MĚŘENÍ ABSORPCE SVĚTLA SPEKOLEM Průchodem světla homogenním prostředím se jeho intenzita zmenšuje podle Lambertova zákona. Klesne-li intenzita monochromatického světla po projití vrstvou tloušťky l z hodnoty na, platí: kl e (1) Výraz můžeme také psát ve tvaru: 1 l (2) Veličina k, respektive se nazývá koeficient absorpce. U dané látky závisí na vlnové délce použitého světla, tlaku a teplotě apod. Koeficient absorpce při použití světla určité vlnové délky závisí na počtu absorbujících center. Pro roztok s neměnnou teplotou a tlakem koncentrace C lze zřejmě psát: C (3) Veličina, zvaná koeficient extinkce. Pro malé hodnoty koncentrace platí Beerův zákon, uvádějící, že v tomto případě koeficient extinkce je na koncentraci nezávislý. Zavedeme-li veličinu extinkci E definovanou vztahem: můžeme pro extinkci psát rovněž vztah: E. l (4) E C.. l (5) a nebo za použití vztahu (2): E log (6) Kromě extinkce a koeficientu extinkce se veličina propustnost, definované vztahem: (7) v němž je intenzita dopadajícího a intenzita prošlého světla. Obecně se pro měření absorpce se užívají fotometry, jejichž princip je založen na srovnání absorpce, případně propustnosti světla daným roztokem s roztokem referenčním. V našem praktiku použijeme spektrofotometr SPEKOL. Je to jednopaprskový spektrofotometr se širokou škálou použití. Kromě extinkce lze na něm měřit fluorescenci, zákal, koncentraci roztoků, titraci, remisi (světlost) atd. - 34 -
Základní prvky přístroje: (62) (62) (1) indikační okénko (2) klávesnice ukládání údajů (3) klávesnice způsob měření (4) rukojeť pro zasunutí fotonky do dráhy paprsků (6) kryt fotonky (7) síťový spínač (8) regulátor vlnových délek (12) nastavení filtru (62) výměník kyvet Obr. 1: Přední strana přístroje SPEKOL 11 Základním prvkem přístroje je zdroj světla, tzv. monochromátor s velkou světlostí a měrné fotonky. Jedna z nich je citlivá na modrou (34-62 nm) a jedna na červenou (62-85 nm) barvu. Posunutím rukojeti (4) směrem označeným modře nebo červeně působí paprsky na modrou nebo na červenou měrnou fotonku. Spojná čočka (L) vede světelný tok, vystupující z výstupní štěrbiny (A) Obr. 2: Princip měření Spekolem 11 monochromátoru, kyvetou (K) na fotonku (Z). Štěrbinová clona (B 1 ; B 2 ) se používá pro zeslabení světla. Mezi kyvetou (K) a fotonkou (Z) se mohou podle příslušného měření používat barevné, interferenční nebo šedé filtry (F). K měření extinkcí kapalných látek se využívá spektrální oblast 34 nm až 85 nm. Výměník kyvet přijímá kyvety, z nichž je vždy jedna v dráze paprsků, pokud je výměník vpravo nebo vlevo v poloze dorazu. K měření se používají skleněné kyvety 8 o tloušťce 1 cm (potřebné množství látky je 1,2 ml/cm tloušťky). - 35 -
(8) regulátor vlnových délek (12) nastavení filtru (63) kyveta (62) výměník kyvety Obr. 3: Detail výměníku kyvet Způsob měření Přístroj, napojený na síť, se zapíná tlačítkem (7) ~. Po zapnutí se musí přistroj před začátkem měření asi 15 minut zahořovat. Následuje vyzvání blikajícími led diodami T - E - C - CAL - FL - KN, k volbě příslušného měření. Po provedené volbě stisknutím příslušné klávesy vyzývají blikající luminiscenční diody ke vkládání příslušných údajů nebo vyrovnání reference. Měření extinkce E 1. Regulátorem (8) nastavíme příslušnou počáteční vlnovou délku světla pro měření. U vlnové délky menší než 39 nm je doporučeno otočit filtr rozptýleného světla pákou (12) na znaménko do dráhy paprsků. 2. Přijímač záření (citlivý na červenou nebo na modrou) zasunout až na doraz do dráhy paprsků (4). 3. Vsadíme referenční vzorek (prázdná kyveta nebo kyveta s destilovanou vodou) do dráhy paprsků. 4. Po stisknutí tlačítka E, bliká R. 5. Stiskneme tlačítko R. Nastane automatického vyrovnání přístroje a po jeho ukončení následuje indikace, ( = E ) a zhasne luminiscenční dioda. 6. Objeví-li se indikace - OFL nebo OFL, je světelná energie dopadající na fotonku příliš nízká nebo vysoká a musí se změnit pomocí filtru. Viz poznámka. Potom se stisknutím R provede opět vyrovnání přístroje. 7. Do dráhy paprsků umístíme pomocí výměníku kyvet (62) zkušební vzorek a odečteme naměřenou hodnotu extinkce. 8. Podle zadaného úkolu měníme hodnoty vlnových délek procházejícího světla. U delších řad naměřených hodnot je možné občasným umístěním zkoušky reference rychle zkontrolovat pracovní stav přístroje a pokud je zapotřebí stisknutím tlačítka R provést vyrovnání přístroje. - 36 -
Poznámka Zeslabení dráhy měřících paprsků a tedy také použití šedého filtru, který náleží ke standardnímu vybavení, je potřebné pouze tehdy, pokud extrémní citlivost fotonek neumožňuje vyrovnání přístroje, a ten indikuje OFL. Otočná páka (12) splňuje následující funkce: filtr rozptýleného světla pro spektrální oblast 34 nm až 39 nm vykývnutý dráha měřících paprsků nezeslabená dráha měřících paprsků zeslabená Kromě extinkce - tlačítko E - měření extinkce, lze na přístroji SPEKOL 11 měřit i další veličiny. K zahájení jejich měření slouží přední straně přístroje příslušná tlačítka: T - měření transmise, C - měření koncentrace na bázi extinkce, CAL - možnost kalibrování k určení koncentrace, R - měření fluorescence, zákal, remise, KN START - určení aktivity u reakčně kinetického měření. Nastavený způsob měření se indikuje rozsvícením příslušné indikace LED diody. Z dalších tlačítek skupiny Ukládání údajů, které se používají pro vkládání parametrů pro zpracování naměřené hodnoty a jiných informačních signálů pro mikroprocesor uveďme jen ty, které jsou důležité pro naše praktikum: Tlačítka: NC/CE - následuje-li během pracovního průběhu přístroje indikace Error, může se chybná indikace zrušit stisknutím tlačítka NC/CE. PRNT - naměřenou hodnotu lze vytisknout připojenou tiskárnou. R - reference - stisknutím tlačítka se automaticky nastaví extinkce E =, respektive hodnota transmise a 1 %. Pracovní úkoly 1. Seznámení se s činností spektrofotometru SPEKOL 11. 2. Změřte extinkci a určete absorpci světla v roztocích bromkresolové zeleně v oblasti viditelného záření. 3. Výsledky tabelárně zpracujte. 4. Graficky znázorněte závislost koeficientu absorpce na vlnové délce pro různé koncentrace. 5. Pro několik vlnových délek ověřte platnost Beerova zákona. Pomůcky Spektrofotometr SPEKOL s příslušenstvím, roztok bromkresolové zeleně, nádobky, váhy. Pokyny a informace 1. Přístroj zapněte ještě před měřením, aby získal optimální teplotu. V průběhu jeho zahřívání se seznamte s popisem přístroje a jeho činností (str. 7 1; 16 17). Seznamte se také dobře s chybovými hlášeními na str. 3 31 návodu. 2. Přístroj připravte pro měření extinkce stisknutím tlačítka. 3. Pro měření použijte dvou kyvet stejné délky (l = 1,2 cm). 4. První kyvetu naplníme destilovanou vodou (rozpouštědlo) a vložíme do jedné části výměníku. 5. Stisknutím tlačítka pro referenci R nastavíme automatické vyrovnání (na displeji by se měla objevit identifikace:,). - 37 -
6. Do druhé části výměníku vsuneme druhou kyvetu s roztokem bromkresolové zeleně určité koncentrace a odečtěte příslušnou hodnotu extinkce. 7. Volte koncentrace roztoků 1 %, 2 %, 25 %, 5 % a 1 %. 8. Měňte vlnovou délku světla v oblasti viditelného světla od 35 do 75 nm po 2 nm. 9. Výsledky tabelárně a graficky zpracujte. Literatura Brož J. a kol: Základy fyzikálních měření Návod k použití přístroje - 38 -