulosti použity pro řadu aplikací v kombinaci s QD, jako například imobilizovaný substrát pro skleněnou uhlíkovou elektrodu (Hua, a kol., 2011, Li, a kol., 2011a) anebo modifikaci povrchu zlaté elektrody (Gu, a kol., 2011, Khene, a kol., 2011). Tato důležitá kombinace dala mnoho podmětů pro využití elektrochemického senzoru pro stanovení glukózy (Gu, a kol., 2011), prostatického specifického antigenu (Yang, a kol., 2011b), trombinu (Li, a kol., 2011a), rakovinných buněk (Li, a kol., 2011a), anebo alergenů (Yang, a kol., 2011a). Nicméně doposud nebyly QD analyzovány pomocí voltametrie s ohledem na optimilaziaci snadno použitelné a opakovatelné metody pro charakterizaci a kvantifikaci QD. 82

83 Elektrochemické techniky jsou známy pro své unikátní výhody, které jsou dány ekonomickou stránkou (relativně levné zařízení a velmi nízké náklady na provoz) a excelentními analytickými zařízeními s možností stanovit velmi nízké hladiny kovů v elektrolytu a různých matricích vzorku od vody po biologické vzorky (Monticelli, a kol., 2007). Ve srovnání s jinými robustními metodami s vysokou pořizovací cenou, jako je TEM, je potřeba mít rychlou a levnou metodu pro charakterizaci a kvantifikaci syntetizovaných kvantových teček. Toto je motivace pro studium elektrochemického chování QD složených z CdTe pokrytých merkaptopropionovou kyselinou (MPA) Cyklická voltametrie QD CdTe Jak již bylo zmíněno výše, CV je jednou ze základních elektrochemických technik využívanou pro zjištění základního redoxního chovaní sledovaných elektroaktvivních látek. Jelikož veškeré chemikálie (Cd, Te, MPA) použité pro syntézu QD jsou elektroaktivní látky, zajímalo nás, jak budou vypadat cyklické voltamogramy QD. Typický cyklický voltamogram QD je zobrazen na Obr. 18A. Vlivem přítomnosti MPA, Cd a teluru, jsme u záznamu CV dostaly 5 charakteristických píků, které odpovídají redoxním reakcím QD. Pík 1 a 5 a píky 2 a 4 poukazují na vratnou redoxní reakci kadmia a MPA v tomto pořadí. Pík 3 by mohl být přímo signál kvantových teček, s tím, že jeho výška je o několik řádů nižší ve srovnání s ostatními signály (Obr. 18B). Tyto výsledky poukazují na elektroaktivitu QD a tedy je možné využít CV pro sledování jejich redoxního chování. Citlivá kvantifikace je ovšem nejistá z hlediska pozorování nízkých signálů. Obr. 18: A) Typické voltamogramy cyklické voltametrie měření CdTe QD za použití HMDE vs. Ag/AgCl/3 M KCl. B) Závislosti výšky detekovaných píků na koncentraci QD. Parametry cyklické voltametrie byly následující: počáteční potenciál 0 V, koncový 83

84 potenciál -1,9 V, potenciál obratu -1,5, rychlost skenu 160 mv/s. všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě (22 24 C) Diferenční pulzní voltametrie QD CdTe Tato metoda byla použita z hlediska vyšší citlivosti při sledování elektroaktivních látek v porovnání s cyklickou voltametrií. Navíc je tato metoda extrémně citlivá pro stanovení kovů (Krystofova, a kol., 2010). Pro lepší pochopení jednotlivých dějů a vznikajících signálu jsme se na začátku zaměřili na elektrochemické stanovení jednotlivých chemických složek QD, které jsou v QD ve větší míře zastoupeny (Obr. 19A). Při měření na visící rtuťové kapkové elektrodě v klasickém tříelektrodovém zapojení Ag/AgCl/3 M KCl byl u MPA pozorován signál okolo potenciálu -0,35 V. Velikost píku MPA byla úměrná jeho koncentraci a výsledky měření jsou zobrazeny na vloženém Obrázku 19A. Detekční limit MPA byl stanoven na 100 ng/ml. Stejný experiment byl proveden s kademnatými ionty Cd 2+. Tyto ionty byly velmi dobře detekovatelné při potenciálu -0,6 V při použití stejných podmínkách jako u měření MPA. Píky byly dobře vyvinuté a úměrné koncentraci Cd 2+ (vložený Obrázek 19B). Díky vysoké citlivosti metody bylo možné detekovat 1 fg/ml (3 S/N). Dále jsme proložili vzniklé píky MPA a kadmia, které jsou zobrazeny na Obr. 19C. I přesto, že jsme použili vyšší koncentrace, oba píky byly dobře vyvinuté (Sobrova, a kol., 2013c). Obr: 19: A) Typický DP voltamogram MPA měřené za požití HMDE vs. Ag/AgCl/3 M KCl; vložený: závislost výšky píků MPA na koncentraci. B) Typický DP voltamogram 84

85 Cd 2+ měřené za požití HMDE vs. Ag/AgCl/3 M KCl; vložený: závislost výšky píků Cd 2+ na koncentraci. C) Proložení voltamogramu MPA a Cd 2+. Dále jsme se v naší práci zaměřili na charakterizaci QD za pomocí DPV. Typické voltamogramy QD jsou zobrazeny na Obrázku 20A. Jak jasně vyplývá ze získaných výsledků, QD poskytují dva typické píky, pík A a pík B, které rostou s narůstající koncentrací kvantových teček (Obr. 20B). Obě dvě závislosti mají logaritmický charakter. Lineární část této závislosti jsme proložili přímkou, jak je zobrazeno na vloženém Obrázku 20B. Obr. 20: A) Typické DP voltamogramy různých koncentrací QD. B) závislosti výšky píků A a B na koncentraci QD. Vložený: lineární část kalibrační křivky ukazující závislost výšky signálu na koncentraci QD. Abychom mohli správně charakterizovat oba píky, uskutečnili jsme řadu doplňujících experimentů, v nichž jsme ke kvantovým tečkám přidávali MPA anebo kadmium a vzniklou směs analyzovali za použití DPV. Nejdříve jsme se zaměřili na MPA. Získané DP voltamogramy přídavku QD (o koncentraci 460 µg/ml, kvantifikováno dle obsahu kadmia) k MPA jsou zobrazeny na Obr. 21A. Na základě získaných obrázků můžeme usoudit, že pík A odpovídá signálu MPA (Obr. 21A), přičemž byl pozorován mírný nárůst u obou píků, MPA a pík B, s narůstající koncentrací QD (vložený Obrázek 21A). Tento experiment jsme rovněž vyzkoušeli v obráceném pořadí, tj. ke QD jsme přidávali MPA (500 µg/ml); (Obr. 21B). Jak jsme očekávali, byl pozorován nárůst píku MPA nicméně byl rovněž pozorován nárůst píku B s rostoucím přídavkem MPA (vložený Obrázek 21B). Tento fenomén může být spojen s vlivem přídavku MPA na povahu píku B (Sobrova, a kol., 2013c). 85

86 Obr. 21: A) DP voltamogramy MPA (500 µg/ml) s přídavkem QD o různých objemech (460 µg/ml, kvantifikováno dle množství kadmia); vložený: závislost výšky píku MPA a B na koncentraci QD. B) DP voltamogramy (460 µg/ml) s přídavkem různých objemů MPA (500 µg/ml); vložený: závislost výšky píků MPA a B na koncentraci MPA. Pro nalezení původu píků B jsme provedli experimenty s kadmiem, další elektroaktivní látkou, ze které jsou QD připravovány. QD byly přidávány ke kadmiu a to ve stejné koncentraci jako v případě s MPA (Obr. 22A) Následně jsme pík B přejmenovali na pík QD, jelikož se zvyšující se koncentrací těchto nanočástic docházelo k nárůstu toho píku (vložený Obrázek 22A). Dále jsme pozorovali rozděleni píku MPA na pík 1 a pík 1a, který potvrzuje hypotézu, že MPA stejně jako kadmium zapříčiňují jejich elektroaktivitu. Dvojitý pík pak může být následkem nadbytku MPA. Nejzajímavější bylo testování přídavku kademnatých iontů o koncentraci 500 µg/ml ke kvantovým tečkám. Při hodnocení voltamogramu je patrné, že pík MPA se vůbec nezměnil. Oproti tomu Pík QD se rozdělil do tři signálů (Obr. 22B). Pík 2a je původně pík QD, který byl ověřen dle hodnoty potenciálu. Nadbytek kadmia byl pak zaznamenán u píku 2 a jako pík tři byl vyhodnocen blíže nespecifikovaný komplex MPA-QD-Cd. Všechny detekované píky se zvyšovaly se vzrůstající koncentrací Cd 2+ (vložený Obrázek 22B). Poté, co jsme objevili původ detekovaných signálu, jsme se zaměřili na stanovení detekčního limitu syntetizovaných QD. Pro jeho stanovení byl zvolen pík QD, na jehož základě a metodou 3 S/N byl limit detekce stanoven na 100 fg/ml (Sobrova, a kol., 2013c). 86

87 Obr. 22: A) DP voltamogramy Cd 2+ (500 µg/ml) s přídavkem QD o různých objemech (460 µg/ml, kvantifikováno dle množství kadmia); vložený: závislost výšky píku MPA (pík 1 a 1a) a píku QD na koncentraci QD. B) DP voltamogramy QD (460 µg/ml) s přídavkem různých objemů Cd 2+ (500 µg/ml); vložený: závislost výšky píku MPA a QD (pík 2, 2a a 3) na koncentraci Cd Stabilita QD Elektrochemické studium chování kvantových teček je slibný nástroj pro velmi citlivou metodu kvantifikace QD a na druhou stranu může být využit pro monitoring stability kvantových teček a ověření postupu jejich přípravy. Z tohoto důvodu jsme zaměřili naše studium na stabilitu používaných QD. Rozklad QD může být charakterizován poklesem emisních píků. My jsme pozorovali, že tento fenomén je možno rovněž sledovat poklesem dvou hlavních píků nazvaných MPA a QD. Na začátku jsme se zaměřili na sledování tepelné stability v teplotním rozmezí C. QD tečky byly vystaveny působení tepelnému ohřevu (99 C) po dobu 1 hodiny v temnu a následně analyzovány. Účinek působení teploty na jednotlivé píky je zobrazen na Obrázcích 23A a B. Jak jasně vyplývá ze získaných výsledků, oba píky vzrostly se vzrůstající teplotou, která byla způsobena jejich rozkladem a byla rovněž v souladu s poklesem emisního spektra. V závislosti na těchto slibných výsledcích jsme nadále pokračovali v testování časové stability. Výšky píků MPA a QD jsou zobrazeny na Obrázcích 23C a D. Můžeme tedy shrnout, že připravené QD jsou stabilní po dobu 2 týdnů, bez známek jakékoliv změny. Po této době je už mírně pozorovatelná degradace QD (Sobrova, a kol., 2013c). 87

88 Obr. 23: Závislost výšky A) MPA a B) QD píku na délce působení denaturační teploty. Závislost výšky píku C) MPA a D) QD na době uchování. Dále jsme se zaměřili na stabilitu QD v živočišné tkáni. Pro tyto účely byly použity kuřecí stehna zakoupené v obchodě Tesco. Byla odstraněna kůže a následně byly QD o objemu 10 µl (460 µl/ml) injektovány do svalu (Obr. 24A). Intenzita fluorescence poklesla se vzrůstající dobou po aplikaci (Obr. 24B). Postup probíhal tak, že na začátku byly pořízeny snímky kuřecího stehna a byla zjištěna autofluorescence tkáně, která byla odečtena od následných snímků již s injektovanými QD. S ohledem na tento fakt je jasné, že připravené QD jsou dostatečně stabilní, aby poskytly dostatečně měřitelný signál i po 210 minutách po aplikaci. Dále bylo potřeba kvantifikovat intenzitu QD a najít korelaci mezi intenzitou a koncentrací našeho markeru. Závislost intenzity emise na koncentraci QD injektovaných do kuřecího stehna je zobrazena Obrázku 24C. Intenzita byla měřena ihned po aplikaci a proporcionálně klesala s klesající koncentrací QD (Sobrova, a kol., 2013c). 8.4 In vitro aplikace QD In vitro podmínky jsou uměle vytvořené podmínky a simulují, co by se mohlo stát in vivo. V posledním desetiletí povrchové inženýrství a bio-funkcionalizační techniky přeměnili polovodičové nanokrystaly na komplexy schopné interagovat s biomolekulami a přímo se podílet na biologických procesech. V roce 1998 byly publikovány dvě práce, které poukazovaly na to, že polovodiče mohou být ve vodě rozpustné a tak využity jako biologická zobrazovací značka (Bruchez, a kol., 1998, 88

89 Chan a Nie, 1998). Jednou z možností je využití enkapsulačních postupů ve snaze produkovat QD pro dvojí barvení buněk (Bruchez, a kol., 1998). Při derivatizaci trimethoxysilylpropylovou močovinou a acetátovými skupinami QD označují preferenčně buněčné jádro, zatímco při derivatizaci biotinem se QD važí na aktinové filamenty. Další publikace jako první demonstrovala výměnu ligandů ve vodě rozpustných QD (Chan a Nie, 1998). Následně byly provedeny zkoušky na konjugaci transferinu, který byl endocytován živými HeLa buňkami, zatímco IgG bioconjugáty byly použity u agregačního imuno testu. Od té doby byla provedena celá řada povrchových modifikačních pokusů pro zvýšení rozpustnosti a biologické dostupnosti QD. Tyto zkoušky nalezly široké uplatnění v in vitro aplikacích, jako je histologické hodnocení buněčných tkání, detekce jednotlivých molekul a jejich sledování v reálném čase, dlouhodobé zobrazování živých buněk a studium intracelulárních procesu. Obr. 24: A) In vivo zobrazení 10 µl CdTe QDs (460 µg/ml) aplikovaných 1 cm pod kůži kuřecího křídla. Obrázek kuřecího křídla bez aplikace byl odečten. B) Závislost emise QD na době po aplikaci QD do tkáně. C) Závislost emise QD aplikovaných do kuřecího stehna na jejich koncentraci. Dále mohou být kvantové tečky využity jako optická značka, která se využívá v dynamických biologických procesech, jako jsou biokatalytické reakce nebo 89

90 strukturálně indukované molekulární mechanismy využívající fluorescenční resonanci energetického přechodu (FRET) nebo zhášení přechodu elektronů jako fotofyzikální mechanismus. TEM charakterizace CdTe QD je ukázána na Obr. 25A a jejich optické vlastnosti na Obr. 25B pro představu vlastností těchto nanočástic a jejich využití pro různé účely. Obr. 25: A) Mikrofotografie TEM vzorku ukazující morfologii QD s typickou částicí o velikosti pod 10 nm; vložený: roztok QD pod UV zářením. B) Absorpční a emisní spektrum CdTe QD. Poslední výzkumy ve spojení enkapsulovaných nanočástic a biokonjugačních kroků a návrh pre-funkcionalizace pokrytí povrchu slibují poskytovat vice kompaktní, stabilní a biokompatibilní nanočástice s kontrolovatelnou hustotou a orientací napojených ligandů. Za tímto účelem byly zkoumány amfilické polymery s maleickým páteřním anhydridem. U organických anhydridních rozpouštědel, jako jsou enkapsulované polymery QD pokryté TOPO a představují skupinu reaktivních anhydridů na povrchu (Pellegrino, a kol., 2004). Další postupy jsou sumarizovány v následujících pracích (Alivisatos, 2008, Fernandez-Arguelles, a kol., 2007, Lin, a kol., 2008). Elektrochemická detekce v kombinaci s QD je citlivou detekční technikou, která byla již použita pro celou řadu aplikací. Díky přítomnosti MPA na povrchu kvantových teček se očekává dobrá interakce s proteiny. Interakce prionového proteinu s CdTe QD za pomocí voltametrie představují nový a velmi citlivý nástroj pro sledování těchto proteinů (Sobrova, a kol., 2013b). 90

91 8.4.1 Sledování prionového proteinu za pomocí elektrochemie V této práci jsme se zabývali studiem prionových proteinů. Smíchali jsme prionový protein (500 µg/ml) s QD (500 µg/ml) v poměru 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 a 1:10 a nechali interagovat při 35 C ve tmě po dobu 24 hodin. Tuto směs jsme nadále analyzovaly za použití AdTS ve spojení s DPV. Za pomocí této techniky jsme zjistili, že QD se neadsorbují na povrch pracovní elektrody. Zatímco komplex QD-prion byl adsorbován na povrch pracovní elektrody (120 s) a měřen pomocí DPV. Zvyšující se koncentrace QD v komplexu QD-prion poskytovala čtyři píky (Obr. 26). Obr. 26: A) DP voltamogramy prionového proteinu (PrP, 500 µg/ml) s přídavkem různých objemů QD (460 µg/ml, kvantifikováno dle koncentrace kadmia. B) Závislost výšky píků 1, 2, 3 a 4 na koncentraci QD. C) DP voltamogramy QD (460 µg/ml) s přídavkem různých objemů prionového proteinu (PrP, 500 µg/ml). D) Závislost píků 1, 2 a 3 na koncentraci PrP. Pík 3 odpovídá prionovému proteinu. Již na první pohled je zřejmé, že tento signál je nižší ve srovnání s ostatními. Píky 1, 3 a 4 patří ke komplexu QD-prion. Pík 1 může být spojený s komplexem Cd 2+ -prion kvůli posunu píku Cd 2+ do pozitivnějších potenciálů po interakci s proteinovými zbytky. Pík 3 a 4 může být spojen s komplexy MPA-Cd 2+ -prion. Tyto komplexy se mohou formovat interakcemi zbytků aminokyselin 91

92 s Cd 2+. Nicméně jsme objevili, že píky 1, 2 a 3 byly lineárně závislé na koncentraci QD, což je pro stanovení prionových proteinů velmi důležité (Obr. 26B). Abychom našli co nejvhodnější pík, sledovali jsme interakci QD-prion při zvyšující se koncentrací prionového proteinu a analyzovali směs za pomocí AdTS DPV. Pík 4 se vytratil, ale zůstali píky 1, 2 a 3 (Obr. 26C). Píky 1 a 3 se lineárně zvyšovaly s rostoucí koncentrací prionového proteinu, což může být spojeno s faktem, že povaha těchto píků souvisí s koncentrací prionového proteinu. (Obr. 26D). Pík 2 poklesl se vzrůstající koncentrací prionového proteinu. Interakce QD s priony byla rovněž potvrzena snižující se fluorescencí částic při zvyšující se koncentrace QD (Sobrova, a kol., 2013b). Jak jasně vyplývá ze získaných výsledků, detekovaný pík 1 je nejvíce citlivý a zároveň přímo úměrný koncentraci u obou komplexů QD-prion. Z tohoto důvodu jsme zaměřili naši pozornost na stanovení detekčního limitu použité metodiky. Prionový protein byl analyzován s přídavkem QD (Obr. 27A) a bez přídavku QD (Obr. 27B) za pomocí metody AdTS DPV. Obr. 27: A) DP voltamogramy komplexu QD-prionový protein. Komplex byl měřen za pomocí AdTS DPV. B) DP voltamogramy různých koncentrací prionového proteinu. 92

93 Výška píků se lineárně zvyšovala s rostoucí koncentrací prionového proteinu. Testované koncentrační rozpětí bylo od 16 µg/ml do 500 µg/ml. C) Kalibrační křivka komplexu QD-prionový protein. Komplex byl měřen za pomocí AdTS DPV; vložený: kalibrační křivka s regresním koeficientem R 2 = Citlivost při použití značení QD bylo o několik řádů citlivější ve srovnání s neznačeným prionem. Detekční limit při měření samotného prionu byl stanoven na 16 µg prionového proteinu v 1 ml (3 S/N). V závislosti na tom jsme se zaměřili na sestrojení kalibrační závislosti komplexu QD-prion (Obr. 27C). Kalibrační rozpětí bylo od do 4 µg/ml s lineární oblastí zobrazenou na vloženém Obrázku 27C. Detekční limit (3 S/N) byl stanoven na 1 fg v 5 µl. Tyto výsledky naznačují, že značení prionových proteinů QD má velkou důležitost kvůli velmi snadné aplikovatelnosti a možnosti použití v miniaturizovaných zařízení (Sobrova, a kol., 2013b). 8.5 In vivo aplikace QD I přesto, že byly doposud provedeny pokusy optického zobrazení onemocnění způsobené prionovým proteinem, většina z nich byla použita in vitro (Dalal, a kol., 2012, Zhou, a kol., 2013). Novým a povzbudivým směrem výzkumu je použití QD jako kontrastních látek v in vivo zobrazování (Gao, a kol., 2005, Hu, a kol., 2011, Michalet, a kol., 2005, Smith, a kol., 2008). Charakterizace a analýza biomolekul a biologických systémů v souvislosti s neporušením organismu je znám jako in vivo výzkum. In vivo přístup zahrnuje experimenty prováděné v širokém systému pokusného zvířete. Organické fluorescenční a chemiluminiscenční zkoušky jsou současně nejpoužívanějšími optickými zkouškami při zobrazování zvířat. Nicméně limitujícím je nedostatek použitelných optických kontrastních látek, které emitují v NIR emisním spektru (> 650 nm). NIR emitující okénko je dobře využitelné pro biologické optické zobrazování kvůli malé absorbanci tkání a disperznímu efektu v tomto emisním spektru. Spektrum optického okna NIR je pro zobrazování zvířat typický v rozpětí nm. Od té doby, co mohou být optické vlastností QD volně laditelné svým složením a velikostí, je možno sestavit sérii NIR emitujících QD pro zobrazování použitelných u živočichů (Taniguchi, a kol., 2011). CdTe, CdTeSe, InPAs, PbS a PbSe byly úspěšně syntetizovány vykazující NIR emisi (Ciarlo, a kol., 2009, Tavares, a kol., 2011). Pro většinu in vivo zobrazení jsou QD přímo injektovány intravenózně do živého organismu a následně dopraveny do krevního oběhu (Sobrova, a kol., 2013a). 93

94 VI. SEZNAM ČLÁNKŮ Analytické metody pro stanovení prionových proteinů ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; ADAM, V.; KIZEK, R. Capillary electromigration based techniques in diagnostics of prion protein caused diseases. Electrophoresis, 2012, roč. 33. č. 24, s ISSN IF Elektrochemické stanovení prionových proteinů ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; HYNEK, D.; ADAM, V.; HUBÁLEK, J.; KIZEK, R. Electrochemical behaviour of native and denatured β-sheet breaker prion protein. Int. J. Electrochem. Sci., 2012, roč. 7. č. 2, s ISSN IF In vivo detekce prionových proteinů ŠOBROVÁ, P.; BLAŽKOVÁ, I.; CHOMOUCKÁ, J.; DRBOHLAVOVÁ, J.; VACULOVIČOVA, M.; KOPEL, P.; HUBÁLEK, J.; KIZEK, R.; ADAM, V. Quantum Dots and Prion Proteins, Is This New Challenge for Neurodegenerative Disease Imaging? Prion, 2013, roč. 7. č. 5. s ISSN , IF 2,850 ŠOBROVÁ, P.; VACULOVIČOVA, M.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Voltammetry as a tool for characterization of CdTe quantum dots. Int. J. Mol. Sci., 2013, č. 14, s , ISSN IF ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; PEKAŘÍK, V.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Femtogram electrochemical sensing of prion proteins using quantum dots. Int. J. Electrochem. Sci., 2013, roč. 8 s ISSN IF

95 ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; ADAM, V.; KIZEK, R. Capillary electromigration based techniques in diagnostics of prion protein caused diseases. Electrophoresis, 2012, roč. 33. č. 24, s ISSN IF Abstrakt Transmisní spongiformní encefalopatie (TSE) je skupina fatálních neurodegenerativních onemocnění s dlouhou inkubační dobou. Do této skupiny patří například Creutzfeld-Jakobova nemoc, kuru, scrapie, chronické chřadnutí jelenovitých a bovinní spongiformní encefalopatie. Senzitivní a specifická detekce abnormálního prionu zdrojového původce výše zmíněných onemocnění z krve může poskytnout diagnostický test nebo screening array u lidských a živočišných diagnostik. Z tohoto důvodu diagnostické testy prionových onemocnění reprezentují jedinečnou výzvu vyžadující vývoj nových testů založených na detekci abnormálního prionového proteinu. Současné diagnostické metody používané pro detekci PrP Sc jsou cyklická amplifikace pozměněného proteinu (PMCA misfolding cyclic amplification), konformačně závislá imunoanalýza, disociačně-zvýšená lanthanidová fluorescentní imunoanalýza, fluorescenčně korelační spektroskopie anebo průtoková mikrokapková imunoanalýza. Na druhé straně, použití kapilární elektroforézy pro detekci PrP Sc v krevním řečišti může být atraktivní alternativou, která byla již aplikována pro analýzu krevních vzorků nakažených ovcí, losů, šimpanzů a také u člověka. V tomto souhrnném článku jsou sumarizovány testy pro detekci prionu se speciálním zaměřením na kapilární elektroforézu, kapilární izoelektrickou fokusaci anebo kapilární gelovou elektroforézu. Významnou výhodou na tomto poli proteomické analýzy je velký potenciál miniaturizace a zabudování do lab-on-chip zařízení. Podíl autorky: 40 % textová část práce Podíl podpory externích projektů DOC_01/2012 CEITEC a JCCM byl 70 % a 30 %. 95

96 3644 Electrophoresis 2012, 33, Pavlina Sobrova 1,2 Marketa Ryvolova 1,2 Vojtech Adam 1,2 Rene Kizek 1,2 1 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Brno, Czech Republic 2 Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Brno, Czech Republic Received April 9, 2012 Revised June 30, 2012 Accepted July 23, 2012 Review Capillary electromigration based techniques in diagnostics of prion protein caused diseases Transmissible spongiform encephalopathies are a group of fatal neurodegenerative diseases with long incubation time. This group includes Creutzfeld-Jakob disease, kuru, scrapie, chronic wasting disease, and bovine spongiform encephalopathy. Sensitive and specific detection of abnormal prion protein as a source agent of the above-mentioned diseases in blood could provide a diagnostic test or a screening assay for animal and human prion protein diseases diagnostics. Therefore, diagnostic tests for prion protein diseases represent unique challenge requiring development of novel assays exploiting properties of prion protein complex. Presently, diagnostic methods such as protein misfolding cyclic amplification, conformation-dependent immunoassay, dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay, fluorescence correlation spectroscopy, and/or flow microbead immunoassay are used for abnormal prion protein (PrP Sc ) detection. On the other hand, using of CE for PrP Sc detection in body fluids is an attractive alternative; it has been already applied for the blood samples of infected sheep, elk, chimpanzee, as well as humans. In this review, assays for prion protein detection are summarized with special attention to capillary electromigration based techniques, such as CE, CIEF, and/or CGE. The potential of the miniaturized and integrated lab-on-chip devices is highlighted, emphasizing recent advances of this field in the proteomic analysis. Keywords: Alzheimer / CE / Neurodegenerative disease / Prion protein / Transmissible spongiform encephalopathies DOI /elps Introduction Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are infectious diseases that cause progressive degenerative disorders of the central nervous system. Sixteen different variants of prion disease have been reported, nine in humans and seven in animals [1 4], listed in Table 1. Since there is a number of neuropathological similarities and genetic links between Alzheimer and prion diseases [5], it is not surprising that the coexistence of Alzheimer disease pathology in Creutzfeld-Jakob disease (CJD) has been reported [6]. According to seeding-nucleation model, the agent that causes these diseases is an abnormal prion protein (PrP Sc ) catalyzing the conversion of normal prion protein (PrP C ) molecules into PrP Sc [1]. The PrP Sc is a conformational isoform of the PrP C. This conformation change, from the -helix Correspondence: Dr. Rene Kizek, Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ Brno, Czech Republic kizek@sci.muni.cz Fax: Abbreviations: CJD, Creutzfeld-Jakob disease; IHC, immunohistochemistry; PrP, prion protein; PrPC, normal prion protein; PrPSc, abnormal prion protein; TSE, Transmissible spongiform encephalopathies; vcjd, variant of CJD in PrP c to the -sheet of the PrP Sc, significantly affects the protein function. Generally, PrP C is a membrane-bound glycoprotein found in the central nervous system of all mammals and avian species. The monomeric form of PrP C has molecular mass of approximately 27 kda. The protein is tethered to the outside surface of cellular membranes by a glycosylphosphatidylinositol anchor at its C terminus. NMR studies on recombinant human PrP C demonstrated that the C-terminal region adopts a globular fold that is largely helical, but with asmalltwo-strand -sheet. Similar structures are found for hamster and mouse prion proteins. N-terminal region, up to approximately residue 120, is unstructured and flexible in solution. A hallmark of this region is the so-called octarepeat domain composed of tandem repeats of the fundamental eight-residue sequence PHGGGWGQ. In most species, including humans, four or five repeat segments are found. Interestingly, the octarepeat domain is among the most highly conserved regions of the prion protein. There are currently no high-resolution structures for PrP Sc, but recent electroncrystallography experiments suggest that residues refold into the -helix [7]. At present, there is no evidence that a nucleic acid is involved in structural changes of PrP C into PrP Sc.The PrP encoding gene occurs in normal and in spongiform Colour Online: See the article online to view Figs. 1 and 2 in colour. C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

97 Electrophoresis 2012, 33, CE and CEC 3645 Table 1. The list of prion protein related diseases Abbreviation Host Animal prion protein disease Transmissible mink encephalopathy TME Mink Scrapie - Sheep Chronic wasting disease CWD Cervids Bovine spongiform encephalopathy BSE Cattle Exotic ungulate spongiform encephalopathy EUE Nyala, Kudu Feline spongiform encephalopathy FSE Cats TSE in nonhuman primates NHP Lemurs Human prion protein disease Sporadic Creutzfeldt-Jacob Disease scjd Human Familial Creutzfeldt-Jacob Disease fcjd Human Variant Creutzfeldt-Jacob Disease vcjd Human Iatrogenic Creutzfeldt-Jacob Disease icjd Human Fatal familial insomnia FFI Human Sporadic fatal insomnia sfi Human Variably protease-sensitive prionopathy VPSPr Human Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrome GSS Human Kuru - Human encephalopathy affected brain. Missense mutations in the human Prnp gene (prion protein gene) are responsible for inherited prion diseases. In uninfected animals, Prnp encodes a glycophosphatidylinositol-anchored protein denoted PrP C ; in prion infections, PrP C is converted to PrP Sc by templated refolding. In spite of the fact that Prnp is conserved in mammalian species, attempts to verify interactions of putative PrP-binding proteins by genetic means have proven frustrating: the ZrchI and Npu lines of Prnp-ablated mice (Prnp(0/0) mice) lacking PrP C remains healthy throughout development. This indicates that PrP C plays a role that is not apparent in a laboratory setting or that other molecules have overlapping functions. However, the protein undergoes a posttranslational alteration that truncates a host PrP C at the N-terminus and causes it to be resistant to protease digestion in diseased brain [8]. After this modification, the protein aggregates into rod-shaped fibrils in the brains of infected animals. The specific function of PrP C in healthy tissues remains unknown. However, several intriguing lines of evidence have emerged recently suggesting that PrP C may exert a cytoprotective activity, particularly against internal or environmental stresses that initiate an apoptotic program [9, 10]. Moreover, recent data indicate that PrP C may play a critical role in the pathogene-sis of Alzheimer disease. A feedback loop has been suggested in the nor-mal brain, where PrP C exerts an inhibitory effect on -secretase BACE1 to decrease both amyloid- and amyloid intracellular domain production. In turn, the amyloid intracellular domain upregulates PrP C expression, thus maintaining the inhibitory ef-fect of PrP C on BACE1. In Alzheimer disease, this feedback loop is disrupted and the abundant amyloid- oligomers bind to PrP C and prevent it from regulating BACE1 activity [5]. It has been recently clarified that the prion protein binds copper in vivo, and the interaction between PrP C and copper requires the highly conserved, N-terminal octarepeat domain [7]. It was found that the amino-terminal domain of PrP C exhibits five to six copper-binding sites (Cu(II)) presented as a glycine chelate. At neutral ph, binding occurs with positive cooperativity, with binding affinity compatible with estimates for extracellular, labile copper. Two lines of independently derived PrP C gene-ablated (Prnp(0/0)) mice exhibit severe reductions in the copper content of membrane-enriched brain extracts. Similar reductions in synaptosomal and endosomeenriched subcellular fractions have been also observed in this model. Prnp(0/0) mice are also characterized by altered cellular phenotypes, including a reduction in the activity of copper/zinc superoxide dismutase and altered electrophysiological responses in the presence of copper excess. These findings indicate that PrP C can exist in a Cu-metalloprotein form in vivo [11]. It should not be missed out that the connection between prion proteins and other ions, such as manganese [12], zinc [13], iron [14], and calcium, have been discussed [15]. Aluminum is also associated with neurodegenerative diseases; it promotes a specific beta-amyloid (1 42) aggregation, thus leading to marked toxic effects on neuroblastoma cells [16]. 2 Analytical methods for prion protein detection The diagnosis of infectious diseases is relatively a wellestablished area. It can be done either by the immune reaction or by the amplification of a nucleic acid that is specific to the prion protein using PCR [17]. However, in TSEs, the infectious agent has the same sequence as a naturally occurring protein and thus no immune reaction is observed. Moreover, there is no nucleic acid to be amplified. Therefore, the diagnostics of prion protein caused diseases represents a sort of challenge [18]. In case of human diseases, diagnosis is based almost exclusively on clinical examination and the disease is then considered as probable depending on the extent to which the clinical symptoms fit the standard guidelines. Currently, PrP Sc is the only disease-specific analyte commercially used for identification of prion diseases [19]. From the clinical point of view, the most sensitive and specific method of diagnosing TSE is unquestionably experimental infection in laboratory animals. The animal is injected with a homogenate prepared from the suspicious tissue and appearance of clinical signs is followed. The disease development is then confirmed after dissection using classic techniques (histology, immunohistology, Western Blot). These methods are too laborious and time-consuming to be used for routine high-throughput screening [20]. Recently, new postmortem tests have been introduced enabling rapid screening of the suspicious samples. Currently five commercial tests are approved by the European Commission for bovine spongiform encephalopathy detection (Prionics-Check Western test, Enfer test, CEA/Biorad test, Prionics-Check LIA test, and conformational-dependent immunoassay). All these tests are based on immunodetection of the pathological PrP Sc isoform; four of them use C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

98 3646 P. Sobrova et al. Electrophoresis 2012, 33, proteolysis to distinguish PrP C from misfolded PrP Sc [18]. It has to be noted that none of these tests is able to identify infected animal at the presymptomatic stage and therefore the risk of the infectious agents entering the food chain is not completely eliminated. Also some commercial assays (TeSeE TM CJD ELISA and TeSeE TM ) are available to detect PrP Sc in cerebral and lymphoid tissues of TSE patients. These two assays have been compared by Ugnon-Cafe et al. [21] using samples from 54 variant of vcjd (vcjd) affected patients and 51 controls. Authors concluded that these tools were rapid and robust for routine in vitro human TSE diagnosis and characterization. CJD could be also diagnosed during the patient s lifetime by detection of PrP Sc in the tonsil. A pilot study was undertaken to look at the feasibility of testing for vcjd in deceased donors using tonsillar tissue. Obtaining tonsillar tissue in the immediate postmortem period was limited by the presence of rigor mortis. Tonsillar tissue was suitable for routine analysis for the presence of prion protein associated with vcjd in deceased tissue donors. In spite of the fact that palatine and lingual tonsil tissue could be obtained in pairs, it was possible, in the majority of cases, to set aside an intact sample for confirmatory testing if required [22]. The main problem with the diagnosis based on the PrP Sc detection is that the pathological form of PrP is abundant only at late stages of the disease in a brain. However, infectivity studies have shown that prion proteins occurred in low amounts in peripheral tissues, such as lymphoid organs and blood, already at early stages of the disease during the presymptomatic period. Another challenge for diagnosis and surveillance is that hosts can incubate infectious prion proteins for many months or years. During this period, they exhibit no overt clinical symptoms. Incubation period for some human prion diseases can be as long as 40 years [23]. The incubation time of the first human transmissible spongiform encephalopathy Kuru described by Professor Gajdusek in the late 1950s was estimated within the range from 21 to 40 years [24, 25]. In order to avoid the use of antibodies, several spectroscopic methods such as multispectral ultraviolet fluoroscopy [26], fluorescence correlation spectroscopy [27, 28], magnetic resonance spectroscopy [29 31], or FTIR [32, 33] have been employed. The main disadvantages of these methods include requirements of expensive and sophisticated equipment as well as skilled operator. Recently also Raman scattering spectroscopy using gold nanorods 3D supercrystals was used for prion protein detection [34]. Last but not least, sensitive MS based method of quantitating the prion proteins in a variety of mammalian species has been presented [35]. Identification of cell lines highly sensitive to prion protein infection led to the development of cell-based titration procedures aiming at replacing animal bioassays, usually performed in mice or hamsters. However, most of these cell lines are only permissive to mouse-adapted prion proteins strains and do not allow titration of prion proteins from other species. In the study of Arellano-Anaya et al. [36], it has been shown that epithelial RK13, a cell line permissive to mouse and bank vole prion protein strains and to natural prion protein agents from sheep and cervids, enables a robust and sensitive detection of mouse and ovine-derived prion proteins. Notably, the cell culture work is strongly reduced as the RK13 cell assay procedure designed here does not require subcultivation of the inoculated cultures. It was also shown that prion proteins effectively bind to culture plastic vessel and are quantitatively detected by the cell assay. A new in vitro amplification technology, designated RT quaking-induced conversion, has been described for detection of the abnormal form of prion protein (PrP Sc ) in easily accessible specimens such as cerebrospinal fluid. RT quaking-induced conversion method can be applied to other prion diseases, including scrapie, chronic wasting disease, and bovine spongiform encephalopathy, and is able to quantify prion protein seeding activity when combined with an end-point dilution of samples [37]. Solid-state matrix can be used for capturing and concentrating disease-associated prion proteins. Coupling of this method with direct immunodetection of surface-bound material enabled to distinguish dilution of exogenous vcjd prion protein infected brain from a 10 6 dilution of normal brain (mean chemiluminescent signal, for vcjd versus for normal brain, showing an assay sensitivity for vcjd of 71.4% and a specificity of 100%) [38]. 2.1 Immuno-based method for prion protein detection Generally, the majority of analytical diagnostic methods rely on the proteolytic removal of endogenous PrP C prior to detection of PrP Sc (Fig. 1). PrP Sc is relatively resistant toward proteolytic degradation whereas PrP C is entirely digested by proteinase K. Identical treatment leads to removal of a variable number of N-terminal amino acids in case of PrP Sc. This results in appearance of three distinct bands, corresponding to the di-, mono-, and unglycosylated form of PrP, upon Western blotting. Several techniques have been developed to detect PrP Sc in brain tissues, including Western blot or other immunoblot methods [39 41]. Quantitative Western blot analysis revealed the highest expression of PrP C in cerebellum, obex, and spinal cord. Intermediate levels were detected in thymus, intestine, nervous, heart, and spleen, and lower levels in lung, muscle, kidney, lymph node, skin, pancreas, and liver [42]. Western blotting coupled with gel electrophoresis is one of the immunodetection methods successfully used for detection of PrP Sc in tissue extracts [43, 44]. After denaturation of the tissue extract by heating with SDS, it is analyzed by PAGE and the denatured protein is transferred to a solid support and detected with an enzyme-labeled antibody, often of goat, rabbit, and mouse. The specificity of Western blotting is based on the fact that proteolysis with proteinase K characteristically alters the molecular mass (approximately 5 kda) of the PrP c, due to the partial degradation of the N-terminal part of the protein [20]. Immunohistochemical analysis detected intense cellular-specific PrP C staining C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

99 Electrophoresis 2012, 33, CE and CEC 3647 Figure 1. Methods used for prion protein detection: CE, cell culture assay, FTIR spectroscopy, immunohistochemistry, bioassay, dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay (DELFIA), slot blot, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), protein misfolding cyclic amplification (PMCA), cell blot, Western blot, paraffin-embedded tissue blot, flow microbead immunoassay (FMB), histoblot, ELISA, current density imaging (CDI). in neurons, thymocytes, and lymphocytes. PrP C was also detected in the enteric wall, pancreatic islets of Langerhans, myocardium, pulmonary alveolar sacs, renal glomeruli, and dermal epithelial cells [42]. Circumvention of the protease digestion step might theoretically result in the increasing sensitivity of PrP Sc -based detection methods and thus make these methods more amenable to high-throughput technologies [45 47]. Also a method using Western blot assay with precipitation of streptomycin sulfate has been reported, improving the PrP Sc detection sensitivity and providing the potential for specific, rapid, and flexible determination of low PrP Sc levels in the specimens not only from the central nervous system, but also from peripheral organs or fluids [48]. Employing of PrP Sc stock sample into various mimic specimens, including normal hamster brain homogenate, human cerebrospinal fluid, and urine, demonstrated that streptomycin precipitation markedly increased the detection sensitivity of PrP Sc, regardless low concentration or large volume. In addition, PrP Sc from human brain tissue of fcjd was efficiently precipitated with streptomycin sulfate. Another approach that has proven usefulness is the in situ detection of PrP by immunohistochemistry (IHC). In most IHC procedures, the brain tissue sections are treated to destroy PrP C with formic acid rather than with protease, since formic acid also enhances the PrP Sc immunoreactivity [8]. A suitable IHC procedure was developed using brain tissue from hamsters that had been inoculated with the transmissible mink encephalopathy agent. Tissue samples were fixed in PLP (periodate, lysine, paraformaldehyde) that contained paraformaldehyde at a concentration of 0.125%. Before application of the IHC technique, tissue sections were deparaffinized and treated with formic acid simultaneously to enhance PrP Sc immunoreactivity and to degrade PrP C. Primary antibody was obtained from a rabbit immunized to PrP Sc extracted from brains of mice with experimentally induced scrapie. Brains from 21 sheep with histopathologically confirmed scrapie were examined by IHC. In all of these brains, PrP Sc was widely distributed throughout the brain. One of the attempts of prion protein diagnosis includes the production of conformational PrP Sc -specific antibodies as described by Korth et al. They prepared 15B3 antibody that specifically precipitates bovine, murine, or human PrP Sc,but not PrP C, suggesting that it recognizes an epitope common to prion proteins from different species [49]. This approach may even eliminate the protease digestion because of specificity of antibodies. Recent experiments in this area have shown that formation of -sheet structures in prion proteins was connected to the increased solvent accessibility of the tyrosine residues. Based on these results, animals were immunized with synthetic peptides rich in tyrosine and several antibodies recognizing PrP Sc (and not PrP C ) were produced [50]. Similarly, a mab against a carboxy-terminal PrP synthetic peptide [51] as well as anti-dna antibody [52] have been developed. Even though these antibodies have been successfully tested, this work has no commercial outcome at present. On the other hand, protein misfolding cyclic amplification has a great potential and it is certainly the most promising approach from the viewpoint of developing a blood test. It mimics pathological processes and is similar to PCR; PrP Sc is C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

100 3648 P. Sobrova et al. Electrophoresis 2012, 33, incubated in the presence of PrP C excess to initiate conversion to PrP Sc aggregates that are subsequently dispersed by sonication to encourage the formation of new aggregates. The quantity of PrP Sc formed depends on the number of expansion/sonication cycles performed [53 56]. To date, no commonly available test can give a reliable diagnosis using a readily available sample from a living animal or person, such as blood or urine [20]. Therefore also nonprion biomarkers are searched to increase the diagnostic possibilities [23, 57]. 2.2 CE of prion proteins Electrophoretic methods represented by gel electrophoresis are commonly used for detection of prion proteins, especially in combination with Western blot. Recently, TGGE was used to find that sensitivity to scrapie is associated with polymorphisms in three codons of prion protein gene: 136, 154, and 171. The TGGE method was used to detect point mutations in these codons responsible for sensitivity or resistance to scrapie [58 61]. In another recent study, the authors utilized recombinant human PrP as a probe in combination with2deandmaldi-tofmsforidentificationofheterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 and aldolase C as novel interaction partners for PrP [62]. Comparison of onedimensional gel electrophoresis and immunoblotting and two-dimensional immunoblot demonstrated serious differences and evidenced that a qualitative difference in glycans contributes to prion protein diversity [63]. Since 1992, when first reports on ACE were published, this technique has emerged as a useful and sensitive technique for studying bimolecular noncovalent interactions and for determining binding and dissociation constants of formed complexes. Numerous interactions including protein ligand [64], peptide metal [65], protein protein [66], antibody antigen [67], and enzyme drug [68] have been examined using ACE. The subset of techniques known as ACE is a group of CE immunoassays defined as methods in which antibodies or antibody-related substances are used as selective binding agents for chemical detection [69]. Generally, two types of immunoassays (i) heterogeneous and (ii) homogeneous can be distinguished. In heterogeneous immunoassays, antibodies are immobilized on a solid support and interact with antigen at the boundary layer. Subsequently, the unbound antibodies and other components can be easily removed. In homogenous immunoassays, antibodies interact with antigens in solution. Heterogeneous as well as homogeneous immunoassays can be further subdivided into competitive and noncompetitive techniques. In competitive mode, the antigens of interest compete with exogenous labeled antigens for a limited, precisely defined, number of antibody-binding sites. Thus, the generated signal is inversely proportional to the antigen concentration. In noncompetitive mode, antigens are captured by an excess of antibodies and are detected after subsequent binding of a second set of labeled antibodies that bind to the antigen at a different epitope. This forms a sandwich immunoassay where the signal is proportional to the antigen concentration [70]. In homogeneous immunoassay based on CE, the immune complex and free antibodies are discriminated based on their electrophoretic mobilities [71]. Several procedures using CE for prion proteins have been developed by Schmerr et al. [72 82]. In the first work of this group, brain tissues of scrapie-infected as well as healthy sheep were used to prepare PrP Sc, which was subsequently reacted with a rabbit antibody specific for a peptide of the prion protein. The immunocomplex formation was observed for the samples from scrapie-infected brain, but not for samples from normal brain. Moreover, when a fluorescein-labeled goat anti-rabbit immunoglobulin was used as a second antibody, the detection of immunocomplex formation was enhanced both by the immunological technique and by using LIF for detection. CE can be used to show immunocomplex formation when PrP Sc occurs in sheep brain [72]. In the following paper, the competition between fluorescently labeled synthetic peptide and prion proteins from infected brain tissues was used to increase the sensitivity of the detection [73]. Later, faster and better resolved separation of the immune complexes from the unbound peptide was achieved using 200 mm Tricine (ph 8.0) in comparison to phosphate or borate buffer systems. As increasing amounts of unlabeled peptide were added to the assay, a concentration-dependent reduction in the immune complex peak was observed. The assay could detect less than 10.0 fmol of unlabeled peptide. Using these optimized conditions there was a quantitative difference in the competition of preparations from scrapieinfected sheep brain and normal sheep brain [74]. Following study from the same group compared SDS gel CE to conventional SDS-PAGE and Western blot to detect the monomer of this aggregated protein. In infected sheep brain samples, but not in healthy sheep brains, a major peak at a molecular mass of 19.2 kda and a minor peak with a leading shoulder were observed. The molecular mass determined for this protein was in good correlation with that estimated on Western blot (22.4 kda). The equivalent amount of brain sample in the capillary was similar to 50 g. The amount of brain sample was 100 times less than that needed for Western blot for sheep samples [75]. A new method competition immunoassay using flourescein-labeled synthetic peptides (amino acid positions and ) from PrP Sc and free zone CE with LIF was presented in 1998 [76]. Antibodies were prepared to each synthetic peptide and used in the competition assay. The fluorescent-labeled peptides bound to the antibody were separated from the unbound peptides. When PrP Sc extracted from infected sheep brain was added to the assay, approximately 135 pg of PrP Sc could be detected; however, there was little or no competition observed when using extracts from normal sheep tissue [76]. In 1999, Schmerr et al. suggested a way of detection of prion proteins in blood. A peptide from the carboxyl terminal region, amino acid positions , was labeled with fluorescein during the synthesis of the peptide at the amino terminus. Antibodies that have been produced from this peptide were affinity purified and used in a CE immunoassay. The amount of fluorescein-labeled peptide in the C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

101 Electrophoresis 2012, 33, CE and CEC 3649 capillary was 50 amol. Blood was obtained from healthy sheep and elk, from sheep infected with scrapie, and elk infected with chronic wasting disease. Buffy coats and plasma were prepared by a conventional method. The abnormal prion protein was detected in fractions from blood of infected animals but not in the blood of healthy animals [77]. The emergence of a new environmentally caused vcjd has stimulated the research on a practical diagnostic screening test. The immunocompetitive CE assay has been reported to detect diseasespecific, proteinase-resistant prion protein (PrPres) in the blood of scrapie-infected sheep. Thus, this method was applied to blood from CJD-infected chimpanzees and humans. The threshold of detection achieved with immunocompetitive CE was 0.6 nm of synthetic peptide corresponding to the prion protein (PrP) C-terminus, and 2 nm of recombinant human PrP under the optimized conditions. However, the test was unable to distinguish between extracts of leucocytes from healthy and CJD-infected chimpanzees, and from healthy human donors and patients affected with various forms of CJD shown in Table 1 [83]. Extraction method based on interaction of antibodies specific to fluorescently labeled synthetic peptides and protein A Sepharose has been described. After elution, the amount of fluorescent peptide that was captured versus the total amount placed in the assay was evaluated by CZE-LIF. Of the three peptides used in this evaluation, it was found that the recovery was approximately 25 35% [78]. Also noncompetitive immunoassay for prion protein was established. FITC-labeled protein A (FITC-PrA) was used as a fluorescent probe to tag mab through noncovalent binding of FITC-PrA to the Fc region of the antibody. The FITC- PrA-Ab was incubated with the analyte, prion protein, under optimized condition, forming the immunocomplex FITC- PrA-Ab-PrP. The complex was separated and analyzed by CE. The addition of carboxymethyl- -cyclodextrin in the running buffer as dynamical coating reagent improved the reproducibility and the resolution. The complex was isolated in less than 1 min with theoretical plates of The estimated detection limit for PrP was 6 ng/ml. The method was successfully applied for testing blood samples from scrapie-infected sheep [79]. The application of carboxymethyl-cyclodextrin as a buffer additive suppressing the analyte adsorption and enhancing separation selectivity in the CE as well as mabs were used in the next work by the same authors [80]. The amount of both free and fluorescein-labeled peptide bound to antibody (immunocomplex) was determined by CE-LIF. In the presence of PrP, the peak height ratio of the immunocomplex and the free peptide was altered compared to control (Fig. 2A and B). These changes were directly proportional to the amount of PrP present. The reaction times of the antibody with either the peptide or the recombinant PrP was significantly improved (less than 1 min) using mabs as compared to polyclonal antibodies (16 18 h). The results of the blood assay were consistent with scrapie status of the sheep as determined postmortem by Western blot analysis [80]. The method evaluated for its performance in the preclinical diagnosis of bovine TSEs has been described by Jackman et Figure 2. The principle of immune detection of prion protein using CE. (A) Fluorescently labeled substrate binds antibody specific for prion protein. (B) In the presence of prion protein, this protein binds antibody specific for prion protein and the signal for complex of fluorescently labeled substrate with antibody specific for prion protein decreases. al. [81]. The blood samples from scrapie-infected sheep aged 7 12 months and of the scrapie-susceptible PrP genotypes Val-Arg-Gln/Val-Arg-Gln and Val-Arg-Gln/Ala-Arg-Gln were analyzed and the abnormal PrP was found. These results correlated with the postmortem diagnosis of scrapie. The sheep were preclinical and appeared normal at the time of testing, but later died with clinical disease approximately 12 months after the testing. In older animals and in those with clinical signs, a smaller percentage of animals was tested as positive. The application of an immunocapillary electrophoresis method developed for blood from patients with CJD is described. The test was evaluated by using clinical blood specimens from patients with variant (n = 5) or sporadic (n = 4) CJD and patients initially suspected of having CJD who were given an alternative diagnosis (n = 6). In this context, the immunocapillary electrophoresis assay was specific, but incompletely sensitive (55%). The method was unable to detect abnormal prion protein in variant CJD brain or spleen reference materials due to its loss during the extraction process [82]. Summary of electrolytes and detection limits is given in Table 2. It is of interest to note the lack of widespread popularity of CE in the fields of PrP Sc detection and prion disease diagnosis. Although the first report of PrP Sc detection by CE appeared over 15 years ago, the use of this and similar methodologies has not dominated the field of prion protein analysis. This is probably caused by the dominancy of commonly used immunochemical methods that are well established over decades and therefore difficult to compete with. However, we believe that advances in CE focused particularly on microfluidic devices and development of portable instruments enabling rapid, simple, and low-cost analyses would turn the attention back to this powerful analytical C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

102 3650 P. Sobrova et al. Electrophoresis 2012, 33, Table 2. LOD and electrolytes used for determination of prion proteins in various types of real samples Sample Electrolyte LOD REF Sheep brain 200 mm Tricine (ph 8.0) 10.0 fmol of unlabeled peptide [74] Sheep brain SDS gel CE 50 g [75] Sheep blood 0.6% CM-CD in 25 mm TAPS at ph ng/ml (or mass detection limit 1 pg) [80] Sheep brain 200 mm Tricine, ph 8.0, containing 0.1% n-octylglucoside 135 pg PrP Sc [76] and 0.1% BSA Sheep and elk blood 250 mm Tricine, ph 8.0, containing 0.1% n-octylglucoside 50 amol [77] and 0.1% BSA Chimpanzee and human blood 250 mm Tricine, ph 8.0, containing 0.1% n-octylglucoside 0.6 nm of synthetic peptide [83] and 0.1% BSA 2 nm of recombinant human PrP Sheep blood Carboxymethyl-beta-cyclodextrin For rprp was 6 ng/ml [79] technique. Even though numerous obstacles still have to be overcome. In some cases, analysis of complex biological samples by CE might be problematic requiring sample pretreatment procedures to be involved. However, application of modern isolation procedures such as extraction of target molecule by magnetic particles as well as hyphenation of sample pretreatment and analytical processes into the one miniature device based on lab-on-chip concept will increase the chances of CE for routine applicability. Furthermore, it is important to highlight the sensitivity issue. For diagnostic purposes, only yes/no information is required to distinguish between healthy and infected animal: according to the hypothesis only a molecule of infectious prion protein is able to convert other prion molecules and initiate the disease. Routinely used methods based on prion protein detection are required to utilize procedures for amplification of PrP Sc in the sample either by cell cultivation, protein misfolding cyclic amplification, or the use of an RNA ligand based adsorbent that improve the detection limits of several hundred-fold [84]. There is also another approach to PrP Sc determination that involves development of high sensitivity methods with extremely low limits of detection. We believe that analytical techniques such as CE, MS, and/or other spectroscopic methods may contribute not only to the identification of diseased individuals but also to better and more detailed understanding of the disease development, progress, and treatment efficiency. 3 Future perspective Expanding interest is focusing on inexpensive, portable, highthroughput, and sensitive integrated diagnostic devices, since traditional tools are labor-, cost-, and time-consuming and also have limited potential for usage in resource-limited settings. Efforts illustrate the great potential of miniaturization in developing point-of-care devices for molecular diagnostics. Recent advances in CE are focused primarily on microfluidic devices [85] due to the numerous advantages such as extremely short time of analysis, exceptionally low amount of sample required, and portability of the instrumentation. Also in the area of protein analysis, the chip-based CE is of a great interest. Due to the requirements for the detection sensitivity, LIF detection is the most commonly applied. The combination of lab-on-chip and fluorescent labels is of great interest for the protein detection. From the group of fluorescent labels quantum dots as a part of modern research area are attracting a great attention as excellent fluorescent labels with outstanding optical properties. These nanoparticles are made up of atoms with typical range of diameter from 1 to 10 nm. They have broad excitation spectra, narrow, tunable, and symmetric emission spectra, and exceptional photostability. Moreover, their surface is suitable for chemical modification thus enabling the specific interaction with a wide range of the target molecules. Quantum dots have been already employed for prion protein analysis [86] and opened numerous new possibilities in the field of in vivo imaging. Financial support from NanoBioTECell GA CR P102/11/1068, IGA IP 5/2012, and CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ is greatly acknowledged. The author P.S. is holder of Brno PhD talent financial aid. The authors have declared no conflict of interest. 4 References [1] Imran, M., Mahmood, S., Virol. J. 2011, 8, 559. [2] Prusiner, S. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, [3] Pan, K. M., Baldwin, M., Nguyen, J., Gasset, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I., Huang, Z. W., Fletterick, R. J., Cohen, F. E., Prusiner, S. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, [4] Prusiner, S. B., Science 1991, 252, [5] Kellett, K. A. B., Hooper, N. M., Prion 2009, 3, [6] Hainfellner, J. A., Wanschitz, J., Jellinger, K., Liberski, P. P., Gullotta, F., Budka, H., Acta Neuropathol. 1998, 96, [7] Millhauser, G. L., Annual Review of Physical Chemistry, Annual Reviews, Palo Alto 2007, pp [8] Miller, J. M., Jenny, A. L., Taylor, W. D., Marsh, R. F., Rubenstein, R., Race, R. E., J. Vet. Diagn. Invest. 1993, 5, C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

103 Electrophoresis 2012, 33, CE and CEC 3651 [9] Roucou, X., LeBlanc, A. C., J. Mol. Med. 2005, 83, [10] Roucou, X., Gains, M., LeBlanc, A. C., J. Neurosci. Res. 2004, 75, [11] Brown, D. R., Qin, K. F., Herms, J. W., Madlung, A., Manson, J., Strome, R., Fraser, P. E., Kruck, T., vonbohlen, A., SchulzSchaeffer, W., Giese, A., Westaway, D., Kretzschmar, H., Nature 1997, 390, [12] Brown, D. R., Metallomics 2011, 3, [13] Walter, E. D., Stevens, D. J., Visconte, M. P., Millhauser, G. L., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, [14] Singh, A., Isaac, A. O., Luo, X., Mohan, M. L., Cohen, M. L., Chen, F. S., Kong, Q. Z., Bartz, J., Singh, N., PLoS Pathog. 2009, 5, [15] Peggion, C., Bertoli, A., Sorgato, M. C., Biofactors 2011, 37, [16] Drago, D., Bettella, M., Bolognin, S., Cendron, L., Scancar, J., Milacic, R., Ricchelli, F., Casini, A., Messori, L., Tognon, G., Zatta, P., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2008, 40, [17] Parchi, P., Strammiello, R., Giese, A., Kretzschmar, H., Acta Neuropathol. 2011, 121, [18] Soto, C., Nat. Rev. Microbiol. 2004, 2, [19] Zsolnai, A., Anton, I., Kuhn, C., Fesus, L., Electrophoresis 2003, 24, [20] Grassi, J., Maillet, S., Simon, S., Morel, N., Vet. Res. 2008, 39. [21] Ugnon-Cafe, S., Dorey, A., Bilheude, J. M., Streichenberger, N., Viennet, G., Meyronet, D., de Paula, A. M., Perret-Liaudet, A., Quadrio, I., J. Virol. Methods 2011, 175, [22] Warwick, R. M., Armitage, W. J., Chandrasekar, A., Mallinson, G., Poniatowski, S., Clarkson, A., Cell Tissue Bank. 2012, 13, [23] Huzarewich, R., Siemens, C. G., Booth, S. A., J. Biomed. Biotechnol [24] Goldfarb, L. G., Cervenakova, L., Gajdusek, D. C., Curr. Mol. Med. 2004, 4, [25] Liberski, P. P., Folia Neuropathol. 2009, 47, [26] Rubenstein, R., Gray, P. C., Wehlburg, C. M., Wagner, J. S.,Tisone,G.C.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 246, [27] Birkmann, E., Schafer, O., Weinmann, N., Dumpitak, C., Beekes, M., Jackman, R., Thorne, L., Riesner, D., Biol. Chem. 2006, 387, [28] Fujii, F., Horiuchi, M., Ueno, M., Sakata, H., Nagao, I., Tamura, M., Kinjo, M., Anal. Biochem. 2007, 370, [29] Lodi, R., Parchi, P., Tonon, C., Manners, D., Capellari, S., Strammiello, R., Rinaldi, R., Testa, C., Malucelli, E., Mostacci, B., Rizzo, G., Pierangeli, G., Cortelli, P., Montagna, P., Barbiroli, B., Brain 2009, 132, [30] Galanaud, D., Haik, S., Linguraru, M. G., Ranjeva, J. P., Faucheux, B., Kaphan, E., Ayache, N., Chiras, J., Cozzone, P., Dormont, D., Brandel, J. P., Am. J. Neuroradiol. 2010, 31, [31] Murray, K. L., Knight, R. S. G., Summers, D., Collie, D. A. C., Will, R. G., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2005, 76, [32] Lasch, P., Schmitt, J., Beekes, M., Udelhoven, T., Eiden, M., Fabian, H., Petrich, W., Naumann, D., Anal. Chem. 2003, 75, [33] Beekes, M., Lasch, P., Naumann, D., Vet. Microbiol. 2007, 123, [34] Alvarez-Puebla, R. A., Agarwal, A., Manna, P., Khanal, B. P., Aldeanueva-Potel, P., Carbo-Argibay, E., Pazos- Perez, N., Vigderman, L., Zubarev, E. R., Kotov, N. A., Liz-Marzan, L. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, [35] Silva, C. J., Onisko, B. C., Dynin, I., Erickson, M. L., Requena, J. R., Carter, J. M., Anal. Chem. 2011, 83, [36] Arellano-Anaya, Z. E., Savistchenko, J., Mathey, J., Huor, A., Lacroux, C., Andreoletti, O., Vilette, D., PLoS One 2011, 6, e [37] Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N., Prion 2011, 5, [38] Edgeworth, J. A., Farmer, M., Sicilia, A., Tavares, P., Beck, J., Campbell, T., Lowe, J., Mead, S., Rudge, P., Collinge, J., Jackson, G. S., Lancet 2011, 377, [39] Brown, D. R., Wong, B. S., Hafiz, F., Clive, C., Haswell, S. J., Jones, I. M., Biochem. J. 1999, 344, 1 5. [40] Safar, J., Wille, H., Itrri, V., Groth, D., Serban, H., Torchia, M., Cohen, F. E., Prusiner, S. B., Nat. Med. 1998, 4, [41] Wadsworth, J. D. F., Joiner, S., Hill, A. F., Campbell, T. A., Desbruslais, M., Luthert, P. J., Collinge, J., Lancet 2001, 358, [42] Peralta, O. A., Eyestone, W. H., Prion 2009, 3, [43] Nunnally, B. K., Trac Trends Anal. Chem. 2002, 21, [44] Aguzzi, A., Heikenwalder, M., Miele, G., J. Clin. Invest. 2004, 114, [45] Colby, D. W., Zhang, Q., Wang, S., Groth, D., Legname, G., Riesner, D., Prusiner, S. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104, [46] Dudas, S., Yang, J. M., Graham, C., Czub, M., McAllister, T. A., Coulthart, M. B., Czub, S., PLoS One 2010, 5, e [47] Triantaphyllidou, I. E., Sklaviadis, T., Vynios, D. H., Anal. Biochem. 2006, 359, [48] Dong, C. F., Huang, Y. X., An, R., Chen, J. M., Wang, X. F., Shan, B., Lei, Y. J., Han, L., Zhang, B. Y., Han, J., Dong, X. P., Zoonoses Public Hlth. 2007, 54, [49] Korth, C., Stierli, B., Streit, P., Moser, M., Schaller, O., Fischer, R., Schulz-Schaeffer, W., Kretzschmar, H., Raeber, A., Braun, U., Ehrensperger, F., Hornemann, S., Glockshuber, R., Riek, R., Billeter, M., Wuthrich, K., Oesch, B., Nature 1997, 390, [50] Paramithiotis, E., Pinard, M., Lawton, T., LaBoissiere, S., Leathers, V. L., Zou, W. Q., Estey, L. A., Lamontagne, J., Lehto, M. T., Kondejewski, L. H., Francoeur, G. P., Papadopoulos, M., Haghighat, A., Spatz, S. J., Head, M., Will, R., Ironside, J., O Rourke, K., Tonelli, Q., Ledebur, H. C., Chakrabartty, A., Cashman, N. R., Nat. Med. 2003, 9, [51] Serbec, V. C., Bresjanac, M., Popovic, M., Hartman, K. P., Galvani, V., Rupreht, R., Cernilec, M., Vranac, T., Hafner, I., Jerala, R., J. Biol. Chem. 2004, 279, C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

104 3652 P. Sobrova et al. Electrophoresis 2012, 33, [52] Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, [53] Castilla, J., Saa, P., Morales, R., Abid, K., Maundrell, K., Soto, C., in: Kheterpal, I., Wetzel, R. (Eds.), Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt B, Elsevier Academic Press Inc, San Diego 2006, pp [54] Saa, P., Castilla, J., Soto, C., J. Biol. Chem. 2006, 281, [55] Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C., Nature 2001, 411, [56] Soto, C., Anderes, L., Suardi, S., Cardone, F., Castilla, J., Frossard, M. J., Peano, S., Saa, P., Limido, L., Carbonatto, M., Ironside, J., Torres, J. M., Pocchiari, M., Tagliavini, F., FEBS Lett. 2005, 579, [57] Parveen, I., Moorby, J., Allison, G., Jackman, R., Vet. Res. 2005, 36, [58] Jasik, A., Reichert, M., J. Vet. Diagn. Invest. 2006, 18, [59] Jasik, A., Reichert, M., Bull. Vet. Inst. Pulawy 2003, 47, [60] Wiese, U., Wulfert, M., Prusiner, S. B., Riesner, D., Electrophoresis 1995, 16, [61] Fink, J. K., Peacock, M. L., Warren, J. T., Roses, A. D., Prusiner, S. B., Hum. Mutat. 1994, 4, [62] Strom, A., Diecke, S., Hunsmann, G., Stuke, A. W., Proteomics 2006, 6, [63] Pan, T., Colucci, M., Wong, B. S., Li, R. L., Liu, T., Petersen, R. B., Chen, S., Gambetti, P., Sy, M. S., J. Biol. Chem. 2001, 276, [64] Hoffmann, T., Martin, M. M., Electrophoresis 2010, 31, [65] Moini, M., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2010, 24, [66] Nguyen, A., Moini, M., Anal. Chem. 2008, 80, [67] Heegaard, N. H. H., Kennedy, R. T., J. Chromatogr. B 2002, 768, [68] Shmykov, A. Y., Filippov, V. N., Foteeva, L. S., Keppler, B. K., Timerbaev, A. R., Anal. Biochem. 2008, 379, [69] Moser, A. C., Hage, D. S., Electrophoresis 2008, 29, [70] Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R., Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397, [71] Yeung, W. S. B., Luo, G. A., Wang, Q. G., Ou, J. P., J. Chromatogr. B 2003, 797, [72] Schmerr, M. J., Goodwin, K. R., Cutlip, R. C., J. Chromatogr. A 1994, 680, [73] Schmerr, M. J., Goodwin, K. R., Cutlip, R. C., Jenny, A. L., J. Microcolumn Sep. 1995, 7, [74] Schmerr, M. J., Goodwin, K. R., Cutlip, R. C., Jenny, A. L., J. Chromatogr. B 1996, 681, [75] Schmerr, M. J., Jenny, A., Cutlip, R. C., J. Chromatogr. B 1997, 697, [76] Schmerr, M. J., Jenny, A., Electrophoresis 1998, 19, [77] Schmerr, M. J., Jenny, A. L., Bulgin, M. S., Miller, J. M., Hamir, A. N., Cutlip, R. C., Goodwin, K. R., J. Chromatogr. A 1999, 853, [78] Jackman, R., Schmerr, M. J., Electrophoresis 2003, 24, [79] Yang, W. C., Schmerr, M. J., Jackman, R., Bodemer, W., Yeung, E. S., Anal. Chem. 2005, 77, [80] Yang, W. C., Yeung, E. S., Schmerr, M. J., Electrophoresis 2005, 26, [81] Jackman, R., Everest, D. J., Schmerr, M. J., Khawaja, M., Keep, P., Docherty, J., J. AOAC Int. 2006, 89, [82] Lourenco, P. C., Schmerr, M. J., MacGregor, I., Will, R. G., Ironside, J. W., Head, M. W., J. Gen. Virol. 2006, 87, [83] Cervenakova, L., Brown, P., Soukharev, S., Yakovleva, O., Diringer, H., Saenko, E. L., Drohan, W. N., Electrophoresis 2003, 24, [84] Nunnally, B. K., Anal. Lett. 2005, 38, [85] Pumera, M., Electrophoresis 2007, 28, [86] Zhang, L. Y., Zheng, H. Z., Long, Y. J., Huang, C. Z., Hao, J. Y., Zhou, D. B., Talanta 2011, 83, C 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

105 ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; HYNEK, D.; ADAM, V.; HUBALEK, J.; KIZEK, R. Electrochemical behaviour of native and denatured β-sheet breaker prion protein. Int. J. Electrochem. Sci., 2012, roč. 7. č. 2, s ISSN IF Abstrakt Prionové onemocnění jsou lidské a živočišné fatální neurodegenerativní onemocnění charakterizované strukturální změnou hostitelského buněčného prionového proteinu (PrP C ) na jeho pozměněnou isoformu PrP Sc. Konformační změna z α-helixu buněčného proteinu (PrPc) na strukturu β-skládaného listu pozměněného proteinu (PrP Sc ), významně změní i jeho funkce. Mutovaná forma (PrP Sc ) je extrémně rezistentní k buněčným degradačním procesům a může indukovat další konformační změny normálních prionů PrP C. Na genezi prionového onemocnění se pak podílí nedostatek fyziologického proteinu PrP C a nadbytek PrP Sc. Hlavním cílem této práce byla elektrochemické studium detekce β-konformace prionového proteinu. Pro tyto účely byla použita cyklická voltametrie (CV), diferenční pulzní voltametrie (DPV), diferenční pulzní voltametrie ve spojení s Brdičkovou reakcí (DPV Brdičkova reakce) a chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza (CPSA). Nejprve jsme se zaměřili na sledování základní elektrochemické charakteristiky prionových proteinů a jejich redoxní systém, kdy za pomocí CV byly detekovány 3 píky při potenciálech -0.5 V (pík 1), -1.2 V (pík 2) a -1.8 V (pík 3). Při optimalizovaných podmínkách (fosfátový pufr, ph 7,38 a doba akumulace 100 s) stanovených při použití DPV byl prion charakterizován použitím různých technik a byly stanoveny limity detekce. Adsorptivní přenosová technika spojená s výše zmíněnými metodami poskytuje velmi nízké limity detekce. Nejnižší limit detekce byl stanoven za pomocí AdTS CPSA, a byl 25 pmol v objemu 5 µl. CPSA je tedy velmi citlivou metodou pro studium chování prionových protein. Dále byl sledován vliv působení teploty denaturace. Jak jasně vyplývá z výsledků, získané signály prionových proteinů lineárně klesaly v závislosti na působení denaturační teploty při 99 C po dobu: 0, 15, 30, 45, a 60 min. Korelační koeficienty měřených závislostí byly 0,9929 (u CV), 0,9973 (u DPV), 0,9965 (u DPV Brdičkova reakce) a 0,9957 (u CPSA). Podíl autorky: 60 % textová část práce, 80 % experimentální část Podíl podpory externího projektu JCCM byl 100 %. 105

106 Int. J. Electrochem. Sci., 7 (2012) International Journal of ELECTROCHEMICAL SCIENCE Electrochemical Behaviour of Native and Denatured β-sheet Breaker Prion Protein Pavlina Sobrova 1, Marketa Ryvolova 1,2,3, David Hynek 1,2, Vojtech Adam 1,2, Jaromir Hubalek 2,3, Rene Kizek 1,2* 1 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ Brno, Czech Republic, European Union 2 Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ Brno, Czech Republic, European Union 3 Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ Brno, Czech Republic, European Union * kizek@sci.muni.cz Received: 2 July 2011 / Accepted: 8 November 2011 / Published: 1 February 2012 Prion diseases are fatal neurodegenerative and infectious disorders of humans and animals, characterized by structural transition of the host-encoded cellular prion protein (PrP C ) into the aberrantly folded pathologic isoform PrP Sc. The conformation change, from the α-helix in the natural protein form (PrP c ) to the β-sheet of the modified protein form (PrP Sc ), significantly influence the protein function. The mutated form (PrP Sc ) is extremely resistant to the cell degradation processes and may bind other PrP c molecules inducing the conformation change to the PrP Sc. The insufficiency of the physiological PrP c and toxic incidence of PrP Sc participate on the genesis of prion neurodegenerative diseases. The main aim of this study was to suggest electrochemical methods for detection of β-sheet breaker prion protein. For this purpose cyclic voltammetry (CV), differential pulse voltammetry (DPV), differential pulse voltammetry Brdicka reaction and chronopotentiometric stripping analysis (CPSA) were used. Primarily, the basic electrochemical behaviour of prion and its redox system was observed using CV where 3 various peaks at potential -0.5 V (peak 1), -1.2 V (peak 2) and -1.8 V (peak 3) were detected. Under the optimal conditions (phosphate buffer, ph 7.38 and time of accumulation 100 s), detected by DPV prion was characterized using different techniques and their limits of detection were found. Adsorptive transfer stripping technique coupled with the abovementioned methods offers very lower detection limits. The lowest limit detection were determined by CPSA AdTS i.e. 25 pmol in volume of 5 μl. CPSA is therefore a very sensitive tool for the studying of prion behaviour. Moreover, the influence of heat denaturation was observed. It clearly follows from the results obtained that signals of prion decreased linearly depending on the duration of the heat treatment at 99 C for various time intervals: 0, 15, 30, 45, and 60 min. The correlation coefficients of the measured dependencies as , , and were determined by CV, DPV, DPV Brdicka reaction and the most sensitive CPSA, respectively.

107 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Keywords: Prion protein (PrP Sc scrapie); Adsorptive transfer stripping technique; cyclic voltammetry (CV); differential pulse voltammetry (DPV); Brdicka reaction; Chronopotenciometric stripping analysis (CPSA) 1. INTRODUCTION It has been generally concluded that every infectious disease may be produced only by such agents with a nucleic acid. Professor Stanley B. Prusiner formulated the prion theory in 1982 for which he praised Nobel Prize in Physiology or Medicine in This theory assumes that there is a pathogenic agent of prion (proteinaceous infectious particle), an infectious protein. The other Nobel Prize was awarded to professor D.C. Gajdusek for his work focused on Kuru, the first human prion disease demonstrated to be infectious, which was associated with the practice of funerary cannibalism by the South Fore people of New Guinea in 1950s [1]. Figure 1. Prions (PrP SC ) have been held responsible for a number of degenerative brain diseases, including scrapie (a fatal disease of sheep and goats), kuru, bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly known as "mad-cow" disease), Creutzfeldt-Jacob disease (CJD), an unusual form of hereditary dementia known as Gertsmann-Straeussler-Scheinker disease (GSS) and fatal familial insomnia (FFI). Moreover, Alzheimer and Huntington disease are recently connected with protein-folding diseases. Prion protein is a biomolecule naturally occurring in the animal cells. This protein is present in all mammal cells and occurs primarily in neural cells and immune system cells. Its physiological function is not completely clear, however it is assumed to participate on synaptic transfer and cell differentiation. It may become infectious. Natural and infectious forms differ only by the spatial

108 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, conformation. The conformation change from the α-helix in the natural protein form (PrP c ) to the β- sheet of the modified protein form (PrP Sc ), significantly influence the protein function [2]. The infectious form (PrP Sc ) is extremely resistant to the cell degradation processes and may bind other PrP c molecules and change them to PrP Sc [3]. The insufficiency of the physiological PrP c and toxic incidence of PrP Sc participate on the genesis of prion neurodegenerative diseases (transmissible spongiform encephalopathies, TSE) [4]. Nine of the main diseases caused by prions are known. Four of these diseases occur in human and five in animals. The most frequent human prion disease (85 %) is Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) [5], which may be due to consumption of the food contaminated by the prions of diseased cow [5,6]. There are hypothesis relating prions to the other neurodegenerative diseases such as Alzheimer s or Huntington disease [7]. In the animal kingdom, bovine spongiform encephalopathy (BSE) is the most known, so called the disease of mad cows. With the outbreak of epidemics and discovery of BSE case almost everywhere in Europe, the question arises of how to improve screening methods and the possibility of detection of prions. Detection and quantification of prion is not simple due to the low amounts in biological samples especially during the early stages of disease. For this purpose, the method Protein-misfolding cyclic amplification (PMCA) for providing sensitivity improvement has been used [8]. Method is based on converting additional normal prion protein to the sample with infectious prion. PMCA involves repeated cycles on incubation and sonication. These repeated cycles can amplify the amount of prion protein present in the sample from four to 40 times in two weeks [9,10]. Analytical methods, which are used for prion detection are usually based on: (I) conformation dependent immunoassays, which are currently the most used assays for routine screening in plasma [11]. (II) Western blot assays [12] (III) CE based methodology [13] and (IV) spectroscopic method [14]. One of the current research directions is the increasing of the method sensitivity enabling of detection of extremely low amounts of prions in short time [15]. Suitable method seems to be electrochemistry. Square-wave voltammetry and cyclic voltammetry are commonly used for protein determination and provide very low limits of detection [16]. Other electrochemical method used for the determination of proteins is Brdicka reaction in connection with differential pulse voltammetry (PDV). Brdicka reaction has been used for the study of physiological concentration of proteins in the wide range of organisms and is widely applied as a diagnostic method in the clinical medicine and pharmacology [17]. Another electrochemical method based on monitoring of catalytic signals is chronopotentiometry stripping analysis (CPSA). CPSA in the combination with adsorptive transfer stripping technique is able to determine femtomolar concentrations of analyte in a very low sample volume (5 µl) [18]. Voltammetric methods were also used for analysis of prion proteins [19], however, their detailed characterization has not been done yet. The main objective of our work was to carry out the electrochemical behaviour of prion protein PrP Sc on mercury drop electrode. For these purpose fundamental electrochemical techniques like cyclic voltammetry (CV), differential pulse voltammetry (DPV), differential pulse voltammetry with Brdicka reaction (DPV Brdicka reaction) and chronopotentiometric stripping analysis (CPSA) were used. To reach very low limits of detection adsorptive transfer stripping technique (AdTs) was used. Moreover, we focused our attention on monitoring the signal change of native and denatured form of prion.

109 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, EXPERIMENTAL PART 2.1 Chemicals Prion protein β sheet breaker peptide fragment (Asp-Ala-Pro-Ala-Ala-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala- Val-Pro-Val; FW = ) was purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, USA) and dissolved by 8.77 M trifluoracetic acid bought from the same supplier. Sodium phosphate and other used chemicals were purchased from Sigma Aldrich. Working standard solutions were prepared daily by dilution of the stock solutions. The ph value was measured using WTW inolab Level 3 with terminal Level 3 (Weilheim, Germany), controlled by personal computer program (MultiLab Pilot; Weilheim, Germany). The ph-electrode (SenTix- H, ph 0 14/3M KCl) was regularly calibrated by set of WTW buffers (Weilheim, Germany). 2.2 Electrochemical measurements Electrochemical measurements were performed with AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) connected to VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland), using a standard cell with three electrodes. The working electrode was a hanging mercury drop electrode (HMDE) with a drop area of 0.4 mm 2. The reference electrode was an Ag/AgCl/3M KCl electrode and the auxiliary electrode was a graphite electrode. The supporting electrolyte was prepared by mixing buffer components except sodium chloride. For smoothing and baseline correction the software GPES 4.4 supplied by EcoChemie was employed Adsorptive transfer stripping technique Principle of the AdTS is based on the strong adsorbing of the studied analyte on the electrode surface at an open electrode circuit. The excess of analyte is rinsed from the surface of the working electrode in the buffer. The adsorbed analyte is finally detected in the presence of indifferent electrolyte. Volume of studied sample was 5 μl in all methods. Time of adsorption was tested in range from 10 to 120s Cyclic voltammetry (CV) and PrP Sc Prion protein was studied using CV. Amount of adsorbed sample was 5 μl. Time of accumulation, ph and electrolyte type was optimized. Volume of supporting electrolyte was 5 ml in the electrochemical cell. CV parameters were as follows: an initial potential 0 V, an end potential -1.9 V, step potential 2.44 mv, scan rate from 20 to 640 mv/s. All experiments were carried out at room temperature (22-24 C)

110 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Differential pulse voltammetry and PrP Sc The amount of prion PrP Sc was measured using AdTS DPV. Following supporting electrolytes were tested: 0.5 M sodium phosphate in ph range from 5.59 to 8.04, borate in ph range from 7.09 to 9.11 and acetate in ph range from 3.8 to 5.6. DPV parameters were follows: an initial potential of 0.2 V, an end potential 0.8 V, a modulation time s, a time interval 0.2 s, a step potential of 1.05 mv/s, a modulation amplitude of 250 mv, E ads = 0 V. All experiments were carried out at room temperature (22 24 C). The analysed DPV samples were deoxygenated prior to measurements by purging with argon (99.999%) saturated with water for 120 s Differential pulse voltammetry - Brdicka reaction and PrP Sc DPV Brdicka reaction was also used for prion determination. The Brdicka supporting electrolyte containing 1 mm Co(NH 3 ) 6 Cl 3 and 1 M ammonia buffer (NH 3 (aq) + NH 4 Cl, ph = 9.6) was used and changed per one analysis. DPV parameters were as follows: initial potential of -0.7 V, end potential of V, modulation time s, time interval 0.2 s, step potential 2 mv, modulation amplitude -250 mv, E ads = 0 V. All experiments were carried out at temperature of 4 C (Julabo F12 cooler, Germany) Peak H and PrP Sc Constant current CPSA was used for the determination of prion by recording the inverted time derivation of potential (de/dt) -1 as a function of potential E. CPSA parameters were as follows: potential limit -1.9 V, I str of 1 µa, max. time of measurement 600 s, temperature 20 C, supporting electrolyte phosphate buffer (ph 7.38). 2.3 Descriptive statistics and estimation of detection limit Data were processed using MICROSOFT EXCEL (USA). Results are expressed as mean ± standard deviation (S.D.) unless noted otherwise (EXCEL ). The detection limits (3 signal/noise, S/N) were calculated according to Long and Winefordner [20], whereas N was expressed as standard deviation of noise determined in the signal domain unless stated otherwise. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1 Adsorptive transfer stripping technique In the fact, this technique belongs to hyphenated ones because composes of two different processes: i) accumulation and ii) transfer. The analytical purpose of the accumulation process has been found more than fifty years ago when working with the sc. oscillographic polarography [21,22]

111 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, and this technique was termed as adsorptive stripping technique (AdS). The mercury dropping electrode was polarized with alternating current several seconds after the mechanical drop detachmentin this quiescent period the electrode was held at the open circuit potential, during which certain compounds with adsorptive properties could be adsorbed on the working electrode surface [23,24]. Other historical remarks of this technique were reviewed by Kalvoda [21]. Even if this technique markedly enhance sensitivity of an electrochemical measurements, decrease detection limits for target molecules, the affecting by various interferences still remains. Thus, a real sample must be homogenized with respect to analyte, if the sample is measured by this technique. To prevent interferences Palecek and his colleagues brilliantly improved the adsorptive stripping technique by so-called transfer step [25]. The main improving is based in electrode removing from a solution after accumulating of a target molecule on its surface, rinsing of the electrode and transferring to a pure supporting electrolyte, where no interferences are present. The scheme of adsorptive transfer stripping technique (AdTS) can be summarized to the following steps: (1) renewing of a surface of a working electrode; (2) adsorbing of target molecule in a drop solution onto the surface at open circuit and/or superimposed potential; (3) washing the working electrode in a solution; (4) transferring of the washed electrode to a supporting electrolyte and measurement of adsorbed target molecules (Fig. 2) R W A Figure 2. Scheme of using of adsorptive transfer stripping technique for study of prions by various techniques. Renewed surface of HMDE (1) is placed to drop containing prion standard (2) where Prion is bond only. Other low molecular substances are washed out in the following step (3) HMDE electrode is placed to supporting electrolyte (4) and analysed Cyclic voltammetry CV is perhaps the most widely used electrochemical technique, and is frequently used for the characterization of a redox system and is often the first experiment performed in an electroanalytical study. It can provide rapid information about the number of redox states of the electroactive species, as

112 ln(na) Peak height [na] Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, well as qualitative information about the stability of these oxidation states and the electron transfer kinetics [26,27]. CV follows the potential scans from the starting potential to the end potential, then reverse from the end potential back to the starting potential. CV is suitable for protein detection as described already in the paper of Rezaei-Zarchi et al. [16]. For this purpose we decided to use CV for basic electrochemical characterization of prion protein. It was observed using AdTS cyclic voltammetry that prions provided oxidations signals only. In oxidation part of cyclic voltammograms, three peaks at potential -0.5 V (peak 1), -1.2 V (peak 2) and -1.8 V (peak 3) were detected (Fig. 3A), which indicated three electroactive moieties in prion molecule. Based on the primary structure of the protein fragment, there were NH 2 and OH moieties, which can undergo oxidation. However, detection of three peaks can be associated with some structural features of this protein as β-sheet conformation. Further, this method was optimized using various scan rates from 20 to 640 mv/s (inset in Fig. 3A). It was observed that the increasing scan rate enhanced the height of all detected peaks. Logarithms of peak height were plotted against logarithm of scan rate. The obtained dependencies revealed that peak 2 with the most linear regression line (R 2 higher than 0.9) is diffusion controlled process. The other peaks (peak 1 and peak 3) are close to logarithmic dependence, which indicate some adsorption-desorption process and structural controlled processes. Besides this, the resolution of the detected peaks decreased at highest used scan rates, which can be associated with the fact that redox processes are slower and, thus, structural dependent. In order to use one of scan rates for calibration of prion protein, the scan rate of 160 mv/s was used. As a peak suitable for calibration, peak 2 was employed due to the fact that the electrode process is diffusion controlled and well correlates with the concentration of prion protein. With increasing concentration the growing peak 2 was observed (Fig. 3B). The calibration curve was measured (R 2 higher than 0.9) and the detection limit 32 μg/ml was estimated as 3 S/N. A electrolyte 1 μa 20 mv/s 40 mv/s 80 mv/s 160 mv/s 320 mv/s 640 mv/s Peak Peak 2 Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 1 y = x R² = y = x R² = y = x R² = ln(mv/s) E / V B Potential [V] µg/ml 63 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Peak 2 50 na y = x R² = Concentration [μg/ml] Figure 3. CV A) Dependence of scan rate on peaks height. The peaks heights enhance with increasing scan rate. B) Dependence on concentration. With increasing concentration enhance the peak height. Calibration curve

113 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Differential pulse voltammetry DPV is an extremely useful technique for measuring trace levels of organic and inorganic species. In DPV, fixed-magnitude pulses superimposed on a linear potential ramp are applied to the working electrode at a time just before the end of the drop. The current is sampled twice, just before the pulse application and again late in the pulse life. The first current is instrumentally subtracted from the second, and this current difference is plotted versus the applied potential. In addition to improvements in sensitivity and resolution, the technique can provide information about the chemical form in which the analyte appears [26]. Figure 4. AdTS DPV. A) Dependence of peak height on time of accumulation. Current response enhanced with the increasing time of accumulation. The highest peak was determined under 100 s long accumulation. B) Phosphate buffer. Dependence of peak height on ph. Electrochemical response enhanced with the increasing ph. The highest electrochemical response was determined in ph C) Borate buffer: Dependence of peak height on ph. The highest response was determined in ph Higher values of ph decreased the peak height. D) Acetate buffer: Dependence of peak height ph [%]. The highest response was determined at ph 5.6. In this study AdTS DPV was employed for prions electrochemical characterization as electrochemical method more sensitive compared to CV. Primarily, the method was optimized to achieve the best condition for prion detection. Particularly, we tested the following conditions as time of accumulation, buffer composition and ph of the supporting electrolyte. Determining dependence of peak height on time of accumulation showed that current response enhanced with increasing time of

114 Peak height [na] Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, accumulation (Fig. 4A). The highest peak was determined under 100 s long accumulation. Longer time of accumulation provided also sufficient responses but due to formation of multiple layers the signal slightly decreased (inset in Fig. 4A). Moreover, the dependence of prion protein peak height on buffer composition and its ph was tested. As buffers phosphate, borate and acetate buffers were chosen. The ph range was from 3.8 to 5.6 in acetate buffer, ph from 6.24 to 8.04 in phosphate buffer and ph from 7.09 to 9.11 in borate buffer. Generally phosphate buffer provided higher signals of the same concentration of prion (125 μg/ml) compared to borate and acetate buffer. The highest electrochemical response was observed in ph 7.38 in the presence of phosphate buffer (Fig. 4B). Despite the fact that borate buffer of ph 7.38 also gave good results, the signal did not reach the phosphate buffer values (Fig. 4C). In addition, acetate buffer indicated increasing trend in peak height but the measured heights were not sufficient to other buffers. This phenomenon, the highest peak of prion determined at neutral ph, can be associated with the fact that structure and charges of amino acids moieties of prions is dependent on ph and physiological conditions are the most convenient. Under the optimal conditions (phosphate buffer, ph 7.38 and time of accumulation 100 s), the calibration curve was measured with equation y = 0.162x and regression coefficient R 2 higher than This shows very good linearity of the electrochemical response on concentration of prion protein. Considering the fact that prions are still of interest of numerous scientists, DPV fulfils demand on the detection of this protein in real samples after pre-treatment. The detection limit as 16 μg of prion protein per ml was estimated (3 S/N) i.e. 50 pmol in 5 µl drop (Fig. 5A). The very well developed signals are shown in Fig. 5B. A y = 0.162x R² = Concentration [μg/ml] B 50 na 16 μg/ml 32 μg/ml 63 μg/ml 125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml Potential [V] Figure 5. DPV. A) Calibration curve with regression coefficient R 2 = B) DP voltammograms of various prion protein concentrations. The peak height enhanced with the increasing concentration of prion proteins. Tested concentration range was from 500 μg/ml to 16 μg/ml. 3.4 Differential pulse voltammetry Brdicka reaction DPV-Brdicka reaction belong to the most common methods used for the determination of proteins. The method for polarographic determination of proteins containing sulfhydryl groups using

115 I [na] Area [nc] Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, mercury electrode was developed by Brdicka in thirties of the last century [17,28,29] and several times optimized [30-37].. The mechanism of the reaction is based on the catalytic evolution of hydrogen on mercury electrodes from solutions of protein containing SH group in ammonia buffer and hexaamminecobalt(iii) chloride complex (Co(NH 3 ) 6 Cl 3 ) called Brdicka solution [38]. A Concentration 500 μg/ml 250 μg/ml 125 μg/ml 63 μg/ml Co na RS 2 Co Cat 2 50 na B Potential [V] C Peak Co Peak RS 2 Co Peak Cat Peak Co 1 Peak RS 2 2Co Peak Cat Potential [V] y = x R² = y = x R² = y = x R² = Potential [V] y = x R² = y = x R² = y = x R² = Figure 6. AdTS DPV Brdicka reaction. A) DP voltammograms of various prions concentrations. Cat 2 peak enhanced with increasing concentration. This signal corresponds to prion concentration. B) Dependence of Co 1, RS 2 SH and Cat 2 peaks height on concentration. Peak 3 linearly increases with prion concentration in sample. C) Dependence of Co 1, RS 2 SH and Cat 2 peaks height on peak area. The mechanisms of the reaction is not elucidated in detail, but it is expected that the cobalt(ii) complex with protein, peptide or basic nitro compounds play important role in catalytic process [33]. Interaction between cobalt(ii) ion and protein causes decreasing of cobalt peak and occurring two new voltammetric peaks at potential area from -1.2 to -1.5 V. The reduction of complex R(SH) 2 and Co(II) at potential app V corresponds to the first catalytic signal (RS 2 Co). Other two signals Cat 1 and Cat 2 correspond to the reduction of hydrogen at the mercury electrode and can be used for

116 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, quantification because their height is proportional to concentration of MT. In addition, the signal called Co 1 could occasionally result from reduction of [Co(H 2 O) 6 ] 2+ [39]. It was observed formation of three prion signals Co 1, RS 2 Co and Cat 2 in potential -0.9 V, V and -1.5 V, respectively, by AdTS DPV Brdicka reaction (Fig. 6A). The signal Cat1 was not observed, which can be related with the fact that this signal can be overlapped by higher and wider RS 2 Co peak. It clearly follows from the results obtained that the character of the mentioned prion signals changes with different prion amount. Signal Co 1 decreased and shifted to more positive potential with higher prion concentration. The signal RS 2 CO markedly decreased with the increasing concentration of prion but the position of peak remained (Fig. 6C). The other mentioned prion signals of Brdicka reaction Cat 2 was getting well-developed and separated with the increasing prion concentration. As it has been published, the height of catalytic signal Cat 2 is directly proportional to the concentration of protein [17,35,36,40]. This signal was subsequently employed for the measurement of prion concentrations as follows 16, 32, 64, 125, 250, 500 μg/ml were used. The peak height increased linearly with the increasing prion concentration R 2 = 0.99 and regression equation y = x (Fig. 6B). Recalculation on the peak area gave the same results, which confirmed that the catalytic peak was well developed (Fig. 6C). The detection limit of DPV was estimated as 50 pmol in 5 µl drop (3 S/N). 3.5 Chronopotentiometric stripping analysis peak H CPSA measures the evolution of hydrogen from the supporting electrolyte catalysed by the presence of a protein. This method is a highly sensitive technique commonly used for the analysis of proteins with detection limits at subnanomolar and lower levels [41]. CPSA has been used for the detection of several biologically important peptides [42,43] and proteins such as metallothionein [36,44-49], α-synuclein protein [50], MutS protein [51], glutathione-s-transferase [52], thrombin [53]. Compared to voltammetry CPSA allows one to reach more negative potentials necessary to obtain a well-developed peak H, which in voltammetry is too close to the background discharge. In this paper, CPSA was therefore used to analyse prion at mercury. For the determination of prion using adsorptive transfer stripping technique in connection with chronopotentiometric stripping analysis (AdTS CPSA) dependence of dt/de on E was recorded. Prion gave a distinct, sharp chronopotentiometric signal at very negative potentials (about V), also called as the "peak H" (inset in Fig. 7). No baseline correction was necessary to measure this peak. Characteristic prion concentration dependence was obtained under 100 long time of accumulation measured in phosphate buffer with ph 7.38 and temperature-controlled supporting electrolyte at 25 C (Fig. 7). This dependence was linear with regression equation y = x and coefficient R 2 = ). The estimated detection limit (3 S/N) was 25 pmol in 5 µl drop. CPSA is therefore a very sensitive tool for the study of prion behaviour.

117 dt/de [s/v] Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, y = x R² = Concentration [µg/ml] 126 µg/ml 63 µg/ml 32 µg/ml 16 µg/ml 8 µg/ml 500 µg/ml 250 µg/ml 5000 dt/de Potential [V] Figure 7. AdTS CPSA calibration curve of prion and their voltammograms in concentration range from 8 μg/ml to 500 μg/ml. The peak enhanced with the increasing concentration. The highest responses ( s/v) was determined at concentration 500 μg/ml in potential V. 3.6 Native and denatured prion Protein denaturation is a complex process [54,55] and its complete understanding requires taking into consideration numerous aspects such as net charge, protein structure, environmental conditions (e.g. electrolyte ph and concentration) as well as equilibrium of folded and unfolded protein form. Elevated temperature is one of the most commonly used approaches for protein denaturation [56-59]. It is well known that at elevated temperatures α-prp converted rapidly and irreversibly to the thermodynamically more stable β-sheet form [60,61]. Electrochemistry seems to be powerful tool for studying of protein denaturation and renaturation [50,57,58,62-65]. In the present study, the behaviour of native and denatured form of prion was studied using all abovementioned methods. It clearly follows from the obtained results that signals of prion decreased linearly depending on the duration of the heat treatment at 99 C for various time intervals as 0, 15, 30, 45, and 60 min. The correlation coefficients of the measured dependencies as , , and were determined by CV (Fig. 8A), DPV (Fig. 8B), DPV Brdicka reaction (Fig. 8C) and the most sensitive CPSA (Fig. 8D), respectively. Electrochemical signals decreased with the increasing time of thermal treatment in all applied methods. The aggregation rate is more sensitive in case of DPV and CPSA where the prion amount decreased more than six times against native prion (0 min. of denaturation). This phenomenon suggests that the thermal treatment causes significant changes in the protein structure. Thermal denaturation is responsible for an irreversible precipitation leading to the aggregation of the denatured prion molecules and creating an undefined polymeric structure.

118 Peak height [na] Peak height [na] Peak height [na] dt/de [s/v] Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, CV y = x A B y = x C 80 y = x D R² = R² = R² = Time of denaturation [min] DPV DPV Brdicka reaction CPSA y = -3.08x R² = Time of denaturation [min] Time of denaturation [min] Time of denaturation [min] Figure 8. Dependence of peak height on time of heat denaturation at 99 C for 0, 15, 30, 45 and 60 min. measured by A) cyclic voltammetry, B) Differential pulse voltammetry, C) Differential pulse voltammetry Brdicka reaction and D) Chronopotentiometric stripping analysis. With longer influence of height temperatures the signal significantly decreased. 4. CONCLUSIONS A great attention on analytical determination of prion protein is paid. Electrochemical methods represent an excellent tool for such studies. As we report in the paper, adsorptive transfer stripping technique coupled with various methods represents powerful tool to detect very low concentration of specific protein. Moreover, the results of denaturation undergo to creation of more complex structures in prion molecule during heat treatment. ACKNOWLEDGEMENTS The financial support from NANOSEMED GA AV KAN , NanoBioTECell GA CR P102/11/1068, RECAMT GA AV IAA and CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ is highly acknowledged. The author P.S. is Holder of Brno PhD Talent Financial Aid. The results were presented at 11 th Workshop of Physical Chemists end Electrochemists held in Brno, Czech Republic. References 1. D. C. Gajdusek and V. Zigas, N. Engl. J. Med., 257 (1957) S. B. Prusiner and S. J. Dearmond, Annual Review of Neuroscience, 17 (1994) O. Nicolas, R. Gavin and J. A. del Rio, Brain Res. Rev., 61 (2009) H. F. Ji and H. Y. Zhang, Trends Biochem.Sci., 35 (2010) J. W. Ironside, Haemophilia, 16 (2010) S. Ugnon-Cafe, A. Dorey, J. M. Bilheude, N. Streichenberger, G. Viennet, D. Meyronet, A. M. de Paula, A. Perret-Liaudet and I. Quadrio, J. Virol. Methods, 175 (2011) T. Yokoyama and S. Mohri, Curr. Med. Chem., 15 (2008) G. P. Saborio, B. Permanne and C. Soto, Nature, 411 (2001) C. Soto, G. P. Saborio and L. Anderes, Trends Neurosci., 25 (2002) 390.

119 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, C. Soto, L. Anderes, S. Suardi, F. Cardone, J. Castilla, M. J. Frossard, S. Peano, P. Saa, L. Limido, M. Carbonatto, J. Ironside, J. M. Torres, M. Pocchiari and F. Tagliavini, FEBS Lett., 579 (2005) D. Volkel, K. Zimmermann, I. Zerr, M. Bodemer, T. Lindner, P. L. Turecek, S. Poser and H. P. Schwarz, Transfusion, 41 (2001) R. C. Hartwell, M. S. Nelson, M. M. Kislan, C. J. Stenland, J. L. C. Miller, D. Y. Pifat, S. R. Petteway and K. Cai, J. Virol. Methods, 125 (2005) B. K. Nunnally, Trac-Trends Anal. Chem., 21 (2002) P. Carmona, E. Monleon, M. Monzon, J. J. Badiola and J. Monreal, Chem. Biol., 11 (2004) P. R. Foster, Ann. Med., 32 (2000) S. Rezaei-Zarchi, A. A. Saboury, J. Hong, H. Ghourchian, P. Norouzi, A. A. Moosavi-Movahedi, M. R. Ganjali and A. Javed, Biotechnol. Appl. Biochem., 47 (2007) R. Brdicka, M. Brezina and V. Kalous, Talanta, 12 (1965) R. Kizek, L. Trnkova and E. Palecek, Anal. Chem., 73 (2001) A. Loksztejn, W. Dzwolak and P. Krysinski, Bioelectrochemistry, 72 (2008) G. L. Long and J. D. Winefordner, Anal. Chem., 55 (1983) A R. Kalvoda, Electroanalysis, 12 (2000) D. Hynek, J. Prasek, P. Koudelka, J. Chomoucka, L. Trnkova, V. Adam, J. Hubalek and R. Kizek, Curr. Phys. Chem., in press (2011). 23. R. Kalvoda, Collect. Czech. Chem. Commun., 21 (1956) R. Kalvoda and J. Macku, Collect. Czech. Chem. Commun., 21 (1956) E. Palecek and I. Postbieglova, J. Electroanal. Chem., 214 (1986) J. Wang, Analytical Electrochemistry, Wiley-VCH, New York, A. J. Bard and L. R. Faulkner, Electrochemical methods - Fundamentals and applications, Wiley- VCH, New York, R. Brdicka, Coll. Czech. Chem. Commun., 5 (1933) R. Brdicka, Nature, 142 (1938) R. W. Olafson, Bioelectrochem. Bioenerg., 19 (1988) R. W. Olafson and P. E. Olsson, Meth. Enzymol., 205 (1991) R. W. Olafson and R. G. Sim, Anal. Biochem., 100 (1979) B. Raspor, J. Electroanal. Chem., 503 (2001) J. Petrlova, D. Potesil, R. Mikelova, O. Blastik, V. Adam, L. Trnkova, F. Jelen, R. Prusa, J. Kukacka and R. Kizek, Electrochim. Acta, 51 (2006) V. Adam, J. Baloun, I. Fabrik, L. Trnkova and R. Kizek, Sensors, 8 (2008) I. Fabrik, S. Krizkova, D. Huska, V. Adam, J. Hubalek, L. Trnkova, T. Eckschlager, J. Kukacka, R. Prusa and R. Kizek, Electroanalysis, 20 (2008) S. Krizkova, I. Fabrik, V. Adam, J. Kukacka, R. Prusa, L. Trnkova, J. Strnadel, V. Horak and R. Kizek, Electroanalysis, 21 (2009) M. Heyrovsky, Electroanalysis, 12 (2000) B. Raspor, M. Paic and M. Erk, Talanta, 55 (2001) J. Petrlova, M. Masarik, D. Potesil, V. Adam, L. Trnkova and R. Kizek, Electroanalysis, 19 (2007) E. Palecek and V. Ostatna, Electroanalysis, 19 (2007) M. Tomschik, L. Havran, M. Fojta and E. Palecek, Electroanalysis, 10 (1998) R. Selesovska-Fadrna, M. Fojta, T. Navratil and J. Chylkova, Anal. Chim. Acta, 582 (2007) R. Kizek, L. Trnkova and E. Palecek, Analytical Chemistry, 73 (2001) I. Sestakova, M. Kopanica, L. Havran and E. Palecek, Electroanalysis, 12 (2000) L. Trnkova, R. Kizek and J. Vacek, Bioelectrochemistry, 56 (2002) M. Strouhal, R. Kizek, J. Vecek, L. Trnkova and M. Nemec, Bioelectrochemistry, 60 (2003) 29.

120 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, V. Adam, J. Petrlova, J. Wang, T. Eckschlager, L. Trnkova and R. Kizek, PLoS ONE, 5 (2010) e J. Petrlova, S. Krizkova, O. Zitka, J. Hubalek, R. Prusa, V. Adam, J. Wang, M. Beklova, B. Sures and R. Kizek, Sens. Actuator B-Chem., 127 (2007) M. Masarik, A. Stobiecka, R. Kizek, F. Jelen, Z. Pechan, W. Hoyer, T. M. Jovin, V. Subramaniam and E. Palecek, Electroanalysis, 16 (2004) E. Palecek, M. Masarik, R. Kizek, D. Kuhlmeier, J. Hassmann and J. Schulein, Anal. Chem., 76 (2004) M. Brazdova, R. Kizek, L. Havran and E. Palecek, Bioelectrochemistry, 55 (2002) J. L. A. Sanchez, E. Baldrich, A. E. G. Radi, S. Dondapati, P. L. Sanchez, I. Katakis and C. K. O'Sullivan, Electroanalysis, 18 (2006) M. V. Piaggio, M. B. Peirotti and J. A. Deiber, Electrophoresis, 28 (2007) J. Y. Kim, S. H. Ahn, S. T. Kang and B. J. Yoon, J. Colloid Interface Sci., 299 (2006) J. K. Myers, C. N. Pace and J. M. Scholtz, Protein Sci., 4 (1995) V. Ostatna, H. Cernocka and E. Palecek, J. Am. Chem. Soc., 132 (2010) V. Ostatna and E. Palecek, Electrochim. Acta, 53 (2008) C. Teijeiro, K. Nejedly and E. Palecek, J. Biomol. Struct. Dyn., 11 (1993) H. Zhang, J. Stockel, I. Mehlhorn, D. Groth, M. A. Baldwin, S. B. Prusiner, T. L. James and F. E. Cohen, Biochemistry, 36 (1997) F. Sokolowski and D. Naumann, Vib. Spectrosc., 38 (2005) D. Potesil, R. Mikelova, V. Adam, R. Kizek and R. Prusa, Protein J., 25 (2006) V. Ostatna, F. Kuralay, L. Trnkova and E. Palecek, Electroanalysis, 20 (2008) E. Palecek and V. Ostatna, Analyst, 134 (2009) E. Palecek, V. Ostatna, M. Masarik, C. W. Bertoncini and T. M. Jovin, Analyst, 133 (2008) by ESG (

121 ŠOBROVÁ, P.; BLAŽKOVÁ, I.; CHOMOUCKÁ, J.; DRBOHLAVOVÁ, J.; VACULOVIČOVÁ, M.; KOPEL, P.; HUBÁLEK, J.; KIZEK, R.; ADAM, V. Quantum Dots and Prion Proteins, Is This New Challenge for Neurodegenerative Disease Imaging? Prion, 2013, roč. 7. č. 5. s ISSN , IF 2,850 Abstrakt Diagnostika infekčních onemocnění může být prováděna prostřednictvím imuno metod nebo amplifikací nukleové kyseliny, která je specifická k nakažlivému původci. Nicméně přenosná spongiformní encefalopatie, s pozměněným prionovým proteinem jako infekčním původcem nese stejnou sekvenci nukleových kyselin jako přirozeně se vyskytující prionový protein. Další problém s diagnostikou onemocnění založené na detekci PrP Sc je, že patologická forma PrP se hojně vyskytuje v mozku pouze v pozdních stádiích vývoje onemocnění. Diagnostika prionových proteinů tudíž představuje výzvu, kdy hostitel může být nositelem nemoci po celé měsíce až roky dokud se neprojeví příznaky onemocnění. Z tohoto důvodu jsme sumarizovali nové možnosti in vivo metod pro detekci přítomnosti patologických prionových proteinů a jejich vztah k neurodegenerativním onemocněním. V tomto článku jsou diskutovány možnosti jejich budoucích možností použití s konkrétním cílem použití kvantových teček jako fluorescenční značky. Podíl autorky: 30 % textová část práce Podíl podpory externích projektů DOC_01/2012 CEITEC a JCCM byl 80 % a 20 %. 121

122 Review Prion 7:5, 1 10; September/October 2013; 2013 Landes Bioscience Review Quantum dots and prion proteins Is this a new challenge for neurodegenerative diseases imaging? Pavlina Sobrova 1,2, Iva Blazkova 1, Jana Chomoucka 2, Jana Drbohlavova 2, Marketa Vaculovicova 1,2, Pavel Kopel 1,2, Jaromir Hubalek 2, Rene Kizek 1,2, and Vojtech Adam 1,2,* 1 Department of Chemistry and Biochemistry; Faculty of Agronomy; Mendel University in Brno; Brno, Czech Republic EU; 2 Central European Institute of Technology; Brno University of Technology; Brno, Czech Republic EU; Keywords: prion protein, quantum dots, neurodegenerative disease, imaging, label A diagnostics of infectious diseases can be done by the immunologic methods or by the amplification of nucleic acid specific to contagious agent using polymerase chain reaction. However, in transmissible spongiform encephalopathies, the infectious agent, prion protein (PrP Sc ), has the same sequence of nucleic acids as a naturally occurring protein. The other issue with the diagnosing based on the PrP Sc detection is that the pathological form of prion protein is abundant only at late stages of the disease in a brain. Therefore, the diagnostics of prion protein caused diseases represent a sort of challenges as that hosts can incubate infectious prion proteins for many months or even years. Therefore, new in vivo assays for detection of prion proteins and for diagnosis of their relation to neurodegenerative diseases are summarized. Their applicability and future prospects in this field are discussed with particular aim at using quantum dots as fluorescent labels. Introduction Alzheimer disease (AD) is characterized by the formation of senile plaques composed of the amyloid-β (Aβ) peptide and neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated Tau. However, it is the accumulation of Aβ in the brain that appears to be critical for the pathogenesis of AD. The prion protein (PrP, Fig. 1) is involved in neurodegeneration via its conversion from the normal cellular form, PrP C, to the infectious form, PrP Sc, which is the causative agent of the transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), including Creutzfeldt-Jakob disease (CJD). 2-4 While there is an established role for PrP C in TSEs, the physiological role of PrP C has still not been fully elucidated. Roles in metal homeostasis, neuroprotective signaling, lymphocyte activation, neurite growth, synaptogenesis, cellular signaling, cell viability, and cellular response to oxidative stress have all been proposed There are many neuropathological similarities and genetic links between AD and prion diseases. The coexistence of AD pathology in CJD has been reported 11 and PrP C has been shown to co-localize with Aβ in plaques. These PrP C -Aβ plaques have been found in most CJD patients with associated AD-type pathology and it has been proposed that PrP C may promote Aβ plaque formation. 12,13 A genetic correlation between PrP C and AD has also been reported. 14,15 A systematic meta-analysis of AD genetic association studies revealed that the gene encoding PrP C (PRNP) is a potential AD susceptibility gene and the Met/Val 129 polymorphism in PRNP has been determined as a risk factor for early-onset AD. 16 Current Diagnostics of Prion Protein Related Diseases Diagnostics of infectious diseases is a relatively wellestablished area. It can be done either by the immunologic methods or by the amplification of a nucleic acid specific to infectious agent using polymerase chain reaction (PCR). 17 However, in TSEs, the infectious agent, PrP, has the same sequence of nucleic acids as a naturally occurring protein. The other issue with the diagnosing based on the PrP Sc detection is that the pathological form of PrP is abundant only at late stages of the disease in a brain. Therefore, the diagnostics of PrP caused diseases represent a sort of challenges 18 as that hosts can incubate infectious prion proteins for many months or even years. During this period, they exhibit no overt clinical symptoms. Incubation period for some human prion diseases can be as long as 40 years. 19 The incubation time of the first human transmissible spongiform encephalopathy Kuru described by Prof. Gajdusek in the late 1950s was estimated within the range from 21 to 40 years. 20,21 Immunological detection of PrP Sc post mortem Generally, the majority of analytical diagnostic methods rely on the proteolytic removal of endogenous PrP C prior to detection of PrP Sc (Fig. 1). PrP Sc is relatively resistant toward proteolytic degradation whereas PrP C is entirely digested by Proteinase K. Identical treatment leads to removal of a variable number of N-terminal amino acids in the case of PrP Sc. This results in the appearance of three distinct bands, corresponding to di-, mono-, and un-glycosylated forms of PrP, upon Western Blotting. Several techniques have been developed to detect PrP Sc in brain tissues, 2013 Landes Bioscience. Do not distribute. *Correspondence to: Vojtech Adam; vojtech.adam@mendelu.cz Submitted: 05/18/2013; Revised: 08/19/2013; Accepted: 09/17/ Prion 1

123 Figure 1. Three-dimensional (3D) structure of human PrP. The structure of the α-helical form of rprp(90 231) resembles that of PrP C. rprp(90 231) is viewed from the interface where PrP Sc is thought to bind to PrP C. The color scheme is as follows: α-helices A (residues ), B ( ), and C ( ) in pink; disulphide between Cys-179 and Cys-214 in yellow; conserved hydrophobic region composed of residues in red; loops in gray; residues in green encompassing strand S1 and residues in blue encompassing strand S2; the arrows span residues and , as these show a closer resemblance to β-sheet (155). 1 The data source was the internet proteomic database Expasy ( For data processing software Matlab version (The MathWorks, Inc.) was used. including Western Blot or other immunoblot methods Quantitative Western Blot analysis revealed the highest expression of PrP C in cerebellum, obex, and spinal cord. Intermediate levels were detected in thymus, intestine, nervous, heart, and spleen; lower levels were found in lung, muscle, kidney, lymph node, skin, pancreas, and liver. 25 Western Blotting coupled with gel electrophoresis is one of the immunodetection methods successfully used for detection of PrP Sc in tissue extracts. 26,27 After denaturation of the tissue extract by heating with sodium dodecyl sulfate, the sample is analyzed by PAGE and the denatured protein is transferred to a solid support and detected with an enzyme-labeled antibody, often of goat, rabbit and mouse. The specificity of Western Blotting is based on the fact that proteolysis with proteinase K characteristically alters the molecular mass (app. five kda) of the PrP c, due to the partial degradation of the N-terminal part of the protein. 28 Immunohistochemical analysis detected intense cellular-specific PrP C staining in neurons, thymocytes and lymphocytes. PrP C was also detected in the enteric wall, pancreatic islets of Langerhans, myocardium, pulmonary alveolar sacs, renal glomeruli, and dermal epithelial cells. 25 Another useful approach is the in situ detection of PrP by immunohistochemistry (IHC). In most IHC procedures, the brain tissue sections are treated to destroy PrP C with formic acid rather than with protease, since formic acid also enhances the PrP Sc immunoreactivity. 29 A suitable IHC procedure was developed using brain tissue from hamsters that had been inoculated with the transmissible mink encephalopathy agent. Tissue samples were fixed in PLP (periodate, lysine, paraformaldehyde) that contained paraformaldehyde at a concentration of 0.125%. Before the application of IHC technique, tissue sections were deparaffinized and treated with formic acid simultaneously to enhance PrP Sc immunoreactivity and to degrade PrP C. Primary antibody was obtained from a rabbit immunized to PrP Sc extracted from brains of mice with experimentally induced scrapie. Brains from 21 sheeps with histopathologically confirmed scrapie were examined by IHC. In all of these brains, PrP Sc was widely distributed throughout the entire brain. In the case of human diseases, diagnosis is based almost exclusively on clinical examination. The disease is then considered as probable depending on the extent to which the clinical symptoms fit the standard guidelines. However, in the case of animals, detection of the only disease-specific analyte, PrP Sc, can be commercially done. 30 From the clinical point of view, the most sensitive and specific method for diagnosing TSE is unquestionably experimental infection of laboratory animals. The animal is injected with a homogenate prepared from the suspicious tissue and the appearance of clinical signs is followed. The disease progress is then confirmed after dissection using classic techniques, such as histology, immunohistology, or Western Blot. 31 The animal infection is too laborious and time-consuming to be used for routine high-throughput screening. 28 Recently, new post-mortem tests have been introduced enabling rapid screening of the suspicious samples. Currently, 5 commercial tests are approved by the European Commission for BSE detection (Prionics-Check Western test, Enfer test, CEA/Biorad test, Prionics-Check LIA test, and Conformational-dependent immunoassay). All these tests are based on the immunodetection of the pathological PrP Sc isoform, whereas four of them use proteolysis to distinguish PrP C from misfolded PrP Sc 17. It has to be noted that none of these tests is able to identify infected animal at the pre-symptomatic stage and therefore the risk of the infectious agents entering the food chain is not completely eliminated. Immunological detection of PrP Sc in peripheral tissues The infectivity studies have shown that prion proteins occurred in low amounts in the peripheral tissues, such as lymphoid organs and blood, 32 already at early stages of the disease, e.g. during the pre-symptomatic period. Some commercial assays (TeSeETM CJD ELISA and TeSeETM, Table 1) are available to detect PrP Sc in cerebral and lymphoid tissues of TSE patients. These two assays have been compared by Ugnon-Cafe et al. 50 using samples from 54 vcjd affected patients and 51 controls. Authors concluded that these tools were rapid and robust for routine in vitro human TSE diagnosis and characterization. CJD could also be diagnosed during the patient s lifetime by detection of PrP Sc in the tonsil. A pilot study was undertaken to look at the feasibility of testing for vcjd in deceased donors using tonsillar tissue. Obtaining tonsillar tissue in the immediate post-mortem period was limited by the presence of rigor mortis. Tonsillar tissue was suitable for routine analysis for the occurrence of prion protein associated with vcjd in the deceased tissue donors. In spite of the fact that palatine and lingual tonsil tissues could be obtained in pairs, it was possible, in the majority of cases, to set aside an intact sample for confirmatory testing if required. 51 A method using Western Blot assay with 2013 Landes Bioscience. Do not distribute. 2 Prion volume 7 Issue 5

124 precipitation of streptomycin sulfate has been also reported improving the PrP Sc detection sensitivity and providing the potential for specific, rapid and flexible determination of low PrP Sc levels in the specimens not only from the central nervous system, but also from peripheral organs or fluids. 52 A new in vitro amplification technology, designated real-time quaking-induced conversion (RT-QUIC), has been described for the detection of tabnormal PrP (PrP Sc ) form in easily accessible specimens, such as cerebrospinal fluid. RT-QUIC method can be applied to other prion diseases, including scrapie, chronic wasting disease (CWD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE), and is able to quantify PrP seeding activity when combined with an end-point dilution of samples. 34 Solid-state matrix can be used for capturing and concentrating disease-associated PrP. Coupling of this method with direct immunodetection of surface-bound material enabled to distinguish dilution of exogenous vcjd prion-protein-infected brain from 10 6 dilution of normal brain (mean chemiluminescent signal, for vcjd vs for normal brain; showing an assay sensitivity for vcjd of 71.4% and a specificity of 100%). 53 Non-immunological detection of PrP Sc In order to avoid the use of antibodies as mentioned in previous paragraph, several spectroscopic methods, such as multispectral UV fluoroscopy, 54 fluorescence correlation spectroscopy, 55,56 magnetic resonance spectroscopy or Fourier-transformed infrared spectroscopy (FTIR) 60,61 have been employed. The main disadvantages of these methods include requirements of expensive and sophisticated equipment as well as skilled operator. Recently, Raman scattering spectroscopy using gold nanorods 3D-supercrystals was used for PrP detection. 62 Last but not least, sensitive mass spectrometry based method of the PrP quantification in a variety of mammalian species has been presented. 36 On the other hand, protein misfolding cyclic amplification (PMCA) has a great potential and it is certainly the most promising approach from the viewpoint of a blood test development. It mimics pathological processes and is similar to the polymerase chain reaction; PrP Sc is incubated in the presence of PrP C excess to initiate conversion to PrP Sc aggregates which are subsequently dispersed by sonication to encourage the formation of new aggregates. The quantity of formed PrP Sc depends on the number of expansion/sonication cycles performed Detection limits are summarized in Table 1. In vivo diagnostics Neurodegenerative diseases can be definitively confirmed by post mortem histopathologic examination of senile plaques (SPs) and neurofibrillary tangles (NFTs) in the brain using stains Table 1. Summary of Limits of Detection (LODs) for prion proteins measured by various methods Method LOD* Ref Long range resonance energy transfer (LrRET) µg/ml** 33 Real-time quaking-induced conversion assay (RT-QuIC) 1 ng/ml (1 fg) 34,35 Mass spectrometry (MS) 15 ng/ml (100 amol) 36,37 Capillary electrophoresis based immunoassay 6 ng/ml** 38 Capillary electrophoresis-based competitive immunoassay 80 ng/ml** 39 Surround optical fiber immunoassay (SOFIA) 10 pg/ml (10 ag) 40 Immuno-quantitative real-time PCR prion epitopes*** Time resolved fluorescence immunoassay 50 ng/ml (10 pg) 42 Simulated sandwich immunoassay 10 fg/ml** 43 Amyloid seeding assay (ASA) 1 ng/ml (1 fg) 44 Aggregation-specific enzyme-linked immunosorbent assay (AS-ELISA) Aggregation-specific fluorescent amplification catalyzed by T7 RNA polymerase technique (AS-FACTT) and dyes that identify these microscopic structures. Advances in in vivo detection of β-amyloid formation and aggregation may further facilitate the drug development for the disease by providing critical information on plaque burden in the living brain. Currently, development of specific molecular imaging agents for direct mapping of Aβ aggregates in the living brain is a research topic being actively investigated. Several research groups have launched programs to successfully identify the biomarkers for imaging Aβ plaques in the brain Even though computer tomography (CT) is not sensitive or specific in the evaluation of the disease, it may show atrophy at the advanced stage of the disease. Magnetic resonance imaging (MRI) is far more sensitive, especially with the addition of fluid attenuation inversion recovery (FLAIR) and diffusion weighted imaging (DWI). MRI of patient s brain with prion diseases may show mild to moderate generalized atrophy at the early stage of disease and dramatic diffuse atrophy after a relatively short duration of disease; however, this finding is not consistent. 70 The detection of individual SPs and NFTs in vivo by positron-emission tomography (PET) or single-photon emission CT (SPECT) should improve diagnosis and also accelerate ng/ml pg/ml 45 Flow cytometry 300 µg/ml (10nM) 46 Aptamer-mediated turn-on fluorescence assay 0.3 µg/ml 47 Nanoparticle-based surface-modified fluorescence assay 60 µg/ml (2 nm) 48 Resonance light scattering (RLS) 2 µg/ml ( M) 49 Chronopotentiometric stripping analysis 500 µg/ml (25 pmol/5 µl) 5 *Limits of detection were re-calculated on the similar units (grams per ml), the original data are in brackets. **The original data were expressed in gram per ml. ***These cannot be re-caluclated on grams per ml Landes Bioscience. Do not distribute. Prion 3

125 Figure 2. Applications of QDs in chemical, biomedical and diagnostic area. QDs (the large green crystal) can be applied for biosensing, biomarker mapping, real time cell growth monitoring, drug delivering, gene delivering, detection and diagnostics, molecular imaging, and targeted therapy. discovery of effective therapeutic agents. About a decade ago, the first successful Aβ plaque-specific PET imaging study was conducted in a living human subject clinically diagnosed with probable AD using the 11 C-labeled radiopharmaceutical Pittsburgh Compound B (PiB; [ 11 C]-2-4 -[methylaminophenyl]- 6-hydroxybenzothiazole). 71 Since then many PET/ SPECT imaging probes have been suggested, e.g. ( 18 F)-2- (1-[2-{N-(2-fluoroethyl)-N-methylamino} naphthalene-6-yl] ethylidene)malononitrile (FDDNP), ( 11 C)4-N-methylamino-4 - hydroxystilbene (SB-13), 72 ( 11 C)2-(2-[2-dimethylaminothiazol- 5-yl]ethenyl)-6-(2-[fluoro]ethoxy)benzoxazole (BF-227), 73 and ( 11 C)-2-(6-[methylamino]pyridin-3-yl)-1,3-benzothiazol-6-ol (AZD2184). 74 It is clear that this type of PrP diagnostics related diseases has a great potential to be further developed and new imaging assays are still being looked for. Some of them could be based on quantum dots (QDs). QDs as Alternative for Prion Detection In the 1970s and early 1980s, understanding the photophysical properties of semiconductor structures was important for a broad range of computer and electronic applications. It was hypothesized that the physical properties of structures in an intermediate size range (between single atoms and bulk) could be tuned by alteration of size and shape. For electronics and computer applications, such a system allows to synthesize a large set of nanometer sized building blocks for constructing faster and smaller computer chips or more efficient light-emitting devices. It was soon realized that these nanometer sized structures called quantum dots (QDs) could have significantly much more applications. Nowadays a wide range of QDs utilizations are found in the area of biology, biochemistry and biomedicine. Besides the applications as simple sensors, the main function of QDs based on their exceptional fluorescent properties in the biochemical and biomedical research area is their usage as unique fluorescent labels The utilization of QDs for various purposes is shown in Figure 2. The most important characterization of QDs dealing with their optical properties is usually provided by UV-VIS and photoluminescence spectroscopy which offer fast, non-destructive and contactless option. Besides monitoring the excitation, absorption and emission spectra which are usually applied for the calculation of quantum yield, band gap studies can be also performed by optical diffuse reflectance spectra measurement. The size of QDs can be calculated from absorption edges using Henglein empirical curve, which relates the wavelength of the absorption threshold to the diameter of QDs. 81 In particular cases, FTIR spectroscopic measurements are also necessary. 82 Raman spectroscopy, as one of the best non-destructive techniques, can be employed for QDs characterization as well, since it allows to probe the active optical phonon modes and to explore the confined electronic structure of QDs. 83,84 As mentioned before, the optical properties (fluorescence emission) of QDs can be fine-tuned by the QDs size which is a key parameter that determines the spectral position and purity of photoluminescence. QDs size and morphology (shape and structure) are generally calculated using conventional techniques like scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), and dynamic light scattering (DLS) studies. For these measurements, QDs are usually transformed to powder form either by simple drying of QDs solution or by precipitation (e.g. with ethanol), centrifugation and final drying. Besides these techniques, field flow fractionation, which belongs to high resolution liquid chromatography-like elution methods for separating and sizing, can be also successfully employed for QDs size distribution analysis. 85 The structure of QDs is usually analyzed by X-ray diffraction (XRD) 86 and the elemental composition of QDs can be studied by energy dispersive X-ray analysis (known as EDS, EDX, or EDAX). 82 Other techniques, like inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES), were used for analysis of QDs as well, namely for the metal ions content in QDs. 87 Recently, electrochemical methods were also applied to study the QDs behavior Biocompatibility To use QDs in biology, it is extremely important to deal with the biocompatibility and toxicity. However, minimum studies have examined the toxicity of these nanomaterials Moreover, their toxicity evaluation is highly complicated, due to the diversity of materials. In sharp contrast to conventional hazardous materials, the attention has to be paid to the nanoparticle-specific problems, including the fact that the surface of nanomaterials is very active due to the large surface area and surface-to-volume ratio. In addition, it is necessary to exclude the effect of solubility and 2013 Landes Bioscience. Do not distribute. 4 Prion volume 7 Issue 5

126 possible contamination which could also decrease the validity of any toxicity testing. 92 In 2006, Hardman reviewed the toxicity of QDs as a function of physicochemical and environmental factors. 94 QDs size, charge, concentration, outer coating bioactivity (capping material, functional groups) as well as oxidative, photolytic, and mechanical stability have each been shown as determining factors of QDs toxicity. To improve the biocompatibility, passivation or capping of QDs with a layer of ZnS or CdS is needed. ZnS or CdS improve the fluorescence quantum yield of the QDs and protect them against photo-oxidation, which is important for minimizing cytotoxicity and enhancing photostability. ZnS shell has larger band gap energy than CdSe, eliminating the core s surface defect states. ZnS shell has also similar bond length to CdSe, minimizing the crystal-lattice strain and allowing the epitaxial growth. Even with advances in synthesis, obtaining biomedically useful QDs is still problematic due to differences in optical properties from batch to batch. From one synthesis to the next, QDs with different quantum yields and fluorescence spectra may be produced. Moreover, further functionalization is needed for incorporation of required chemical species. Various surface modification techniques were developed to ensure the specific bio-conjugation (Fig. 3). This is usually achieved by modifying QDs with proteins, peptides, nucleic acids, or other biomolecules that mediate specific interactions with living systems. Surface engineering is thus crucial not only for tuning the fundamental properties of nanomaterials and for rendering them stable and soluble in different environments, but also for creating nanoparticle biomolecule hybrids capable of participating in biological processes. Such hybrids should combine useful properties of both materials involved, i.e. the optical properties of nanocrystals and biological functions of ligands attached. 78 One of these strategies utilizes the biotin-avidin (respectively streptavidin and neutravidin) interaction known for its very high specificity. Modification of QDs by the streptavidin proved a very successful method evaluated in numerous publications. 78,95-98 Due to this success, streptavidin-qds are nowadays also commercially available. In addition, biotin-functionalized QDs were developed to exploit the same interaction (Fig. 2). In vitro applications The conditions of in vitro experiments are artificial and simulate what might happen in vivo. In the last decade, surface engineering and biofunctionalization techniques have transformed semiconductor nanocrystals into complex cellular probes capable of interaction with biomolecules and direct participation in biological processes. In 1998, two seminal scientific papers demonstrated for the first time that semiconductor nanoparticles could be made water-soluble and used as biological imaging probes. 99,100 One approach utilized encapsulation of QDs in silica shell in order to produce QDs for a single-excitation dual-color cell staining. 99 When derived with trimethoxysilylpropyl urea and acetate groups, green QDs preferentially labeled the cell nucleus, and when modified with biotin, red QDs labeled F-actin filaments pretreated with phalloidin-biotin and streptavidin. The second paper was the first to demonstrate the ligand-exchange approach to QDs water solubilization. 100 Subsequent conjugation of transferrin produced QDs probes that were endocytosed by live HeLa cells, resulting in the punctate cell staining, while IgG bioconjugates were used in an aggregation-based immunoassay. Since then, many surface engineering techniques for QDs solubilization and 2013 Landes Bioscience. Do not distribute. Figure 3. (A) Differential pulse voltammograms of prion protein (PrP, 500 µg/ml) with additions of QDs in various volumes (460 µg/ml, quantified according to concentration of cadmium[ii]). Electrochemical measurements were performed with AUTOLAB Analyzer (EcoChemie) connected to VA-Stand 663 (Metrohm), using a standard cell with three electrodes. The working electrode was a hanging mercury drop electrode (HMDE) with a drop area of 0.4 mm 2. The reference electrode was an Ag/AgCl/3M KCl electrode and the auxiliary electrode was a graphite electrode. Acetate buffer (0.2 M, ph 5) was used as the supporting electrolyte. For smoothing and baseline correction the software GPES 4.9 supplied by EcoChemie was employed. The amount of QDs was measured using DPV. Differential pulse voltammetric measurements were performed under the following parameters: start potential 1.5 V; end potential 0 V; modulation time s, time interval 0.2 s, step potential of 1.05 mv/s, modulation amplitude of 250 mv, Eads = 0 V. All experiments were performed at room temperature (20 C). The DPV samples analyzed were deoxygenated prior to measurements by purging with argon (99.999%) saturated with water for 120 s. (B) In vivo images of 10 µl (460 µg/ml) of CdTe QDs with prion protein (PrP, 500 µg/ml) applied 1 cm under skin of chicken thigh. The image of chicken leg without any injection was subtracted. The fluorescence imaging was performed by In vivo Xtreme system by Carestream. This instrument is equipped with 400 W xenon light source and 28 excitation filters ( nm). The emitted light is captured by 4MP CCD camera. In this experiment, 410 nm was used as an excitation wavelength and the emission was measured at 535 nm. The exposition time was 5 s. The other parameters were set as follows: Bin, 2 2; field of view, 12 cm; fstop, 1.1. (C) Scheme of complex of QDs and antibody with prion protein and the possible using of such prion protein sensing in brain tissue. Prion 5

127 biofunctionalization have been developed, enabling the application of QDs probes with specific design. Such probes have found their use in a variety of in vitro applications, such as histological evaluation of cells and tissue specimens, single molecule detection and real-time tracking, long-term live-cell imaging, and study of intracellular processes. Moreover, QDs can be employed as optical labels that probe dynamic biological processes, such as biocatalysed reactions or structurally induced biomolecular transformations using fluorescence resonance energy transfer (FRET) or electron-transfer quenching as photophysical probing mechanisms (Fig. 2). Recent achievements in merging nanoparticle encapsulation and bioconjugation steps and design of pre-functionalized surface coatings promise to provide more compact, stable, and biocompatible nanoparticles with controlled density and orientation of ligands attached. Amphiphilic polymers with a maleic anhydride backbone are being actively explored for this purpose. In organic anhydrous solvents, such polymers encapsulate trioctylphosphine-coated QDs and introduce reactive anhydride groups on the surface. In basic aqueous buffers, anhydride rings are quickly hydrolyzed, yielding negatively charged carboxylic acid groups and rendering QDs water soluble. 101 More importantly, anhydride groups are highly reactive toward amine-containing molecules, thus allowing covalent conjugation of various biomolecules to the polymer chains without the need for postencapsulation modification. 102,103 The choice of bioconjugation approach depends on the availability of ligands with suitable functional groups and on specific application requirements. However, common design criteria involve preserved QDs photo-physical properties and ligand biofunctionality, controlled ligand orientation and binding stoichiometry, compact probe size, and good stability in physiological environment. As these criteria can be satisfied in only few specific cases, improvement of existing bioconjugation techniques and design of novel application specific water solubilization and bioconjugation approaches remain an active area of research. With the development of stable and biofunctional QDs probes, these materials will become the nanoscience building blocks with flexible properties that could be further optimized for specific applications, including biomedical imaging, detection, and nano-therapeutics. 104 Electrochemical detection as a sensitive technique in combination with QDs has been already used for numerous applications. However, QDs have not been sufficiently analyzed by voltammetry with respect to employment these easy to use and repeatable methods for QDs characterization and quantification. Therefore, CdTe QDs were characterized using cyclic and differential pulse voltammetry. The obtained peaks were identified and detection limit (3 S/N) was estimated down to 100 fg/ml. Based on convincing results, new way how to study the stability and quantify QDs was suggested. The approach was further utilized for testing of QDs stability. 5 Interaction of PrP with CdTe QDs by voltammetry seems to be a new and extremely sensitive tool for sensing of these proteins. Primarily, fluorescent and electrochemical properties of QDs were characterized. Further, electrochemical study of their interactions was performed to find the most suitable conditions for sensitive detection of PrP (Fig. 3A). Detection limit (3 S/N) was estimated as 1 fg in 5 µl. 105 This makes labeling of proteins with QDs of great importance due to easy applicability and possibility to use in miniaturized devices. Based on our results, it can be concluded that QDs-PrP complex is stable and can be quantified in extremely low amounts. The stability of complex in vivo was also proven (Fig. 3B). This should open new possibilities how to determine the presence of these proteins in a tissue (Fig. 3C), on surgical equipment and on other types of materials which could be contagious (Fig. 4A D). In vivo applications Even though some attempts for optical imaging of prion based diseases have been made, these were mostly in in vitro mode. 107,108 A new and exciting direction of research using QDs is their application as contrast agents for in vivo imaging The characterization and analysis of biomolecules and biological systems in the context of intact organisms is known as in vivo research. The in vivo approach involves experiments performed in the large system of an experimental animal body. Organic fluorophores and chemiluminescence probes are currently the most commonly used optical probes for animal imaging. However, the lack of available probes that emit in NIR emission range (>650 nm) cause a significant limitation of these optical contrast agents. The NIR emitting window is appealing for biological optical imaging because of low tissue absorption and scattering effects in this emission range. The range of NIR optical window for animal imaging is typically set at nm. Since the optical properties of QDs can be tuned by size and composition, it is possible to prepare series of NIR-emitting QDs for animal imaging. 113 CdTe, CdTeSe, InPAs, PbS, and PbSe have been successfully synthesized with NIR emission. 114,115 For most in vivo imaging investigations, QDs are usually directly injected into the living animal intravenously or subcutaneously and thereby are delivered into the bloodstream. Future Prospects QDs, tiny light-emitting nanocrystals, have emerged as a new promising class of fluorescent probes for biomolecular and cellular imaging. In comparison with organic dyes and fluorescent proteins, QDs possess unique optical and electronic properties such as size-tunable light emission, improved signal brightness, resistance against photobleaching, and simultaneous excitation of multiple fluorescence colors. The biomedical applications of nanoparticles are rooted in the advanced functional design and have been realized in preclinical experimental diagnosis. As compared with the imaging in vitro, QDs imaging in vivo faces different challenges, caused by the increase of complexity of multicellular organism. There are four main kinds of in vivo imaging applications with QDs: (1) biodistribution of QDs, (2) vascular imaging, (3) tracking of QDs, and (4) tumor imaging (Fig. 2). Utilization of nanomaterials, particularly nanoparticles for the in vivo monitoring of brain diseases is one of near future appealing applications. 116 The incorporation of contrast agents into the cells can be done by either phagocytosis or conjugation of the contrast 2013 Landes Bioscience. Do not distribute. 6 Prion volume 7 Issue 5

128 Figure 4. Sensing of prion protein complex with quantum dots on the surface of a scalpel. (A) photo of a scalpel, (B) fluorescent image of scalpel, (C) fluorescent image of scalpel with prion protein-qds complex, and (D) detail of fluorescent image of scalpel with prion protein-qds complex. QD were prepared according to Duan et al. 106 Cadmium chloride solution (CdCl 2, 0.04 M, 4 ml) was diluted to 42 ml with ultrapure water, and then trisodium citrate dihydrate (100 mg), Na 2 TeO 3 (0.01 M, 4 ml), MPA (119 mg), and NaBH 4 (50 mg) were added successively under magnetic stirring. The molar ratio of Cd 2+ / MPA/Te was 1:7:0.25. Ten ml of the resulting CdTe precursor was put into a Teflon vessel. CdTe QDs were prepared at 95 C for various times according to desired color (10 min, green; 30 min, yellow; 120 min, red) under microwave irradiation (400 W, Multiwave3000, Anton-Paar GmbH). After microwave irradiation, the mixture was cooled to 50 C and the CdTe QDs sample was obtained. Purification of CdTe QDs was performed using isopropanol condensing. The CdTe QDs was mixed with isopropanol in ratio 1:2 and then centrifuged for 10 min at rpm (Eppendorf centrifuge 5417R). Precipitate (pure CdTe QDs) was than resuspended to initial volume of Tris Buffer ph 8.5. The fluorescence imaging was performed by In vivo Xtreme system by Carestream. This instrument is equipped with 400 W xenon light source and 28 excitation filters ( nm). The emitted light is captured by 4MP CCD camera. In this experiment, 410 nm was used as an excitation wavelength and the emission was measured at 535 nm. The exposition time was 5 s. The other parameters were set as follows: Bin, 2 2; field of view, 12 cm; fstop, 1.1. agent to the cell surface via antibody interaction with the receptor. In vivo imaging of amyloid plaques may be useful for the evaluation and diagnosis of AD patients (Fig. 3). Disclosure of Potential Conflicts of Interest No potential conflicts of interest were disclosed. References 1. Prusiner SB. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: ; PMID: ; org/ /pnas Hegde RS, Tremblay P, Groth D, DeArmond SJ, Prusiner SB, Lingappa VR. Transmissible and genetic prion diseases share a common pathway of neurodegeneration. Nature 1999; 402:822-6; PMID: ; 3. Prusiner SB. Prion diseases and the BSE crisis. Science 1997; 278:245-51; PMID: ; dx.doi.org/ /science Inge-Vechtomov SG, Zhouravleva GA, Chernoff YO. Biological roles of prion domains. Prion 2007; 1:228-35; PMID: ; pri Sobrova P, Ryvolova M, Hynek D, Adam V, Hubalek J, Kizek R. Electrochemical Behaviour of Native and Denatured beta-sheet Breaker Prion Protein. Int J Electrochem Sci 2012; 7: Kozlowski H, Luczkowski M, Remelli M, Valensin D. Copper, zinc and iron in neurodegenerative diseases (Alzheimer s, Parkinson s and prion diseases). Coord Chem Rev 2012; 256: ; org/ /j.ccr Viles JH. Metal ions and amyloid fiber formation in neurodegenerative diseases. Copper, zinc and iron in Alzheimer s, Parkinson s and prion diseases. Coord Chem Rev 2012; 256: ; org/ /j.ccr Kessels HW, Nguyen LN, Nabavi S, Malinow R. The prion protein as a receptor for amyloid-beta. Nature 2010; 466:E3-4, discussion E4-5; PMID: ; 9. Laurén J, Gimbel DA, Nygaard HB, Gilbert JW, Strittmatter SM. Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers. Nature 2009; 457: ; PMID: ; nature Fowler DM, Kelly JW. Functional amyloidogenesis and cytotoxicity-insights into biology and pathology. PLoS Biol 2012; 10:e ; PMID: ; Hainfellner JA, Wanschitz J, Jellinger K, Liberski PP, Gullotta F, Budka H. Coexistence of Alzheimer-type neuropathology in Creutzfeldt-Jakob disease. Acta Neuropathol 1998; 96:116-22; PMID: ; Acknowledgments Financial support from CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ , DOC CEITEC.01/2012, Grant Agency of the Czech Republic under the contract GACR 102/ P and IGA TP1/2013 (EA 3b) is highly acknowledged. The author Sobrova P is Holder of Brno PhD Talent Financial Aid. 12. Peden AH, Ironside JW. Molecular pathology in neurodegenerative diseases. Curr Drug Targets 2012; 13: ; PMID: ; org/ / van Harten AC, Kester MI, Visser PJ, Blankenstein MA, Pijnenburg YAL, van der Flier WM, Scheltens P. Tau and p-tau as CSF biomarkers in dementia: a meta-analysis. Clin Chem Lab Med 2011; 49:353-66; PMID: ; CCLM Jellinger KA. Interaction between pathogenic proteins in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med 2012; 16: ; PMID: ; org/ /j x 15. Revesz T, Ghiso J, Lashley T, Plant G, Rostagno A, Frangione B, Holton JL. Cerebral amyloid angiopathies: a pathologic, biochemical, and genetic view. J Neuropathol Exp Neurol 2003; 62:885-98; PMID: Kellett KAB, Hooper NM. Prion protein and Alzheimer disease. Prion 2009; 3:190-4; PMID: ; pri Landes Bioscience. Do not distribute. Prion 7

129 17. Parchi P, Strammiello R, Giese A, Kretzschmar H. Phenotypic variability of sporadic human prion disease and its molecular basis: past, present, and future. Acta Neuropathol 2011; 121:91-112; PMID: ; s Soto C. Diagnosing prion diseases: needs, challenges and hopes. Nat Rev Microbiol 2004; 2:809-19; PMID: ; nrmicro Huzarewich RL, Siemens CG, Booth SA. Application of omics to prion biomarker discovery. J Biomed Biotechnol 2010; 2010:613504; PMID: ; Goldfarb LG, Cervenakova L, Gajdusek DC. Genetic studies in relation to kuru: an overview. Curr Mol Med 2004; 4:375-84; PMID: ; dx.doi.org/ / Liberski PP. Kuru and D. Carleton Gajdusek: a close encounter. Folia Neuropathol 2009; 47:114-37; PMID: Brown DR, Wong BS, Hafiz F, Clive C, Haswell SJ, Jones IM. Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. Biochem J 1999; 344:1-5; PMID: ; org/ / : Safar J, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, Cohen FE, Prusiner SB. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med 1998; 4: ; PMID: ; dx.doi.org/ / Wadsworth JDF, Joiner S, Hill AF, Campbell TA, Desbruslais M, Luthert PJ, Collinge J. Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay. Lancet 2001; 358:171-80; PMID: ; S (01) Peralta OA, Eyestone WH. Quantitative and qualitative analysis of cellular prion protein (PrP(C)) expression in bovine somatic tissues. Prion 2009; 3:161-70; PMID: ; pri Nunnally BK. It s a mad, mad, mad, mad cow: a review of analytical methodology for detecting BSE/ TSE. Trac-Trends Anal Chem 2002; 21:82-9; dx.doi.org/ /s (01) Aguzzi A, Heikenwalder M, Miele G. Progress and problems in the biology, diagnostics, and therapeutics of prion diseases. J Clin Invest 2004; 114:153-60; PMID: Grassi J, Maillet S, Simon S, Morel N. Progress and limits of TSE diagnostic tools. Vet Res 2008; 39:33; PMID: ; vetres: Miller JM, Jenny AL, Taylor WD, Marsh RF, Rubenstein R, Race RE. Immunohistochemical detection of prion protein in sheep with scrapie. J Vet Diagn Invest 1993; 5:309-16; PMID: ; Zsolnai A, Anton I, Kühn C, Fésüs L. Detection of single-nucleotide polymorphisms coding for three ovine prion protein variants by primer extension assay and capillary electrophoresis. Electrophoresis 2003; 24:634-8; PMID: ; org/ /elps Groschup MH, Weiland F, Straub OC. Diagnosis of bovine spongiform encephalopathy and scrapie - Possibilities and limitations of the diagnosis. Tierarztl Umsch 1994; 49: Lacroux C, Bougard D, Litaise C, Simmons H, Corbiere F, Dernis D, Tardivel R, Morel N, Simon S, Lugan S, et al. Impact of leucocyte depletion and prion reduction filters on TSE blood borne transmission. PLoS One 2012; 7:e42019; PMID: ; Zhuang HL, Zhen SJ, Wang J, Huang CZ. Sensitive detection of prion protein through long range resonance energy transfer between graphene oxide and molecular aptamer beacon. Anal Methods 2013; 5:208-12; Atarashi R, Sano K, Satoh K, Nishida N. Realtime quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion 2011; 5:150-3; PMID: ; pri Azam G, Shibata T, Kabashima T, Kai M. Sensitive chemiluminescence detection of prion protein on a membrane by using a peroxidase-labeled dextran probe. Anal Sci 2011; 27:715-20; PMID: ; Silva CJ, Onisko BC, Dynin I, Erickson ML, Requena JR, Carter JM. Utility of mass spectrometry in the diagnosis of prion diseases. Anal Chem 2011; 83: ; PMID: ; org/ /ac102527w 37. Onisko B, Dynin I, Requena JR, Silva CJ, Erickson M, Carter JM. Mass spectrometric detection of attomole amounts of the prion protein by nanolc/ MS/MS. J Am Soc Mass Spectrom 2007; 18:1070-9; PMID: ; jasms Yang WC, Schmerr MJ, Jackman R, Bodemer W, Yeung ES. Capillary electrophoresis-based noncompetitive immunoassay for the prion protein using fluorescein-labeled protein A as a fluorescent probe. Anal Chem 2005; 77: ; PMID: ; Yang WC, Yeung ES, Schmerr MJ. Detection of prion protein using a capillary electrophoresis-based competitive immunoassay with laser-induced fluorescence detection and cyclodextrin-aided separation. Electrophoresis 2005; 26:1751-9; PMID: ; Chang BG, Gray P, Piltch M, Bulgin MS, Sorensen- Melson S, Miller MW, Davies P, Brown DR, Coughlin DR, Rubenstein R. Surround optical fiber immunoassay (SOFIA): an ultra-sensitive assay for prion protein detection. J Virol Methods 2009; 159:15-22; PMID: ; org/ /j.jviromet Reuter T, Gilroyed BH, Alexander TW, Mitchell G, Balachandran A, Czub S, McAllister TA. Prion protein detection via direct immuno-quantitative real-time PCR. J Microbiol Methods 2009; 78:307-11; PMID: ; mimet Dabaghian RH, Barnard G, McConnell I, Clewley JP. An immunoassay for the pathological form of the prion protein based on denaturation and time resolved fluorometry. J Virol Methods 2006; 132:85-91; PMID: ; jviromet Brooks B, Brooks A, Wulff SS, Lewis RV. Identification of problems developing an ultrasensitive immunoassay for the ante mortem detection of the infectious isoform of the CWD-associated prion protein. J Immunoassay Immunochem 2009; 30:135-49; PMID: ; org/ / Colby DW, Zhang Q, Wang S, Groth D, Legname G, Riesner D, Prusiner SB. Prion detection by an amyloid seeding assay. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: ; PMID: ; org/ /pnas Chang BG, Cheng X, Yin SM, Pan T, Zhang HT, Wong PK, Kang SC, Xiao F, Yan HM, Li CY, et al. Test for detection of disease-associated prion aggregate in the blood of infected but asymptomatic animals. Clin Vaccine Immunol 2007; 14:36-43; PMID: ; CVI Trieschmann L, Navarrete Santos A, Kaschig K, Torkler S, Maas E, Schätzl H, Böhm G. Ultrasensitive detection of prion protein fibrils by flow cytometry in blood from cattle affected with bovine spongiform encephalopathy. BMC Biotechnol 2005; 5:26; PMID: ; org/ / Xiao SJ, Hu PP, Li YF, Huang CZ, Huang T, Xiao GF. Aptamer-mediated turn-on fluorescence assay for prion protein based on guanine quenched fluophor. Talanta 2009; 79:1283-6; PMID: ; dx.doi.org/ /j.talanta Henry J, Anand A, Chowdhury M, Coté G, Moreira R, Good T. Development of a nanoparticle-based surface-modified fluorescence assay for the detection of prion proteins. Anal Biochem 2004; 334:1-8; PMID: ; ab Huang XX, Long YJ, Zhang HJ, Wang QL, Zhu R, Zheng HZ. Gold nanoparticles as a probe for prion determination via resonance light scattering method. Anal Sci 2012; 28:475-9; PMID: ; dx.doi.org/ /analsci Ugnon-Café S, Dorey A, Bilheude JM, Streichenberger N, Viennet G, Meyronet D, Maues de Paula A, Perret-Liaudet A, Quadrio I. Rapid screening and confirmatory methods for biochemical diagnosis of human prion disease. J Virol Methods 2011; 175:216-23; PMID: ; org/ /j.jviromet Warwick RM, Armitage WJ, Chandrasekar A, Mallinson G, Poniatowski S, Clarkson A. A pilot to examine the logistical and feasibility issues in testing deceased tissue donors for vcjd using tonsil as the analyte. Cell Tissue Bank 2012; 13:53-61; PMID: ; s y 52. Dong CF, Huang YX, An R, Chen JM, Wang XF, Shan B, Lei YJ, Han L, Zhang BY, Han J, et al. Sensitive detection of PrPSc by Western blot assay based on streptomycin sulphate precipitation. Zoonoses Public Health 2007; 54:328-36; PMID: ; dx.doi.org/ /j x 53. Edgeworth JA, Farmer M, Sicilia A, Tavares P, Beck J, Campbell T, Lowe J, Mead S, Rudge P, Collinge J, et al. Detection of prion infection in variant Creutzfeldt-Jakob disease: a blood-based assay. Lancet 2011; 377:487-93; PMID: ; dx.doi.org/ /s (10) Rubenstein R, Gray PC, Wehlburg CM, Wagner JS, Tisone GC. Detection and discrimination of PrPSc by multi-spectral ultraviolet fluorescence. Biochem Biophys Res Commun 1998; 246:100-6; PMID: ; bbrc Birkmann E, Schäfer O, Weinmann N, Dumpitak C, Beekes M, Jackman R, Thorne L, Riesner D. Detection of prion particles in samples of BSE and scrapie by fluorescence correlation spectroscopy without proteinase K digestion. Biol Chem 2006; 387:95-102; PMID: ; BC Fujii F, Horiuchi M, Ueno M, Sakata H, Nagao I, Tamura M, Kinjo M. Detection of prion protein immune complex for bovine spongiform encephalopathy diagnosis using fluorescence correlation spectroscopy and fluorescence cross-correlation spectroscopy. Anal Biochem 2007; 370:131-41; PMID: ; Lodi R, Parchi P, Tonon C, Manners D, Capellari S, Strammiello R, Rinaldi R, Testa C, Malucelli E, Mostacci B, et al. Magnetic resonance diagnostic markers in clinically sporadic prion disease: a combined brain magnetic resonance imaging and spectroscopy study. Brain 2009; 132: ; PMID: ; awp Landes Bioscience. Do not distribute. 8 Prion volume 7 Issue 5

130 58. Galanaud D, Haik S, Linguraru MG, Ranjeva JP, Faucheux B, Kaphan E, Ayache N, Chiras J, Cozzone P, Dormont D, et al. Combined diffusion imaging and MR spectroscopy in the diagnosis of human prion diseases. AJNR Am J Neuroradiol 2010; 31:1311-8; PMID: ; A Murray KL, Knight RSG, Summers D, Collie DAC, Will RG. The role of MRI brain scan in the diagnosis of human prion disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2005; 76: Lasch P, Schmitt J, Beekes M, Udelhoven T, Eiden M, Fabian H, Petrich W, Naumann D. Antemortem identification of bovine spongiform encephalopathy from serum using infrared spectroscopy. Anal Chem 2003; 75:6673-8; PMID: ; org/ /ac030259a 61. Beekes M, Lasch P, Naumann D. Analytical applications of Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy in microbiology and prion research. Vet Microbiol 2007; 123:305-19; PMID: ; Alvarez-Puebla RA, Agarwal A, Manna P, Khanal BP, Aldeanueva-Potel P, Carbó-Argibay E, Pazos- Pérez N, Vigderman L, Zubarev ER, Kotov NA, et al. Gold nanorods 3D-supercrystals as surface enhanced Raman scattering spectroscopy substrates for the rapid detection of scrambled prions. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108: ; PMID: ; Castilla J, Saa P, Morales R, Abid K, Maundrell K, Soto C. Protein misfolding cyclic amplification for diagnosis and prion propagation studies. In: Kheterpal I, Wetzel R, eds. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt B. San Diego: Elsevier Academic Press Inc, 2006: Saá P, Castilla J, Soto C. Ultra-efficient replication of infectious prions by automated protein misfolding cyclic amplification. J Biol Chem 2006; 281: ; PMID: ; M Saborio GP, Permanne B, Soto C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature 2001; 411:810-3; PMID: ; org/ / Soto C, Anderes L, Suardi S, Cardone F, Castilla J, Frossard MJ, Peano S, Saa P, Limido L, Carbonatto M, et al. Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding. FEBS Lett 2005; 579:638-42; PMID: ; org/ /j.febslet Agdeppa ED, Kepe V, Liu J, Flores-Torres S, Satyamurthy N, Petric A, Cole GM, Small GW, Huang SC, Barrio JR. Binding characteristics of radiofluorinated 6-dialkylamino-2-naphthylethylidene derivatives as positron emission tomography imaging probes for beta-amyloid plaques in Alzheimer s disease. J Neurosci 2001; 21:RC189; PMID: Cai LS, Chin FT, Pike VW, Toyama H, Liow JS, Zoghbi SS, Modell K, Briard E, Shetty HU, Sinclair K, et al. Synthesis and evaluation of two 18F-labeled 6-iodo-2-(4 -N,N-dimethylamino) phenylimidazo[1,2-a]pyridine derivatives as prospective radioligands for beta-amyloid in Alzheimer s disease. J Med Chem 2004; 47: ; PMID: ; jm030477w 69. Klunk WE, Wang YM, Huang GF, Debnath ML, Holt DP, Shao L, Hamilton RL, Ikonomovic MD, DeKosky ST, Mathis CA. The binding of 2-(4 -methylaminophenyl)benzothiazole to postmortem brain homogenates is dominated by the amyloid component. J Neurosci 2003; 23: ; PMID: Mastrianni JA. Prion diseases. Clin Neurosci Res 2004; 3:469-80; cnr Ono M, Saji H. Molecular approaches to the treatment, prophylaxis, and diagnosis of Alzheimer s disease: novel PET/SPECT imaging probes for diagnosis of Alzheimer s disease. J Pharmacol Sci 2012; 118:338-44; PMID: ; org/ /jphs.11r08fm 72. Verhoeff NP, Wilson AA, Takeshita S, Trop L, Hussey D, Singh K, Kung HF, Kung MP, Houle S. In-vivo imaging of Alzheimer disease beta-amyloid with [11C]SB-13 PET. Am J Geriatr Psychiatry 2004; 12:584-95; PMID: Kudo Y, Okamura N, Furumoto S, Tashiro M, Furukawa K, Maruyama M, Itoh M, Iwata R, Yanai K, Arai H. 2-(2-[2-Dimethylaminothiazol-5-yl] ethenyl)-6- (2-[fluoro]ethoxy)benzoxazole: a novel PET agent for in vivo detection of dense amyloid plaques in Alzheimer s disease patients. J Nucl Med 2007; 48:553-61; PMID: ; org/ /jnumed Johnson AE, Jeppsson F, Sandell J, Wensbo D, Neelissen JAM, Juréus A, Ström P, Norman H, Farde L, Svensson SPS. AZD2184: a radioligand for sensitive detection of beta-amyloid deposits. J Neurochem 2009; 108: ; PMID: ; org/ /j x 75. Zhang LJ, Xu CL, Li BX. Simple and sensitive detection method for chromium(vi) in water using glutathione-capped CdTe quantum dots as fluorescent probes. Mikrochim Acta 2009; 166:61-8; dx.doi.org/ /s Li T, Zhou YY, Sun JY, Tang DB, Guo SX, Ding XP. Ultrasensitive detection of mercury(ii) ion using CdTe quantum dots in sol-gel-derived silica spheres coated with calix 6 arene as fluorescent probes. Mikrochim Acta 2011; 175:113-9; org/ /s Li YL, Zhou J, Liu CL, Li HB. Composite quantum dots detect Cd(II) in living cells in a fluorescence turning on mode. J Mater Chem 2012; 22: ; Algar WR, Tavares AJ, Krull UJ. Beyond labels: a review of the application of quantum dots as integrated components of assays, bioprobes, and biosensors utilizing optical transduction. Anal Chim Acta 2010; 673:1-25; PMID: ; org/ /j.aca Chen JA, Pei Y, Chen ZW, Cai JY. Quantum dot labeling based on near-field optical imaging of CD44 molecules. Micron 2010; 41: ; PMID: ; Resch-Genger U, Grabolle M, Cavaliere-Jaricot S, Nitschke R, Nann T. Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nat Methods 2008; 5:763-75; PMID: ; nmeth Das P, Zhong WH, Claverie JP. Copolymer nanosphere encapsulated CdS quantum dots prepared by RAFT copolymerization: synthesis, characterization and mechanism of formation. Colloid Polym Sci 2011; 289: ; s Kumar KS, Divya A, Reddy PS. Synthesis and characterization of Cr doped CdS nanoparticles stabilized with polyvinylpyrrolidone. Appl Surf Sci 2011; 257:9515-8; apsusc Gondal MA, Bagabas AA, Dastageer MA. Synthesis of w-cds quantum dots and discovery of intense sub band emission owing to longitudinal optical phonons. J Nanopart Res 2011; 13: ; dx.doi.org/ /s y 84. Gu Y, Kuskovsky IL, Fung J, Robinson R, Herman IP, Neumark GF, Zhou X, Guo SP, Tamargo MC. Determination of size and composition of optically active CdZnSe/ZnBeSe quantum dots. Appl Phys Lett 2003; 83: ; org/ / Rameshwar T, Samal S, Lee S, Kim S, Cho J, Kim IS. Determination of the size of water-soluble nanoparticles and quantum dots by field-flow fractionation. J Nanosci Nanotechnol 2006; 6:2461-7; PMID: ; jnn Lin ZH, Wang MQ, Wei LZ, Song XH, Xue YH, Yao X. Synthesis and characterization of ZnSe/ZnS core/shell nanocrystals by aqueous reflux route. J Alloy Comp 2011; 509:8356-9; org/ /j.jallcom Huang FH, Lan YL, Chen PF. Synthesis and characterization of water-soluble l-cysteine-modified ZnS nanocrystals doped with silver. J Mater Sci 2011; 46:5732-6; s Khene S, Moeno S, Nyokong T. Voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy of gold electrodes modified with CdTe quantum dots and their conjugates with nickel tetraamino phthalocyanine. Polyhedron 2011; 30: ; org/ /j.poly Li YF, Han M, Bai HY, Wu Y, Dai ZH, Bao JC. A sensitive electrochemical aptasensor based on water soluble CdSe quantum dots (QDs) for thrombin determination. Electrochim Acta 2011; 56: ; Wang QS, Yang L, Fang TT, Wu S, Liu P, Min XM, Li X. Interactions between CdSe/CdS quantum dots and DNA through spectroscopic and electrochemical methods. Appl Surf Sci 2011; 257: ; dx.doi.org/ /j.apsusc Ghaderi S, Ramesh B, Seifalian AM. Fluorescence nanoparticles quantum dots as drug delivery system and their toxicity: a review. J Drug Target 2011; 19:475-86; PMID: ; 109/ X Hoshino A, Hanada S, Yamamoto K. Toxicity of nanocrystal quantum dots: the relevance of surface modifications. Arch Toxicol 2011; 85:707-20; PMID: ; s Pelley JL, Daar AS, Saner MA. State of academic knowledge on toxicity and biological fate of quantum dots. Toxicol Sci 2009; 112:276-96; PMID: ; kfp Hardman R. A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physicochemical and environmental factors. Environ Health Perspect 2006; 114:165-72; PMID: ; org/ /ehp Ryvolova M, Chomoucka J, Janu L, Drbohlavova J, Adam V, Hubalek J, Kizek R. Biotin-modified glutathione as a functionalized coating for bioconjugation of CdTe-based quantum dots. Electrophoresis 2011; 32: ; PMID: Bottini M, Cerignoli F, Dawson MI, Magrini A, Rosato N, Mustelin T. Full-length single-walled carbon nanotubes decorated with streptavidin-conjugated quantum dots as multivalent intracellular fluorescent nanoprobes. Biomacromolecules 2006; 7: ; PMID: ; org/ /bm Shao J, You XG, Gao F, He R, Cui DX. Labeling of quantum dots with streptavidin and its bioactivity measurement. Chin J Anal Chem 2006; 34: Wu Y, Lopez GP, Sklar LA, Buranda T. Spectroscopic characterization of streptavidin functionalized quantum dots. Anal Biochem 2007; 364: ; PMID: ; ab Bruchez M Jr., Moronne M, Gin P, Weiss S, Alivisatos AP. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science 1998; 281:2013-6; PMID: ; science Landes Bioscience. Do not distribute. Prion 9

131 100. Chan WCW, Nie SM. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science 1998; 281:2016-8; PMID: ; org/ /science Pellegrino T, Manna L, Kudera S, Liedl T, Koktysh D, Rogach AL, Keller S, Radler J, Natile G, Parak WJ. Hydrophobic nanocrystals coated with an amphiphilic polymer shell: A general route to water soluble nanocrystals. Nano Lett 2004; 4:703-7; Fernandez-Argüelles MT, Yakovlev A, Sperling RA, Luccardini C, Gaillard S, Medel AS, Mallet JM, Brochon JC, Feltz A, Oheim M, et al. Synthesis and characterization of polymer-coated quantum dots with integrated acceptor dyes as FRET-based nanoprobes. Nano Lett 2007; 7:2613-7; PMID: ; Lin CAJ, Sperling RA, Li JK, Yang TY, Li PY, Zanella M, Chang WH, Parak WJ. Design of an amphiphilic polymer for nanoparticle coating and functionalization. Small 2008; 4:334-41; PMID: ; Alivisatos AP. Birth of a nanoscience building block. ACS Nano 2008; 2:1514-6; PMID: ; dx.doi.org/ /nn800485f 105. Sobrova P, Ryvolova M. J. H, Adam V, Kizek R. Femtogram Electrochemical Sensing of Prion Proteins Using Quantum Dots. Anal Chim Acta 2013; Submitted Duan JL, Song LX, Zhan JH. One-Pot Synthesis of Highly Luminescent CdTe Quantum Dots by Microwave Irradiation Reduction and Their Hg(2+)- Sensitive Properties. Nano Res 2009; 2:61-8; dx.doi.org/ /s Dalal V, Bhattacharya M, Narang D, Sharma PK, Mukhopadhyay S. Nanoscale Fluorescence Imaging of Single Amyloid Fibrils. J Phys Chem Lett 2012; 3:1783-7; Zhou YW, Li CM, Liu Y, Huang CZ. Effective detection and cell imaging of prion protein with new prepared targetable yellow-emission silver nanoclusters. Analyst 2013; 138:873-8; PMID: ; dx.doi.org/ /c2an36456e 109. Gao XH, Yang LL, Petros JA, Marshall FF, Simons JW, Nie SM. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Curr Opin Biotechnol 2005; 16:63-72; PMID: ; org/ /j.copbio Michalet X, Pinaud FF, Bentolila LA, Tsay JM, Doose S, Li JJ, Sundaresan G, Wu AM, Gambhir SS, Weiss S. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science 2005; 307:538-44; PMID: ; science Smith AM, Duan HW, Mohs AM, Nie SM. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: ; PMID: ; org/ /j.addr Hu R, Zhang XB, Kong RM, Zhao XH, Jiang JH, Tan WH. Nucleic acid-functionalized nanomaterials for bioimaging applications. J Mater Chem 2011; 21: ; Taniguchi S, Green M, Rizvi SB, Seifalian A. The one-pot synthesis of core/shell/shell CdTe/CdSe/ ZnSe quantum dots in aqueous media for in vivo deep tissue imaging. J Mater Chem 2011; 21: ; Ciarlo M, Russo P, Cesario A, Ramella S, Baio G, Neumaier CE, Paleari L. Use of the semiconductor nanotechnologies quantum dots for in vivo cancer imaging. Recent Pat Anticancer Drug Discov 2009; 4:207-15; PMID: ; org/ / Tavares AJ, Chong LR, Petryayeva E, Algar WR, Krull UJ. Quantum dots as contrast agents for in vivo tumor imaging: progress and issues. Anal Bioanal Chem 2011; 399: ; PMID: ; dx.doi.org/ /s Jetha NN, Semenchenko V, Wishart DS, Cashman NR, Marziali A. Nanopore Analysis of Wild-Type and Mutant Prion Protein (PrPC): Single Molecule Discrimination and PrPC Kinetics. PLoS ONE 2013; 8:1-10; pone Landes Bioscience. Do not distribute. 10 Prion volume 7 Issue 5

132 ŠOBROVÁ, P.; VACULOVIČOVÁ, M.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Voltammetry as a tool for characterization of CdTe quantum dots. Int. J. Mol. Sci., 2013, č. 14, s , ISSN IF Abstrakt Elektrochemická detekce jako citlivá detekční technika ve spojení s kvantovými tečkami (QD) byla použita už v celé řadě aplikací. Nicméně QD doposud nebyly charakterizovány snadno použitelnou a opakovatelnou metodou. Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat CdTe QD za použití cyklické voltametrie a diferenční pulzní voltametrie. Pozorované píky byly identifikovány a byl stanoven limit detekce na 100 fg/ml (3 S/N). V závislosti na přesvědčivých výsledcích byla navržena nová metoda pro studování stability a kvality kvantových teček. Tento přístup byl dále použit pro sledování stability QD. Podíl autorky: 30 % textová část práce, 80 % experimentální část Podíl podpory externích projektů DOC_01/2012 CEITEC a JCCM byl 70 % a 30 %. 132

133 Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, ; doi: /ijms Article OPEN ACCESS International Journal of Molecular Sciences ISSN Voltammetry as a Tool for Characterization of CdTe Quantum Dots Pavlina Sobrova 1, Marketa Ryvolova 1,2, Jaromir Hubalek 2,3, Vojtech Adam 1,2 and Rene Kizek 1,2, * Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ Brno, Czech Republic; s: pavlina.sobrova@seznam.cz (P.S.); Marketa.Ryvolova@seznam.cz (M.R.); vojtech.adam@mendelu.cz (V.A.) Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ Brno, Czech Republic; hubalek@feec.vutbr.cz Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Technicka 10, CZ Brno, Czech Republic * Author to whom correspondence should be addressed; kizek@sci.muni.cz; Tel.: ; Fax: Received: 22 April 2013; in revised form: 6 May 2013 / Accepted: 20 May 2013 / Published: 27 June 2013 Abstract: Electrochemical detection of quantum dots (QDs) has already been used in numerous applications. However, QDs have not been well characterized using voltammetry, with respect to their characterization and quantification. Therefore, the main aim was to characterize CdTe QDs using cyclic and differential pulse voltammetry. The obtained peaks were identified and the detection limit (3 S/N) was estimated down to 100 fg/ml. Based on the convincing results, a new method for how to study stability and quantify the dots was suggested. Thus, the approach was further utilized for the testing of QDs stability. Keywords: quantum dot; electrochemistry; differential pulse voltammetry; cyclic voltammetry; in vivo imaging

134 Int. J. Mol. Sci. 2013, Introduction Quantum dots (QDs), semiconductor nanocrystals small enough to exhibit size-dependent properties, have generated tremendous interest due to their unique optical properties [1 6], including broad excitation spectra [7], narrow, tuneable [8] and symmetric emission spectra covering the wide range of spectra from visible to infrared, excellent photostability, and large quantum yield [9 14]. Their surface is also suitable for modification via incorporation of required functionality, and good biocompatibility [5,15 17], and they are also highly efficient multi-photon absorbers that can be potentially useful for three dimensional multi-photon microscopy and imaging [18] a rapidly developing area for both biological and medical applications. These features make QDs one of the most promising nanomaterials for biological staining, detection of bio-macromolecules, and immunohistochemistry [16,19,20]. The most popular types of QDs include CdTe, CdSe, ZnSe, and ZnS; however, metals, such as In, Ga, and many others also can be used [21,22]. Despite the interesting properties hosted by these QDs, the potential leakage of metal ions by chemical dissolution under biological conditions may generate oxidative stress in living cells. Accordingly, the passivation of the surface of the QDs, in order to make them biologically inert without affecting their optical properties, becomes indispensable. Silicates, thiols, organic acids, peptides, proteins, and nucleic acids, forming bioconjugates have been used to cover the surface of QDs and, consequently, to reduce the possible leaking of free cadmium ions under physiological environments [16,23,24]. Electrochemical detection as a sensitive detection technique, in combination with QDs, has already been used for numerous applications such as immobilized substrate for glassy carbon electrodes [25,26] and/or modification of the surface of gold electrodes [27,28]. This powerful combination has also given rise to many electrochemical sensors for glucose [27], prostate specific antigen [29], thrombin [26], tumour cells [26], and/or allergens [30]. Electrochemical studies have also demonstrated several distinct oxidation and reduction peaks in the voltammograms with the peak positions being nanocrystal size dependent. It is demonstrated that the method is very sensitive to the nanocrystal surface states, providing complementary information for better understanding the optical properties of semiconductor nanocrystals [31]. However, to our knowledge, QDs have not been characterized well by voltammetry, with respect to use these easy-to-use and repeatable methods for QDs characterization and quantification. Therefore, the main aim was to characterize CdTe QDs using cyclic and differential pulse voltammetry. Based on convincing results, a new way to study stability, and quantify the dots, was suggested. 2. Results and Discussion 2.1. TEM Characterization of Synthesized Quantum Dots (QDs) The TEM examination of prepared CdTe QDs indicated that the morphology and phase composition were clearly homogeneous. The transmission electron microscope (TEM) pictures (at higher magnifications) showed typical particle size was below 10 nm. Moreover, QDs solution under UV light illumination is shown in the left inset in Figure 1. Optical properties of synthesized QDs were further characterized spectrometrically. The absorption maximum at 500 nm was observed (Figure 1). From the emission spectrum showed in Figure 1 it is apparent that CdTe QDs are exhibiting strong

135 Int. J. Mol. Sci. 2013, fluorescence with the emission maximum at 525 nm. In the following parts of our experiments, we aimed our attention at their electrochemical characterization. Figure 1. Emission (blue line) and absorption (red line) spectrum of CdTe quantum dots (QDs); inset: QDs solution under UV light illumination Voltammetry of QDs Electrochemical techniques are known to show unique advantages in terms of both economic (relatively reasonable cost of equipment and very low operating costs) and excellent analytical features, i.e., determination of low levels of metals in the buffer system and different matrix [32]. Compared to robust and highly expensive microscopic techniques like TEM, there is a need to have a method for rapid and low cost characterization and quantification of synthesized QDs. This was the motivation to study the electrochemical behaviour of QDs, which were composed of Cd and Te Cyclic Voltammetry (CV) of QDs Cyclic voltammetry (CV) is perhaps the most widely used electrochemical technique, and is frequently used for the characterization of redox systems and is often the first experiment performed in an electroanalytical study. It can provide rapid information about the number of redox states of the electroactive species, as well as qualitative information about the stability of these oxidation states and the electron transfer kinetics. Based on the fact that chemicals used for synthesis of QDs are electroactive, we were interested in the issue what a cyclic voltammogram of QDs looked like. Typical cyclic voltammograms of CdTe QDs are shown in Figure 2A. Due to the presence of MPA, Cd, and Te, we obtained five peaks, which correspond to the redox reactions of the QDs. Peaks 1 and 5, and peaks 2 and 4, show reversible redox reactions of MPA and cadmium, respectively. Peak 3 could be of QD origin, but its height was several orders of magnitude lower when compared to the previously mentioned peaks (Figure 2B,C). These results indicate that QDs are electroactive, however, cyclic voltammetry is a method useful for redox characterization only. Quantification is doubtful due to poor sensitivity to QD signals.

136 Int. J. Mol. Sci. 2013, Figure 2. (A) Typical cyclic voltammograms of CdTe QDs measured at hanging mercury drop electrode (HMDE) vs. Ag/AgCl/3 M KCl; (B) Dependences of heights of peaks Nos. 2, 3, and 4 on concentration of QDs; (C) Dependences of the heights of peaks Nos. 1 and 5 on concentration of QDs. Acetate buffer (0.2 M, ph 5) was used as the supporting electrolyte. Cyclic voltammetry (CV) parameters were as follows: an initial potential 0 V, an end potential 1.9 V, vertex potential 1.5 mv, scan rate from 160 mv/s. All experiments were carried out at room temperature (22 24 C). QDs were quantified according to results obtained by differential pulse voltammetry (DPV) Differential Pulse Voltammetry (DPV) of MPA and Cadmium(II) Ions Differential pulse voltammetry (DPV) as a method using fixed-magnitude pulses, which are superimposed on a linear potential ramp and applied to a working electrode at a time just before the end of the drop, is more sensitive to electroactive species compared to CV. DPV can be extremely sensitive for the determination of metal ions [33]. Therefore, we aimed our attention on the studying of the basic electrochemical behaviour of MPA and cadmium, as the components of our QDs of the highest content and highest redox activity as was shown in Figure 3A. MPA peaks at

137 Int. J. Mol. Sci. 2013, V measured at hanging mercury drop electrode (HMDE) vs. Ag/AgCl/3 M KCl. The peak of MPA was proportional to its concentration as is shown in inset in Figure 3A. Detection limit of MPA (3 S/N) was estimated as 100 ng/ml. The same experiment was carried out for cadmium(ii) ions (Figure 3B). These ions are well detectable at V measured at HMDE vs. Ag/AgCl/3 M KCl. Peaks are well developed and also proportional to Cd(II) concentrations up to 50 µg/ml (inset in Figure 3B). After that, the increasing concentration of Cd(II) caused oversaturation of the electrode surface and the shape of the peak was not Gaussian, as is shown in Figure 3B. Moreover, the peaks were not proportional to the concentrations of QDs under concentration higher than 50 µg/ml. Due to extremely high sensitivity, we were able to detect 1 fg/ml (LOD, 3 S/N). In addition, we plotted both MPA and cadmium(ii) ions peaks, which is shown in Figure 3C. In spite of the fact that we used higher concentrations of both chemicals, their peaks were well separated. Figure 3. (A) Typical DP voltammograms of MPA measured at hanging mercury drop electrode (HMDE) vs. Ag/AgCl/3 M KCl; in inset: dependences of MPA peak height on its concentration; (B) Typical DP voltammograms of cadmium(ii) ions measured at HMDE vs. Ag/AgCl/3 M KCl; in inset: dependences of Cd(II) peak height on its concentration; (C) Plotting of MPA and cadmium(ii) ions peaks. Acetate buffer (0.2 M, ph 5) was used as the supporting electrolyte. Differential pulse voltammetric measurements were carried out under the following parameters: start potential 1.5 V; end potential 0 V; a modulation time s, a time interval 0.2 s, a step potential of 1.05 mv/s, a modulation amplitude of 250 mv, E ads = 0 V. All experiments were carried out at room temperature (22 24 C). The DPV samples analyzed were deoxygenated prior to measurements by purging with argon (99.999%) saturated with water for 120 s.

138 Int. J. Mol. Sci. 2013, Differential Pulse Voltammetry of QDs Further, we aimed our attention differential pulse voltammetric characterization of QDs. Typical voltammograms of QDs are shown in Figure 4A. It clearly follows from the results obtained that both detected peaks called Peak A and Peak B enhanced with the increasing concentration of QDs (Figure 4B). The both dependences were of logarithmic shape. Therefore we split the curve and their linear parts are shown in inset in Figure 4B. To identify both peaks, we performed the experiments, in which we added MPA and/or cadmium(ii) to solution containing QDs, and the mixture measured by DPV. We firstly focused on MPA. DP voltammograms of QDs additions (460 µg/ml, quantified according to concentration of cadmium(ii)) to MPA are shown in Figure 5A. Based on the addition, we can conclude that peak A belongs to MPA. Both peaks, MPA and B, enhanced linearly with the increasing concentration of QDs (inset in Figure 5A). We performed this experiment in the opposite way, i.e., additions of MPA (500 µg/ml) to QDs (Figure 5B). As we expected, we observed an increase in the peak of MPA, however, peak B was also enhancing with the increasing concentration of MPA (inset in Figure 5B). The increase was not sharp but considerable. This phenomenon can be related to influence of MPA additions on the nature of the peak B. Figure 4. DP voltammetry of QDs. (A) Typical DP voltammograms of various concentrations of QDs; (B) Dependences of peaks A and B heights on the concentration of QDs. In insert: linear part of dependence of peak A and B heights on the concentration of QDs. All experimental parameters were the same as indicated in caption for Figure 3. QDs were quantified according to results obtained by DPV. To find the nature of peak B, we tested the second electroactive substance, cadmium(ii) ions, from which QDs were prepared. QDs (460 µg/ml) were added in the same concentrations as in the case of MPA (Figure 6A). Peak B renamed on peak QDs enhanced with the increasing concentration of the nanoparticles (inset in Figure 6A). Moreover, we found the dividing of MPA peak into Peak 1 and Peak 1a, which confirmed our hypothesis that MPA as well as cadmium(ii) influenced their electroactivity. Double peaks should be related to excess of MPA, which could result in two peaks. The most interesting part was the testing of additions of cadmium(ii) ions (500 µg/ml) to QDs. Based on the measured voltammograms, Peak MPA did not change, but peak QDs divided into three signals

139 Int. J. Mol. Sci. 2013, (Figure 6B). Peak 2a is of QDs origin, which was confirmed according to peak potential. The excess of cadmium(ii) ions gave peak 2 and some MPA-QDs-Cd(II) complexes related to peak 3. All detected peaks enhanced with the increasing concentration of Cd(II) (inset in Figure 6B). After that, we found the nature of the detected peaks, we attempted to estimate detection limit for synthesized QDs. In order to estimate it, peak QDs was selected. Detection limit (3 S/N) was estimated as 100 fg/ml. Figure 5. (A) DP voltammograms of MPA (500 µg/ml) with additions of QDs in various volumes (460 µg/ml, quantified according to concentration of Cd(II)); in inset: dependence of MPA and B peak heights on concentration of QDs; (B) DP voltammograms of QDs (460 µg/ml) with additions of MPA in various volumes (500 µg/ml); in inset: dependence of MPA and B peak heights on concentration of MPA. Figure 6. (A) DP voltammograms of Cd(II) (500 µg/ml) with additions of QDs in various volumes (460 µg/ml, quantified according to concentration of cadmium(ii)); in inset: dependence of MPA (peak 1 and 1a) and QDs peak heights on concentration of QDs; (B) DP voltammograms of QDs (460 µg/ml) with additions of Cd(II) in various volumes (500 µg/ml); in inset: dependence of MPA and QDs peaks (peak 2, 2a, and 3) heights on concentration of Cd(II).

140 Int. J. Mol. Sci. 2013, Stability of Quantum Dots The electrochemical studying of quantum dot behaviour gave a tool for their ultrasensitive quantification on one hand, but, based on the profile of detected peaks, there could be also possibility to monitor their stability on the other hand. Therefore, we focused on studying the time of stability of the used QDs. The decaying of QDs can be characterized by the detection of the decreasing of emission peak. We assume that this phenomenon can be also characterized by the increasing of two main electrochemical peaks called MPA and QDs. Primarily, temperature stability was investigated within the range from 30 to 90 C. The dots were heat treated for one hour in the dark and then analyzed. The effects of temperature on peaks of MPA and QDs is shown in Figure 7A,B, respectively. It clearly follows, from the results obtained, that both peaks increased with the increasing temperature, which was associated with the decaying of the dots and was in good agreement with the emission decreasing (inset in Figure 7B). Based on these promising results, we followed with time stability tests. QDs were analyzed for three weeks. The height of MPA and QDs peaks are shown in Figure 7C,D, respectively. It can be concluded that the prepared dots are stable for two weeks without any changes, after which, some degradation occurred. Figure 7. Dependences of the height of (A) MPA and (B) QDs peaks on temperature used for treatment of CdTe QDs; inset in (B): dependence of QDs emission on the temperature. The dots were heat treated for one hour. Dependences of the height of (C) MPA and (D) QDs peaks on time of storage of CdTe QDs.

141 Int. J. Mol. Sci. 2013, Further, we were interested in the issue whether our stable quantum dots could be used in vivo. Therefore, we investigated the fluorescence of QDs in an animal tissue. The chicken thigh was bought from Tesco store. The skin was removed from the chicken thigh and 10 µl (460 µg/ml) of QDs were injected into the muscle (Figure 8A). The intensity of the fluorescence decreased with the increasing time, as is shown in Figure 8B. It should be noted that the image of the chicken leg without any injection was taken first and was subtracted from all images to remove the autofluorescent background signal caused by tissues. Considering these facts, it is clear that the prepared QDs were stable enough to give considerable signal even after 210 min in a muscle. There is also need to quantify the intensity of the dots and to find the correlation between intensity and the concentration of the label. The dependence of QDs emission intensity on concentration of QDs injected into the chicken thigh is shown in Figure 8C. The intensity was determined immediately after application. The emission intensity decreased with decreasing concentration of QDs, proportionally. Figure 8. (A) In vivo images of 10 µl (460 µg/ml) of CdTe QDs applied 5 mm under the skin of the chicken thigh. The image of the chicken leg without any injection was subtracted; (B) The dependence of the emission of QDs on time after injection of the dots into a tissue; (C) The dependence of the emission of QDs injected into the chicken thigh on their concentration.

142 Int. J. Mol. Sci. 2013, Experimental Section 3.1. Chemicals Cadmium chloride, sodium tellurite, mercaptopropionic acid, and other used chemicals were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Stock solutions of 50 µg/ml of Cd(II), and 500 µg/ml of MPA were prepared daily and subsequently diluted to the appropriate concentration. Acetate buffer of ph 5 was prepared with 0.2 M acetic acid and 0.2 M sodium acetate, diluted with ACS water and used as a supporting electrolyte. High purity deionized water (Milli-Q Millipore 18.2 MΩ/cm, Bedford, MA, USA) was used throughout the study Microwave Assisted Preparation of Quantum Dots QDs were prepared according to Duan et al. [34]. Cadmium chloride solution (CdCl 2, 0.04 M, 4 ml) was diluted to 42 ml with ultrapure water, and then trisodium citrate dihydrate (100 mg), Na 2 TeO 3 (0.01 M, 4 ml), MPA (119 mg), and NaBH 4 (50 mg) were added successively under magnetic stirring. The molar ratio of Cd 2+ /MPA/Te was 1:7: ml of the resulting CdTe precursor was put into a Teflon vessel. CdTe QDs were prepared at 95 C for various times according to emission color (10 min green; 30 min yellow; 120 min red) under microwave irradiation (400 W, Multiwave3000, Anton-Paar GmbH, Graz, Austria). After microwave irradiation, the mixture was cooled 50 C and the CdTe QDs sample was obtained. Repurification of CdTe QDs was carried out using isopropanol condensing. The CdTe QDs were mixed with isopropanol in ratio 1:2 and then centrifuged 10 min at 25,000 rpm (Eppendorf centrifuge 5417R, Hamburg, Germany). Supernatant (pure CdTe QDs) was then resuspended in the initial volume of Tris Buffer ph Electrochemical Analyzer Electrochemical measurements were performed with an AUTOLAB Analyzer (EcoChemie, Utrecht, The Netherlands) connected to VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland), using a standard cell with three electrodes. The working electrode was a hanging mercury drop electrode (HMDE) with a drop area of 0.4 mm 2. The reference electrode was an Ag/AgCl/3 M KCl electrode and the auxiliary electrode was a graphite electrode. Acetate buffer (0.2 M, ph 5) was used as the supporting electrolyte. For smoothing and baseline correction GPES 4.9 software, supplied by EcoChemie, was employed Cyclic Voltammetry (CV) QDs were studied using cyclic voltammetry. The amount of measured sample was 2 ml in an electrochemical cell. CV parameters were as follows: an initial potential 0 V, an end potential 1.9 V, vertex potential 1.5 mv, scan rate from 160 mv/s. All experiments were carried out at room temperature (20 C).

143 Int. J. Mol. Sci. 2013, Differential Pulse Voltammetry (DPV) The amount of QDs was measured using DPV. Differential pulse voltammetric measurements were carried out under the following parameters: start potential 1.5 V; end potential 0 V; a modulation time s, a time interval 0.2 s, a step potential of 1.05 mv/s, a modulation amplitude of 250 mv, E ads = 0 V. All experiments were carried out at room temperature (20 C). The DPV samples analyzed were deoxygenated prior to measurements by purging with argon (99.999%) saturated with water for 120 s Transmission Electron Microscope Morphology studies and phase analysis were carried out with a transmission electron microscope (TEM) Philips CM 12 (tungsten cathode, using a 120 kv electron beam, Eindhoven, The Netherlands). Chemical compositions were studied by energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX, JEOL, Akishima, Japan). Electron diffraction patterns were simulated with JEMS software. Samples for TEM measurements were prepared by placing drops of the solution (sample and water) on coated Cu grids (holey carbon and holey SiO 2 /SiO) and subsequently drying in air Spectroscopy Absorbance and fluorescence spectra were acquired by a multifunctional microplate reader Tecan Infinite 200 PRO (TECAN, Männedorf, Switzerland). The sample (50 µl) was placed in a transparent 96 well microplate with a flat bottom (Nunc, Thermo Scientific, Freiburg, Germany). Absorbance scan was measured in the range from 230 to 1000 nm using 5 nm steps. Three hundred and fifty nanometers was used as an excitation wavelength, and the fluorescence scan was within the range from 400 to 850 nm (5 nm steps). The detector gain was set to 50. For both absorbance and fluorescence measurements, each value was an average of five measurements In vivo Imaging The fluorescence imaging was carried out by In vivo Xtreme system from Carestream, USA. This instrument is equipped with a 400 W xenon light source and 28 excitation filters ( nm). The emitted light is captured by a 4MP CCD camera. In this experiment, 410 nm was used as an excitation wavelength and the emission was measured at 535 nm. The exposition time was 5 s. The other parameters were set as follows: Bin 2 2, field of view 12 cm, f Stop 1.1. The X-ray image was taken as a background image using following setting: exposure time 1.2 s, filter 0.2 mm, Bin 1 1, power 45 KVP. Between each measurement, the tray with the chicken leg was kept at 4 C Descriptive Statistics and Estimation of Detection Limit Data were processed using MICROSOFT EXCEL (Redmond, WA, USA). Results are expressed as mean ± standard deviation (S.D.) unless noted otherwise (EXCEL ). The detection limits (LOD,

144 Int. J. Mol. Sci. 2013, signal/noise, S/N) were calculated according to Long and Winefordner [35], whereas N was expressed as standard deviation of noise determined in the signal domain unless stated otherwise. 4. Conclusions There are several methods, which can be used for characterization of quantum dots. These methods are often laborious and instruments have high costs. Our results suggest that both cyclic and differential pulse voltammetry can be considered as extremely sensitive, easy-to-use, and a low cost method for the rapid characterization of quantum dots. With LOD down to fg per ml, quantum dots should be of interest also as an electroactive label. Moreover, we showed that QDs were stable enough to be applied into a muscle. Acknowledgments Financial support from the following projects IGA TP1/2013, NanoBioMetalNet CZ.1.07/2.4.00/ and CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ is highly acknowledged. Pavlina Sobrova is Holder of Brno PhD Talent Financial Aid. Marketa Ryvolova wishes to express her thanks to project CZ.1.07/2.3.00/ for financial support. Conflict of Interest The authors declare no conflict of interest. References 1. Bierman, M.J.; Lau, Y.K.A.; Jin, S. Hyperbranched PbS and PbSe nanowires and the effect of hydrogen gas on their synthesis. Nano Lett. 2007, 7, Burda, C.; Chen, X.B.; Narayanan, R.; El-Sayed, M.A. Chemistry and properties of nanocrystals of different shapes. Chem. Rev. 2005, 105, Alivisatos, A.P. Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots. Science 1996, 271, Yong, K.T.; Sahoo, Y.; Choudhury, K.R.; Swihart, M.T.; Minter, J.R.; Prasad, P.N. Control of the morphology and size of PbS nanowires using gold nanoparticles. Chem. Mater. 2006, 18, Drbohlavova, J.; Adam, V.; Kizek, R.; Hubalek, J. Quantum Dots-Characterization, Preparation and Usage in Biological Systems. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, Bouzigues, C.; Gacoin, T.; Alexandrou, A. Biological Applications of Rare-Earth Based Nanoparticles. ACS Nano 2011, 5, Li, Y.S.; Yannouleas, C.; Landman, U. Three-electron anisotropic quantum dots in variable magnetic fields: Exact results for excitation spectra, spin structures, and entanglement. Phys. Rev. B 2007, 76, Tracy, L.A.; Nordberg, E.P.; Young, R.W.; Pinilla, C.B.; Stalford, H.L.; Ten Eyck, G.A.; Eng, K.; Childs, K.D.; Wendt, J.R.; Grubbs, R.K.; et al. Double quantum dot with tunable coupling in an enhancement-mode silicon metal-oxide semiconductor device with lateral geometry. Appl. Phys. Lett. 2010, 97, 1 3.

145 Int. J. Mol. Sci. 2013, Aldeek, F.; Mustin, C.; Balan, L.; Medjahdi, G.; Roques-Carmes, T.; Arnoux, P.; Schneider, R. Enhanced Photostability from CdSe(S)/ZnO Core/Shell Quantum Dots and Their Use in Biolabeling. Eur. J. Inorg. Chem. 2011, 6, Emin, S.; Loukanov, A.; Wakasa, M.; Nakabayashi, S.; Kaneko, Y. Photostability of Water-dispersible CdTe Quantum Dots: Capping Ligands and Oxygen. Chem. Lett. 2010, 39, Ma, Q.F.; Chen, J.Y.; Wu, X.; Wang, P.N.; Yue, Y.; Dai, N. Photostability comparison of CdTe and CdSe/CdS/ZnS quantum dots in living cells under single and two-photon excitations. J. Lumin. 2011, 131, Samadpour, M.; Zad, A.I.; Taghavinia, N.; Molaei, M. A new structure to increase the photostability of CdTe quantum dot sensitized solar cells. J. Phys. D 2011, 44, Zhao, J.J.; Chen, J.; Wang, Z.P.; Pan, J.; Huang, Y.H. Double labeling and comparison of fluorescence intensity and photostability between quantum dots and FITC in oral tumors. Mol. Med. Rep. 2011, 4, Amelia, M.; Lincheneau, C.; Silvi, S.; Credi, A. Electrochemical properties of CdSe and CdTe quantum dots. Chem. Soc. Rev. 2012, 41, Huang, F.H.; Chen, G.N. Preparation and application of L-cysteine-modified CdSe/CdS core/shell nanocrystals as a novel fluorescence probe for detection of nucleic acid. Spectroc. Acta A 2008, 70, Juzenas, P.; Chen, W.; Sun, Y.P.; Coelho, M.A.N.; Generalov, R.; Generalova, N.; Christensen, I.L. Quantum dots and nanoparticles for photodynamic and radiation therapies of cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 60, Lu, M.G.; Al-Jamal, K.T.; Kostarelos, K.; Reineke, J. Physiologically Based Pharmacokinetic Modeling of Nanoparticles. ACS Nano 2010, 4, Jamieson, T.; Bakhshi, R.; Petrova, D.; Pocock, R.; Imani, M.; Seifalian, A.M. Biological applications of quantum dots. Biomaterials 2007, 28, Jin, S.; Hu, Y.X.; Gu, Z.J.; Liu, L.; Wu, H.C. Application of Quantum Dots in Biological Imaging. J. Nanomater. 2011, 2011, Rosenthal, S.J.; Chang, J.C.; Kovtun, O.; McBride, J.R.; Tomlinson, I.D. Biocompatible Quantum Dots for Biological Applications. Chem. Biol. 2011, 18, Green, M.; O'Brien, P. A novel metalorganic route for the direct and rapid synthesis of monodispersed quantum dots of indium phosphide. Chem. Commun. 1998, 22, Ryvolova, M.; Chomoucka, J.; Janu, L.; Drbohlavova, J.; Adam, V.; Hubalek, J.; Kizek, R. Biotin-modified glutathione as a functionalized coating for bioconjugation of CdTe-based quantum dots. Electrophoresis 2011, 32, Weng, J.F.; Song, X.T.; Li, L.A.; Qian, H.F.; Chen, K.Y.; Xu, X.M.; Cao, C.X.; Ren, J.C. Highly luminescent CdTe quantum dots prepared in aqueous phase as an alternative fluorescent probe for cell imaging. Talanta 2006, 70,

146 Int. J. Mol. Sci. 2013, Chomoucka, J.; Drbohlavova, J.; Babula, P.; Adam, V.; Hubalek, J.; Provaznik, I.; Kizek, R. Cell Toxicity and Preparation of Streptavidin-Modified Iron Nanoparticles and Glutathione-Modified Cadmium-Based Quantum Dots. In Proceedings of Eurosensors XXIV Conference, Linz, Austria, 5 8 September 2010; Jakoby, B., Vellekoop, M.J., Eds.; Elsevier Science Bv: Amsterdam, The Netherlands, Hua, M.; Li, P.; Li, L.; Huang, L.L.; Zhao, X.H.; Peng, Y.J.; Yang, Y.H. Quantum dots as immobilized substrate for electrochemical detection of cocaine based on conformational switching of aptamer. J. Electroanal. Chem. 2011, 662, Li, J.J.; Xu, M.; Huang, H.P.; Zhou, J.J.; Abdel-Halim, E.S.; Zhang, J.R.; Zhu, J.J. Aptamer-quantum dots conjugates-based ultrasensitive competitive electrochemical cytosensor for the detection of tumor cell. Talanta 2011, 85, Gu, Z.G.; Yang, S.P.; Li, Z.J.; Sun, X.L.; Wang, G.L.; Fang, Y.J.; Liu, J.K. An ultrasensitive electrochemical biosensor for glucose using CdTe-CdS core-shell quantum dot as ultrafast electron transfer relay between graphene-gold nanocomposite and gold nanoparticle. Electrochim. Acta 2011, 56, Khene, S.; Moeno, S.; Nyokong, T. Voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy of gold electrodes modified with CdTe quantum dots and their conjugates with nickel tetraamino phthalocyanine. Polyhedron 2011, 30, Yang, M.H.; Javadi, A.; Gong, S.Q. Sensitive electrochemical immunosensor for the detection of cancer biomarker using quantum dot functionalized graphene sheets as labels. Sens. Actuators B 2011, 155, Yang, C.; Cu, B.X.; Xu, C.X.; Xu, X.Y. Self-assembled ZnO quantum dot bioconjugates for direct electrochemical determination of allergen. J. Electroanal. Chem. 2011, 660, Gaponik, N.; Poznyak, S.K.; Osipovich, N.P.; Shavel, A.; Eychmuller, A. Electrochemical probing of thiol-capped nanocrystals. Microchim. Acta 2008, 160, Monticelli, D.; Ciceri, E.; Dossi, C. Optimization and validation of an automated voltammetric stripping technique for ultratrace metal analysis. Anal. Chim. Acta 2007, 594, Krystofova, O.; Trnkova, L.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Hubalek, J.; Babula, P.; Kizek, R. Electrochemical microsensors for the detection of cadmium(ii) and lead(ii) ions in plants. Sensors 2010, 10, Duan, J.L.; Song, L.X.; Zhan, J.H. One-Pot Synthesis of Highly Luminescent CdTe Quantum Dots by Microwave Irradiation Reduction and Their Hg(2+)-Sensitive Properties. Nano Res. 2009, 2, Long, G.L.; Winefordner, J.D. Limit of detection. Anal. Chem. 1983, 55, by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (

147 ŠOBROVÁ, P.; RYVOLOVÁ, M.; PEKAŘÍK, V.; HUBÁLEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Femtogram electrochemical sensing of prion proteins using quantum dots. Int. J. Electrochem. Sci., 2013, roč. 8 s ISSN IF Abstrakt Prionový protein (PrP) se účastní neurodegeneračních procesů cestou konverze přirozeného buněčného prionu (PrP C ) na jeho infekční formu PrP Sc, která je příčinou transmisních spongiformních onemocnění (TSE) zahrnující Creutzfeldt-Jakobovu nemoc (CJD). Diagnostika prionových proteinů způsobující onemocnění představuje velkou výzvu. V této práci jsme se zaměřili na studium interakcí prionového proteinu a CdTe kvantových teček (QD) za použití voltametrie jako nové velmi citlivé metody pro sledování prionových proteinů. Primárně jsme se zaměřili na sledování fluorescenčních a elektrochemických vlastností QD. Následně bylo provedeno elektrochemické studium jejich interakcí, aby bylo možné stanovit nejoptimálnější podmínky pro citlivou detekci prionových proteinů. Detekční limit byl stanoven na 1 fg v 5 µl vzorku. Toto dává značení prionových proteinů za pomocí QD velkou důležitost a to zejména kvůli snadné aplikovatelnosti a možnosti použití u miniaturizovaných zařízení, které mohou být použity in situ. V závislosti na výsledcích můžeme usoudit, že komplex prion-qd je stabilní a dostačí extrémně nízké množství vzorku. Toto může otevřít nové možnosti stanovení přítomnosti těchto proteinů na chirurgických nástrojích a dalších typů materiálů, které mohou být kontaminovány. Podíl autorky: 40 % textová část práce, 70 % experimentální část Podíl podpory externích projektů DOC_01/2012 CEITEC a JCCM byl 70 % a 30 %. 147

148 Int. J. Electrochem. Sci., 8 (2013) International Journal of ELECTROCHEMICAL SCIENCE Femtogram Electrochemical Sensing of Prion Proteins Using Quantum Dots Pavlina Sobrova 1,2, Marketa Ryvolova 1,2, Vladimir Pekarik 3, Jaromir Hubalek 1,2, Vojtech Adam 1,2, Rene Kizek 1,2,* 1 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ Brno, Czech Republic, European Union 2 Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ Brno, Czech Republic, European Union 3 Department of Cellular and Molecular Neurobiology, Central European Technology Institute, Masaryk University, Kamenice 735/3, CZ Brno, Czech Republic, European Union * kizek@sci.muni.cz Received: 20 April 2013 / Accepted: 19 August 2013 / Published: 1 October 2013 The prion protein (PrP) is involved in neurodegeneration via its conversion from the normal cellular form, PrP C, to the infectious form, PrP Sc, which is the causative agent of the transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) including Creutzfeldt-Jakob disease (CJD). In spite of great effort in this field, diagnostics of prion protein caused diseases represents a sort of challenge. In this study, we aimed our attention on studying of prion protein interaction with CdTe quantum dots (QDs) by voltammetry as a new and extremely sensitive tool for sensing of these proteins. Primarily, we characterized fluorescent and electrochemical properties of QDs. Further, electrochemical study of their interactions was carried out to find the most suitable conditions for sensitive detection of prion proteins. Detection limit (3 S/N) was estimated as 1 fg in 5 µl. This makes labeling of proteins with QDs of great importance due to easy applicability and possibility to use in miniaturized devices, which can be used in situ. Based on our results it can be concluded that QDs-prion protein complex is stable and can be quantified in extremely low amounts. This should open new possibilities how to determine the presence of these proteins on surgical equipment and other types of materials, which could be contagious. Keywords: Quantum Dot; Prion Proteins; In Vivo Imaging; Electrochemistry; Differential Pulse Voltammetry 1. INTRODUCTION Prion protein occurs in all mammal cells, primarily in neural cells and immune system cells. Its physiological function is not completely clear, however it is assumed that participates on synaptic

149 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 8, transfer and cell differentiation. The prion protein (PrP) is involved in neurodegeneration via its conversion from the normal cellular form, PrP C, to the infectious form, PrP Sc, which is the causative agent of the transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) including Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) [1-4]. The coexistence of Alzheimer disease pathology in Creutzfeld-Jakob disease (CJD) has been reported [5]. Transfer of infectious prion proteins from animal to animal has been numerous times described [2,6,7], however, it was discovered recently prion proteins could cling to surgical equipment used on CJD patients and then infect others, because normal sterilization techniques do not kill the hardy proteins [8]. The risks of transmission are low, but it might occur if hospitals do not discard all CJD-contaminated surgical tools or strip them of prions using chemicals and ultra-high temperature. Until now, most attention has been focused on treating dirty equipment after neurosurgery, from which five patients have caught CJD [9], but the transmission might also happen from patients incubating the disease who have operations before they begin to show symptoms. Diagnostics of prion protein caused diseases represents a sort of challenge [10,11]. In the case of human diseases, diagnosis is based almost exclusively on clinical examination and the disease is then considered as probable depending on the extent to which the clinical symptoms fit the standard guidelines. Currently, PrP Sc is the only disease-specific analyte commercially used for identification of prion diseases [12]. From the clinical point of view, the most sensitive and specific method of diagnosing TSE is unquestionably experimental infection in laboratory animals. The animal is injected with a homogenate prepared from the suspicious tissue and appearance of clinical signs is followed. The disease development is then confirmed after dissection using classic techniques (histology, immunohistology, Western Blot). These methods are too laborious and time-consuming to be used for routine high-throughput screening [13]. Recently, new post-mortem tests have been introduced enabling rapid screening of the suspicious samples. Currently five commercial tests are approved by the European Commission for BSE detection (Prionics-Check Western test, Enfer test, CEA/Biorad test, Prionics-Check LIA test, and Conformational-dependent immunoassay). All these tests are based on immunodetection of the pathological PrP Sc isoform; four of them use proteolysis to distinguish PrP C from misfolded PrP Sc [10]. It has to be noted that none of these tests is able to identify infected animal at the pre-symptomatic stage. A possibility how to diagnose prion protein related neurodegenerative disease is to use Protein-misfolding cyclic amplification (PMCA) [14]. Method is based on converting additional normal prion protein to the sample with infectious prion. PMCA involves repeated cycles on incubation and sonication. These repeated cycles can amplify the amount of prion protein present in the sample from four to 40 times in two weeks [15,16]. Sensitive and specific detection of abnormal prion protein in blood could provide a diagnostic test or screening assay for animal and human prion diseases. Therefore, diagnostic tests of prion diseases present a unique challenge requiring development of novel assays exploiting properties uniquely possessed by this misfolded protein complex. The characterization and analysis of biomolecules and biological systems in the context of intact organisms is known as in vivo research. A new and exciting direction of research for quantum dots (QDs) is their application as a contrast agent for in vivo imaging [17-28]. For most investigations of in vivo imaging, QDs are usually directly injected into the live animal intravenously or subcutaneously and thereby are delivered into the bloodstream. The behavior of QDs in vivo is very

150 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 8, interesting because they have to interact with the components of plasma, blood cells, and the vascular endothelium. QDs are mainly applied for imaging of cancer cells [29-31], however, prion proteins have not been sensed by these particles yet. Therefore, we aimed our attention on studying of prion protein interaction with CdTe QDs by voltammetry as a new and extremely sensitive tool for sensing of these proteins. 2. EXPERIMENTAL PART 2.1 Chemicals and material Cadmium chloride, sodium tellurite, mercaptopropionic acid and other used chemicals were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Stock solutions of 50 µg ml -1 of Cd 2+, and 500 µg/ml of MPA were prepared daily and subsequently diluted to the appropriate concentration. Acetate buffer of ph 5 was prepared with 0.2 M acetic acid and 0.2 M sodium acetate, diluted with ACS water and used as a supporting electrolyte. Prion - Recombinant bovine PrP (highly purified protein (rec bovprp), amino acid sequence corresponding to mature bovine PrP (amino acids ), Expressed in an E. coli K12 strain, MW Da) was purchased from Prionics AG (Switzerland). High purity deionized water (Milli-Q Millipore 18.2 MΩ cm -1, Bedford, MA, USA) was used throughout the study. 2.2 Microwave assisted preparation of quantum dots QD were prepared according to Duan et al. [32]. Cadmium chloride solution (CdCl 2, 0.04 M, 4 ml) was diluted to 42 ml with ultrapure water, and then trisodium citrate dihydrate (100 mg), Na 2 TeO 3 (0.01 M, 4 ml), MPA (119 mg), and NaBH 4 (50 mg) were added successively under magnetic stirring. The molar ratio of Cd 2+/ MPA/Te was 1:7: ml of the resulting CdTe precursor was put into a Teflon vessel. CdTe QDs were prepared at 95 C for various times according to desired color (10 min. green, 30 min. yellow, 120 min. red) under microwave irradiation (400 W, Multiwave3000, Anton-Paar GmbH, Austria). After microwave irradiation, the mixture was cooled 50 C and the CdTe QDs sample was obtained. Repurification of CdTe QDs was carried out using isopropanol condensing. The CdTe QDs was mixed with isopropanol in ratio 1:2 and then centrifuged 10 minutes under rpm (Eppendorf centrifuge 5417R). Supernatant (clear CdTe QDs) was than resuspended in initial volume of Tris Buffer ph Transmission electron microscope Morphology studies and phase analysis were carried out with the transmission electron microscope (TEM) Philips CM 12 (tungsten cathode, using a 120kV electron beam). Chemical compositions were studied by energy-dispersive X ray spectroscopy (EDX). Electron diffraction patterns were simulated by JEMS software. Samples for TEM measurements were prepared by placing

151 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 8, drops of the solution (sample and water) on coated Cu grids (holey carbon and holey SiO 2 /SiO) and subsequently drying in air. 2.4 Spectroscopy Absorbance and fluorescence spectra were acquired by multifunctional microplate reader Tecan Infinite 200 PRO (TECAN, Switzerland). The sample (50 µl) was placed in a transparent 96 well microplate with flat bottom (Nunc, Thermo Scientific, Germany). Absorbance scan was measured in the range from nm using 5 nm steps. 350 nm was used as an excitation wavelength and the fluorescence scan within the range from 400 to 850 nm (5 nm steps). The detector gain was set to 50. For both absorbance and fluorescence measurements, each value was an average of 5 measurements. 2.5 Electrochemical analyzer Electrochemical measurements were performed with AUTOLAB Analyzer (EcoChemie, Netherlands) connected to VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland), using a standard cell with three electrodes. The working electrode was a hanging mercury drop electrode (HMDE) with a drop area of 0.4 mm 2. The reference electrode was an Ag/AgCl/3M KCl electrode and the auxiliary electrode was a graphite electrode. Acetate buffer (0.2 M, ph 5) was used as the supporting electrolyte. For smoothing and baseline correction the software GPES 4.9 supplied by EcoChemie was employed. The amount of QDs was measured using DPV. Differential pulse voltammetric measurements were carried out under the following parameters: start potential -1.5 V; end potential 0 V; a modulation time s, a time interval 0.2 s, a step potential of 1.05 mv s -1, a modulation amplitude of 250 mv, E ads = 0 V. All experiments were carried out at room temperature (20 C). The DPV samples analyzed were deoxygenated prior to measurements by purging with argon (99.999%) saturated with water for 120 s. 2.6 Descriptive statistics and estimation of detection limit Data were processed using MICROSOFT EXCEL (USA). Results are expressed as mean ± standard deviation (S.D.) unless noted otherwise (EXCEL ). The detection limits (LOD, 3 signal/noise, S/N) were calculated according to Long and Winefordner [33], whereas N was expressed as standard deviation of noise determined in the signal domain unless stated otherwise. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1 TEM characterization of synthesized quantum dots The TEM examination of prepared CdTe QDs indicated the morphology and phase composition were clearly homogeneous. The TEM pictures (at higher magnifications) showed that dried droplets consists of a fine grain powder of a typical size of particles below 10 nm (Fig. 1A).

152 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 8, Chemical and phase compositions were proved by EDAX measurements and by electron diffraction (SEAD), respectively (bottom inset in Fig. 1A). A width of the diffraction rings corresponding to the observed small particles size. Other morphological structures were not found and other phases were not distinguished on both type TEM grid (carbon and silicon oxide). When we found that we synthesized objects smaller than 10 nm, we followed with their optical characterization. QDs solution under UV light illumination is shown in upper inset in Fig. 1A. Optical properties of synthesized QDs were characterized spectrometrically. From the absorbance spectra it follows that QDs absorb strongly the light in the UV range, however also the absorption maximum at 500 nm was observed. From the emission spectrum shown in Fig. 1B it is apparent that CdTe QDs are exhibiting strong fluorescence with the emission maximum at 525 nm. It can be concluded based on the results obtained that we successfully synthesized CdTe QDs. In the following parts of our experiments, we aimed our attention at their electrochemical characterization. Figure 1. (A) TEM micrograph of the sample showing fine morphologies of QDs with the typical particles size below 10 nm; in inset: QDs solution under UV light illumination. (B) Absorption and emission spectra of CdTe QDs. 3.2 Sensing of prion proteins Due to the presence of MPA on the surface of QDs, good interaction with proteins can be expected. Sensing of proteins is of extreme interest for numerous scientists. In this study, we studied prion proteins, which are biomolecules naturally occurring in the animal cells. 3D model of prion protein structure is shown in inset in Fig. 2A. We mixed prion protein (500 µg ml -1 ) with QDs (500 µg ml -1 ) in ratios 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 and 1:10, and vice versa, and let to interact at 35 C in dark for 24 hours. This mixture was the analyzed by adsorptive transfer stripping technique (AdTS) coupled with differential pulse voltammetry. The main principle is based in electrode removing from a solution after accumulating of a target molecule on its surface, rinsing of the electrode and transferring to a pure supporting electrolyte, where no interferences are present. The scheme of adsorptive transfer stripping technique (AdTS) can be summarized to the following steps:

153 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 8, (1) renewing of a surface of a working electrode; (2) adsorbing of target molecule in a drop solution onto the surface at open circuit and/or superimposed potential; (3) washing the working electrode in a solution; (4) transferring of the washed electrode to a supporting electrolyte; (5) measurement of adsorbed target molecules. Using AdTS DPV we found that QDs itself did not adsorb on the surface of working electrode (not shown). Figure 2. (A) DP voltammograms of prion protein (PrP, 500 μg ml -1 ) with additions of QDs in various volumes (460 μg ml -1, quantified according to concentration of cadmium(ii)). (B) Dependences of peaks 1, 2, 3 and 4 heights on the concentration of QDs. (C) DP voltammograms of QDs (460 μg ml -1 ) with additions of prion protein (PrP, 500 μg ml -1 ) in various volumes (500 μg ml -1 ). (D) Dependences of peaks 1, 2 and 3 heights on the concentration of PrP. Therefore, QDs-prion protein complex only was adsorbed on the surface of working electrode (120 s) and measured using DPV. The increasing concentration of QDs gave us four peaks (Fig. 2A). Peak 3 corresponded to prion protein itself. It is obvious that this signal is lower compared to others. Peaks 1, 3 and 4 belong to QDs-prion protein complex. Peak 1 can be associated to Cd(II)-prion protein because of shifting of Cd(II) peak to more positive potentials due to Cd(II) interactions with protein moieties. Peaks 3 and 4 can be associated with MPA-Cd(II)-protein complexes. These

154 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 8, complexes can be formed by interactions of some amino acids moieties with Cd(II). Moreover, we found that peaks 1, 2 and 3 were linearly proportional to concentration of QDs, which is important for sensing of prions (Fig. 2B). Figure 3. (A) 3D structure of human prion protein, expasy.org. (B) DP voltammograms of QDs-prion protein complex, concentration of the prion protein was as stated in the figure. The complex was measured using AdTS DPV. (C) DP voltammograms of various prion protein concentrations. The peak height enhanced with the increasing concentration of prion proteins. Tested concentration range was from 16 μg ml -1 to 500 μg ml -1. The complex was measured using AdTS DPV; in inset: calibration curve with regression coefficient R 2 = (D) Calibration curves for QDs-prion protein complex. To find the most appropriate peak, complexes of QDs with the increasing prion protein concentration were analyzed using AdTS DPV. Peak 4 disappeared, but the peaks 1, 3 and 4 remained (Fig. 2C). Peak 1 and 3 increased linearly with the increasing concentration of prions, which can be associated with the fact that nature of this peak is somewhat dependent on prion protein concentration (Fig. 2D). Peak 2 decreased with the increasing concentration of prions. The interaction of prion proteins with CdTe QDs was also confirmed by decreasing fluorescence of the particles with the increasing concentration of QDs.