UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. Katedra biologických a lékařských věd DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd DIPLOMOVÁ PRÁCE Hradec Králové 2007 Miroslava Steňková

2 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd DIPLOMOVÁ PRÁCE Vliv hypolipidemické terapie na endoteliální dysfunkci a časné aterogenní změny ve stěně cévy u experimentálních modelů aterosklerózy II Hypolipidemic treatment and its effects on endothelial dysfunction and early atherogenesis in the vessel wall in experimental models of atherosclerosis II. Školitel: PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D. Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc. Hradec Králové 2007 Miroslava Steňková 2

3 Poděkování Děkuji PharmDr. Petru Nachtigalovi, Ph.D., za odborné vedení diplomové práce, poskytování rad a materiálových podkladů k práci, dále Doc. RNDr. Vladimíru Semeckému, CSc., a celé katedře biologických a lékařských věd za umožnění vykonávání experimentální části na této katedře. 3

4 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Funkce endotelu za fyziologických podmínek Buněčné adhezivní molekuly (CAM) Imunoglobulinová skupina CAM Fyziologická funkce CAM Regulace exprese endoteliálních CAM Endoteliální dysfunkce Ateroskleróza Rizikové faktory Ovlivnitelné Neovlivnitelné Patofyziologie aterosklerózy Zvířecí modely používané ke studiu aterosklerózy Myší model aterosklerózy Statiny v léčbě hypercholesterolémie Mechanismus účinku statinů a jejich lipidové účinky Pleiotropní nelipidové účinky statinů Atorvastatin CÍL PRÁCE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Zvířata a předepsaná dieta Biochemická analýza Histologická barvení olejovou červení Imunohistochemie Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí

5 4.6. Statistická analýza V ÝSLEDKY Biochemická analýza Histologické barvení olejovou červení Imunohistochemické barvení VCAM-1 v oblasti aortálního sinu Stereologická analýza histologického barvení olejovou červení a imunohistochemického barvení VCAM D ISKUSE Z ÁVĚR A BSTRAKT A BSTRACT P OUŽITÁ LITERATURA

6 Seznam použitých zkratek ACE acetylcholinesteráza ACH acetylcholin ADP adenosindifosfát apoe apolipoprotein E apoe/ldlr-dko apoe/ldl receptor double knockout, dvojnásobně knokautovaná myš CAM cell adhesion molecules, buněčné adhesivní molekuly CMP cévní mozková příhoda CRP C reaktivní protein EDGF endothelium derived growth factor EDHF endothelium derived hyperpolarizing factor Hb hemoglobin HDL high density lipoprotein, lipoproteiny s vysokou hustotou HMG-CoA 3-hydroxyl-3-methylglutaryl koenzym A ICAM-1 intercellular cell adhesion molecule, adhezivní molekula IDL intermediate density lipoproteins, lipoproteiny se střední hustotou IGF-1 inzulínu podobný růstový faktor ICHS ischemická choroba srdeční ICMP ischemická cévní mozková příhoda IL interleukin INF-γ interferon gamma LDL low density lipoprotein, lipoproteiny s nízkou hustotou LPS lipopolysacharidy MAdCAM-1 mucosal addressin cell adhesive molecule MCP-1 monocytární chemotaktický protein-1 M-CSF macrophage colony stimulating factor, růstový hormon makrofágů NF-κB nukleární faktor kappa B NO oxid dusnatý OxLDL oxidované LDL částice PAF faktor agregace PAI-1 inhibitor aktivátoru plazminogenu PDGF platelet-derived growth factor, destičkový růstový faktor PECAM-1 platelet endothelial cell adhesion molecule 6

7 TAG TGF β TNF α t-pa VCAM-1 VLDL triacylglyceroly transforming growth factor, transformující růstový faktor tumor necrosis factor tkáňový aktivátor plazminogenu vascular cell adhesion molecule, adhezivní molekula very low density lipoprotein, lipoproteiny s velmi nízkou hustotou 7

8 1. ÚVOD Ateroskleróza, neboli kornatění tepen, je degenerativním onemocněním cév. Způsobuje ji ukládání tukových látek a vápníku do jejich stěny. Typicky se projevuje snížením průtoku krve postiženou cévou a poruchou zásobení částí těla a orgánů. Ateroskleróza se někdy označuje jako nemoc 20. století (1). Její orgánové komplikace, tedy infarkt myokardu, mozkové cévní příhody a ischemická choroba dolních končetin jsou nejčastější příčinou předčasné invalidizace a úmrtí ve většině civilizovaných zemí a jsou jedním z významných sociálních problémů civilizace spojené se západním stylem života. Současná data ze Světové zdravotnické organizace ukazují, že úmrtnost na kardiovaskulární onemocnění tvoří asi %. Česká republika se nachází i přes příznivý vývoj v posledních letech na jednom z předních míst v Evropě v úmrtnosti populace na choroby srdce a cév. Velkým problémem je též stárnutí populace a s tím související i zvyšování prevalence kardiovaskulárních onemocnění v populaci. V průběhu posledního desetiletí zaznamenaly velký pokrok v léčbě kardiovaskulárních onemocnění inhibitory HMG-CoA reduktázy, statiny. Výraznou měrou přispěly k pokrokům v oblasti hypolipidemické léčby a snížení kardiovaskulárního rizika. Jednoznačný posun byl zaznamenán v etiologii a patogenezi vzniku aterosklerózy, stejně jako v objasnění úlohy cholesterolu a kardiovaskulárních rizikových faktorů (2). Jistě bude stát ještě mnoho úsilí, než se podaří změnit životní styl mladé a střední generace, u níž se aterosklerotické změny velice často vyskytují, ale nezpůsobují ještě zřetelné potíže. S prevencí aterosklerózy by se mělo začít již v dětství. Tato diplomová práce se zaměřila na studium vlivu atorvastatinu na vybrané parametry lipidů a zánětu u geneticky modifikovaného kmene myší, který by mohl být potenciálně použitý jako standardní zvířecí model pro studium efektů daných podáváním statinů. 8

9 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Funkce endotelu za fyziologických podmínek Endotel je významným orgánem, který má zásadní vliv na udržení krevního toku, průchodnosti cév a výši krevního tlaku. Endoteliální buňky uvolňováním různých humorálních působků kontrolují cévní relaxaci a kontrakci, trombogenezi a fibrinolýzu, aktivaci buněčných elementů krve a jejich inhibici (3). Dlouhou dobu se předpokládalo, že endotel tvoří pouze buněčnou bariéru oddělující cévní stěnu od krve a zajišťuje nesmáčivý povrch cévního lumen. Výzkum v posledních letech však prokázal, že endotel je metabolicky velmi aktivní orgán s celou řadou fyziologických funkcí (4). Jednou ze základních funkcí endotelu je zajištění řízené propustnosti mezi krví a okolními tkáněmi. Endotel kontroluje prostup jak pro buněčné elementy, tak pro nebuněčné krevní komponenty. Nebuněčné komponenty využívají pro svou cestu paracelulární i transcelulární transportní mechanismy. Prostup krevních elementů leukocytů je realizován za pomoci vazoadhezivních molekul, kterých endotel na svém povrchu exprimuje celou řadu (E-selektin, ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1) (5). Druhou úlohou endotelu je kontrola optimálního průtoku krve cévou. Mezi nejdůležitější látky s vazoaktivním účinkem, které jsou produkovány endotelem, patří oxid dusnatý (NO). Jeho tvorba je zprostředkována NO-syntázou z aminokyseliny L-argininu. NOsyntáza je aktivována smykovým napětím krevního proudu (shear-stress), hypoxií a celou řadou lokálních působků. NO má mohutný vazodilatační účinek, inhibuje expresi adhezivních molekul, adhezi a agregaci trombocytů a apoptózu endoteliálních buněk. Brzdí též migraci myocytů z médie, jejich proliferaci a transformaci v sekreční buňky. Další vazodilatační látkou produkovanou endotelem je prostacyklin PGI 2. Prostacyklin je uvolňován za obdobných situací jako NO a jejich účinek se navzájem potencuje. Třetím vazodilatačně působícím faktorem je hyperpolarizační faktor pocházející z endotelu (EDHF), jehož hlavní biologickou úlohou je pravděpodobně vazodilatace v koronárním řečišti. K zachování rovnováhy vzniká v endotelu několik látek s vazokonstrikčním působením. Jde především o endotelin-1. Vedle podnětů, které vedou i k uvolnění NO (např. bradykinin, angiotenzin II, shear stress), jeho syntézu stimulují některé aterogenní proteiny (trombin), či lipoproteiny (oxidovaný LDL). V intaktních cévách působí endotelin-1 bimodálně vazokonstrikční účinek je mírněn současnou stimulací produkce NO a prostacyklinu. Plná vazokonstrikce se objeví až při poškození endotelu. Endotelin-1 také stimuluje proliferaci myocytů v cévní stěně. Na povrchu endotelu je též vázán 9

10 angiotenzin-konvertující enzym a endotel může prostřednictvím změny jeho aktivity ovlivňovat hladiny angiotezinu II a bradykininu (6). Další funkcí endotelu je zajištění integrity cévního řečiště. Intaktní endotel je dokonale nesmáčivým povrchem. Již při pouhé deskvamaci endoteliálních buněk dochází k expresi von Willebrandova faktoru (vwf) a ten prostřednictvím destičkových receptorů aktivuje adhezi trombocytů, které se vážou na subendoteliálně lokalizovaná vlákna kolagenu. Poté dochází k jejich aktivaci a degranulaci, což vede k uvolnění řady dalších proagregačně a vazokonstrikčně působících látek. Prostřednictvím destičkových receptorů IIb/IIIa a fibrinogenu destičky agregují. Primární, destičková fáze hemokoagulace je doprovázena sekundární hemostázou, na jejímž konci je přeměna fibrinogenu trombinem v nerozpustný fibrin. I tato fáze je ovlivnitelná endotelem. Endotel váže na svém povrchu antitrombin III, který inaktivuje trombin a vzniklý komplex je z cirkulace odstraněn. Endotel také produkuje trombomodulin. Komplex trombomodulin-trombin má již omezenou schopnost štěpit fibrinogen, navíc aktivuje protein C, který v komplexu s proteinem S inaktivuje faktory Va a VIIa a tím inhibuje koagulaci. Endotel kontroluje navíc i fibrinolýzu. Klíčovým enzymem štěpícím molekuly fibrinu je plasmin. Ten vzniká z cirkulujícího plasminogenu působením tkáňového aktivátoru plasminogenu (t-pa). Ten naopak může být inhibován svým inhibitorem (PAI-1). Jak t-pa, tak PAI-1 jsou syntetizovány v endotelu a mohou být v různém poměru uvolňovány (7). Endotel může zasahovat i do reparativních procesů a angiogeneze. Reparativní pochody v cévní stěně jsou kontrolovány řadou cytokinů. Mezi růstové faktory a cytokiny endoteliálního původu jsou řazeny např. transformující růstový faktor beta, fibroblastový růstový faktor, destičkový růstový faktor, interleukin-1, nebo endotelin-1. Tyto mitogeny stimulují růst buněk hladké svaloviny, jejich migraci do subendoteliálního prostoru z médie s následnou hyperplázií intimy a hypertrofií cévní stěny. Naopak velmi významným antimitogenem je NO, který inhibuje proliferaci buněk hladké svaloviny a zabraňuje hypertrofii cévní stěny (8). 2.2 Buněčné adhezivní molekuly (CAM) Imunoglobulinová skupina CAM Tato skupina zahrnuje celou řadu molekul s četnými povrchovými znaky protilátek. Část z nich má vztah ke vzniku cévních onemocnění, konkrétně adhezivní molekuly ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecule-1) a ICAM-2 (intracellular cell adhesion molecule-2), 10

11 VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), PECAM-1 (platelet-endothelial cell adhesion molecule-1) a MAdCAM-1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1). ICAM-1 je exprimována na mnoha typech buněk, její výskyt na endoteliálních buňkách je ale regulován (5). V rámci cévního řečiště navíc vykazuje významnou heterogenitu (9). V séru můžeme detekovat rozpustnou isoformu ICAM-1 za fyziologických podmínek, ve významně zvýšeném množství pak v různých stadiích onemocnění (10). ICAM-2 je zkrácenou formou ICAM-1, rovněž se vyskytuje na endoteliálních buňkách, ale na rozdíl od ICAM-1 není její exprese zvýšená při aktivaci endotelu (11). Exprese VCAM-1 je v nestimulovaných endoteliálních buňkách nízká, může být ale výrazně zvýšená působením cytokinů. Tato adhezivní molekula zprostředkovává adhezi lymfocytů a monocytů na zánětem postižený endotel. Adhezivní molekula PECAM-1 je exprimována hlavně na leukocytech a endoteliálních buňkách, v menší míře i na krevních destičkách. Zprostředkovává adhezi buď v heterofilní nebo homofilní interakci. Jelikož exprese PECAM není závislá na stimulaci cytokíny, hustota těchto molekul se používá k odhadu plochy cévního řečiště (12) Fyziologická funkce CAM Adhezivní molekuly mohou být exprimovány ve všech částech cévního řečiště (artériích, kapilárách i žílách), ale největší odpověď na zánětlivé procesy vzniká v postkapilárních venulách, pravděpodobně proto, že zde dochází k nejrozsáhlejší expresi těchto adhezivních molekul. Pokusy in vivo, které byly zaměřeny na chování leukocytů, vedly k vytvoření jakéhosi modelu, který předpokládá tři postupné fáze při pohybu leukocytů skrz cévní endotel: rolování ( kutálení po endotelu ), pevnou adhezi (přilnutí) a vycestování z cévního řečiště transendoteliální migraci (viz. obr.2, str.20) (13). Pro vytvoření pevné interakce s buňkami endotelu se samozřejmě musí leukocyty nejdříve přemístit z centrálního proudu tekoucí krve směrem k cévní stěně (14). Rolování (slabé adhezivní interakce) umožňují selektiny, pro které mají leukocyty na svém povrchu příslušné ligandy. Přestože na leukocytech můžeme nalézt i jiné adhezivní molekuly (například VLA-4, VCAM-1, MAdCAM-1 a zástupce ze skupiny β 1 integrínů), jejich kvantitativní význam v procesu rolování zůstává zatím nejasný (15). Adherované leukocyty jsou dále vystaveny působení nízkých koncentrací chemoatraktantů/mediátorů zánětu, které způsobí jejich aktivaci a následně vyvolají integrin-ig dependentní vazbu leukocytů k povrchu endotelu. Jedná se již o pevnou adhezivní interakci. Současně dochází k down-regulaci L-selektinu. Aktivace leukocytů je rovněž spojená se zvýšenou aktivitou integrinů, která může být vyvolána chemokiny, bakteriálními peptidy, PAF (faktor 11

12 aktivující destičky) a leukotrieny B 4 (16). Transendoteliální migrace začíná pohybem takto přilnutých leukocytů směrem k mezibuněčným spojům. V průběhu tohoto procesu buňka neustále vytváří nové adhezivní kontakty na předním konci, zatímco na zadním konci jsou tyto vazby redukovány (viz. obr.2) Regulace exprese endoteliálních CAM Koordinovaná mobilizace leukocytů na místa zánětu je ve větší míře určována časovým průběhem a velikostí endoteliální exprese CAM. Rolování je výsledkem aktivace L- selektinu na povrchu leukocytů a rychlé mobilizace preformovaného P-selektinu na povrch endoteliálních buněk. Exprese β 2 -integrinu nebo aktivace rolujících leukocytů vyvolá zvýšenou adherenci leukocytů k povrchu endotelu, což umožní navázat spojení s endoteliální molekulou ICAM-1. K vytvoření infiltrace velkého počtu leukocytů v zanícené tkáni je nezbytná vysoká hustota endoteliálních CAM. Ta je udržována pouze syntézou proteinů de novo. Na transkripci závislou syntézu různých endoteliálních CAM (zahrnujících ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, E-selektin a P-selektin) indukuje velké množství rozmanitých bakteriálních toxinů, cytokinů a oxidantů. Maximum exprese těchto adhesivních molekul bylo zaznamenáno po 3 až 6 hodinách po počátečné expozici stimulem vyvolávajícím zánět. V regulaci endoteliální exprese CAM hrají roli dva transkripční faktory: NF-κB a AP-1 (16). Vazebná místa pro NF-κB byly identifikovány v promotorové oblasti genů pro E- selektin, VCAM-1 a ICAM-1, zatímco vazebná místa pro AP-1 byla lokalizována v promotorové oblasti genů pro ICAM-1 a E-selektin (17). Na pokusech in vitro i in vivo bylo demonstrováno, že ke snížení exprese CAM indukované cytokíny, lipopolysacharidy nebo oxidanty lze využít inhibitory aktivace nebo nukleární translokace NF-κB a AP-1 (18). 2.3 Endoteliální dysfunkce Endoteliální dysfunkce je definována jako funkční poškození endotelu, charakterizované především zvýšenou propustností cévní stěny, nerovnováhou mezi vazoaktivními, hemokoagulačními a proliferaci inhibujícími, respektive stimulujícími působky. Představuje časnou, morfologicky němou fázi aterosklerózy, avšak podílí se i na vývoji morfologicky zřejmých aterosklerotických lézí a přispívá ke klinické manifestaci aterosklerózy (19). Zlepšení poškozené funkce endotelu úpravou životosprávy a vhodnou léčbou může zabránit vzniku a progresi aterosklerózy a jejích komplikací (20). 12

13 K poškození endotelu může dojít v důsledku působení celé řady faktorů. Většina z nich jsou známé rizikové faktory aterosklerózy. Mezi hlavní příčiny patří arteriální hypertenze, hyperlipoproteinémie (zejména hypercholesterolémie a především zvýšená hladina LDL, přičemž nejnebezpečnější jsou oxidované či glykované LDL), hyperglykémie, hyperinzulinémie, hypoxie, kouření, ionizující záření, cytostatika, stárnutí, imunokomplexy a různé infekce. K těmto systémovým faktorům se mohou přidat lokálně působící faktory, jako jsou turbulence krevního toku (bifurkace cévy, menší fixace cévy k okolí), vrozené či získané cévní anomálie nebo intravaskulární výkony (angioplastika) (21). Aktivace endotelu těmito podněty vede k různým typům odpovědi ke změně permeability, vazospastickým reakcím, porušení hemostatických mechanismů nebo uvolnění růstových faktorů. Výsledkem endoteliální dysfunkce je proaterogenní účinek s převahou vazokonstrikčních, protrombotických a proliferačních pochodů. Endoteliální dysfunkce a ateroskleróza Endoteliální dysfunkce se podílí na vývoji jak časných, tak i pozdních fází aterosklerózy. Dysfunkční endotel umožňuje vyšší průnik aterogenních lipidů. Zvýšenou expresí adhezivních molekul a produkcí některých cytokinů usnadňuje kumulaci monocytů v cévní stěně, jejich přeměnu v makrofágy a pěnové buňky. Nedostatečná produkce NO vede k uplatnění řady růstových faktorů, stimulujících buňky hladkého svalstva k migraci do subendoteliálních prostor a k produkci extracelulární vazivové komponenty aterosklerotických lézí. Již v těchto fázích, kdy morfologické změny cévy nejsou přítomné, nebo jsou hemodynamicky nevýznamné, se může klinicky manifestovat přítomný sklon k vazospazmům, např. formou mikrovaskulární anginy pectoris či tranzitorní mozkové ischémie. Endoteliální dysfunkce akceleruje vývoj aterosklerózy i v pozdějších fázích. Podílí se na kumulaci makrofágů a pěnových buněk v aterosklerotickém plátu. Nedostatečná produkce NO, prostacyklinu a dalších působků inhibujících adhezi a agregaci destiček a naopak zvýšená exprese von Willebrandova a tkáňového faktoru navozují protrombogenní stav. Proto ruptura i hemodynamicky nevýznamného plátu s nasedající trombózou, může vést k rychlému uzavření tepny zvláště, když endoteliální dysfunkci provází snížená fibrinolýza. K úplnému uzávěru tepny může také přispět již zmíněný zvýšený sklon k vazospazmům (22). 13

14 Obr. 1 Poškození endoteliální funkce hlavními rizikovými faktory aterosklerózy (23). 2.4 Ateroskleróza Aterosklerózu lze definovat jako chronické onemocnění cévní intimy, provázené akumulací cholesterolu, fibrózní tkáně, některých dalších komponent krve a změnami v medii cévní stěny s postupným zužováním cévního lumen. Z etiopatogenetického hlediska je zcela nepochybně multifaktoriálního původu. Vzniká jako specifická reakce na poškození cévní stěny. Jednoznačná příčina vzniku aterosklerózy sice není úplně známá, známe však řadu faktorů, které se na jejím vzniku podílejí a které souhrnně nazýváme rizikovými faktory (24) Rizikové faktory Udává se, že doposud bylo identifikováno celkově kolem 300 rizikových faktorů pro rozvoj aterosklerózy (25). Můžeme je dělit z několika hledisek, nejobvyklejší je dělení na rizikové faktory ovlivnitelné a neovlivnitelné. Za hlavní ovlivnitelné faktory považujeme kouření, inzulínovou rezistenci a hyperinzulinismus, arteriální hypertenzi, dyslipidémii, obezitu, diabetes mellitus, hyperfibrinogenémii, nedostatek aerobní aktivity, nedostatek estrogenů, nedostatek antioxidancií, nenasycených mastných kyselin a vlákniny, nadbytek přijímané energie, cholesterolu, nasycených mastných kyselin a dále biologické faktory. Mezi hlavní neovlivnitelné faktory patří vyšší věk, mužské pohlaví a genetická predispozice, někteří autoři řadí do této skupiny i faktory rasové (26). 14

15 Odhalení těchto rizikových faktorů vzešlo z velkých kohortových studií a patří k nejvýznamnějším úspěchům lékařství (27) Ovlivnitelné rizikové faktory Kouření Je jedním z nejrozsáhlejších rizikových faktorů aterosklerózy. Rizikové je nejen aktivní, ale, jak bylo dokázáno na základě výsledků řady epidemiologických studií, i kuřáctví pasivní. Odhaduje se, že efekt pasivního kouření představuje % kouření aktivního (28). Mezi rizikem ICHS a počtem cigaret vykouřených za den existuje závislost dávky a účinku. Riziko u těch, kteří přestanou kouřit, je pouze poloviční oproti těm, kteří kouří dál, nezávisle na tom, jak dlouho kouřili. Kouření cigaret snižuje koncentraci HDL a zvyšuje LDL cholesterol. Zvýšením koncentrace oxidu uhelnatého v krvi může vyvolat hypoxii endotelu. Dále zvyšuje reaktivitu destiček a koncentraci fibrinogenu v plazmě a hematokrit, což vede k nárůstu krevní viskozity (29). Hypertenze Hypertenze je složitým onemocněním, jehož všechny aspekty nejsou dosud vysvětleny. V mechanizmu poškození cévní stěny hraje významnou roli osa renin angiotenzin aldosteron (angiotenzin II způsobuje vazokonstrikci a stimuluje proliferaci vaziva). Na stěnu tepny působí přímo zvýšení krevního tlaku, změny proudění krve, dochází k poruše endoteliální vrstvy, a tím k umožnění výše popsaných jevů. Hypertenze vede k remodelaci hladké svaloviny ve velkých tepnách a v malých tepnách vede ke zvýšení cévního tonu. Zvýšení systolického krevního tlaku je významnějším rizikovým faktorem než zvýšení diastolického krevního tlaku (30). Porucha metabolismu lipidů (dyslipidémie) V rozvoji aterosklerózy hraje nejdůležitější roli zvýšená hladina LDL cholesterolu (24). Jeho snížení o 1 % vede k poklesu rizika koronárních příhod o přibližně 2 %. Jeho doporučená koncentrace je < 3 mmol/l pro osoby v primární prevenci. Pro osoby s manifestací aterosklerózy a pro diabetiky 2. typu (resp. diabetiky 1. typu s mikroalbuminurií) je doporučená koncentrace < 2,5 mmol/l. Nemocní v sekundární prevenci s diabetem by měli mít LDL cholesterol < 2,0 mmol/l. Podle intervenčních studií i další pokles LDL cholesterolu redukuje riziko koronárních příhod (31). Aterogenita částic LDL klesá s jejich velikostí. Existuje pozitivní korelace mezi velikostí LDL částic a rizikem infarktu myokardu (32). Malé LDL 3 jsou často přítomny 15

16 u nemocných s metabolickým syndromem a u nemocných s diabetes mellitus 2. typu. Množství LDL 3 v krvi se zvyšuje od koncentrace triglyceridů > 1,5 mmol/l (33). Naproti tomu zvýšená hladina HDL cholesterolu je ochranným faktorem před vznikem aterosklerózy. HDL mobilizuje cholesterol z periferie do jater a žláz produkujících steroidy, navíc má i antioxidační vlastnosti a působí protizánětlivě. Proto je někdy označován jako hodný cholesterol (26). Zvýšení HDL cholesterolu o 1 % snižuje riziko koronárních příhod o 2 3 %. Optimální hladina HDL cholesterolu je > 1,0 mmol/l. Zvýšení HDL cholesterolu nad 1,6 mmol/l je tzv. negativním rizikovým faktorem, který snižuje kardiovaskulární riziko (34). Se zvyšující se koncentrací triglyceridů od 1,7 do asi 10,0 mmol/l stoupá i riziko ICHS, a to více u žen než u mužů. Při dalším vzestupu nad 10 mmol/l aterogenita opět postupně klesá a velmi vysoké koncentrace triglyceridů nejsou ani tak rizikem pro ICHS jako pro akutní pankreatitidu (35). Za samostatný rizikový faktor je považován zvýšený apolipoprotein B a snížený apolipoprotein AI. Jejich stanovení může mít někdy lepší předpovědní hodnotu, než měření LDL a HDL cholesterolu (25). Zvýšení apolipoproteinu B100 při normálním LDL cholesterolu může signalizovat zvýšený podíl malých LDL 3 v částic krvi. Diabetes mellitus, inzulínová rezistence, hyperinzulinémie Není jasné, zda-li v tomto případě hraje větší roli proces glykace proteinů (včetně LDL) a zvýšená tvorba vasokonstrikčních prostaglandinů, nebo doprovodná dyslipidémie, hypertenze a obezita. Riziko ICHS je u diabetiků 2 4x vyšší než u nediabetické populace (36). Inzulinová rezistence zvyšuje koncentraci VLDL, snižuje koncentraci HDL cholesterolu a zvyšuje výskyt arteriální hypertenze. Inzulin působí na cévní stěnu stimulací tvorby růstových faktorů, proliferací buněk hladkého svalstva, stimulací produkce pojivové tkáně, zvýšenou aktivitou LDL cholesterolu, zvýšenou tvorbou cholesterolu, zvýšenou tvorbou a sníženou regresí tukových proužků a zvýšením hladin plazmatického endotelinu-1 a inhibitoru aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1) (30). Obezita, nevhodná strava Obezita představuje jeden z dlouho známých a základních rizikových faktorů aterosklerózy. V poslední době však přibývají přesvědčivé důkazy o tom, že rozhodujícím rizikovým faktorem není obezita, ale typ obezity, konkrétně přítomnost intraabdominální akumulace tuku. V současnosti se zdá být zcela zřetelné, že přítomnost intraabdominální 16

17 obezity představuje na Body Mass Indexu (BMI) nezávislý a dokonce mnohem citlivější rizikový faktor rozvoje aterosklerózy či jejich klinických manifestací. Snadno zjistitelným parametrem odrážejícím rozsah intraabdominální obezity je obvod pasu (normální hodnoty obvodu pasu: muž < 102 cm, žena < 88 cm). Intraabdnominálně uložené adipocyty se vyznačují oproti jinde uloženým tukovým buňkám zvýšenou lipolytickou aktivitou, sníženou produkcí adiponektinu a zvýšenou produkcí řady prozánětlivých (TNF α, IL6, CRP) a prokoagulačních faktorů (PAI-1). Není tak překvapením, že intraabdominální obezita je spojena s řadou proaterogenních jevů, jako je prozánětlivý stav, prokoagulační stav, hypertriglyceridémie a inzulínová rezistence s rozvojem hyperglykémie (28). Co se týče stravy, nevhodná jsou jídla s nadbytečným množstvím tuků, zvláště nasycených, cholesterolu a cukrů. Metabolický syndrom U některých nemocných se často vyskytuje kombinace hyperlipoproteinémie, inzulinové rezistence, hypertenze a obezity centrálního typu, nazývaná plurimetabolickým syndromem. Trombogenní rizikové faktory Mezi trombogenní faktory patří lipoprotein(a), fibrinogen, faktor VII, VIII, PAI-1 a zvýšená hladina CRP (C-reaktivní protein) (34). Vysoká hladina fibrinogenu v séru je samostatným nezávislým rizikovým faktorem ICHS. Zvýšená koncentrace lipoproteinu(a) zvyšuje riziko uzávěru artérie trombem, což je dáno kompeticí a podobností jeho struktury s molekulou fibrinogenu a je rizikovým faktorem vzniku ICHS. Jeho hladinu ale neumíme terapeuticky ovlivnit (28). CRP je velmi nespecifický, ale zato velmi citlivý marker zánětu, produkovaný za stimulace určitých mediátorů zánětu mnohými buňkami, včetně buněk endotelových. Z in vitro studií vyplývá, že CRP je schopen zasahovat do řady pochodů na úrovni cévní stěny, vždy se však jedná o rozvoj dysfunkce endoteliálních buněk, o posílení prozánětlivého či prokoagulačního stavu. Proto se uvažuje o jeho spolupodílu na rozvoji aterosklerózy (37). Nízká fyzická aktivita Longitudinální studie prokázaly, že pravidelná fyzická aktivita snižuje riziko ICHS, kardiovaskulární i celkové mortality u mužů i u žen (38). 17

18 Infekční agens Uvažuje se o některých bakteriálních a virových patogenech (Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, Herpes simplex virus, Cytomegalovirus). Teoreticky mohou infekční agens ovlivnit vznik aterosklerózy řadou způsobů, jak lze demonstrovat na dopadu infekce gramnegativními bakteriemi - ovlivněním lipidového spektra (vzestup hladin triglyceridů, VLDL, pokles HDL), indukcí tvorby volný radikálů v cévní stěně (oxidace LDL, další poškození cévní stěny), indukcí prozánětlivých a prokoagulačních dějů (39). Další rizikové faktory Z nejnovějších studií vyplynulo, že dalším rizikovým faktorem aterosklerózy je i obstrukční spánková apnoe. Její přítomnost je spojena prokazatelně s řadou proaterogenních jevů, jako je stimulace sympatiku, prokoagulační a prozánětlivý stav a endoteliální dysfunkce (29). Dále se v poslední době objevila i řada dat ukazujících na význam subklinické dysfunkce štítné žlázy, projevující se necharakteristickými příznaky jako je únavnost, nevýkonnost, depresivní ladění apod. Tento stav je spojen se zvýšenými hladinami sérového cholesterolu. Bylo prokázáno, že nemocní se subklinickou hypotyreózou mají prokazatelně rozsáhlejší aterosklerózu aorty a častější výskyt akutního infarktu myokardu Neovlivnitelné rizikové faktory Genetická predispozice Rozdílná četnost výskytu aterosklerotických tepenných změn byla potvrzena v 60. letech 20. století patologickou studií (International Atherosclerosis Project). Rovněž řada studií prokázala rodinný výskyt ICHS. Genetici analyzují celou řadu kandidátních genů pro rizikové faktory aterosklerózy, ale samozřejmě jednoduché vysvětlení není možné (40). V současné době rozeznáváme ve vztahu k rozvoji aterosklerózy několik genových kategorií: a) geny způsobující onemocnění spojené s rozvojem aterosklerózy, např. poruchy lipidového metabolismu, poruchy metabolismu homocysteinu, b) geny způsobující aterosklerózu bez závislosti na jakémkoli jiném ději či rizikovém faktoru (tato oblast není zatím zcela prozkoumána, nalezení takovýchto genů by patrně představovalo revoluci v možnostech identifikace rizikových nemocných; v roce 2004 byl možná první z takovýchto genů popsán), c) geny zodpovědné za náchylnost k rozvoji aterosklerózy ohromná skupina genů a jejich variant s poměrně častým výskytem v populaci, jejich síla významu je ale v porovnání s významem klasických rizikových faktorů menší, patrně však v současnosti představuje nejvýznamnější klinickou roli, d) geny s aterosklerózou spojené 18

19 rovněž velká skupina genů, která je spojována s přítomností aterosklerózy, ale jejich přímý vztah k rozvoji aterosklerózy není doposud poznán či určen (41). Věk Ateroskleróza je dlouhodobý proces, není proto divu, že pravděpodobnost jeho manifestace vzrůstá s věkem. Za rizikový považujeme z hlediska ICHS věk 45 let a vyšší u muže a 55 let a vyšší u ženy (42). Pohlaví U mužů přicházení aterosklerotické změny o 10 let dříve než u žen. Je to z důvodu protektivního působení ženských pohlavních hormonů, po snížení jejich hladiny v menopauze dochází k zrychlení vývoje aterosklerózy (34) Patofyziologie aterosklerózy Rozvoj procesu aterosklerózy, který probíhá v cévní stěně, zahrnuje: 1. zvýšenou expozici biologickým nebo chemickým patogenům 2. vznik endoteliální dysfunkce a léze 3. vznik pěnových buněk z monocytů a makrofágů, tvorbu tukových proužků a následně aterosklerotického plátu 4. destabilizaci plátu - fisuraci a rupturu, vznik klinických projevů ICHS, CMP, ICHDK (43). Tukové proužky Tukové proužky (fatty streaks) jsou shluky pěnových buněk. Jsou nejčastější a pravděpodobně u všech přítomnou formou aterosklerózy. Vyskytují se běžně již v dětském věku a někdy je lze prokázat i u novorozenců. Vznikají většinou v místech, kde došlo k lokálnímu zvýšení obsahu lipoproteinů v intimě (44). Tato akumulace není ani tak výsledkem zvýšené propustnosti endotelu jako vazby lipoproteinů (zejména LDL) na makromolekuly extracelulární matrix v intimě (především proteoglykany). Takto vázané lipoproteiny můžou podléhat chemickým modifikacím oxidaci a neenzymatické glykaci. Oxidace lipoproteinů je navíc usnadněna tím, že jsou tyto částice mimo dosah antioxidantů vyskytujících se v plasmě. K neenzymatické glykaci dochází nejčastěji u pacientů s diabetes mellitus s trvalou hyperglykémií (45). Oxidované (modifikované) LDL stimulují endotelové buňky k expresi adhezivních molekul (VCAM-1, ICAM-1, E-selektin, 19

20 P-selektin), k produkci chemotaktických faktorů pro monocyty (MCP-1), jakož i jejich receptorů (CCR-2). Kromě oxldl a MCP-1 jsou dalšími chemoatraktanty, které indukují chemotaxi monocytů lipoprotein(a), degradovaný kolagen a elastin a cytokiny IL-1 a TNFα. Výsledkem je aktivace cirkulujících monocytů a T-lymfocytů a jejich prostup do intimy cév (46). Chemotaktický faktor MCP-1 hraje klíčovou roli v migraci leukocytů směrem k endotelu. Kromě endotelových buněk je syntetizován také hladkosvalovými buňkami a makrofágy (viz. obr. 3). Předpokládá se, že na povrchu endotelu je tento faktor zachycen pomocí vazby na proteoglykany. Jeho funkce závisí na specifickém receptoru CCR-2, ukotveném v membráně leukocytů (47). Na povrchu leukocytů jsou běžně přítomna vazebná místa pro selektiny, které se však za klidového stavu na endoteliálních buňkách nevyskytují. Po výše popsané aktivaci dojde k expresi selektinů na povrchu endotelu, což způsobí první fázi v prostupu leukocytů do subendoteliálního prostoru, nazývanou tzv. kutálením po endotelu. Jedná se o slabou adhezivní interakci. Následná aktivace leukocytů prostřednictvím mediátorů zánětu umožní vytvořit pevnou vazbu mezi integriny na povrchu leukocytů a adhezivními molekulami ICAM-1 a VCAM-1 exprimovanými endotelovými buňkami. Transmigraci leukocytů do subendoteliálního porostoru umožňuje endoteliální adhezivní molekula PECAM-1, která se nachází v mezibuněčných spojích endoteliálních buněk. (viz. obr.2). Obr. 2 Schéma transmigrace monocytů přes cévní endotel (13). 20

21 Monocyty, které takto vcestovaly do subendoteliálního prostoru se dále transformují na makrofágy prostřednictvím růstových faktorů, jedním z nejvýznamnějších je M-CSF, který je navíc induktorem exprese receptorů vychytávajících modifikované částice LDL, tzv. scavanger receptorů. Scavanger receptory, které se nachází pouze na makrofázích a hladkosvalových buňkách, mají pro modifikované (oxidované) LDL přibližně 10x vyšší afinitu než klasické receptory pro LDL (24). Jelikož pohlcování oxldl cestou scavangerových receptorů nepodléhá zpětnovazebné regulaci jako internalizace normálními LDL receptory, dochází k intracelulární akumulaci esterů cholesterolu a vzniku tzv. pěnových buněk (viz. obr. 3), jejich nahromaděním pak vznikají tukové proužky (48). Obr. 3 Vznik pěnových buněk (foam cells) a produkce hlavních chemotaktických faktorů (49). Tukové proužky nejsou ještě klinicky významné, to znamená, neprojeví se ischémií, jsou ale nebezpečné v tom, že se během života můžou vyvíjet v další aterosklerotické léze, může však dojít i k jejich regresi. Fibromuskulární plát Makrofágy, které se podílejí na tvorbě lipidních proužků, produkují množství látek, které ovlivňují další formování aterosklerotické léze. Jedním z nejvýznamnějších je chemokin MCP-1 (viz. obr. 3), který zesiluje chemotaxi makrofágů a T-lymfocytů a přispívá tak k jejich akumulaci v aterosklerotické lézi (50), dále jsou to růstové a zánětlivé faktory, které přispívají ke změně kontraktilního fenotypu hladkosvalových buněk na fenotyp syntetický a podporují proliferaci a migraci hladkosvalových buněk (51) nebo faktory 21

22 zvyšující expresi adhezivních molekul VCAM-1 a ICAM-1. Různorodé cytokiny produkují i T-lymfocyty, které jsou v aterosklerotické lézi roztroušeny mezi pěnovými buňkami, tím se rovněž aktivně podílejí na progresi aterosklerotických lézí (52). V tomto případě je pravděpodobně nejvýznamnější INF-γ, který se spolupodílí na tvorbě pěnových buněk. Kromě toho inhibuje proliferaci hladkosvalových buněk a způsobuje tvorbu hydrolytických enzymů (metaloproteináz), které později narušují stabilitu aterosklerotického plátu (viz. níže) (53). Charakteristickou složkou fibromuskulárních plátů jsou hladkosvalové buňky. Ty jsou za normálních okolností součástí médie cév, kde se podílejí na udržování cévního tonu, na syntéze extracelulární matrix a na reparaci cévní stěny při různých poraněních. Růstové a zánětlivé faktory makrofágů a T-lymfocytů způsobí jejich migraci z médie do intimy a jejich transformaci z kontraktilního fenotypu na fenotyp syntetický. Syntetický fenotyp ztrácí schopnost kontrakce a získává schopnost proliferace a produkce cytokinů, růstových faktorů a látek tvořících extracelulární matrix (kolagen, elastin, proteoglykany). Obsahuje rovněž již zmíněné scavangerové receptory a vychytáváním modifikovaných LDL přispívá k tvorbě pěnových buněk. Dále bylo zjištěno, že syntetický typ hladkosvalových buněk je náchylnější k apoptóze. Čím je apoptóza intenzivnější, tím je rychlejší i jejich proliferace. Proto se v místě aterosklerotických lézí nachází zvýšený počet odumřelých hladkosvalových buněk. Příčinou je i skutečnost, že syntetický fenotyp v porovnání s kontraktilním fenotypem obsahuje vyšší aktivitu kaspázy 3, klíčového enzymu v mechanismu apoptózy (18). Kromě buněčné složky se v aterosklerotických lézích nachází i složka vláknitá, která je reprezentována nejvíce kolagenem. Ten je produkován nejen hladkosvalovými buňkami, ale z části také endoteliálními buňkami a fibroblasty. Syntéza kolagenu souvisí jak se změnou fenotypu, migrací a proliferací hladkosvalových buněk, tak s řadou lokálních i systémových činitelů (TGF-β, PDGF, endotelin-1, angiotensin II, IL-1, homocystein i mechanické napětí stimulují tvorbu kolagenu) (54). I v tomto stádiu je ještě možná regrese a regenerace endotelových buněk v případě, že aterogenní faktor přestane působit. Výsledkem je pouze ztluštění intimy, která obsahuje jednu nebo dvě vrstvy myocytů, které se zde normálně nevyskytují. Pokud aterogenní faktor stále působí, proces se rozvíjí do dalších stádií. Ateromový plát Jedná se o pokročilou aterosklerotickou lézi, která vznikla vytvořením lipidového jádra, zformováním fibromuskulární čepičky a ukládáním vápenatých iontů. 22

23 Makrofágy, které dále pohlcují lipoproteinové částice, se nyní akumulují ve střední části plátu. Zvýšeně akumulují volný cholesterol, zatímco v počátečních stadiích pohlcovaly především estery cholesterolu. Zvýšený poměr volný cholesterol/fosfolipidy zřejmě přispívá k odumírání makrofágů díky cytotoxickým účinkům volného cholesterolu (55). Makrofágy, stejně tak jako hladkosvalové buňky, v tomto stádiu podléhají zvýšené nekróze a apoptóze. Po odumření makrofágů dochází k extracelulární akumulaci lipidů, uvolnění hydrolytických enzymů a zánětlivých substancí, které vedou k vzniku nekrotického lipidového jádra. Hladkosvalové buňky i nadále pokračují v syntéze extracelulární matrix, zejména kolagenu, elastinu a proteoglykanů. Postupně tak dochází k vytvoření tzv. fibromuskulární čepičky na povrchu aterosklerotické léze. Bylo zjištěno, že v aterosklerotických lézích se nachází proteiny vážící vápník. Je to například osteopontin, produkovaný hladkosvalovými buňkami pod vlivem růstových faktorů, nebo osteokalcin. Tím dochází v těchto nekrotických oblastech navíc k ukládání vápníku a mineralizaci (56). Pokročilé aterosklerotické léze jsou často příčinou klasických komplikací aterosklerózy, jako je stenóza a vznik trombóz, které pak omezují krevní průtok a vedou k orgánovým poškozením (viz. níže). Z klinického hlediska můžeme aterosklerotické pláty rozdělit na stabilní a nestabilní (viz. obr. 4). Stabilní plát má nízký obsah tuků v jádře a pevnou fibromuskulární čepičku, proto nemá tendenci k ruptuře s vytvořením následné trombózy. Nestabilní plát je bohatý na lipidy, jeho fibromuskulární čepička je tenká a dochází často k jeho prasknutí. Zatímco stabilní pláty, které postupně pouze zužují cévní lumen, způsobují vznik typických námahových stenokardií při angině pectoris, trombóza, která provází nestabilní pláty, je zodpovědná za akutní koronární syndromy, nestabilní anginu pectoris a za vznik infarktu myokardu. Závažnost aterosklerotických plátů tedy nezávisí na jejich velikosti, ale zejména na jejich složení a charakteru. Nestabilní plát představuje typickou komplikovanou lézi (57). 23

24 Obr. 4 Stabilní a nestabilní aterosklerotický plát (58). Komplikované léze Tyto léze vznikají z ateromových plátů masivní kalcifikací a především těžkými degenerativními změnami (ulcerace, ruptura), které se pak stávají místem adherence trombocytů, agregace, trombózy a současné organizace trombu. Makroskopický vzhled komplikované léze odpovídá ateromovému plátu s následnými změnami v důsledku trombózy a přítomnosti erytrocytů (58). Ke vzniku trombu může dojít buď při erozi endotelu nebo při ruptuře plátu (3). Malá eroze vede k odhalení kolagenu a tkáňového faktoru destičkám a vede ke vzniku malých mikrotrombů. Ty obvykle nemají žádný klinický význam. Při větším poškození endotelu dochází ke vzniku tzv. červeného trombu, který je bohatý na obsah destiček, červených krvinek a fibrinu. Tento trombus postupně uzavírá lumen cévy, může dojít i k její úplné okluzi, nebo se trombus může uvolnit a způsobit embolizaci. Navíc se v místě vzniku trombu rozvíjí zánětlivá reakce s akumulací makrofágů a T-lymfocytů (59). Ruptura plátu vzniká následkem jeho zvýšené zranitelnosti (vulnerability). Ta závisí hlavně na velikosti a složení ateromového jádra a pevnosti fibromuskulární čepičky. Zvětšení objemu vnitřního nekrotického jádra plátu přímo koreluje s jeho zranitelností. V jádře se nachází kašovitá směs bohatá na lipidy, která je vysoce trombogenní. Obsahuje 24

25 totiž velkou koncentraci tkáňového faktoru, který je produkován makrofágy, hladkosvalovými i endotelovými buňkami. Fibromuskulární čepička obsahuje hlavně makrofágy, T-lymfocyty, kolagen a proteoglykany. Její ztenčení vzniká především následkem porušení rovnováhy mezi produkcí a degradací kolagenu. Produkce kolagenu závisí hlavně od množství a aktivity hladkosvalových buněk. Makrofágy a T-lymfocyty snižují stabilitu plátu zejména produkcí zánětlivých a proteolytických enzymů, které snižují syntézu a zvyšují degradaci extracelulární matrix (57). Je to například INF-γ, v hojné míře produkován T-lymfocyty, který inhibuje tvorbu kolagenu v hladkosvalových buňkách, aktivuje makrofágy na uvolňování matrixových metaloproteináz (MMPs), které odbourávají složky extracelulární matrix a současně je i inhibitorem proliferace a induktorem apoptózy hladkosvalových buněk, hlavního producenta kolagenu (60). K sníženému počtu hladkosvalových buněk vede i jejich zvýšená apoptóza. Na ruptuře nestabilního plátu se zúčastňuje rovněž myeloperoxidáza uvolňovaná z makrofágů. Její aktivitou vzniká kyselina chlorná (HOCl), která má přímý destrukční účinek a kromě toho inaktivuje přirozené inhibitory matrixových metaloproteináz. Všechny tyto mechanismy přispívají ke snížení mechanických vlastností aterosklerotického plátu a jeho zvýšené náchylnosti k ruptuře. 2.5 Zvířecí modely používané ke studiu aterosklerózy Pro studium patogeneze a potenciální léčby aterosklerotických lézí bylo použito množství živočišních druhů. První důkaz ve studiu experimentální aterosklerózy byl uveřejněn již v roce 1908, kdy Ignatowski (61) zjistil, že při podávání diety bohaté na živočišní proteiny (maso, mléko, vejce) králíkovi dochází k ztluštění jeho cévní intimy, způsobené velkými buňkami v aortě. V průběhu času byli použiti například primáti, prasata a králíci. Příležitostně byly použiti křečci a holuby, později se však ukázalo, že tyto modely nejsou vhodné. Potkani a psy rovněž nejsou vhodnými modely, protože k tvorbě lézí, které v jejich cévách nevznikají spontánně, vyžadují větší nároky na dietu. Na druhou stranu, u králíků se ateroskleróza rovněž nerozvíjí spontánně bez speciální diety, ale po cholestorolové manipulaci vznikají léze v poměrně krátkém čase (62). Jejich léze jsou mnohem více bohaté na tuky a makrofágy než léze v lidských cévách a hodnoty plazmatického cholesterolu jsou výjimečně vysoké (na rozdíl od člověka). Mnohem vhodnější modely, které tvoří léze podobné lidským, jsou prasata a opice. V současné době se však opice pro výzkum využívají zřídka kvůli riziku vyhubení a rovněž kvůli vysoké ceně. Po aplikaci cholesterolové diety u prasete jsou hladiny cholesterolu a vzniklé léze velice podobné jako u lidí, jejich využití je ale limitováno vysokými náklady a potížemi 25

26 s jejich manipulací a udržováním prasečích kolonií. To, co dlouhou dobu chybělo, byl malý, geneticky reprodukovatelný myší model. Až do roku 1992 byla převážná většina výzkumu v oblasti aterosklerózy prováděna na modelu králíka, v menším míře pak na modelech prasete a primátů. Během výzkumů se získaly neocenitelné poznatky. Na prasečím modelu bylo odhaleno, že jedním z primárních dějů v procesu aterosklerózy je infiltrace monocyty (63). Studie na modelech opice a králíka vedly k objasnění buněčných procesů v procesu vzniku a rozvoje aterosklerotických lézí. Dnes se ve studiích aterosklerózy in vivo hojně využívají myší modely Myší model aterosklerózy Myší model pomohl z důvodu jeho velikosti překonat množství problémů a nedostatků spojených s používáním větších zvířat a rovněž zdolat potíže s genetickou reprodukovatelností. Je vhodný rovněž z důvodu potřeby relativně velkého počtu experimentálních jedinců ve studiích zaměřených na léčbu. Myši jsou vysoce rezistentní vůči vzniku aterosklerózy s výjimkou myšího plemena C57BL/6. Aplikace diety bohaté na cholesterol s obsahem kyseliny cholové, vede u tohoto typu myší k tvorbě aterosklerotických lézí, které se od lidských odlišují v histologické povaze i umístění. Navíc jsou pravděpodobně způsobené chronickým zánětem než-li genetickou predispozicí. První použitá dieta vedoucí k rozvoji aterosklerózy u myši C57BL/6 obsahovala 30 % tuků, 5 % cholesterolu a 2 % žlučových kyselin. Bohužel se ukázala jako poměrně drastická, myš ubývala na váze a často onemocněla smrtelnými respiračními infekcemi. Další dietou byla tzv. Paigenova dieta, která obsahovala 15 % tuků, 1,25 % cholesterolu a 0,5 % kyseliny cholové (64). I když se tato dieta často používala, i zde bylo mnoho nevýhod. Myši byly krmené v časovém období od 14 týdnů do 9 měsíců. Aterosklerotické léze, které se u nich posléze vyvinuly, byly poměrně malé ( μm 2 ), byly omezeny převážně na aortální oblouk a nacházeli se ve stádiu pěnových buněk s malým zastoupením hladkosvalových buněk. Na rozdíl od lidských lézí, zůstávaly v tomto případě léze ve stadiu tukových proužků a nedocházelo k jejich další progresi. Tato dieta rovněž není fyziologická s ohledem na extrémně vysoký podíl cholesterolu a přítomnost kyseliny cholové. Navíc bylo zjištěno, že tato dieta je sama o sobě prozánětlivá, jelikož vede k indukci jaterního NF-κB a expresi mediátorů akutní fáze zánětu, jako například sérového amyloidu A (65). 26

27 Po mnoho let se myší modely nepoužívaly při studiu aterosklerózy z důvodu domněnek, že myš není schopna přežívat na vysoce aterogenní tukové dietě, léze nejsou reprodukovatelné, většina myší není schopna tvorby lézí a nebo že jejich patologie není podobná lidským. Nakonec se problém přežívání vyřešil použitím diety s nižším obsahem tuků, problém reprodukovatelnosti byl vyřešen využitím imbredních linií namísto náhodně vybíraných, ke snadné tvorbě aterosklerotických lézí došlo použitím tzv. rodově zatížených myších kmenů a tvorbu fibromuskulární čepičky umožnilo prodloužení experimentálního času (61). Myší modely splňují řadu důležitých kritérií, podstatné je ale uvědomit si hlavní rozdíly mezi myším a lidským organismem. Průměrná délka lidského života je okolo 75 let, zatímco u myši jsou to pouze 2 roky. Myší váha je samozřejmě mnohem menší, v dospělosti kolem 30 gramů. Další rozdíl je v lipidovém spektru, které je velice odlišné od lidského. U člověka je většina plasmatického cholesterolu (až 75 %) obsažena v LDL, zatímco u myši je to HDL, který, jak je známo, představuje v lidském organismu ochranný faktor před vznikem aterosklerózy. Z tohoto důvodu myš krmená normální nízkotučnou dietou nezíská aterosklerózu, zatímco u lidí je to úplně běžná nemoc. Velkou výhodou myších modelů, stejně tak jako všech ostatních zvířecích modelů, je možnost měnit vnější podmínky a dietu. U člověka, pochopitelně, to vzhledem k délce jeho života není možné. V myších studiích jsou navíc možné různé genetické experimenty, zahrnující křížení a genetické inženýrství. Vyžití myších modelů ve studiu aterosklerózy přináší řadu výhod. Snadné a hospodárné je zejména jejich získávání a udržování druhu. Jejich reprodukční období je krátké (přibližně 9 týdnů - 3 týdny trvá období březosti a přibližně 6 týdnů dozrání do pohlavní dospělosti), proto je snadné odchovat velké skupiny pro experimentální studie. Klasická genetika je v myším organismu obzvlášť stabilní a tento fakt je ještě podpořen možností získat stovky inbredních linií. V roce 2002 zveřejnila Společnost pro sekvenování myšího genomu (The Mouse Genome Sequencing Consortium) vysoce kvalitní sekvenci a analýzu genomu myšího kmenu C57BL/6J (66). S nástupem molekulární genetiky je nyní možné začlenit do myšího genomu vnější geny, což je samozřejmě možné i u mnoha jiných živočišních druhů. Navíc, speciálně u myší, je rovněž možné vyřadit z funkce (knokautovat) nebo přemístit vnitřní geny, což je jedna z hlavních výhod práce s myšími modely. Naopak hlavní nevýhodou myších modelů je jejich malá velikost, způsobující potíže při výkonu chirurgických manipulací a zobrazování in vivo. 27

28 V nedávné době byly vytvořeny genetickou manipulací tzv. dvojnásobně knokautované myši (apoe/ldlr-dko) (67). Tyto myši reprezentují nový model, který je schopen rozvinout závažný stupeň hyperlipidémie a aterosklerózy. Bylo zjištěno, že u myší apoe/ldlr-dko dokonce i běžná strava vede k výraznější progresi aterosklerózy než u myší, které mají poruchu jen v apoe (68). Z toho důvodu je myší model apoe/ldlr-dko vhodný pro studium antiaterosklerotického efektu jednotlivých látek bez nutnosti krmit zvířata aterogenní dietou. 2.6 Statiny v léčbě hypercholesterolémie Statiny (nebo-li kompetitivní inhibitory 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-koenzym A-reduktázy) patří v současné době mezi nejúčinnější a celosvětově nejpoužívanější hypolipidemika s příznivými účinky na hladiny sérových lipidů i celkovou a kardiovaskulární mortalitu. Snižují především hladiny celkového cholesterolu a LDL cholesterolu. Existuje rozsáhlá dokumentace jejich pozitivních účinků v prevenci závažných komplikací aterosklerózy i u osob s relativně nízkými hladinami sérového cholesterolu. Cílovým orgánem zásahu statinů jsou játra (2) Mechanizmus účinku statinů a jejich lipidové účinky Limitující reakcí endogenní biosyntézy cholesterolu je převedení aktivované kyseliny 3-hydroxy-3-methylglutarové (HMG-CoA) na kyselinu mevalonovou (viz. obr. 5). Tuto reakci katalyzuje HMG-CoA-reduktáza lokalizovaná v hladkém endoplazmatickém retikulu jaterních buněk, dá se však prokázat i v jiných tkáních. Statiny obsahují ve své molekule skupiny strukturálně podobné substrátu, proto mohou tento enzym kompetitivně inhibovat. Jeho inhibicí dochází ke snížení nitrobuněčné syntézy cholesterolu a buňka se dostává do situace deficitu cholesterolu. Ten pak vede ke zvýšené transkripci LDL receptorového genu a zvýšené expresi LDL receptorů na buněčné membráně všech buněk, především však hepatocytů. Zvýšená syntéza a zvýšení aktivity LDL receptorů vedou k urychlenému vychytávání LDL partikulí z plazmy (69). Snížení LDL cholesterolu může dosáhnout až 40 %. Navíc dochází obvykle k mírnému zvýšení HDL (až o 15 %) a snížení koncentrace triglyceridů až o 25 %. Tento mechanizmus není zcela znám. Postuluje se především snížení syntézy VLDL v játrech. Dalším možným mechanizmem je zvýšení clearance a odbourávání VLDL cestou LDL receptorů. To je umožněno přítomností apolipoproteinu E na částicích VLDL, který je schopen navázat se na LDL receptor. Nepřímo jsou tak ovlivněny i hladiny HDL. Teprve nedávno bylo prokázáno, že statiny sou schopny snižovat i koncentraci malých denzních LDL částic (70). 28

29 Obr. 5 Schéma biosyntézy cholesterolu (71) Pleiotropní (nelipidové) účinky statinů Kromě příznivého účinku na hladiny krevních lipidů mají statiny další, na lipidech zcela nezávislé vlastnosti, které se podílejí na snižování kardiovaskulárního rizika. Jsou označovány jako tzv. pleiotropní účinky (72). Další efekty jsou částečně na lipidech nezávislé, zčásti je lze dávat do souvislosti i se změnami koncentrace lipidů, především s poklesem hladiny cholesterolu. Odlišení lipidových a nelipidových (pleiotropních) účinků je proto někdy obtížné, jelikož oba efekty se vzájemně doplňují a v mechanizmu působení statinů jde často o jejich souhru (73). Pleiotropní účinky vyplívají z inhibice HMG-CoA-reduktázy, kdy dochází také ke snížení hladin izoprenoidů, meziproduktů v syntéze cholesterolu (viz. obr. 5). Tyto látky mají rozmanité funkce podílejí se na regulaci buněčného růstu, expresi NO-syntázy, migraci hladkosvalových buněk, ovlivnění trombogenní aktivity a mnoha dalších dějích. Mezi nejdůležitější nelipidové účinky statinů 29

30 patří modulace endoteliální funkce, antioxidační, antiinflamatorní, antiproliferační a antitrombogenní účinky (74). Zlepšení endoteliální dysfunkce Statiny zlepšují endoteliální dysfunkci zčásti snižováním LDL cholesterolu, specifičtěji však působí jejich schopnost bránit downregulaci endoteliální NO syntázy (enos), enzymu, který katalyzuje vznik NO z L-argininu. Dále stimulují i aktivitu tohoto enzymu, čímž zvyšují dostupnost NO. Předpokládá se, že statiny takto kompenzují nedostatečnou tvorbu NO v aterosklerotických lézích a působí tak proti progresi aterosklerózy (72). Tlumí i uvolňování a aktivitu vazokonstrikčních látek (například endotelinu a angiotenzinu II) (75). Antioxidační efekt Uvažuje se minimálně o 4 mechanizmech antioxidačního působení: 1) jelikož dochází ke snížení koncentrace LDL cholesterolu, vzniká tím pádem i méně oxldl, 2) inhibicí NADH oxidáz dochází ke snížení tvorby vaskulárních a endoteliálních superoxidů; vzniku oxldl brání i udržování aktivity vnitřních antioxidačních systémů (například superoxid dismutázy), 3) přímou vazbou statinů na fosfolipidy lipoproteinové částice dochází k ochraně lipidového jádra před volnými radikály, 4) silná antioxidační aktivita statinových metabolitů (např. u atorvastatinu a fluvastatinu) rovněž přispívá k ochraně před oxidačními procesy (76). Protizánětlivé účinky Bylo prokázáno, že statiny snižují hladinu zánětlivého markeru CRP, jehož hladina je zvýšená i v rozvoji aterosklerózy. Významné je i snižování exprese mnoha adhezivních a chemotaktických molekul a inhibice aktivity integrinu (77). Statiny a trombóza Antitrombotické působení statinů spočívá v příznivém ovlivnění agregace destiček, krevní viskozity, hladin tkáňového faktoru a jeho přirozeného inhibitoru, fibrinogenu, tkáňového aktivátoru plazminogenu (tpa) a jeho přirozeného inhibitoru (PAI-1) a rovněž lipoproteinu(a). Dochází k inhibici buněčné exprese tkáňového faktoru v makrofázích (56), k normalizaci tvorby trombinu u pacientů s hyprecholesterolémií a ke snížení agregace destiček. Snížení agregace destiček má pravděpodobně vztah k redukci obsahu cholesterolu v jejich buněčných membránách (71). 30

31 Stabilizace aterosklerotického plátu Statiny přispívají ke stabilizaci aterosklerotického plátu více mechanismy. Je to například snížení oxidovaného LDL cholesterolu a jeho vychytávání makrofágy, které vede ke zmenšení fibromuskulární čepičky, inhibice matrixových metaloproteináz (MMPs), které se podílí na destabilizaci aterosklerotických plátů, snížení obsahu lipidového jádra a počtu makrofágů nebo zvýšení obsahu kolagenu v plátech (78). Efekt na hladkosvalové buňky Pomocí statinů dochází též k inhibici proliferace a migrace hladkosvalových buněk v cévní stěně. Zatímco většina autorů považuje inhibici proliferace myocytů za pozitivní efekt léčby, který působí protiaterogenně, objevují se i opačné názory, které považují proliferaci myocytů za významný faktor při stabilizaci plátů (72). Další příznivé účinky statinů Výzkumy potvrdily, že statiny inhibují růst nádorových buněk. Bylo zjištěno, že většina nádorových buněk vykazuje zvýšenou aktivitu HMG-CoA reduktázy, proto se předpokládá, že selektivní inhibice tohoto enzymu by mohla vést k novým možnostem léčby rakoviny. Statiny se uplatňují i v kostním metabolismu. Dochází ke snížení aktivity osteoklastů a snížení kostní resorpce, naopak se zvyšuje novotvorba kostní hmoty. Pravděpodobně proto je podávání statinů spojené se sníženým rizikem vzniku kostních zlomenin u pacientů starších 50 let. Použití statinů v jiných než hypolipidemických indikacích však zatím brání nedostatek randomizovaných klinických studií, takže obecně platí názor, že extralipidové účinky statinů efektivně doplňují jejich přímý účinek na hladinu lipidů (79). I když je působení pleiotropních účinků jistě významné, je třeba zdůraznit, že jejich role je ve srovnání s hypolipidemickým efektem pravděpodobně méně důležitá. Za převážnou většinu pozitivních kardiovaskulárních účinků statinů stojí jejich vliv na LDL-cholesterol. 31

32 Obr. 6 Mechanismus antiaterosklerotického působení statinů (73) Atorvastatin Atorvastatin patří v současné době k nejvíce užívaným statinům. Je podáván ve formě aktivní látky. Po perorálním podání se snadno a rychle vstřebává, maximálních plazmatických koncentrací je dosaženo přibližně za 2,5 hodiny. Z důvodu vysokého firstpass metabolismu v játrech je biologická dostupnost atorvastatinu pouze 12 %. Přibližně z 98 % se váže na plasmatické bílkoviny. Je metabolizován cytochromem P450 3A4 na biologicky aktivní metabolity, které přispívají k inhibici HMG-CoA reduktázy asi ze 70 %. Po hepatální a extrahepatální metabolizaci jsou atorvastatin a jeho metabolity primárně eliminovány žlučí, přičemž nedochází k enterohepatální cirkulaci. Jeho eliminační poločas je v průměru 14 hodin, ale díky prítomnosti aktivních metabolitů přetrvává inhibiční účinek na HMG-CoA reduktázu asi 24 hodin (80). Studie prokázaly, že u pacientů s hypercholesterolémií snižuje atorvastatin hladinu LDL cholesterolu, celkového cholesterolu a především triglyceridů efektivněji než ostatní statiny. Již při obvyklých dávkách dochází k poklesu koncentrace triglyceridů okolo 20 %. Maximální snížení LDL cholesterolu může dosáhnout až 90 %. Naopak zvýšení hladiny HDL není tak významné (5 15 %). Pozitivním jevem je změna velikosti LDL částic od malých denzních aterogenních částic k částicím větším (81). Nežádoucí účinky atorvastatinu jsou mírné a mají přechodný charakter, lék je obecně dobře snášen. Nejčastěji se vyskytují zažívací potíže, dále bolesti hlavy a svalů, kopřivka 32

33 nebo ospalost. Stejně tak jako u jiných statinů, i po podání atorvastatinu bylo popsáno zvýšení hladin jaterních transamináz. Výskyt závažné rabdomyolýzy spojované s léčbou statinů, která může vést až k ledvinnému selhání, však zatím u atorvastatinu nebyl prokázán. I když studie na zvířatech nepotvrdily teratogenní účinky atorvastatinu, všechny statiny jsou kontraindikovány v těhotenství a u kojících matek (82). 33

34 3. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo ověřit, zda atorvastatin vykazuje u apoe/ldl-receptor deficientních myší podobné účinky jako je tomu v humánní medicíně. K tomu byly sledovány parametry lipidového spektra v krvi, exprese zánětlivých markerů v aterosklerotických plátech a velikost aterosklerotických lézí. K hodnocení morfologických nálezů byly použity imunohistochemické, vybrané histologické a stereologické metody. 34

35 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Samice kmene C57BL/6J s dvojitým deficitem apolipoproteinu E a LDL-receptoru, vážící gramů, byly zakoupeny v Taconic Europe (Dánsko) a ustájeny ve zvěřinci Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. 4.1 Zvířata a předepsaná dieta U všech myší byl zahájen výkrm experimentálními dietami ve věku 8 týdnů. Zvířata byla náhodně rozdělena do 2 skupin, kontrolní, které byla podávána pouze aterogenní dieta, a atorvastatinové, které byla podávána aterogenní dieta obohacena o 100 mg atorvastatinu na 1kg váhy denně. Aterogenní dieta (Western type diet) obsahovala 21 % tuku (11 % nasycených mastných kyselin) a 0,15 % cholesterolu. Obě skupiny byly krmeny experimentálními dietami po dobu 8 týdnů. Každá z myší byla chována v samostatné kleci. Dostávaly denně 6g potravy (ve speciálně upravených granulích) a měly volný přístup k vodě po celou dobu studie. Během experimentu nebyly nalezeny změny tělesné hmotnosti v souvislosti se spotřebou potravy. Na konci experimentu byla zvířata přes noc vylačněna a bylo provedeno usmrcení předávkováním v parách éteru. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Tyto segmenty se ponořily do OCT media (Leica, Praha, Česká republika), následně byly zmraženy v tekutém dusíku a uskladněny při - 80 C. 4.2 Biochemická analýza Biochemická analýza vzorků krve byla provedena na gerontologické a metabolické klinice Fakultní nemocnice v Hradci Králové. Celkové koncentrace cholesterolu byly hodnoceny enzymaticky na základě konvenčních diagnostických metod (Lachema, Brno, Česká republika) a spektrofotometrické analýzy (cholesterol při 510 nm, triglyceridy při 540 nm vlnové délky) (ULTROSPECT III, Pharmacia LKB biotechnologie, Uppsala, Švédsko). 35

36 4.3 Histologické barvení olejovou červení Barvení olejovou červení se používá k detekci lipidů ve tkáních. Zde byla tato metodika použita pro stanovení množství lipidů v aterosklerotických lézích. Postup barvení olejovou červení: Barvení Oil Red O: 1) Oil Red O 15 minut 2) pramenitá voda oplach 3) Gill hematoxylin asi 5 sekund 4) pramenitá voda modrání 1 minuta 5) montování krycího skla do vodného media (glycerol) Zásobní roztok Oil Red O se připraví rozpuštěním 0,5 g Oil Red O ve 100 ml isopropanolu. Pracovní roztok se připravuje v čas potřeby ze 60 ml zásobního roztoku smíchaného se 40 ml destilované vody a filtruje se přes papírový filtr. 4.4 Imunohistochemie Imunohistochemická a stereologická analýza byla provedena v 1 cm aortálního sinu a části aortálního oblouku. Pro hodnocení byly nakrájeny série příčných řezů o tloušťce 7 µm na zmrazovacím mikrotomu. Řezy byly přeneseny na sklíčka, která byla předem upravena v roztoku želatiny. Řezy se nechaly oschnout (60 minut) a pak se na 15 minut vložily do roztoku acetonu uchovávaného v 20 C. Poté se řezy nechaly usušit (15 minut) a znovu se vložily na 15 minut do acetonu. Tímto procesem došlo k fixaci řezů a jejich lepší adhezi na podložní sklíčko. Poté se řezy po patnáctiminutovém usušení vložily na 10 minut do destilované vody, následně se vložily do roztoku PBS (2x5 minut). Před inkubací řezů s primární protilátkou bylo nutné ještě zablokovat nespecifická vazebná místa, proto se řezy na 30 minut ponořily do roztoku 10% goat séra v PBS (Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Německo). V další fázi byly na sklíčka napipetovány roztoky anti-avidinu a anti-biotinu, které byly použity k zablokování reaktivity těchto látek v myší tkáni. Sklíčka se pak 1 hodinu inkubovala s primární protilátkou při pokojové teplotě. Poté se řezy vložily do roztoku PBS (2x5minut), dále do roztoku 3% H 2 O 2 (15 minut). Po oplachu v PBS (2x5minut) se řezy inkubovaly se sekundární protilátkou (30 minut) goat anti-rat IgG (Vector Laboratories), které byly značeny biotinem a opět se řezy vložily do roztoku PBS (2x5 minut). Dále byl na sklíčka nanesen avidin-biotinový komplex obsahující peroxidázový substrát (Vector Laboratories). K vizualizaci navázaných protilátek se použil 36

37 diaminobenzidin (DAB substrát-chromogen roztok, DAKO, Carpinteria, USA). Na závěr byly řezy opláchnuty ve vodě a poté odvodněny v acetonu, aceton xylenu (10:1) asi 3 minuty, aceton xylenu (1:10) také 3 minuty, 3x v xylenu (po 2 minutách). Na závěr byla sklíčka zamontována do eukittu. Byla použita následující primární protilátka: monoklonální protilátka Rat Anti-Mouse CD106 (VCAM-1) zředění 1/100 (Pharmingen, USA). Pracovní postup nechat uschnout řezy 60 minut fixace aceton (uschovaný v -20 C) 15 minut usušit 15 minut PBS 10 minut 10% zvířecí sérum v PBS (900 μl PBS μl séra) 30 minut inkubace s avidinem D 15 minut oplach v PBS 5 minut inkubace s biotinem 15 minut PBS oplach primární protilátka (ředí se v BSA) 60 minut PBS 1 2x5 minut 10% zvířecí sérum v PBS (900 μl PBS μl séra) 15 minut sekundární protilátka (+ mouse sérum v PBS) 30 minut PBS 3 5 minut 3% H 2 O 2 (8 ml H 2 O ml H 2 O) 15 minut PBS 4 2x5 minut ABC komplex elite 30 minut PBS 5 5 minut DAB (podle návodu) nutno určit čas destilovaná voda oplach aceton oplach aceton xylen (10:1) 3 minuty aceton xylen (1:10) 3 minuty 3x xylen 2 minuty eukitt montování krycího sklíčka 37

38 4.5 Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí Plocha velikosti barvení olejovou červení a endoteliální exprese VCAM-1 byla kvantifikována pomocí stereologických metod (83). Nejprve se nakrájela série řezů o tloušťce 7µm (0,385 mm dlouhé úseky cévy tvořící tzv. referenční objem). Byl proveden systematický náhodný výběr řezů z referenčního objemu. První řez pro každé barvení byl vybrán náhodně, a pak se vybral každý pátý řez, takže pět řezů pro každé barvení bylo použito ke stereologickému odhadu. Byla použita metoda bodové testovací mřížky, která se zvolila tak, abychom napočítali více než 100 průsečíků mezi body sítě a pozitivitou olejové červeně, respektive VCAM-1 barvením v intimě cévy na jednu cévu (84). Odhadovaná plocha aterosklerotické léze se vypočetla podle vzorce: esta = a P, kde parametr a charakterizuje plochu příslušející jednomu testovacímu bodu a P je počet průsečíků mezi body testovací sítě a pozitivitou barvení. Fotodokumentace a digitalizace z mikroskopu byla provedena mikroskopem Nikon Eclipse E2000, digitální kamerou Pixelink PL-A642 (Vitana Corp., USA) a za pomoci softwaru LUCIA verze 5.0 (Laboratory Imaging Prague, Česká republika). Stereologická analýza byla hodnocena softwarem PointGrid ELLIPSE (ViDiTo, Slovensko). 4.6 Statistická analýza Statistická analýza byla provedena za využití statistického softwaru SigmaStat 2.0 (Jandel Corporation). Ke vzájemnému porovnání parametrů u jednotlivých skupin zvířat byl použit neparametrický T test. Rozdíly mezi skupinami byly statisticky významné v případě, že p α, kde α = 0,05. 38

39 5. VÝSLEDKY 5.1 Biochemická analýza U všech myší v experimentu byly stanoveny hladiny celkového cholesterolu, VLDL cholesterolu, LDL cholesterolu, HDL cholesterolu a triacylglycerolů (TAG). Výsledky prokázaly, že osmitýdenní podávání atorvastatinu v dávce 100 mg/kg statisticky významně snížilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL, LDL a TAG (viz. obr.7-9;11). Navíc bylo zjištěno, že atorvastatin také zvýšil hladiny HDL cholesterolu (viz. obr.10). Obr. 7 Hladiny celkového cholesterolu u experimentálních myší. Osmitýdenní podávání atorvastatinu statisticky významně snížilo hladiny celkového cholesterolu ve srovnání s kontrolní skupinou. ( xxx P 0,001). Celkový cholesterol kontrolní skupina atorvastatinová skupina 39

40 Obr. 8 Hladiny VLDL cholesterolu u experimentálních myší. Osmitýdenní podávání atorvastatinu statisticky významně snížilo hladiny VLDL cholesterolu ve srovnání s kontrolní skupinou. ( xxx P 0,001). VLDL kontrolní skupina atorvastatinová skupina Obr. 9 Hladiny LDL cholesterolu u experimentálních myší. Osmitýdenní podávání atorvastatinu statisticky významně snížilo hladiny LDL cholesterolu ve srovnání s kontrolní skupinou. ( xxx P 0,001). 40

41 Obr. 10 Hladiny HDL cholesterolu u experimentálních myší. Osmitýdenní podávání atorvastatinu statisticky významně zvýšilo hladiny HDL cholesterolu ve srovnání s kontrolní skupinou. ( xx P 0,05). HDL kontrolní skupina atorvastatinová skupina Obr. 11 Hladiny triacylglycerolů u experimentálních myší. Osmitýdenní podávání atorvastatinu statisticky významně snížilo hladiny triacylglycerolů ve srovnání s kontrolní skupinou. ( xxx P 0,001). 41

42 5.2 Histologické barvení olejovou červení U všech řezů v kontrolní i atorvastatinové skupině byla pozorována přítomnost aterosklerotických lézí. Léze byly největší v oblasti aortálního sinu, ale pokračovaly také v oblasti aortálního oblouku. Podávání atorvastatinu vedlo k mírnému snížení akumulace lipidů v aterosklerotických lézích. Obr. 12 Barvení olejovou červení u kontrolní skupiny zvířat, kterým byla podávána 8 týdnů aterogenní dieta. Šipky ukazují na akumulaci lipidů v aterosklerotických lézích. Uprostřed cévy jsou vidět zbytky semilunárních chlopní (hvězdička). Zvětšení preparátu 40x. 42

43 Obr. 13 Barvení olejovou červení u atorvastatinové skupiny zvířat, kterým byla podávána 8 týdnů aterogenní dieta společně se 100 mg/kg atorvastatinu. Šipky ukazují na akumulaci lipidů v aterosklerotických lézích. Uprostřed cévy jsou vidět zbytky semilunárních chlopní. Intenzita a plocha barvení olejovou červení se zdá být menší, než tomu bylo u kontrolní skupiny. Zvětšení preparátu 40x. 5.3 Imunohistochemické barvení VCAM-1 v oblasti aortálního sinu Exprese VCAM-1 byla pozorována v kontrolní i atorvastatinové skupině. Silná intenzita byla pozorována v medii cév pod aterosklerotickými pláty. Dále byla pozorována exprese v aterosklerotických plátech a to zejména u kontrolní skupiny. Silná exprese byla pozorována také na cévním endotelu v oblasti plátu i mimo něj. Barvení v obou skupinách bylo velmi podobné z hlediska lokalizace, nicméně v atorvastatinové byla exprese v aterosklerotických plátech menší ve srovnání s kontrolní skupinou. 43

44 Obr. 14 Imunohistochemické barvení VCAM-1 u kontrolní skupiny zvířat (A). Silná exprese je pozorována v medii cévy pod aterosklerotický plátem, v plátu a na cévním endotelu. Podávání atorvastatinu vedlo ke snížení intenzity barvení VCAM-1 (B) zejména uvnitř plátu ve srovnání s kontrolní skupinou a to bez zmenšování velikosti aterosklerotických lézí. Zvětšení 200x. A B 44