Jana Fauknerová Matějčková

Transkript

1 Jana Fauknerová Matějčková

2 analytická metoda separace nabitých molekul (např. proteiny) vlivem elektrického pole elektroforetická pohyblivost (elektromigrace) závisí na: náboji velikosti tvaru molekuly vloženém napětí

3 anion negativně nabitý ion, pohybuje se k anodě (+) kation kladně nabitý ion, pohybuje se ke katodě (-) amfolyt může mít kladný i záporný nebo nulový náboj v závislosti na podmínkách (ph) využití elfo proteiny, izoenzymy, nukleové kyseliny, imunoglobuliny

4 volná elektroforéza separace probíhá pouze v kapalné fázi (pufru) bez účasti nosného média kapilární elektroforéza elektroforéza na nosičích papír, gel (agaróza, polyakrylamid, acetátcelulóza) horizontální nebo vertikální uspořádání

5 pohyb nabitých molekul v elektrickém poli elektroosmotický tok (electroosmotic flow, EOF) - spontánní tok kapaliny v kapiláře v důsledku náboje (obvykle záporného) na vnitřní stěně kapiláry zdroj vysokého napětí kapilára detektor

6 horizontální uspořádání gel polyakrylamid síť monomerů akrylamidu (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) spojených kovalentními příčnými vazbami pomocí N,N methylylenbisakrylamidu (CH 2 =CH- CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH=CH 2 ), vytváří dlouhé řetězce agaróza síť tvořená dlouhými cukernými polymery vázanými nekovalentními vodíkovými můstky a hydrofobními vazbami zdroj napětí elektrolyt

7 nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza bez denaturačních činidel proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru podle velikosti pórů v gelu SDS gelová elektroforéza proteiny denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a b-merkaptoethanolem (zruší disulfidické vazby) pohyblivost závisí na molekulové hmotnosti polypeptidových řetězců vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů

8 napětí migrační rychlost je přímo úměrná napětí čas rozlišení (vzájemné oddělení proužků) roste lineárně s časem, ale rozmytí proužků (difuze) roste se čtvercem času nosné médium velikost pórů nosiče a endoosmóza ovlivňují migrační rychlost (výběr typu nosiče)

9 aplikace vzorku nastavení vhodného napětí nebo proudu! STEJNOSMĚRNÝ PROUD gelová elektroforéza: kolem V, kapilární elektroforéza: kolem V nastavení doby separace - řádově minuty gelová elfo proteinů séra trvá asi 30 min. při elfo na nosičích následuje po separaci fixace a barvení vyhodnocení kvalitativní - srovnání se standardy kvantitativní - na nosičích: densitometricky

10 rozdělení proteinů do frakcí - za fyziologických podmínek konstantní (poloha, intenzita) zastoupení proteinů v plazmě se při různých onemocněních mění (vzájemný poměr) specifický vzhled elektroferogramu (rozložení frakcí nebo píků)

11 a2-makroglobulin haptoglobin imunoglobuliny IgG, IgA, IgM a1 antitrypsin orozomukoid transferin C3-komponent

12 hypergama globulinémie normální nález

13 A. fyziologický nález B. akutní onemocnění C. výskyt paraproteinu D. frakce fibrinogenu při analýze plazmy

14 60% 3% 9% 12% 16%

15 tvoří 8% hmotnosti lidského těla složení krve buňky (erytrocyty, leukocyty) buněčné fragmenty krevní plazma 45% celk. objemu krve hematokrit podíl objemu krve erytrocyty normální hematokrit u muže je 45%, u ženy 42%

16 transport kyslíku homeostáza vodní rovnováhy, tělesné teploty srážení výživa vylučování (do ledvin) acidobazická rovnováha transport hormonů, metabolitů antioxidační ochrana

17 vodný roztok 90% elektrolyty Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl -, HCO 3-, HPO 4 - živiny metabolity Glc, laktát, pyruvát, urea, kreatin, amoniak, TAG, cholesterol proteiny albuminy a globuliny vitamíny stopové prvky hormony inzulín, glukagon, kortikoidy, atd. objem plazmy 2,5 3 litry

18 koncentrace g/l 300 různých proteinů v plazmě většinou jde o glykoproteiny (mimo albuminu) enzymy klasifikace zvlášť rozděleny do 5 tříd dle chování během elfo albuminy a1 - globuliny a2 - globuliny b globuliny g - globuliny

19 vznik většinou syntetizovány v játrech g-globuliny v plazmatických buňkách mnoho vykazuje polymorfismus (žádný není vzácný) charakteristický poločas trávení v oběhu některé proteiny vzrůstají během akutního zánětlivého stavu proteiny akutní fáze CRP, a1-antitrypsin, hatoglobin, a1 kyselý glykoprotein, fibrinogen

20 hladina se mění během akutního zánětu nebo nekrózy tkáně stimuly vedoucí ke změnám konc. reaktantů akutní fáze infekce chirurgický zákrok poranění nádory

21 H CH COO amfolyty NH 3 - COOH - COO - + H + - NH 2 + H + - NH 3 + při fyziologickém ph převaha záporného náboje - anionty

22

23 prealbumin fibrinogen

24 podle specifické funkce transportní proteiny proteiny imunitní odpovědi proteiny aktivní při hemokoagulaci signální proteiny enzymy buněčné proteiny podle klinického využití kardiomarkery tumormarkery reaktanty akutní fáze buněčné enzymy hormony cytokiny

25 bílkovina Prealbumin (Transthyretin) Albumin konc. g/l 0,2 0,4 poločas dní funkce vazba hormonů štítné žlázy a retinol vázajícího proteinu (thyreoidální horm.) nejvýznamnější transportní protein udržení koloidněosmotického tlaku proteinová rezerva organismu malnutrice katabolismus hepatopatie ztráty bílkovin

26 rozpustný ve vodě syntetizován v játrech koncentrace 45 g/l snížen při jaterních onemocnění polypeptidová řetězec 585 amk, 17 disulfidických vazeb funkce transport FA, bilirubinu, některých steroidních hormonů, vitaminů, léčiv udržování onkotického tlaku krve pufrační schopnosti

27 bílkovina α 1 -lipoprotein α 1 -antitrypsin (α 1 -inhibitor proteáz) α 1 -kyselý glykoprotein (orosomukoid) α 1 -fetoprotein konc. g/l 1,0 1,6 (Apo A-I) poločas 0,9 2,0 4 0,5 1,2 5 < 7,5 μg/l 3,5 funkce lipoprotein o vysoké hustotě (HDL) atherosklerózy transport cholesterolu do jater inhibitor lyzosomálních proteáz (hlavně elastázy z polymorfonukleárních leukocytů) vrozená deficience může být příčinou onemocnění plic (emfyzém) a jater (cirhóza) vazba lipofilních látek (např. progesteronu a některých léků) podílí se na regulaci imunitní odpovědi fyziologicky produkován fetálními játry a žloutkovým váčkem hlavní protein fetálního séra fyziologicky přítomen v séru těhotných žen akutní zánět zánět hepatom některé malignity GIT těhotenství

28 rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny antitrypsin a antichymotrypsin protrombin koagulační faktor transkortin transport kortizolu kyselý glykoprotein TBG (thyroxin-binding-protein) transport thyroxinu T4

29 syntetizován v hepatocytech a makrofázích tvoří 90 % a1 frakce glykoprotein, vysoce polymorfní funkce hlavní plazmatický inhibitor serinových proteas (trypsinu, elastasy...) deficience - proteolytické poškození plic (emfyzém) vazby s proteázami se účastní methionin kouření - oxidace tohoto Met AT přestává inhibovat proteolytické poškození plic, zvláště pacienti s deficiencí AT

30 bílkovina Haptoglobin konc. g/l poločas funkce 0,3 2,0 5 dní vychytává volný hemoglobin akutní zánět hepatopatie intravaskulární hemolýza (konzumpce haptoglobinu) inhibitor proteáz (trombin, trypsin, chymotrypsin, pepsin) α 2 - makroglobulin Ceruloplasmin ,3 3,0 5 0,2 0,6 4,5 transport malých proteinů (cytokiny, růstové faktory) a dvojmocných iontů (např. Zn 2+ ) díky velmi vysoké molekulové hmotnosti neprojde ani poškozenou glomerulární membránou oxidoredukční aktivita (oxidace Fe 2+ na Fe 3+ ) akutní zánět Wilsonova choroba (hepatolentikulární vazba mědi (váže až 90 % Cu v degenerace) séru)

31 rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny ceruloplazmin transport Cu iontů haptoglobin vazba hemoglobinu makroglobulin vazba proteáz, transport Zn iontů retinol-binding protein vitamin D-binding protein

32 koncentrace v plazmě 300 mgl funkce přenáší 90% plazmatické mědi (měď kofaktor různých enzymů) 1 molekula váže 6 atomů mědi váže měď pevněji než albumin, který přenáší 10% mědi albumin je asi pro přenos mědi významnější (snadněji ji uvolňuje)

33 a2- globulin, tetramer vyskytuje se ve 3 polymorfních formách funkce haptoglobinu váže volný hemoglobin a transportuje jej do retikuloendoteliálních buněk komplex Hb-Hp neprochází glomeruly - zamezení ztráty volného Hb, a tudíž i Fe volný Hb prochází glomeruly a precipituje v tubulech - poškození ledvin

34 poločas 5 dní poločas Hp-Hb 90 min. (rychleji odstraňovány hepatocyty) neprochází do ledvin protein akutní fáze, zvýšen při zánětech při anémiích u hemolytiků

35 bílkovina konc. g/l Transferin Hemopexin β-lipoprotein C4 složka komplementu poločas funkce 2,0 3,6 7 transport a vychytávání volného železa 0,5 1,1 3 7 vazba hemu, antioxidant 0,7 0,9 (Apo B- 100) 3 lipoprotein o nízké hustotě (LDL) transport cholesterolu k buňkám velmi vysoká molekulární hmotnost 0,1 0,4 1 součást komplementu nedostatek železa malnutrice hepatopatie zánět zánět autoimunitní stavy

36 bílkovina C3 složka komplementu β 2 - mikroglobulin Fibrinogen C-reaktivní protein konc. g/l poločas funkce 0,8 1,4 1 součást komplementu 0,001 0,002 1,5 4,5 součást leukocytárních antigenů součást koagulační kaskády, prekurzor fibrinu zánět fyziologicky jen v plazmě, není v séru 1,5 5 mg/l 3 aktivace komplementu zánět autoimunitní stavy hematologické nádory porucha tubulární resorpce akutní zánět (bakteriální)

37 rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny LDL transferin transport Fe iontů fibrinogen koagulační faktor I sex hormone binding globulin transport testosteronu a estradiolu CRP aktivace komplementu

38 koncentrace v plazmě 3 gl transport železa z odbouraného hemu a z potravy (střeva) do místa potřeby, tj. do kostní dřeně a dalších tkání 1 mol transferinu přenáší 2 moly Fe 3+ pokles transferinu popáleniny infekce maligní procesy onemocnění jater a ledvin relativní nadbytek transferinu anémie z nedostatku železa

39 intracelulární protein v plazmě jen malé množství( mg/l, ženy méně než muži) 24 podjednotek, které obklopují iontů Fe 3+ funkce uchovává a v případě potřeby uvolňuje železo protein skladující železo v buňkách vzniká v játrech, slezině, kostní dřeni, střevní sliznici koncentrace v séru odráží zásoby železa v těle patří mezi tumorové markery primární hemochromatosa genetické onemocnění zvyšuje se absorpce železa ve střevě a to se pak hromadí ve tkáních poškození jater, kůže, pankreatu, srdce

40 citlivý marker zánětu rozlišení bakteriální a virové infekce zhodnocení těžkého poškození tkání monitorování průběhu nemoci, pooper. stavů sledování účinnosti antimikrobiální léčby předpověď budoucích kardiovaskulárních chorob roste při bakteriální infekci zvyšuje se během 6-12 hod. po začátku zánětlivého procesu

41 při virové infekci nestoupá, popř. jen málo rychlejší než sedimentace ery závisí na koncentraci pozitivně nabitých sérových proteinů (fibrinogen, Ig) za zvýšení koncentrací neutralizujících čistý negativní náboj červených krvinek hodnoty klesají až o 50% /den, výhodné pro monitorování nemoci minimálně zvýšené hodnoty (2-3 mg/l) zdvojnásobují riziko kardiovaskulárních chorob

42 cyklický pentamérový sérový protein Mr 120 kda 5 identických nekovalentně vázaných podjednotek (206 amk) syntetizován v játrech a epitheliálních buňkách za stimulace zánětlivých lymfokinů (interleukinů-6 a -1 a tumor nekrotizujícího faktoru) objeven 1930 precipitující kapsulární C polysacharid nakterie Streptococcus pneumonie; sérový faktor identifikován a označen jako C- reaktivní protein

43 součást nespecifického imunitního obranného mechanismu, který je schopný vázat pneumokokový kapsulární C-polysacharid, fosfocholinové skupiny membránových zbytků, chromatin v přítomnosti Ca2+ je schopný aktivovat klasickou cestu komplementu funkce jako opsonin v leukocytové fagocytóze stimuluje lymfocyty nebo aktivuje monocyty/makrofágy detekován v aterosklerotických plátech, vázaný převážně na k částečně degradovanému LDL

44 koncentrace CRP reflektuje stupeň syntézy tohoto proteinu v játrech syntéza je spouštěna cytokiny (interleukin-6, 1 a TNF) sekretovaný makrofágy stanovení pomocí turbidimetrie (zákal) nebo nefelometrie virová infekce CRP nezvyšuje tolik adenovirus a herpes mohou vyvolat masivní poškození tkání, pak CRP roste syntéza po 6-12 hod. od začátku infekce

45 nad 100 mg/l těžká bakteriální infekce meningitida odlišení bakteriální a virové (virová pod 20 mg/l) pneumonie 60 mg/l pneumonie bakteriální bronchitis zvýšeno jen u Chlamidya pneumoniae a Mykoplasma pneumoniae bolest v krku Spreptococcus pyogenes, pneumoniae zvýšení, jinak ne infekce močových cest mg/l pyelonefritida po operacích u popálenin, transplantace, apendicitida (perforované 100 mg/l; neperforovaná nad 20 mg/l)

46

47

48 bílkovina konc. g/l poločas funkce IgG ,0 18,0 24 pozdní protilátky (chronický) zánět IgA ,9 3,0 6 protilátky slizniční imunity záněty sliznic a jater IgM ,6 2,5 5 časné protilátky akutní zánět

49 rozpustné ve vodě v přítomnosti solí glykoproteiny IgA IgG pozdní protilátky IgD IgD IgE

50 transferin feritin ceruloplasmin haptoglobin hemopexin (váže hem a transportuje ho do jater) odstraňují Fe 2+, a tím zabraňují Fentonově reakci: H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH + OH -

51 cystatin C indikátor poruchy glomerul. funkcí (0,5-1,2 mg/l) myoglobin kardiomarker s rychlou odpovědí (30-80 mg/l) troponiny kardiomarkery (ctnt, ctni) apolipoprotein A1 - povrchový protein HDL (1-2 g/l) apolipoprotein B souhrnný název pro Apo B-48 a Apo B-100 lipoprotein (a) - rizikový faktor vzniku koronárních příhod tyreoglobulin - zvýšen u chorob štítné žlázy (0-60 mg/l) CEA karcinoembryonální antigen, tumormarker (0-5 mg/l) CA skupina tumormarkerů (CA = carbohydrate antigen, cancer antigen)

52 koncentrace g/l ovlivnění rychlost syntézy a odbourávání distribuce v tělních tekutinách ztráty do třetího prostoru eliminace z organismu hydratace organismu zakoncentrování před odběrem poloha těla, stažení paže skladování biologického materiálu

53 změna rychlosti sedimentace ery otoky polyurie zvýšená citlivost k infekcím odběr!

54 podkoží depozita albuminu lymfa méně proteinů než plazma likvor 200x méně než v plazmě

55 denně syntetizováno a sekretováno 25 g játra většina plazmatických proteinů plazmocyty imunoglobuliny ostatní buňky b2-mikroglobulin

56 ZVÝŠENÍ SNÍŽENÍ zánět hypertyroidismus hyperkotizolismus nadprodukce růst. h. deficit železa ztráty proteinů klonální produkce Ig jaterní onemocnění se parench. tkáně nutriční deficit hypotyroidismus diabetes mellitus alkoholismus

57 závisí na funkci proteinu nejdelší strukturní proteiny nejkratší regulační proteiny ovlivněn distribucí rychlostí katabolismu a eliminace

58 filtrace v ledvinách vyloučení močí fyziologické ztráty do 150 mg/den difúze do GIT hydrolýza nebo vyloučení stolicí ztráty kůží

59 zvýšení pozitivních reaktantů akutní fáze (α 1 -antitrypsinu, orosomukoidu, haptoglobinu, ceruloplazminu, CRP, C3) pokles negativních reaktantů akutní fáze akutní fáze infekčních onemocnění akutní poškození tkáně (infarkt myokardu, chirurgický výkon) větší popáleniny

60 polyklonální zmnožení imunoglobulinů rekonvalescence po infekčním onemocnění některá revmatická onemocnění

61 zvýšení α-globulinů svědčí o reaktivaci procesu chronická aktivní revmatoidní artritida

62 vázne proteosyntéza v hepatocytech nadměrná tvorba imunoglobulinů někdy se neoddělí β a γ frakce (tzv. β-γ můstek při zvýšení IgA) chronická jaterní onemocnění jaterní fibróza a cirhóza

63 výrazné ztráty bílkovin močí (převládají renální ztráty albuminu) zvýšení bílkovin s největší Mr α 2 -makroglobulinu a β-lipoproteinu někdy se neoddělí β a γ frakce (tzv. β-γ můstek při zvýšení IgA) nadměrná tvorba imunoglobulinů nefrotický syndrom

64 pokles v oblasti γ globulinů primární deficity tvorby protilátek sekundární deficit tvorby protilátek ztráty imunoglobulinů

65 homogenní vrchol kdekoliv v oblasti β až γ benigní monoklonální gamapatie maligní monoklonální gamapatie (myelom)