Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287) Název ústavu: Ústav hygieny a technologie mléka Název předmětu: H2HM1 Technologie mléka a mléčných výrobků Ročník a fakulta: 2. ročník NaMSP; Fakulta veterinární hygieny a ekologie Číslo a název inovovaného cvičení: Využití luminometrické metody při stanovení účinnosti sanitace v mlékárenských provozech zdroj: 1766.cz.all.biz ATP bioluminiscenční metoda teoretická část 1. Úvod Bioluminiscence Bioluminiscence je emise světla u živých organismů, je výsledkem specifických biochemických reakcí. Organické a/nebo anorganické látky, které mají schopnost přeměnit absorbovanou energii ve světlo, se označují luminiscenční látky (luminofory). Bioluminiscence se vyskytuje u mnoha organismů (bakterie, houby, prvoci, láčkovci, kroužkovci, měkkýši, členovci). Charakteristické rysy bioluminiscenčních reakcí Společným znakem všech bioluminiscenčních systémů je, že světlo je produkováno jako vedlejší produkt luciferázou katalyzované reakce, ve které dochází k oxidaci substrátů nazývaných luciferiny v přítomnosti kyslíku. Struktura a vlastnosti luciferázy a luciferinů se liší u jednotlivých organismů. Reakce probíhají pouze v přítomnosti kyslíku a vždy je nutná přítomnost 2 látek: luciferázy a luciferinu, dále ATP a hořečnatých iontů. Pod pojmem luciferin jsou zahrnuty látky, které mohou být substrátem pro enzym luciferázu a produkují světlo např. alkoholy, flaviny, benzothiazoly, aldehydy. Luciferiny se vyskytují v buňkách nebo v mezibuněčných prostorech některých živočichů. Při oxidaci luciferázou se uvolňuje
tepelné záření. Enzym luciferáza katalyzuje oxidaci specifického substrátu kyslíkem za spolupůsobení ATP a hořečnatých iontů. Oxidací se dostává molekula do excitovaného stavu, při návratu do stavu s nižší energií se uvolňuje energie ve formě světla. Pojem luciferáza je opět souhrnný název pro enzymy umožňující vznik bioluminiscence. ATP se vyskytuje ve všech organismech, je důležitým zdrojem energie pro živé buňky. luciferin + O 2 oxyluciferin + CO 2 + světlo Bioluminiscence nachází uplatnění v lékařství, v kosmickém výzkumu, v oblasti základního biologického výzkumu. 2. Využití ATP bioluminiscenční metody v potravinářském průmyslu V potravinářském průmyslu je při výrobě potravin monitorování hygieny v celém potravinářském závodě absolutní nutností. Pro výrobce potravin je nezbytné provádět pravidelné povinné kontroly a uchovávat záznamy o kontrolách. V současnosti se nabízejí stále nové metody, kterými je možné rychle detekovat a monitorovat hygienu technologických procesů a čistotu výrobních prostor a zařízení (účinnost sanitace). Uplatnění bioluminiscenční metody při kontrole hygieny v potravinářských závodech je založené na měření množství ATP nacházejícího se ve všech živých buňkách nebo v jejich částech a v mikroorganismech, ve kterých slouží jako zdroj energie. Množství světla uvolněné při bioluminiscenční reakci ATP (adenosintrifosfátu) se specifickými chemickými látkami je přímo úměrné množství ATP: Mg + luciferin + luciferáza + ATP (luciferin-luciferáza-amp) + pyrofosforečnan O 2 (luciferin-luciferáza-amp) oxyluciferin + luciferáza + CO2 + AMP + světlo Látky luciferin a enzym luciferáza použité v testu byly izolovány ze světlušek. Průběh reakce je velmi rychlý (několik sekund), množství vzniklého světla je možné objektivně kvantifikovat s pomocí citlivého přístroje luminometru, který je schopný zachytit a změřit i velmi malé množství vznikajícího světla. Intenzita emitovaného světla se stanovuje v komoře luminometru a vyjadřuje se v relativních světelných jednotkách RLU. RLU je přímo závislé na množství ATP ve vzorku, a tím přímo závisí na množství biologické kontaminace ve vzorku. ATP test je třeba chápat jako TEST ZNEČIŠTĚNÍ, protože detekuje nejen mikrobiální znečištění, ale i přítomnost organické hmoty, která slouží jako substrát pro zachycení mikroorganismů, je živnou půdou pro jejich růst a zároveň i jejich ochrana před působením desinfekčních prostředků. Veškerá organická hmota (živá nebo původně živá) obsahuje ATP, a to včetně potravin, bakterií, plísní a dalších organismů. ATP test ideální metodou kontroly úspěšnosti sanitačních procesů.
Na základě dosažených výsledků je možné ihned vyhodnotit odebraný vzorek. Velkou výhodou metody je vysoká citlivost, nezávislost na zkušenostech personálu a reprodukovatelné výsledky do 2 minut. Výhody ATP bioluminiscenční metody: 1. Proaktivní monitorizace v reálném čase Reakce mezi luciferázou a ATP je okamžitá a odečtení hodnot je otázkou několika vteřin. Tato skutečnost umožňuje provést okamžitě opravná opatření. 2. Spolehlivost Systém identifikuje přítomnost biologických látek (například zbytků potravy nebo tělesných výměšků) stejně jako zbytků mikrobiálních - i když nejsou na pohled viditelné. Výsledky jsou spolehlivé a poskytují objektivní hodnocení čistících metod. 3. Přímé a nepřímé hodnocení rizika Vzhledem k tomu, že zkouška zjišťuje všechen přítomný biologický materiál, může prokázat nejen mikroorganizmy, ale i potencinálně rizikové oblasti, v nichž potraviny a jiné biologické zbytky mohou být zdrojem výživy mikrobů. 4. Snadné použití Systém může být snadno zařazen do denních čistících režimů. 5. Jednoduché vyhodnocování Výsledky jsou sdělovány v relativních světelných jednotkách (RLU), které mají přímý vztah k hygienickému stavu zařízení nebo pracovních povrchů. Dosažené výsledky mohou být přímo srovnány s předem stanovenými mezními hodnotami dostatečný- nedostatečný. Čím je hodnota RLU nižší, tím je povrch čistší. ATP bioluminiscenční metoda návod do praktického cvičení Metoda slouží k monitorování úrovně hygieny, poskytuje informace o účinnosti sanitace v potravinářském provozu. Metodu je možné implementovat jako rychlý hygienický monitoring podle požadavků různých průmyslových odvětví. Principem ATP bioluminiscenční metody je měření adenosin trifosfátu (ATP) molekula energie přítomná v buňkách všech živočichů, rostlin, bakterií, kvasinek a plísní. Potravinové zbytky jsou rovněž bohaté na ATP a poskytují výživu k růstu mikroorganismů. Metody stanovení jsou snadno použitelné; jednoduše se odebere vzorek, aktivuje se test sloučením ATP vzorku s luciferázou, poté se měří luminometrem množství světla vyzařovaného směsí luciferázy se vzorkem - výsledkem je odhad úrovně biologického materiálu přítomného ve vzorku (viz úvod). 1. Popis přístroje Luminometr PD 20 je lehký, plně přenosný přístroj s alfanumerickým LCD displejem. Je určen k použití v potravinářských provozech a v laboratořích (obrázek 1 a 2)
Obrázek č. 1 Luminometr PD 20 Obrázek č. 2 Operační panel luminometru
Obrázek č. 3 Displej přístroje 2. Zapnutí přístroje Přístroj zapneme zmáčknutím tlačítka POWER na operačním panelu přístroje (obr. 2). Na displeji se ukáže odpočítávání několika sekund a po odpočítávání se displej přepne do základního módu pro měření. Během této doby probíhá kalibrace přístroje. 3. Výběr režimu (módu) 3.1. Automatický režim Měření lze provádět ve dvou režimech automatickém a programovatelném. Volíme automatický režim. V automatickém režimu se volí mezi módy 0 až 9. Pro každý mód je
možné zvolit vlastní spodní a horní limit pro vyhodnocování výsledků měření. V každém módu může být uloženo až 200 hodnot. Upozornění: - V módu 0 nelze stanovit limity. - Programovatelný režim lze zvolit pouze tehdy, jsou-li všechna data vymazána z paměti přístroje. - V přístroji jsou přednastaveny nejběžněji používané limity, a to 100 RLU pro spodní limit, 200 RLU pro horní limit. 3.2. Nastavení limitů pro vyhodnocení v automatickém režimu Stiskněte tlačítko F na ovládacím panelu. Tlačítko opakovaně tiskneme tak dlouho, až na displeji v levém horním rohu začne blikat nápis MODE, poté stiskneme tlačítko ENTER. Pomocí tlačítek zvolíme požadovaný mód a potvrdíme stisknutím tlačítka ENTER. Nakonec pomocí tlačítek a nastavíme spodní a horní limity pro vyhodnocení výsledků a vše potvrdíme zmáčknutím tlačítka ENTER. 4. Vlastní měření - odběr vzorku (stěru) 4.1. Příprava a odběr stěru Před odběrem vzorku je nutné stěry LuciPac Pen temperovat alespoň 20 minut při pokojové teplotě. Stěr vytáhneme z ampule a navlhčíme buď v destilované vodě, nebo lze podle doporučení výrobce navlhčení stěru provést pitnou vodou (před navlhčením necháme z kohoutku odtéci asi 10-20 l vody). Pitná voda hodnotu RLU nezvyšuje, její pozadí je 10 RLU. Otáčením stěrovky odeberte stěr z plochy 10 cm 2 (obrázek 4-7). Obrázek 4-7 Příprava a odběr stěru
Poté stěr vrátíme do ampule a silou zatlačíme stěr dovnitř ampule tak, aby špička stěru prorazila komůrku s roztokem enzymu a došlo k reakci. Po proražení stěrem po dobu cca 10 sekund protřepáváme tak dlouho, až dojde k rozpuštění tablety na dně ampule. Stěr je připraven k měření (obrázek 8-11). Obrázek 8-11 Příprava stěru před měřením Upozornění: Pokud je k dezinfekci povrchu použit prostředek obsahující etanol, mohou být ovlivněny výsledky měření. 4.2. Vlastní měření
Otevřeme víčko měřící komůrky, vložíme připravený stěr, zavřeme víčko a zmáčkneme tlačítko ENTER. Přístroj začne odpočítávat 15 sekund, poté se na displeji objeví změřený výsledek a začne blikat indikátor signalizující vytažení stěru z měřící komůrky. Otevřeme víčko přístroje, vyndáme stěr a víčko zavřeme. Na displeji jsou zobrazeny následující údaje (obrázek 12-18). Přístroj musí být při měření ve svislé poloze! Po ukončení měření vždy vyjměte stěr z měřící komůrky! Obrázek 12-17 Měření Pořadové číslo vzorku #00x Naměřená hodnota je automaticky uložena v paměti přístroje spolu s časem a datumem měření a je jí přiřazeno pořadové číslo, tzn. prvnímu měření odpovídá symbol #001 v levém
horním rohu displeje, měření druhému číslo o jedno vyšší, tj. #002 atd. Přístroj uchovává v paměti pouze 200 hodnot tzn., že 201 měření se ukládá opět pod číslem #001. Obrázek č. 18 Měření Naměřená hodnota RLU Změřená hodnota je vyjádřena v jednotkách RLU (Relative Light Unit) a je úměrná množství ATP v odebraném stěru. RLU může být měřeno v rozsahu od 0 do 999,999, přičemž při překročení této maximální hodnoty přístroj začne blikat. Hodnoty RLU vyšší než 1000 jsou zobrazeny ve tvaru s desetinnou čárkou, např. 1,256 atd. Obrázek č. 19 Zobrazení výsledků na displeji přístroje
4.3. Hodnocení výsledků Vyhodnocení výsledku měření Vyhodnocení se zobrazí ve čtverečku, vpravo nad hodnotou RLU. Naměřené hodnoty jsou přístrojem vyhodnoceny a zařazeny do tří kategorií (A,B,C), kritéria pro vyhodnocení jsou následující: Limit A = správně provedená sanitace, optimální způsob čištění. Limit B = správně provedená sanitace, avšak při častějším výskytu výsledků v tomto limitu je nutné provést zásah do čištění. Limity jsou určeny na základě předchozích pravidel, v úvahu jsou brány následující faktory: - rizikovost výrobku - způsob čištění - dlouhodobé zkušenosti s měřením - druh povrchu výrobního zařízení - vysoce rizikové výrobky. Tabulka 1 Příklady doporučených limitů RLU Typ výroby A B Pekařství, těstárny, koření, 500 1000 dehydrované produkty Zpracování ovoce a zeleniny 500 1000 Hotová jídla, lahůdky, 200 300 majonézy Nápoje 150 200 Mléčné výrobky 200 300 Hodnota RLU nižší než spodní limit Hodnota RLU vyšší než spodní limit, ale nižší než horní limit Hodnota RLU vyšší než horní limit A (akceptováno) B (pozor) C (nevyhovující)