MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2015 ELIŠKA SEDLÁČKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Vypracovala: Eliška Sedláčková Konzultant: Ing. Dr. Branislav Ruttkay-Nedecký Brno 2015

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis 3

4 Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/ z Evropského fondu regionálního rozvoje. 4

5 PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala mému vedoucímu bakalářské práce panu Doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D. za téma práce a především pak za možnost vyzkoušet si v rámci stáže práci v laboratorním provozu a provést tak pod odborným dohledem veškeré experimenty. Mé velké díky patří Ing. Dr. Branislavu Ruttkay-Nedeckému za maximální ochotu, vstřícnost, trpělivost, pomoc při interpretaci výsledků, cenné rady při psaní práce a celkově za veškerý čas, který mojí práci obětoval. Zároveň ze srdce děkuji Mgr. Dagmar Chudobové, Ph.D. a Ing. Kristýně Číhalové za nekonečnou trpělivost, cenné rady, přátelský přístup a odborný dohled nad mou prací a prováděnými experimenty. Největší dík patří panu prof. Ing. Renému Kizekovi, Ph.D. a všem pracovníkům Laboratoře metalomiky a nanotechnologií za odbornou asistenci u experimentů, cenné rady, odbornou pomoc a vůbec za příjemnou pracovní atmosféru. 5

6 ABSTRAKT Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy Prionové proteiny jsou infekční glykoproteiny, které neobsahují nukleové kyseliny. Jejich specifická funkce v mozku však dosud není zcela objasněná. Konverze buněčné formy prionového proteinu (PrP C ) na jeho patologickou izoformu (PrP Sc ) je považována za příčinu vzniku neurodegenerativních onemocnění. PrP C je glykoprotein, který interaguje s řadou dvojmocných kovových iontů, zejména s Cu 2+ a Zn 2+. Dalším proteinem, který má schopnost vázat kovy je i metalothionein (MT), který tvoří několik specifických forem. Z hlediska vzniku neurodegenerativních onemocnění je významná izoforma MT-3 obsažena v mozku. Jednou z funkcí MT-3 v mozku je účast na udržování optimální koncentrace kovových iontů. Cílem této práce bylo ověření přítomnosti exprese genů PrP C anebo MT-3 v bakteriálních buňkách E. coli. Dále jsme sledovali vliv přídavků kovů k bakteriální kultuře E. coli exprimující protein PrP C anebo MT-3. V závěru jsme se věnovali stanovení celkové koncetrace MT v bakteriálních buňkách E. coli exprimujících protein PrP C anebo MT-3. Veškerá stanovení proběhla v porovnání se standardním kmenem E. coli Bl21(DE3). Klíčová slova: prionová onemocnění, PrP C, PrP Sc, MT, MT-3, měď, zinek, kadmium ABSTRACT Prion proteins and their interactions with heavy metals Prion proteins are infectious glycoproteins that do not contain nucleic acids. Their specific function in the brain is not yet fully understood. Conversion of the cellular form of prion protein (PrP C ) into the pathological isoform (PrP Sc ) is regarded as the cause of neurodegenerative diseases. PrP C is a glycoprotein that interacts with many divalent metal ions, particularly Cu 2+ and Zn 2+. Another protein having the ability to bind metals, is also metallothionein (MT), which consists of several specific forms. Regarding formation of neurodegenerative diseases is significant metallothionein isoform MT-3 occuring in the brain. One of the MT-3 functions in the brain is its participation in maintaining of the optimal concentration of metal ions. The aim of this study was to verify the presence of expression PrP C or MT-3 genes in E. coli bacterial cells. Furthermore, we investigated the effect of metal additions on E. coli bacterial culture expressing PrP C or MT-3 protein. In the end we focused on determining the total concentration of MT in E. coli bacterial cells expressing the PrP C or MT-3 protein. Any determination was compared to a standard E. coli BL21 (DE3) strain. Keywords: prion diseases, PrP C, PrP Sc, MT, MT-3, copper, zinc, cadmium 6

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍLE PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Prionové proteiny Molekulární podstata přirozeného prionového proteinu PrP C Molekulární podstata infekčního prionového proteinu PrP Sc Konverze PrP C na PrP Sc Prionová onemocnění Historie prionových onemocnění Prionová onemocnění u lidí Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) GSS (Gerstmann-Sträussler-Scheikerova choroba) FFI (Fatální familiální insomnie) Kuru Prionová onemocnění u zvířat Scrapie (klusavka, drbavka) Bovinní spongiformní encefalopatie (nemoc šílených krav, BSE) Metalothionein (MT) MT-3 a jeho role při vzniku neurodegenerativních onemocnění Bakteriální metalothionein Interakce prionových proteinů s kovy a jejich vliv na neurodegenerativní onemocnění Interakce prionových proteinů s esenciálními kovy (Zn, Cu) Interakce prionových proteinů s toxickými kovy (Cd) MATERIÁL A METODIKA Materiál

8 4.1.1 Použité mikroorganismy Chemikálie pro kultivaci E. coli Chemikálie pro ověření exprese MT-3 a hprp Chemikálie použité na elektrochemická měření Metody Kultivace transformovaných E. coli Ověření exprese genů hprp a MT-3 pomocí western blotu a dot blotu Příprava vzorků pro western blot a dot blot Příprava gelů pro SDS-PAGE Polyakrylamidová gelová elektroforéza SDS-PAGE Western blot Dot blot Měření růstových křivek po přidání vybraných iontů těžkých kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) k bakteriálním kulturám Elektrochemická stanovení vzorků Příprava vzorků pro elektrochemická stanovení Stanovení hladiny MT metodou diferenční pulzní voltametrie (DPV) VÝSLEDKY A DISKUZE Ověření exprese rekombinantního lidského prionového proteinu (hprp C ) a metalothioneinu 3 (MT-3) metodami western-blot a dot-blot Studium vlivů iontů kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) na růst bakteriální kultury Elektrochemické stanovení celkové hladiny MT po přídavku iontů kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) k bakteriální kultuře metodou diferenční pulzní voltametrie (DPV) ZÁVĚR PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM ZKRATEK

9 1 ÚVOD Prionovým proteinům se v posledních letech dostalo zvýšené pozornosti. V roce 1982 zformuloval Stanley B. Prusiner tzv. prionovou teorii, která definuje prion jako proteinovou infekční částici postrádající nukleovou kyselinu. Prionové proteiny zodpovídají u člověka či zvířat za řadu neurodegenerativních onemocnění, obecně nazývané jako přenosné spongiformní encefalopatie (TSE). Podstatou onemocnění je konverze buněčné formy prionového proteinu (PrP C ) struktury α-helixu na jeho patologickou izoformu (PrP Sc ), která nabývá konformace β-skládaného listu. K nejznámějším lidským onemocněním způsobených priony patří Creutzfeldt- Jakobova choroba (CJD) a její subtypy, Gerstmann-Sträussler-Scheinkerův syndrom (GSS), fatální familirní insomnie (FFI) a kuru. Zvířecí prionová onemocnění zahrnují bovinní spongiformní encefalopatii (BSE), scrapii, chronické chřadnutí jelenovitých (CWD), spongiformní encefalopatii koček (FSE), přenosnou encefalopatii norků (TME), exotickou spongiformní encefalopatii kopytníků (EUE) anebo nákazu nehumánních primátů (NHP). Do popředí zájmu se však prionové proteiny dostaly až v roce 1986, a to právě z důvodu vypuknutí epidemie BSE, která se objevila poprvé ve Velké Británii a zapříčinila tak smrt mnoha kusů dobytka. Naopak zvýšený zájem o studium prionových proteinů způsobilo objevení nové varianty CJD (vcjd) v roce 1996 a následné obavy z možného přenosu BSE na člověka alimentární cestou. Vlastnosti PrP C dosud nejsou zcela prozkoumány, ale předpokládá se jeho afinita k iontům kovů. Vzhledem k tomu, že je PrP C protein vázající kov, existuje hypotéza, že ionty kovů (Cu, Zn a Mn) mohou hrát roli při transformaci z PrP C na PrP Sc. Neméně důležitým pojítkem mezi prionovými onemocněními a kovy je i protein metalothionein. Jeho mozkově specifická forma metalothionein-3 (MT-3) se účastní vzniku neurodegenerativních onemocnění a zajišťuje udržování optimální koncentrace kovů v mozku. Bylo zjištěno, že při snížení hladiny MT-3 dochází k formaci neurofibrilárních shluků charakteristických pro neurodegenerativní onemocnění. 9

10 2 CÍLE PRÁCE Zpracovat literární rešerši na téma "Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy" Ověření přítomnosti lidského prionového proteinu (hprp C ) a metallothioneinu-3 (MT-3) v bakteriálních buňkách E. coli exprimujících tyto proteiny Sledování změn růstu u bakteriálních kultur exprimujících proteiny hprp C a MT-3 po přidání tří těžkých kovů (Cu, Zn a Cd) Elektrochemické stanovení celkové hladiny MT v bakteriálních buňkách E. coli exprimujících proteiny hprp C a MT-3 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Prionové proteiny Priony jsou samostatně se replikující proteinové agregáty, které hrají primární roli v řadě neurologických onemocnění u savců. Buněčná forma prionového proteinu (PrP C ) podléhá konformační transformaci, která vede ke tvorbě patologické izoformy (PrP Sc ). Buňěčná a patologická izoforma se liší pouze změnou konformace. Nejvyšší exprese PrP C je v nervových buňkách a buňkách imunitního systému. Nicméně fyziologická funkce tohoto proteinu není dosud zcela objasněna, pravděpodobně se podílí na synaptickém přenosu a diferenciaci buněk. PrP C je kódován samostatnou kopií chromozomálního genu (PRNP) a způsobuje jevy, jež mohou mít širší dopad u neurodegenerativních onemocnění (Pan, Stahl et al. 1992; Prusiner, Scott et al. 1998). PRNP je u lidí umístěn na 20. chromozomu (Glatzel, Stoeck et al. 2005). Předpokládá se, že hlavní roli při prionových onemocněních hraje konformační konverze normálního buněčného prionového proteinu (PrP C ), na jeho abnormální patologickou izoformu (PrP Sc ), jenž se v důsledku nepřítomnosti nukleové kyseliny stává infekční (Ortega-Cubero, Luquin et al. 2013). Rovněž byla prokázána podobnost prionových proteinů s jinými proteiny, které způsobují Alzheimerovou a Parkinsonovou chorobu (Hur, Kim et al. 2002). Buněčný prionový protein (PrP C, obrázek 1A) je glykoprotein, který se nachází převážně v centrální nervové soustavě (CNS), ale v menším množství se vyskytuje i v jiných tkáních (Hur, Kim et al. 2002). O PrP Sc je známo mnohem méně informací než o PrP C. Patologická izoforma (PrP Sc, obrázek 1B) je velice odolná vůči degradačním buněčným procesům. Toxicita obtížně degradovatelného proteinu a nedostatek fyziologického PrP C vedou ke vzniku a rozvoji progresivních neurodegenerativních chorob (Ji and Zhang 2010; Fraser 2014). Experimenty s tkáňovou kulturou mozečku ukazují, že buňky, kterým chybí PrP C jsou mnohem náchylnější k oxidačnímu stresu a snadno podléhají buněčné smrti (Brown, Schulz-Schaeffer et al. 1997). Existuje několik různých prionových kmenů, které se vyskytují u většiny živočišných druhů a způsobují podobná onemocnění (Arnold and Wilesmith 2004; Coppede, Mancuso et al. 2006). 11

12 A B Obrázek 1: (A) Schéma struktury buněčné formy prionového proteinu (PrP C ); (B) struktura patologického (abnormálního) infekčního prionu (PrP Sc ). Převzato z (Prusiner, Scott et al. 1998) Molekulární podstata přirozeného prionového proteinu PrP C PrP C se přirozeně vyskytuje ve všech savčích buňkách (Biasini, Turnbaugh et al. 2012). PrP C tvoří konformaci -helix a je bohatý na C-terminální globulární doménu, která obsahuje dvě vázané glykosylace na asparagin a intramolekulární disulfidovou vazbu. Kromě toho také obsahuje hydrofobní centrální oblast a relativně nestrukturovanou N-terminální doménu, v níž se nachází oktapeptidové repetice glycinu a histidinu vázající měďnaté ionty vyznačující se nízkou mikromolekulární afinitou (Varela-Nallar, Toledo et al. 2006; Haik, Dormont et al. 2002). PrP C je lokalizován převážně v plazmatických membránách. Bylo zjištěno, že se vyskytuje i v endozomálních strukturách, kde dochází k odbourávání s membránou spojených PrP C (Godsave, Peters et al.). Molekuly PrP C se obvykle nacházejí na povrchu buněk, kde jsou připojeny pomocí C-terminální GPI kotvy. PrP C se syntetizuje v drsném plazmatickém retikulu (ER) a při své cestě k povrchu buněk přechází do Golgiho aparátu (Harris 2003; Trzesniewska, Brzyska et al. 2004). Přítomnost buněčné formy PrP C na povrchu buňky je kritická v 12

13 případě neurotoxicity prionů. Kromě toho je PrP C navržen tak, aby hrál roli v buněčné adhezi, regulaci iontových proudů na buněčné membrány, neuroprotekci a také má funkci receptoru pro rozpustné oligomery β-amyloid peptidů (Aβ) (Yi, Xu et al. 2013; Pan, Stahl et al. 1992) Molekulární podstata infekčního prionového proteinu PrP Sc Vzácná konformace patologické izoformy (PrP Sc ) se vyskytuje pouze u savců, kteří trpí přenosným prionovým onemocněním neboli transmisivní spongiformní encefalopatií (TSE). PrP Sc forma buď sama představuje infekční agens, nebo tvoří její hlavní součást. Vzniká změnou prostorového uspořádání bílkovinného řetězce, ve kterém klesá podíl -helikální struktury a přibývá β-struktury. Prion již nemá původní tvar šroubovice, jeho molekula se stává menší a tím roste jeho odolnost vůči proteázám i vůči působení vysokých teplot. Prion na rozdíl od většiny bílkovin není denaturován při teplotě 100 C. Mechanismus, který zahajuje tvorbu PrP Sc je dosud neznámý. To stejné platí i o mechanismu konverze PrP C na PrP Sc (obrázek 2). PrP C PrP Sc Zmutovaný PrP Patologický PrP (II) Recyklovaný endozom (I) Rab4 Rab5 (III) (IV) (I) Raný endozom ER Lysozom Pozdní endozom Exozom 13

14 Obrázek 2: Model vnitrobuněčné migrace PrP C a PrP Sc a možné způsoby vzniku PrP Sc. PrP C je syntetizován v ER, ve kterém dochází ke tvorbě PrP Sc a dědičný zmutovaný PrP se v ER mění na patologický, přičemž prionové proteiny jsou částečně degradovány proteazomem po retrotranslokaci přes cytosol. PrP C byl také nalezen v neuronálním cytosolu a za určitých vhodných podmínek jsou v cytosolu také přítomny PrP Sc agregáty. Po kvalitativní kontrole v ER je PrP C transportován přes Golgiho aparát na povrch buněk, přičemž se spojuje s rafty. Blokováním transportu PrP C do plazmatické membrány a jeho přesměrováním do lysozomů vlivem degradace (I) a zároveň následným uvolněním vznikajícího PrP C z buněčného povrchu (II), by se zabránilo tvorbě PrP Sc. Redukce internalizace PrP C (III) také snižuje tvorbu PrP Sc. Obě PrP izoformy se nacházejí v Rab5-pozitivních raných endozomech, procházejí přes pozdní endozomy a jsou zcela PrP C a nebo částečně PrP Sc degradovány v kyselých lysozomech. Kromě toho, část PrP C zdroje se recykluje zpět do cytoplazmatické membrány v Rab4- závislé dráze a obě formy jak PrP C i PrP Sc se nacházejí spojeny s exosomálnímy membránami v extracelulárním médiu infikovaných buněk. A konečně bylo zjištěno, že ER má roli v přeměně prionu, tím že zesiluje tvorbu PrP Sc skrze Rab6a-závislý retrográdní transport PrP C (IV). Upraveno podle (Campana, Sarnataro et al. 2005). Toxicita PrP Sc je spojována s procesem uvolňování vápníku z endoplazmatického retikula (ER) a se zrychlenou regulací několika chaperonů ER. Rozsah prionové replikace úzce koreluje se zrychlenou regulací u ER chaperonových proteinů, které podléhají stresu (Walter, Stevens et al. 2007). Rozdílem PrP Sc oproti PrP C je jeho rezistence vůči proteináze K, fosfolipáze C a také k vysokým teplotám a vzhledem k PrP C formě obsahuje větší obsah konformace β- skládaného listu. PrP Sc má stálý metabolismus, je nerozpustný v detergentech a ve vodě, také má silnou schopnost agregovat a polymerizovat. Patologická forma prionového proteinu je u infikovaných jedinců zastoupena v počtu, který je úměrný stádiu infekce (Dormont 2002). Štěpná reakce PrP Sc probíhá nejspíš v endozomech či lysozomech a na rozdíl od proteolytického post-translačního štěpení PrP C, však PrP Sc narušuje amyloidogenní a neurotoxickou oblast polypeptidového řetězce (Chen, Teplow et al. 1995). V případě dědičných prionových chorob vznikají abnormální formy PrP Sc vlivem mutací v PRNP genu (Gaggelli, Kozlowski et al. 2006). K identifikaci rozdílných kmenů PrP Sc slouží jejich biochemické vlastnosti jako je například glykosylace, 14

15 elektroforetická pohyblivost, výše zmíněná rezistence vůči proteáze či sedimentace. Pouze asi 1% prionových onemocnění je způsobeno infekcí z vnějšího zdroje. Většina prionových onemocnění jsou sporadického charakteru a není zcela jasné, co iniciuje vznik molekuly PrP Sc (Morales, Abid et al. 2007) Konverze PrP C na PrP Sc Všechny dostupné důkazy naznačují, že konverze PrP C na PrP Sc je spíše konformační než kovalentní, což vede k teorii, že dvě odlišné izoformy mají stejné sekvence aminokyselin a pravděpodobně i stejné post-translační přírůstky. Konformační změna působí výrazný nárůst konformace β-skládaného listu, nicméně pokles konformace α- helixu není tak výrazný. Metodami cirkulárního dichroismu a infračervené spektroskopie bylo zjištěno, že PrP C obsahuje přibližně 42% konformace α-šroubovice a 3 % konformace β-skládaného listu ve srovnání s PrP Sc, který obsahuje 30% konformace α-šroubovice a 43% konformace β-skládaného listu (Harris 1999). Jak již bylo zmíněno výše, PrP Sc je syntetizován z normální buněčné formy PrP C pomocí post-translační modifikace, ke které pravděpodobně dochází v endozomech. Ze studií vědců Campana a Sarnatara vyplývá, že k prvnímu kontaktu pravděpodobně dochází na plazmatické membráně, nebo až po endocytóze v endolyzozomálních strukturách či endoplazmatickém retikulu. Některé studie (Godsave, Peters et al.; Sanghera and Pinheiro 2002) hovoří o tom, že přeměna buněčné formy PrP C může nastat jen tehdy, až tento nově vzniklý protein dosáhne buněčného povrchu (Campana, Sarnataro et al. 2005). Byly navrženy dva modely konverze PrP C na PrP Sc (obrázek 3), aby vznikla lepší představa o možném průběhu vzniku prionových proteinů. 15

16 Obrázek 3: Modely konformační přeměny PrP C na PrP Sc. (A) Matricový model - spontánní konverzi PrP C na PrP Sc je zabráněno vysokou energetickou bariérou. Matricový model požaduje vzájemné působení mezi exogenním (PrP Sc ) a endogenním (PrP C ), kterému je vtisknuta konformace PrP Sc. (B) Nukleárně-polymerizační model - naopak předpokládá mezi PrP C a PrP Sc reverzibilní termodynamickou rovnováhu. Ke vzniklému jádru se přidružují monomery PrP Sc a vytváří se tak amyloid. Fragmentací vzniklého agregátu se zvyšuje počet infekčních jader, která mohou přijímat další monomery PrP Sc. Upraveno podle (Aguzzi and Sigurdson 2004). Jedná se o model matricový a nukleárně polymerizační. U matricového modelu se předpokládá, že dojde ke vzájemnému působení endogenního PrP C a exogenního PrP Sc, přičemž se uskuteční přeměna normální formy PrP C na patogenní formu PrP Sc. V tomto modelu brání spontánní konverzi energetická bariéra (Campana, Sarnataro et al. 2005). Jako katalyzátor nebo jako matrice zde slouží PrP Sc, který otiskne svou strukturu do PrP C. Na této reakci se může podílet hypotetický chaperon (Huang, Prusiner et al. 1996). Naopak druhý model, nukleárně polymerizační předpokládá termoreverzibilní termodynamickou rovnováhu mezi PrP C a PrP Sc (Campana, Sarnataro et al. 2005). 16

17 Spontánní konverze těchto dvou molekul pravděpodobně probíhá přes rozloženou strukturu prionového proteinu (Collinge 2001). Po jejich shromáždění se vytvoří vysoce uspořádaný agregát (jádro), ke kterému se případně mohou přidávat další monomery PrP Sc. Pro rozmnožování prionů je tato fragmentace nezbytná (Piening, Weber et al. 2005; Campana, Sarnataro et al. 2005). 3.2 Prionová onemocnění Přenosné spongiformní encefalopatie (TSE) jsou skupinou fatálních neurodegenerativních onemocnění (obrázek 4), která způsobují Creutzfeldt-Jakobovu nemoc u lidí a bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) nebo scrapii postihující zvířata. Klinické příznaky Obrázek 4: Proces prionové replikace během patogeneze TSE. Na obrázku je znázorněn prionový replikační proces během patogeneze TSE. Inkubační doba je různě dlouhá a má různý průběh, avšak PrP Sc se stále replikují, aby v mozku dosáhly co největší koncentrace a to je ten moment, kdy se klinické příznaky začnou projevovat. Převzato a upraveno podle (Soto, Saborio et al. 2002). Tato onemocnění jsou nyní klasifikována dohromady, protože jejich etiologie a patogeneze zahrnují úpravu prionového proteinu. Pouze 1% prionových onemocnění je způsobeno infekcí z vnějšího zdroje (Prusiner 1996). Prionová onemocnění, ať už u zvířat nebo u lidí sdílejí stejné histopatologické rysy. Charakteristickými symptomy pro tato onemocnění je spongiformní vakuolizace, postihující velkou část šedé kůry 17

18 mozkové, případně ztráta neuronů a astrocytů, dále také proliferace doprovázená amyloidními plaky (Collinge 2001). Jedním z nejčastějších klinických projevů těchto onemocnění je nástup demence. Pro všechna prionová onemocnění jsou typické neuropatologické vlastnosti, které zahrnují ztráty neuronů, reaktivní gliózu, amyloidní plak PrP C (shluk β-amyloidů), dále také velké vakuoly, které v mozku způsobují typický houbovitý vzhled. Z historického hlediska byla prionová onemocnění zařazena do třech kategorií získané, dědičné nebo sporadické (Ortega-Cubero, Luquin et al. 2013). Ačkoliv všechna onemocnění jsou vzácná, v průběhu posledních 15 let vzrostl zájem zejména o Creutzfeldt-Jakobovu nemoc, která je způsobena požitím masa ze skotu infikovaného bovinní spongiformní encefalopatií (BSE). Nemoc je tedy přenosná i mezi druhy (Giese, Brown et al. 1998; Gupta and Hirsch 2013). Všechna prionová onemocnění jsou spojena několika prvky. Tato onemocnění napadají mozek a je pro ně charakteristická dlouhá inkubační doba, téměř bez příznaků. Může trvat roky, ale i několik desítek let. Onemocnění se vyznačují vysokou progresivitou a fatálním klinickým průběhem. V dnešní době bohužel zatím neexistuje žádné specifické klinické vyšetření nebo léčba. Přenosné spongiformní encefalopatie souvisí s buněčnou podstatou prionového proteinu (PrP C ), jenž je hojně zastoupen v CNS. Infekční formy jsou připisovány vstupu proteinové částice do mozku, která vede k akumulaci neobvykle složené formy proteinu (scrapie nebo PrP Sc ) v důsledku konformační přeměny endogenního PrP C (Chiarini, Freitas et al. 2002). Nicméně příčina smrti neuronů při prionovém onemocnění zůstává nejasná (Mallucci, Dickinson et al. 2003). Prionová onemocnění svým mechanismem podnítila intenzivní vědecký výzkum, a to zejména při zjištění, že infekční agens postrádá nukleové kyseliny. Navzdory tomuto zjištění hraje genetika klíčovou roli při pochopení patogeneze a klinických aspektů prionových onemocnění prostřednictvím účinku řady polymorfismů a mutací genu prionového proteinu (PRNP) (Mead 2006) Historie prionových onemocnění První zmínky o neznámém a smrtelném onemocnění postihující ovce a kozy datujeme na počátek 19. století. Název scrapie (klusavka) byl později odvozen ze symptomů nakažených zvířat. Onemocnění bylo v Evropě uznáno před více než 200 lety a její výskyt je rozšířený v mnoha zemích po celém světě a první infekční experimentální přenos byl uskutečněn již v roce 1899 (Chesebro 2003). 18

19 Počátkem roku 1936 bylo prostřednictvím inokulace dokázáno, že klusavka je přenosná a inkubační doba onemocnění je poměrně dlouhá (Collinge 2001). Nejdříve bylo onemocnění popsáno jako progresivní demence s vlivem na chůzi, s rozsáhlou vakuolizaci a astrocytickými buňkami v mozku. Od počátku objevení scrapie bylo popsáno již 7 prionových onemocnění postihující zvířata (Tabulka 1 ) Prionová onemocnění zvířat Onemocnění Hostitel Etiologie Rok objevení BSE Skot Infekce priony neznámého 1986 původu Scrapie Ovce, kozy Infekce priony neznámého Polovina původu 18.století TME Norci Infekce priony původem z ovcí 1947 či skotu CWD Jelenovití Infekce priony neznámého 1967 původu FSE Kočkovité Infekce priony původem BSE 1990 šelmy EUE Exotičtí Infekce priony původem BSE 1986 kopytníci TSE u NHP Lemur, Infekce priony původem BSE 1995 makakové Tabulka 1: Prionová onemocnění zvířat. Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), Transmisivní encefalopatie norků (TME), chronické chřadnutí jelenovitých (CWD), spongiformní encefalopatie koček (FSE), exotická spongiformní encefalopatie kopytníků (EUE), nákaza nehumánních primátů (NHP). Upraveno a převzato dle (Imran and Mahmood 2011). U lidí byl první případ prionového onemocnění popsán Creutzfeldt a Jakobem ve 20. letech minulého století. (Chesebro 2003). Oficiální název Creutzfeldt-Jakobova nemoc (CJD) byl představen o dva roky později. V polovině 50. let 19. století, při studiu primitivních kultur, Carlton Gajdušek rozpoznal a popsal onemocnění trvale se vyskytující u domorodců kmene Fore žijících na Nové Guinei, které bylo nazváno "kuru". Kuru v překladu znamená "neobvyklá chůze", protože se onemocnění 19

20 projevovalo jako progresivní ataxie chůze v kombinaci s abnormálním chováním. Bylo zjištěno, že zdrojem onemocnění kuru je mozek postižených osob, který se konzumuje během kanibalistického rituálu. O pár let později, v roce 1959 Hadlow zjistil, že se rysy kuru velmi podobají nemoci u ovcí (scrapii)(collinge 2001; Mastrianni 2004; Collinge 2005) Prionová onemocnění u lidí Prionová onemocnění vyskytující se u lidí mohou být trojího typu a to sice sporadické, dědičné nebo získané infekcí. Výrazné klinické a patologické charakteristiky rozdělují sporadické onemocnění do třech fenotypů: Creutzfeld- Jakobova nemoc (CJD), fatální familiární insomnie (FFI) a variabilní na proteázu senzitivní prionopatie (VPSPr) (Puoti, Bizzi et al. 2012) Familiární prionová onemocnění jsou u lidí spojována s asi 30 bodovými mutacemi PRNP genu, který kóduje prionový protein (Zhou and Xiao 2013). Genetická prionová onemocnění jsou způsobena mutací v PRNP genu a zahrnují asi kolem 15 % všech případů onemocnění způsobených priony. Předpokládá se, že sporadická forma Creutzfeld-Jakobovy choroby (scjd) se objevuje zcela spontánně a tvoří přibližně 85 % všech případů prionových onemocnění. (Anders 1993) Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) se vyznačuje charakteristickou triádou příznaků, které zahrnují postupnou demenci, ataxii a myoklonus. Dezorientace a poškození paměti jsou nejčastěji se vyskytující příznaky u přibližně 70 % případů, zatímco zbývající procenta mohou představovat ataxii nebo kortikální slepotu (Mastrianni 2004). CJD je tedy rychlé progresivní neurodegenerativní onemocnění centrálního nervového systému. V jedné třetině případů se toto onemocnění může zpočátku projevovat nespecifickými psychiatrickými symptomy, jako je únava, úzkost nebo změna osobnosti. V současné době rozeznáváme čtyři formy CJD. První formou CJD je sporadická forma (scjd) a zároveň se také jedná o nejčastější typ onemocnění. Z genetického hlediska je pro rozvoj scjd rizikovým faktorem homozygotnost v polymorfismu M129V. Dalším typem je familiární nebo také genetická forma CJD (f/gcjd). Charakteristickým rysem onemocnění je výskyt dominantně dědičné bodové mutace v genu PRNP. Iatrogenní CJD (icjd) je onemocnění, které vzniklo přenosem 20

21 po transplantaci rohovky od kadaverního dárce, který byl nakažen CJD. V roce 1996 byly ve Velké Británii diagnostikovány první případy variantní formy CJD (vcjd)(coppede, Mancuso et al. 2006) GSS (Gerstmann-Sträussler-Scheikerova choroba) Gerstmann-Sträussler-Scheinkerova (GSS) choroba je velmi vzácné neurodegenerativní onemocnění, které se vyskytuje ve formě sporadické i familiární. Neuropatologickým znakem GSS onemocnění je přítomnost unicentrických a multicentrických amyloidních plaků v mozku a mozečku (Tagliavini, Prelli et al. 1991) FFI (Fatální familiální insomnie) V roce 1986 byly zaznamenány dva případy progresivního onemocnění charakterizované klinicky neléčitelnou nespavostí, dysautonomií a postižením anteriorventrální a mediodorzálních thalamických jader (Medori, Tritschler et al. 1992). Histologicky se jedná o atrofie neuronů v thalamu, geneticky však jde o bodovou mutaci prionového genu. Sekvenováním PRNP byla potvrzena mutace v kodonu 178, což je způsobeno nahrazením asparaginu za kyselinu asparagovou (D178N). Tento druh mutace byl také popsán u některých forem CJD (Collins, Lawson et al. 2004) Kuru Příkladem nejznámějších získaných prionových onemocnění postihující člověka je kuru. Centrálním klinickým jevem kuru je progresivní cerebrální ataxie a ve srovnání s CJD se demence může dostavit později nebo vůbec (Wadsworth and Collinge 2007). Lidé trpící tímto onemocněním jsou odsouzeni k smrti. Nejkratší inkubační doba se odhaduje přibližně na 5 let, i když tato doba může být i kratší, protože doba infekce není přesně známa. Od doby, kdy bylo upuštěno od rituálních zvyků, se kuru prakticky nevyskytuje. V klinickém obraze se vyskytovaly mozečkové příznaky, jako je ataxie a výrazný třes, obrny a další poruchy korových funkcí. Konečné stádium onemocnění končilo kachexií a demencí (Collinge, Whitfield et al. 2006). 21

22 3.2.3 Prionová onemocnění u zvířat Scrapie (klusavka, drbavka) Scrapie se objevila v Evropě před více než 250 lety, ze které se prostřednictvím nakažených stád ovcí šířila do dalších částí světa. U ovcí a koz, které trpí touto nemocí, se často objevuje závažné svědění. Infikované ovce se tedy doslova drbou o ploty či stromy. Z tohoto důvodu je scrapie v některé literatuře označována jako "drbavka" (Bechtel and Geschwind 2013) Bovinní spongiformní encefalopatie (nemoc šílených krav, BSE) Tato choroba, často označována jako "nemoc šílených krav", se poprvé objevila ve Velké Británii (Prusiner 1996). Epidemie se primárně projevila v reakci na změnu přípravy masokostní moučky. Masokostní moučka byla vyráběna ze zvířecích vnitřností, zejména pak z vnitřností skotu, prasat, ovcí a kuřat. Dále sloužila jako doplněk stravy s vysokým obsahem proteinů a změna v postupu výroby vedla ke vzniku masokostní moučky s vyšším obsahem tuku, aby se docílilo lepší nutriční hodnoty (Prusiner 1997). Spongiformní degenerace tkání se u BSE vyskytuje v infikovaném mozku bez zánětlivé odezvy. Z tohoto důvodu nejsou v krevním séru ani mozkomíšním moku přítomny specifické protilátky. Inkubační doba je různá a může trvat i několik let. Bovinní spongiformní encefalopatie je chorobou, která spadá pod povinnost ohlášení v případě výskytu nákazy, a u které je pečlivě kontrolována likvidace mozků nakažených zvířat (Holt and Phillips 1988). Ochranná opatření přijatá v České republice vzhledem k BSE V roce 1991 byla založena Národní referenční laboratoř pro diagnostiku TSE a zároveň se začalo s monitorováním BSE. Vyšetření podléhala jen zvířata, která vykazovala symptomy charakterizující nervové onemocnění. Koncem roku 2000 se přistoupilo k histologickému vyšetření zdravých kusů dobytka. V České republice se k detekci BSE používá metoda western-blot. Vyšetření provádí Státní veterinární ústav (SVÚ) Jihlava, SVÚ Praha, později se k nim přidal i SVÚ Olomouc. Na BSE se vyšetřuje skot starší 30 měsíců při normální porážce, avšak při nucené porážce se věk skotu snižuje na hranici starší 24 měsíců. Dále musí vyšetření podstoupit 22

23 všechna zvířata poražená mimo jatka, uhynulá a utracená zvířata, zvířata podezřelá z nákazy BSE a také zvířata, která se musela nechat utratit z důvodu nákazy BSE v chovu. Z preventivních důvodů stále platí zákaz zkrmování masokostní moučkou (MKM) přežvýkavců. Na jatkách nebo v bourárnách také dochází k odstranění specifického rizikového materiálu (SRM), který zahrnuje lebku, mandle, míchu přežvýkavců starších 12 měsíců, dále ileum (kyčelník) skotu staršího 12 měsíců, slezina ovcí a koz. Následná likvidace se provádí v asanačních podnicích. Obecně platí nařízení o kontrole, které vstoupilo v platnost dne 1. ledna 2000 na základě vyhlášky č. 286/1999 Sb. (později zrušena a nahrazena předpisem č. 164/2005 Sb.), kterou se provádějí ustanovení zákona č.166/1999 Sb., o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon předpis č. 166/1999 Sb.). Pro Českou republiku platí tyto předpisy, které jsou v souladu s nařízením Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 999/2001 ze dne 22. května 2001 o stanovení pravidel pro prevenci, tlumení a eradikaci některých TSE. Toto nařízení je nadřazené dvěma předchozím a na základě těchto ustanovení se provádí odstraňování SRM z potravinového řetězce. 3.3 Metalothionein (MT) Zástupci skupiny metalothioneinů (MT) jsou relativně malé proteiny s vysokým obsahem cysteinu a optimální kapacitou pro koordinaci s kovovými ionty (Atrian and Capdevila 2013). MT hrají důležitou roli v metabolismu kovů, také chrání buňku před toxickými účinky záření, alkylačními činidly a před volnými kyslíkovými radikály (Raudenska, Gumulec et al. 2014). MT v roce 1957 objevili Margoshes a Vallee z koňských ledvin a od té doby jsou účinky MT aktivně zkoumány (Margoshes and Vallee 1957). U savců představuje skupina MT neenzymatické polypeptidy, které jsou tvořeny 61 až 68 aminokyselinami. Tyto aminokyseliny jsou také zodpovědné za relativně nízkou molekulovou hmotnost, která se pohybuje kolem 6 7 kda (Shamsi and Fatima 2014). Byly identifikovány čtyři savčí izoformy MT (MT-1 až MT-4) a rozdíly v těchto izoformách spočívají v post-translační modifikaci, v malých změnách v primární struktuře, typem navázaného iontu kovu a rychlosti degradace. Navzdory fyzikálněchemickým podobnostem jednotlivých forem se jejich role a výskyt v tkáních podstatně liší. MT-1 a MT-2 formy jsou přítomny téměř ve všech typech měkkých tkání. Naproti tomu je MT-3 exprimován především v mozkové tkáni, dále také v srdci, ledvinách a reprodukčních orgánech a MT-4 byl detekován v rozvrstvených dlaždicových a 23

24 epiteliálních buňkách ve spojení s epitelem jícnu, žaludku a chodidel (Ruttkay-Nedecky, Nejdl et al. 2013) MT-3 a jeho role při vzniku neurodegenerativních onemocnění MT-3 je protein, který se nachází v mozku a původně byl pojmenován jako inhibiční faktor růstu (GIF). Izoforma MT-3 je přítomna hlavně v neuronech a jeho exprese je vyvolána působením kovů, včetně Hg, Cd, Cu a Zn, cytokinů a reaktivních forem kyslíku (ROS). MT-3 izoformu můžeme mimo mozek najít i v CNS, malé množství MT-3 se také vyskytuje i ve slinivce břišní a ve střevech. MT-3 také hraje důležitou roli v rozvoji, organizaci a programované smrti mozkových buněk (Hozumi, Asanuma et al. 2004). MT-3 byl objeven při výzkumu zaměřeného na pochopení patogeneze Alzheimerovy nemoci (AD) (Chatterjee 2011). Funkce MT-3 v mozku je velmi specifická a pokud dojde k jeho dramatickému poklesu, pak vznikají neurodegenerativní onemocnění (Aschner, Cherian et al. 1997) Bakteriální metalothionein Bakteriální metalothioneiny jsou známy již od poloviny 80. let minulého století. Do nedávna byla známá pouze rodina proteinů BmtA charakteristická proteinem SmtA vázající zinek a kadmium od sinice Synechococcus. Bakeriální metalothioneiny rodiny BmtA proteinů se vyskytují i v některých bakteriích kmene Pseudomonas a Staphylococcus. Teprve až v roce 2008 byl identifikován druhý typ bakteriálního MT v mykobakteriích a to měď vázající protein, který byl pojmenován MymT. V bakteriích Escherichia coli byl také nalezen zinek vázající protein YeiR (Davis 2011). 3.4 Interakce prionových proteinů s kovy a jejich vliv na neurodegenerativní onemocnění Bylo prokázáno, že měď a zinek jsou specifickými kovy, které vedou ke zvýšené expresi prionového proteinu. Schopnost mědi upravovat hladinu exprese PrP C naznačuje funkční roli mědi ve fyziologické funkci PrP C (Choi, Kanthasamy et al. 2006). Byla zjištěna spojitost mezi TSE a příbuznými neurodegenerativními poruchami vykazující fyziologické symptomy podobné stárnutí. V průběhu posledních třech desetiletí přitahovala úloha kovových iontů při TSE značnou pozornost, zejména v 70. letech minulého století, kdy bylo zjištěno, že ionty Cu 2+ s pomocí chelatačního činidla vyvolaly histopatologické změny, které byly 24

25 podobné klusavce. Ionty kovů ve vyšších koncentracích vykazují značnou patogenitu a prostřednictvím Fentonové reakce vyvolávají zvýšenou produkci volných hydroxylových radikálů, což vede k oxidačnímu stresu a následné destrukci nervové buňky. Rovněž je známo, že reaktivní formy kyslíku způsobují fragmentaci DNA, což může vést až k programovatelné smrti buňky (apoptóze). Dosud byly zmíněny tři funkce PrP C, jenž by mohly souviset s homeostázou kovů: ochrana před oxidačním stresem, transport Cu 2+ do buňky a ukládání Cu 2+ do buňky. Ačkoliv se o existenci a povaze těchto funkcí stále diskutuje, existuje spousta důkazů o tom, že všechny nebo některé z těchto tří funkcí mohou představovat skutečnou funkci prionového proteinu in-vivo. Mezi další funkce, které by PrP C mohly vykazovat, patří jeho funkce v paměti a role při zánětlivých reakcích, buněčné proliferace a diferenciace v nervovém a imunitním systému, signální transdukce a jiné (Rana, Gnaneswari et al. 2009) Interakce prionových proteinů s esenciálními kovy (Zn, Cu) Měď (Cu) Měď je esenciální stopový kov, který hraje zásadní roli v biochemii nervového systému člověka. Tento kov má funkci prostetické skupiny, která umožňuje snadný přenos elektronů v klíčových enzymatických procesech (Harris 1999). Měď se vyznačuje svou redoxní aktivitou a vyskytuje se ve dvou oxidačních stavech +II a +I. Měď interaguje s různými ligandy, jako je imidazol, amidy a aminoskupiny, karboxylový kyslík, cystein a thiolovou skupinou methioninu. Ačkoliv je redoxní aktivita mědi zásadní pro biologickou aktivitu poměrně velkého množství enzymů, může se stát velmi nebezpečnou, pokud není přesně regulována. Díky tomu nám specifické proteiny zaručují, že se žádné ionty mědi nemohou volně pohybovat. Distribuce mědi v CNS se liší v závislosti na živočišném druhu. Každá oblast mozku je charakterizována specifickým rozvodem mědi, který se zvyšuje s věkem (Kozlowski, Luczkowski et al. 2012). Z četných studií (Viles 2012; Brown, Qin et al. 1997; Brown 2001) vyplývá, že ionty kovů a jejich chelátory mohou mít vliv i na biochemické vlastnosti PrP Sc, a zároveň mají vliv i na jeho migraci při denaturační elektroforéze. Zásadním rozdílem mezi PrP C a PrP Sc je preference vazeb s kovy (obrázek 5). PrP Sc preferuje vazbu se zinkem či manganem, kdežto PrP C má nejvyšší afinitu k mědi (Wong, Chen et al. 2001). 25

26 Obrázek 5: Vztahy mezi PrP C, PrP Sc a ionty kovů. Buněčná forma PrP C (v obrázku označená jako PrP C - Cu) je protein, na kterém je navázána měď. PrP C je senzitivní k proteázám a je rozpustný v nedenaturačních činidlech. (A) Jakmile dojde ke kontaktu s kovy (měď, zinek, mangan) vznikne abnormální molekula PrP C - Cu/Mn/Zn. Tato molekula má stejné vlastnosti jako PrP Sc, tedy nerozpustnost či částečná rezistence k proteázám, ale zdá se, že postrádá infekční charakter. (B) Klasická molekula PrP Sc může vzniknout přirozenou cestou z PrP C - Cu a tak se z něj stane PrP Sc - Cu. (C) Změnou konformace se pravděpodobně změní i afinita ke kovovým iontům, a tím dochází ke tvorbě molekul s různým obsahem kovů PrP Sc -Cu/Mn/Zn. (D) Alternativní cesta vzniku molekuly PrP Sc -Cu/Mn/Zn přes abnormální molekulu PrP C -Cu/Mn/Zn tvoří střední článek přeměny. Upraveno podle (Lehmann 2002). Bylo také zjištěno, že činidla chelatující měď oddalují nástup nemoci. Homeostatická bilance mědi v CNS je zásadní pro její normální funkci, což znamená, že měď spolu s PrP C hrají klíčovou úlohu v patogenezi prionových chorob. V dnešní době je již dobře známo, že PrP C váže měď a prionové proteiny mohou být tedy izolovány pomocí afinitní měděné kolony. Četné studie naznačují (Attwood 2002; Choi, Kanthasamy et al. 2006); (Rana, Gnaneswari et al. 2009), že by úloha PrP mohla souviset s transportem mědi do CNS. Jiné studie zase prokázaly, že nadměrná exprese PrP C má za následek větší obsah mědi v membránové frakci. PrP C mohou být 26

27 soustředěny při synapsi neuronů, což naznačuje, že prionový protein může regulovat hladinu mědi v synaptickém spojení tím, že působí jako kovová výlevka. Nicméně narušení regulační funkce PrP C mědí v neuronových synapsích by mohlo mít za následek větší náchylnost neuronů k oxidačnímu poškození v důsledku nadměrného množství volné mědi. Zmíněná zjištění naznačují, že interakce mezi PrP C a mědí může být složitější, než se původně zdálo (Choi, Kanthasamy et al. 2006). Iont Cu 2+ je schopný přirozené interakce dvojmocného kovového iontu s PrP C. Nicméně vliv Cu 2+ na patogenní formu PrP je poněkud složitější (Zhou and Xiao 2013). PrP C váže měď a má antioxidační aktivitu. Změny v obsazení kovového iontu mohou vést k výraznému poklesu antioxidační aktivity a ke změnám v konformaci proteinu (Wong, Chen et al. 2001). Vědcům ze skupiny kolem Burnse se podařilo prokázat, že měď stimuluje endocytózu PrP C a hraje tak úlohu ve fyziologické regulaci exprese PrP C (Burns, Aronoff-Spencer et al. 2002). Zinek (Zn) Zinek je esenciální kov nezbytný pro všechny formy života. Tento kov patří mezi stopové kovy, které jsou přítomny v tělech vyšších savců. I když je Zn důležitý kov, o zinkové homeostáze toho zatím víme jen velmi málo, avšak interakci Zn 2+ s prionovým proteinem je přikládán stále větší význam. Snížení hladiny Zn by mohlo nepříznivě ovlivnit na zinku závislou uhličitou anhydridázu, která hraje důležitou roli ve správné funkci paměti a ph homeostázy v hipokampu. Kromě toho může zinek indukovat apoptózu snížením mitochondriálního membránového potenciálu a tím dochází k uvolňování proapoptotických peptidů. Díky tomu mají buňky schopnost regulovat homeostázu zinku. Z pozorování PrP C vyplývá, že tento protein může přirozeně vázat zinek a také podléhá endocytóze v reakci na extracelulární Zn. Vědci (Watt and Hooper 2003; Rana, Gnaneswari et al. 2009; Jobling, Huang et al. 2001) tak vytvořili hypotézu, že PrP C je zapojen do homeostázy Zn na několika různých úrovních. Na nejjednodušší úrovni by mohl PrP C vyvazovat přebytečný Zn a uvolňovat ho tak během synaptických přenosů. V tomto modelu PrP C funguje jako "jímka na čištění" přebytečných kovových iontů, aby se tak zabránilo toxickým účinkům před jeho odesláním na specifický plasmaticko-membránový transportér. Na další úrovni se může PrP C přímo podílet na absorpci Zn do nervových buněk. Za třetí by PrP C mohl působit 27

28 jako snímač zinku monitorováním hladiny iontu kovu v extracelulárním prostoru (Watt and Hooper 2003) Interakce prionových proteinů s toxickými kovy (Cd) Kadmium (Cd) Kadmium (Cd) je kov kontaminující životní prostředí, a to buď přirozeně, nebo vlivem průmyslové výroby. Toxicita kadmia je historicky velmi úzce spjata s homeostázou zinku a oxidativním stresem v buňkách savců. Z tohoto důvodu je možné, že existuje jeho spojení i s prionovými proteiny, které mají taktéž svou roli při regulaci oxidativního stresu. Rozšířený výskyt kadmia v životním prostředí představuje nadále hrozbu pro lidské zdraví, a to i přes snahu omezit jeho technické využití. Biologicky významná iontová forma kadmia (Cd 2+ ) váže mnoho biogenních molekul a tyto interakce jsou základem mechanismu, který způsobuje toxicitu kadmia. Je také velmi pravděpodobné, že toxicita kadmia je nejčastěji zprostředkována biologickými systémy zesilovanými signály, jež se spouští přítomností Cd 2+ kationtů (Moulis 2010). Kademnaté ionty se na rozdíl od zinku nebo mědi vyznačují slabou vazebnou afinitou na prionový protein. Avšak účinky kadmia navázaného na PrP C a jeho vlivu na fyziologické funkce prionu či na patogenezi prionových onemocnění, jsou stále předmětem studia (Rana, Gnaneswari et al. 2009). 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál Použité mikroorganismy K přípravě transformovaných buněk Escherichia coli (E. coli) genem prionového proteinu (hprp C ) a metalothioneinu-3 (MT-3) byl použit klonovací kit prset B (Invitrogen, Německo). Všechna stanovení probíhala na třech bakteriálních kulturách transformovaných E. coli (hprp C, MT-3) a kontrolní E. coli BL21(DE3) bez transformovaných genů. Přípravu transformovaných E. coli (hprp C a MT-3) pro naše účely zajistil Mgr. Vladimír Pekařík, Ph.D. (Středoevropský technologický institut, Kamenice 753/5, , Brno, Česká republika). Jako kontrolní bakterie byly použity kompetentní buňky E. 28

29 coli BL21(DE3), které připravila Msc. Ana Maria Jimenez Jimenez (Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií, Zemědělská 1, Brno, ). Veškeré chemikálie použité v experimentu byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich (USA), v případě, že není uvedeno jinak. Chemikálie odpovídají čistotě ACS Chemikálie pro kultivaci E. coli V experimentu bylo použito kultivační LB (Luria Bertrani) médium. Složení média: trypton 10 g.l 1, NaCl 5 g.l 1, kvasniční extrakt 5 g.l 1. Médium má práškový charakter, proto bylo nutné jej rozpustit ve sterilizované MilliQ vodě o objemu 1 litr. Sterilace média proběhla v autoklávu (Tuttnauer 2450EL, Izrael) při teplotě 121 C, po dobu 1 hodiny Chemikálie pro ověření exprese MT-3 a hprp Jako primární protilátka proti prionovému proteinu byla použita anti-prp monoklonální protilátka (Monoclonal Anti-Prion Protein Clone 8H4) a sekundární antimyší protilátka (Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins /HRP) byla zakoupena od firmy Dako Agilent Technologies, ČR. Jako primární protilátka proti MT-3 byla použita protilátka anti-mt-3 (polyclonal rabbit anti-mt-3 antibody, USA) a dále byla použita sekundární protilátka (anti-rabbit 42 IgG, USA). Pro western-blot byl připraven blotovací pufr: 0,025 M Tris, 0,150 M glycin, 10 % metanol; roztok na barvení gelu Coomassie Brilliant Blue R-250 dle (Wong, Barbeau et al. 1985) a roztok na odbarvení gelu: 1 M acetátový pufr ph 5,5 (octan sodný trihydrát) Chemikálie použité na elektrochemická měření Pro elektrochemická měření byly použity standardy potřebných kovů. Jako standard mědi byl použit Cu(NO 3 ) 2.3H 2 O (M r = 241,60 g/mol), jako standard zinku byl použit Zn(NO 3 ) 2.6H 2 O (M r = 297,49 g/mol) a jako standard kadmia byl použit Cd(NO 3 ) 2 4H 2 O (M r = 308,48 g/mol). K promývání byl použit 0,2 M fosfátový pufr o ph 7, který byl připraven smícháním dvou roztoků H 1 (Na 2 HPO 4 ) a H 2 (NaH 2 PO 4 ), přičemž pomocí H 2 bylo upravováno ph za použití ph metru InoLab WTW (Weilheim, Německo). Standard metalothioneinu (Zinc Metallothionein; Zn-MT65) byl zakoupen od firmy Ikzus Proteomics (Itálie). 29

30 Pro stanovení celkové bílkoviny byly využity dvě reagencie složené z 50 mm kyseliny jantarové; 3,47 mm benzoanu sodného; 0,06 mm molybdenanu sodného; 1,05 mm šťavelanu sodného a 0,07 mm pyrogalové červeně. Všechny chemikálie byly rozpouštěny v MiliQ vodě, která byla přečištěna v přístroji MiliQ Direct QUV. 4.2 Metody Kultivace transformovaných E. coli Připravené médium bylo inokulováno bakteriálními kulturami kontrolní E. coli BL21 (DE3), E. coli transformované hprp C a MT-3 v 50 ml Erlenmeyerových baňkách. K E. coli transformované hprp C a MT-3 geny byla přidána antibiotika ampicilin (50 g/ml) a chloramfenikol (35 g/ml) od firmy Bio-Rad (Česká republika). Poté byly bakteriální kultury kultivovány na třepačce ES-20 (Biosan, USA) při teplotě 37 C, po dobu 24 hodin, při 600 rpm (rotate per minute = otáček za minutu). Po uplynutí dané doby byly bakteriální kultury naředěny LB médiem na OD 600 = 0.1 a změřeny na spektrofotometru Specord 210 (Analytic Jena, Německo). Poté byly bakteriální kultury kultivovány až po dosažení hodnoty absorbance zákalu OD 600 = , kdy bylo k bakteriím přidáno činidlo isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) podporující expresi genů syntetizující proteiny hprp C a MT-3 a vše bylo třepáno po dobu 30 min při teplotě 37 C a 600 rpm. 3 Erlenmeyerovy baňky obsahovaly činidlo IPTG a 3 kontrolní baňky toto činidlo neobsahovaly Ověření exprese genů hprp a MT-3 pomocí western blotu a dot blotu Příprava vzorků pro western blot a dot blot Byl odebrán 1 ml bakteriální kultury do 1,5 ml Eppendorfovy zkumavky (Německo) a následně stočeno na centrifuze 5417R (Eppendorf, Německo) při rpm po dobu 10 minut. Poté byl vzorek promyt PBS (Phosphate buffered saline = fyziologický roztok s fosfátovým pufrem) a následovala opět centrifugace při rpm po dobu 5 minut. Tento krok byl zopakován celkem třikrát. Po stočení byl supernatant odpipetován, následně bylo k peletu přidáno PBS a Eppendorfovy zkumavky byly i s obsahem převedeny do tekutého dusíku, kde byly ponechány po dobu 2 minut. Po uplynutí této doby byly vzorky vytaženy, rozmraženy a na závěr byly buňky rozbíjeny ultrazvukovou jehlou (Bandelin-sonopuls, Německo). Tyto vzorky byly opět centrifugovány po dobu 30 min při rpm. Finálně byly vzorky umístěny do termobloku (Thermomixer 30

31 Comfort D1/235; Eppendorf Německo), kde probíhala denaturace proteinů při 99 C, po dobu 20 minut při 350 rpm Příprava gelů pro SDS-PAGE Pro přípravu dělícího a zaostřovacího gelu byly použity následující roztoky: 30% směs akrylamidu a bisakrylamidu (29:1, Sigma); 1,88 M Tris-HCl pufr (ph 8,8); 0,625 M Tris-HCl pufr, (ph 6,8); 0,5% roztok SDS; 10% roztok persulfátu amonného (APS). Dále chemikálie TEMED (N,N,N,N - tetramethylendiamin) a standardy molekulových hmotností (Bio-Rad broad range a Prestained Bio-Rad low) Polyakrylamidová gelová elektroforéza SDS-PAGE Analýzy vzorků transformovaných E. coli byly ověřeny polyakrylamidovou gelovou elektroforézou v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Nejprve byly vzorky smíchány 2:1 s redukujícím vzorkovým nanášecím pufrem (PLB-R; max na 10 ml): 20% glycerol (2 ml); 0,1% bromfenolová modř; MiliQ H 2 O (7 ml); 50 mm Tris/HCl; 2% SDS a 3,3 % β-merkaptoetanol. Vzorky byly 3 minuty zahřívány na termobloku při 95 C a nanášeny na gely (12,5% separační gel a 5% zaostřovací gel), které byly připraveny dle přesného postupu popsaného v tabulce 2. Složky pro dva gely 12,5 % separační gel 5% zaostřovací gel Akrylamid/bisakryalmid 4,2 0,3 (ml) 1,88 M Tris/HCl, ph (ml) 0,625 M Tris/HCl, ph 6.8-0,4 (ml) 0,5 % SDS (ml) 2 0,4 TEMED (μl) 8, % APS (μl) Tabulka 2: Rozpis chemikálií na přípravu dvou sad gelů. 31

32 Samotná separace poté probíhala pomocí SDS-PAGE elektroforézy při 170 V po dobu 70 minut na přístroji PowerPack P25T (Biometra, Německo). Jednotlivé proteiny byly vizualizovány v gelu pomocí Coomassie briliant blue připravené dle protokolu (Wong, Barbeau et al. 1985) Western blot Metoda western-blot se používá pro kvalitativní nebo semikvalitativní detekci určitého proteinu ve směsi s dalšími proteiny. Tato technika je založena na oddělení proteinů na základě molekulové hmotnosti podle určitého druhu proteinů pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu SDS-PAGE. Po elektroforéze následuje blotování, přičemž dochází k přenosu (přeblotování) proteinů na PVDF-membránu. Poslední fází blotování je reakce proteinů s protilátkami. Nejdříve se přidá primární protilátka. Po inkubaci a promytí se poté přidá sekundární protilátka. Na závěr se provede vyvolání blotu a případná úprava výsledků (Welinder and Ekblad 2011; Mahmood and Yang 2012). Dvě výše zmíněné metody se používají především k identifikaci a imunodetekci proteinů, které mohou být markery celé řady onemocnění. Pro imunodetekci proteinů je nutné přenést proteiny z gelu na pevnou fázi, tedy na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu zakoupenou od firmy Bio-Rad (Česká republika) pomocí Western blottingu. PVDF membrána byla ekvilibrovaná v blotovacím pufru. SDS-PAGE gel byl vložen mezi chromatografický papír (Whatman, Anglie) a jednotlivé proteiny byly přenášeny z gelu na membránu při 43,2 ma po dobu 60 minut. Pro zablokování membrány byl použit 2 % roztok sušeného mléka v 1 mm PBS (8 g NaCl; 1,44 g Na 2 HPO 4 ; 0,2 g KCl; 0,24 g KH 2 PO 4 ), délka blokování byla stanovena na 30 minut. Dále byla nanesena primární protilátka proti hprp C anti-prp při koncentraci 1:1847 a proti MT-3 byla použita anti-mt-3 při koncentraci 1:1000. Následovala inkubace se sekundárními protilátkami. Proti MT-3 byla použita protilátka Anti-rabbit a proti hprp C byla použita Anti-mouse v koncentraci 1:1000 a tyto protilátky byly s membránou inkubovány přes noc. Dalším krokem bylo promytí PBS s přídavkem 0,05% TWEENU 20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurát). Po tomto kroku byla přidána sekundární protilátka značená křenovou peroxidázou (HRP = horseradish peroxidase) a opět byla inkubována s membránou po dobu 1 hodiny. Následovalo odbarvení pomocí 1 M acetátového pufru, peroxidem vodíku (H 2 O 2 ) a AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole), což bylo rozpuštěno v 1 ml N,N-dimethylformamidu a v tomhle substrátu byly membrány odbarvovány 5 30 minut. Před 32

33 usušením byly membrány promyty ACS vodou, následně usušeny a připraveny ke zpracování výsledků. Postup metody je popsán v obrázku 6. Obrázek 6: Schéma metody western-blot. Metoda je tvořena třemi základními kroky. Nejdříve dochází prostřednictvím elektroforézy k separaci proteinů (SDS-PAGE), dále následuje přenos separovaných proteinů a na závěr došlo k samotné detekci proteinů. Převzato a upraveno dle (Feig and Peter 2008) Dot blot Další použitou metodou k ověření exprese proteinů byl dot blot. U metody dot-blot není nutná gelová elektroforéza, což zkracuje čas detekce. Vzorek se přímo aplikuje na nylonovou membránu a poté dochází k inkubaci s protilátkami. K detekci se využívá specifické vazby antigen-protilátka. Na PVDF membrány byly přímo napipetovány připravené vzorky o objemu 2 μl a nechaly se zaschnout. Po zaschnutí byly membrány přeneseny do blokovacího roztoku 2 % sušeného mléka v PBS. Poté byla každá membrána inkubována s primární protilátkou proti hprp C anti-prp při koncentraci 1:1847 a proti MT-3 byla použita anti-mt-3 při koncentraci 1:1000. Následovala inkubace se sekundárními protilátkami. Proti MT-3 byla použita protilátka Anti-rabbit a proti hprp byla použita Anti-mouse v koncentraci 1:1000. Další postup je stejný jako u western-blotu. 33

34 4.2.3 Měření růstových křivek po přidání vybraných iontů těžkých kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) k bakteriálním kulturám Metoda měření růstových křivek je založena na spektrofotometrickém měření buněčné kultury po půlhodinových intervalech při teplotě 37 C a vlnové délce 600 nm, kde nárůst absorbance je úměrný růstu bakteriálních buněk. Důležitým ukazatelem je hodnota IC 50, což je koncentrace přidané látky potřebná k inhibici růstu 50 % bakterií (Adam, Chudobova et al. 2014). Kultura E. coli byla naředěna LB médiem na hodnotu OD 600 = 0.1 na spektrofotometru Specord 210 (Analytik Jena, Německo). Do mikrotitrační destičky byla kultura napipetována v různých kombinacích s vybranými kovy i samostatně jako kontrolní měření. Koncentrace přidávaných iontů těžkých kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) byly 0; 10; 150; a 300 μm. Celkový objem v jamkách mikrotitrační destičky pak činil 300 μl. Měření proběhlo v čase 0 a pokračovalo vždy po půlhodinových intervalech po dobu 24 hodin, při teplotě 37 C a vlnové délce 600 nm na přístroji Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific, Německo) Elektrochemická stanovení vzorků Příprava vzorků pro elektrochemická stanovení Pro přípravu vzorků byl odpipetován automatickou pipetou Research plus (Eppendorf, Německo) 1 ml bakteriální kultury do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky (Německo) a následně byly vzorky stočeny na centrifuze 5417R (Eppendorf, Německo) při rpm po dobu 10 minut. Poté byl vzorek promyt fosfátovým pufrem o ph 7 a opět následovala centrifugace při rpm po dobu 5 min. Tento krok byl zopakován celkem třikrát. Po stočení byl supernatant odpipetován a k peletu byl následně přidán fosfátový pufr, vše bylo převedeno do tekutého dusíku, kde byly vzorky ponechány po dobu 2 minut. Po uplynutí této doby byly vzorky odebrány, rozmraženy a poté byly buňky rozbíjeny ultrazvukovou jehlou (Bandelin-sonopuls, Německo). Vzorky byly opět centrifugovány po dobu 30 min při rpm. Po stočení na centrifuze bylo odebráno 500 l z každé mikrozkumavky do nových mikrozkumavek, aby mohla být změřena celková bílkovina (BS-400 Mindray, Čína) a polovina vzorků byla umístěna do termobloku (Eppendorf, Německo), kde probíhala denaturace při 99 C, po dobu 20 minut při 350 rpm. Příprava jednotlivých vzorků je znázorněna na obrázku 7. 34

35 Obrázek 7.: Schéma přípravy vzorků pro elektrochemické stanovení. Stanovení celkové bílkoviny Stanovení celkové bílkoviny probíhalo spektrofotometricky (BS-400 Mindray, Čína) s využitím pyrogallové červeně. Podstatou stanovení je vazba pyrogallové červeně s molybdenanem sodným na makromolekulu bílkovin. K vazbě dochází v prostředí jantarového pufru o ph 2,5. Zde dochází k posunu absorpčního maxima z λ = 460 nm (činidlo) na λ = 600 nm (komplex činidla s bílkovinou). Do plastových kyvet bylo napipetováno 150 l směsi reagencií složené z 50 mm kyseliny jantarové; 3,47 mm benzoanu sodného; 0,06 mm molybdenanu sodného; 1,05 mm šťavelanu sodného a 0,07 mm pyrogallové červeně v poměru 1:1. Poté bylo přidáno 8 l stanovovaného vzorku). Pro výpočet byly použity hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 10 minutové inkubaci se vzorkem Stanovení hladiny MT metodou diferenční pulzní voltametrie (DPV) Elektrochemické metody slouží pro senzitivní detekci anorganických a organických látek ve směsích biologických látek. Tyto metody jsou rychlé, jednoduché a selektivní. Voltametrie je elektrochemická metoda, pomocí které můžeme sledovat závislost intenzity proudu na velikosti proměnlivého vloženého napětí. Toto napětí je měřeno mezi pracovní elektrodou (visící kapková rtuťová elektroda), která je polarizovatelná a 35

36 referentní elektrodou, která je nepolarizovatelná. Další používanou elektrodou, která napomáhá snížení rušivých vlivů na měření, je elektroda pomocná. Princip metody diferenční pulzní voltametrie (DPV) spočívá ve sledování rozdílů proudů (ΔI). Tyto proudy jsou měřeny v krátkých časových intervalech intervalech a díky aplikaci frekvence pulsů s konstantní amplitudou je možné meřit rozdíly proudů (Shuman 1996). Při DPV sledujeme závislost proudu na napětí, která je přístrojem zobrazována ve formě píků. Pro elektrochemickou detekci byla využita metoda diferenční pulzní voltametrie (DPV) s využitím přístroje 694 VA Stand (Metrohm, Švýcarsko) připojeného k AUTOLAB analyzátoru (EcoChemie, Nizozemsko), který pracuje v klasickém zapojení tří elektrod. Jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm 2. Za pomocnou elektrodu byl zvolen platinový drátek a referenční elektrodou byla v našem případě argentochloridová elektroda (Ag/AgCl/3M KCl). Během analýzy byl pracovní povrch elektrody aktivní. Po každém stanovení nebo opakování byl její povrch obnoven odkápnutím nové rtuťové kapky ze zásobníku rtuti a tak mohlo proběhnout samotné stanovení. Analyzované vzorky byly před samotným měřením zbaveny kyslíku probubláním argonem (99,999%) po dobu 120 s. Brdičkův roztok (1mM Co(NH 3 ) 6 Cl 3 a 1M amonný pufr (NH 3 (aq) + NH4Cl, ph = 9.6), který byl použit jako základní elektrolyt, byl vyměňován po každém stanovení. Parametry metody byly následující: počáteční potenciál -0,4 V, koncový potenciál V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, krokový potenciál 2 mv, amplituda 250 mv, objem dávkovaného vzorku 10 µl, celkový objem měřící cely 2 ml (10 µl vzorku µl Brdičkova elektrolytu). Ke zpracování naměřených dat byl využit program GPES 4.9 (EcoChemie, Nizozemsko). Všechna měření byla uskutečňována při laboratorní teplotě (24 C). K vyhodnocení všech naměřených dat byl využit Microsoft Excel a Microsoft PowerPoint. 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Cílem experimentální části bakalařské práce bylo sledování vlivu vybraných těžkých kovů mědi, zinku a kadmia na hladinu metalothioneinu a na dynamiku růstu bakteriálních buněk u třech různých bakteriálních kultur: E. coli transformována plazmidem obsahující gen lidského prionového proteinu (hprp C ), anebo gen izoformy 36

37 metalothioneinu-3 (MT-3) a kontrolní E. coli ( BL21(DE3)). Proteiny PrP C a MT-3 jsou schopny vázat těžké kovy, čímž by měly buňky ochránit před jejich toxicitou. 5.1 Ověření exprese rekombinantního lidského prionového proteinu (hprp C ) a metalothioneinu 3 (MT-3) metodami western-blot a dotblot Prostřednictvím western-blotu a dot-blotu byla nejdříve ověřena přítomnost exprese hprp C (Obrázek 8). Pro dosažení lepší produkce a stimulace proteinů v bakteriálních buňkách byla k bakteriím přidávána chemikálie IPTG (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyranosid). Bakteriální buňky exprimující hprp C byly po lýze a následné centrifugaci rozděleny na pelet a supernatant. Po elektroforetické separaci na SDS- PAGE (Obrázek 8B) byly proteiny přeneseny na nylonovou membránu, kde byly po inkubaci s protilátkami proti hprp C detekovány. Pozitivní band hprp C o velikosti kolem 20 kda byl detekován pouze v peletu u vzorku bakteriálních buněk s přídavkem IPTG. Tohle zjištění lze vysvětlit možnou agregací a krystalizací hprp C v peletu (Obrázek 8B). Totéž bylo potvrzeno dot-blotem (Obrázek 8C). Obrázek 8: Ověření přítomnosti prionového proteinu (hprp C ) v buňkách bakterií E. coli BL21(DE3) transformovaných plazmidem obsahujícím hprp C gen. Červené elipsy značí výskyt prionového proteinu (velikost kda). (A) Gel obarvený Coomassie 37

38 brilliant blue, standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standards (Bio-Rad); (B) Western blot, standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standards (Bio-Rad) a (C) Dot-blot po 70 min inkubaci s anti-hprp protilátkou, Mr-hmotnostní standard; dráha č. 1: hprp C supernatant, dráha č. 2: hprp C pelet, dráha č. 3: hprp C /+IPTG supernatant, dráha č. 4: hprp C /+IPTG pellet. Stejným způsobem byla ověřena přítomnost exprese MT-3 (Obrázek 9). Metodou western-blot byl detekován pozitivní band o velikosti kolem 10 kda v obou frakcích buněk (supernatantu i peletu) s přídavkem IPTG (Obrázek 9B). Stejného výsledku jsme dosáhli i metodou dot-blot (Obrázek 9C). Obrázek 9: Ověření přítomnosti metalothioneinu (MT-3) v buňkách bakterií E. coli BL21(DE3) transformovaných plazmidem obsahujícím MT-3 gen. Červené elipsy značí výskyt proteinu metalothioneinu-3 (velikost 7-10 kda). A) Gel obarvený Coomassie brilliant blue, standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standards (Bio-Rad); B) Western blot, standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standards (Bio-Rad) a C) Dotblot po 70 min inkubaci s anti hprpc protilátkou, Mr-hmotnostní standard, dráha č. 1: E. coli BL21(DE3) supernatant, dráha č. 2: E. coli BL21(DE3) pelet, dráha č. 3: MT-3 supernatant, dráha č. 4: MT-3 pelet, dráha č. 5: MT-3/+IPTG supernatant, dráha č. 6: MT-3/+IPTG pelet. 38

39 5.2 Studium vlivů iontů kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) na růst bakteriální kultury Vliv měďnatých, zinečnatých a kademnatých iontů na růst bakteriálních kultur exprimujících proteiny hprp C a MT-3 byl zkoumán základní mikrobiologickou metodou t.j. metodou růstových křivek. Postup pro hodnocení antimikrobiálního účinku třech těžkých kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) byl založen na měření absorbance transformovaných bakteriálních kultur E. coli exprimujících proteiny hprp C a MT-3 v porovnání s kontrolní bakteriální kulturou E. coli BL21(DE3), která byla rovněž vystavena působení výše zmíněných těžkých kovů. Na obrázku 10 je znázorněn vliv iontů kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) na množení transformovaných bakteriálních kultur exprimujících geny hprp C anebo MT-3. Koncentrace kovů (Cu, Zn a Cd) přidávaných k jednotlivým bakteriálním kulturám byla vždy stejná. Koncentrační řada začínala vždy koncentrací 0 μm (kontrola) a končila koncentrací 300 μm kovových iontů. Délka měření růstu transformované i kontrolní bakteriální kultury činila 24 hodin. Buňky, které exprimovaly hprp C a byly vystaveny toxicitě kademnatých iontů, vykazovaly účinnější obranu proti oxidačnímu stresu způsobeného kadmiem (IC 50 = 11,2 μm), než tomu bylo u buněk exprimujících MT-3 (IC 50 = 6,1 μm). Ochrana proti oxidačnímu stresu u buněk exprimujících MT-3 byla o něco vyšší než u kontrolních buněk (IC 50 = 5,2 μm) (Obrázek 10A). Naproti tomu aplikací měďnatých iontů došlo u buněk, které exprimovaly hprp C k vyšší inhibici růstu (IC 50 = 2,7 μm), než u kontrolních buněk (IC 50 = 5,1 μm). Nejlépe chráněny vůči oxidačnímu stresu byly buňky exprimující MT-3 (IC 50 = 10,0 μm) (Obrázek 10B). Podobné zjištění jako v případě aplikace kademnatých iontů bylo pozorováno i v případě aplikace zinečnatých iontů. Buňky, které exprimovaly hprp C a byly vystaveny toxicitě zinečnatých iontů byly nejlépe chráněny vůči oxidačnímu stresu (IC 50 = 110,6 μm), méně chráněny byly buňky exprimující MT-3 (IC 50 = 46,9 μm) a nejméně chráněny byly kontrolní buňky (IC 50 = 5,0 μm) (Obrázek 10C). 39

40 Obrázek 10: Pozorování inhibice růstu buněk bakterií E. coli BL21(DE3) transformovaných prázdným plazmidem (a), s plazmidem obsahujícím MT-3 gen (b) anebo hprp C gen (c) metodou růstových křivek po inkubaci s různými koncentracemi kovů Cd (A), Cu (B) a Zn (C) (10, 50, 150, a 300 μm), ve srovnání s kontrolními bakteriemi bez přídavku kovu (tmavě modrá křivka). Průměrné hodnoty IC 50 (poloviční z maximální inhibiční koncentrace) vypočteny ze všech křivek jsou uvedeny uvnitř grafu. 5.3 Elektrochemické stanovení celkové hladiny MT po přídavku iontů kovů (Cu 2+, Zn 2+ a Cd 2+ ) k bakteriální kultuře metodou diferenční pulzní voltametrie (DPV) Před samotným měřením hladiny MT byla vytvořena kalibrační křivka (obrázek 11 A) měřením různých koncentrací standardu MT (0,39 25,0 μg/ml) a z naměřených dat byly následně vytvořeny voltamogramy (obrázek 11 B) znázorňující katalytické signály 40

41 standardů získané po proměření kalibrační křivky. Metalothioneinu odpovídá nejvyšší katalytický signál RS 2 Co měřený při potenciálu -1,35 V. Hodnoty MT získané odečtem z kalibrační křivky byly přepočteny na mg stanoveného proteinu ve vzorku. Obrázek 11: (A) Kalibrační křivka stanovena metodou DPV, jako elektrolyt byl využit Brdičkův roztok (1mM Co(NH 3 ) 6 Cl 3 a 1M amonný pufr (NH 3 (aq) + NH 4 Cl, ph = 9.6); parametry metody byly zvoleny následovně: počáteční potenciál -0,4 V, koncový potenciál -1,75 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, krokový potenciál 2 mv, amplituda 250 mv. (B) Voltamogramy standardů MT (0,39-25 μg/ml) získaných při měření kalibrační křivky. Dále bylo provedeno měření celkové hladiny MT v kontrolních buňkách E. coli a v buňkách E. coli exprimujících hprp C anebo MT-3 proteiny. Tyto kultury byly vystaveny působení iontů 2 esenciálních kovů (Cu 2+, Zn 2+ ) a 1 toxického kovu (Cd 2+ ). Bakterie, které exprimovaly hprp C byly proti oxidačnímu stresu způsobeného přítomností iontů kovů lépe chráněny, z toho důvodu, že hprp C spolu s bakteriálním metalothioneinem působí jako vychytávače iontů kovů a to zároveň vedlo ke snížení hladiny metalothioneinu při nižších koncentracích kovů oproti kontrole (obrázek 12). Jedna z možností vysvětlení by byla taková, že vyšší hladina MT u kontroly bez přídavku kovu než u přídavku kovu s nízkou koncentrací může být způsobená zapojením hprp C do regulace homeostázy kovů v bakteriích exprimujících hprp C. 41

42 Obrázek 12: Množství metalothioneinu v buňkách bakterií E. coli BL21(DE3) transformovaných s prázdným plazmidem, s plazmidem obsahujícím hprpc anebo MT-3 gen po inkubaci s různými koncentracemi kovů (25, 75, a 125 μm) Cu (A), Zn (B) a Cd (C) ve srovnání s kontrolními bakteriemi bez přídavku kovu. 42