Laboratorní cvičení z lékařské chemie IV 1. ročník, všeobecné lékařství Ústav lékařské chemie a biochemie Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova Jméno: Potvrzení o účasti na praktikách Studijní skupina: Datum: (razítko, podpis) Protokol odevzdán dne: Protokol uznán vrácen k přepracování (podpis asistenta)
Před zahájením praktika si vyzvednete klíč od skříňky (stejné, jako v předchozím praktiku, viz. seznam). Bez pláště nebudete do laboratoře vpuštěni/ny. Náplň laboratorního cvičení: Vybrané reakce organických sloučenin a) důkaz acetonu - Lestradetova zkouška - Legalova zkouška b) reakce aminokyselin a bílkovin - reakce aminokyselin s ninhydrinem - biuretová reakce bílkovin - srážení bílkovin varem v acetátovém pufru - důkaz bílkovin v moči kyselinou sulfosalicylovou c) reakce sacharidů - důkaz glukózy Fehlingovým činidlem d) vitamín C demonstrace redukčních vlastností - reakce s Fehlingovým činidlem - redukce Fe 3+ na Fe 2+ e) analýza neznámého vzorku Po dokončení práce po sobě ukliďte pracovní místo (uveďte do původního stavu), což potvrdí laborantka razítkem na čelní stranu protokolu! Potom, před odchodem, požádejte asistentku/asistenta o stvrzení účasti jejím/jeho podpisem! Vraťte zapůjčený klíč od skříňky (pověste jej na desku u dveří). Pokyny pro bezpečnou práci s kahanem: Zapalte kahan: škrtněte zápalku, hořící ji přidržujte poblíž ústí kahanu a druhou rukou otevřete přívod plynu. Použijte držák na zkumavky (zkumavku do něj upevněte poblíž jejího ústí)! Zkumavkou v plameni pohybujte, aby se zahřívala rovnoměrně! Minimalizuje se tak riziko prasknutí. Každých asi 5 s vyndejte zkumavku z plamene, aby byl čas, aby teplo ze skla zkumavky přešlo také do roztoku! Nikdy nemiřte ústím zkumavky na sebe ani na nikoho jiného! Ústí zkumavky směřujte tam, kde nikdo není! Po skončení práce zhasněte kahan uzavřením přívodu plynu! Uvědomte si, že cokoli, co jste zahřívali, může být horké!
Vybrané reakce organických sloučenin a) Důkaz acetonu Aceton může vznikat v lidském těle. Je řazen mezi tzv. KETOLÁTKY Ketolátky v metabolickém slova smyslu jsou: kyselina acetoctová (acetoacetát) kyselina -hydroxymáselná ( -hydroxybutyrát) aceton Tyto látky jsou svým metabolizmem úzce propojeny. Vznikají, jsou-li intenzivně katabolizovány tuky při nedostatečném metabolizmu sacharidů. K tomu dochází např. při hladovění nebo při vyčerpávající tělesné námaze. Z patologických stavů je nadměrná produkce ketolátek typická pro diabetes mellitus. Tvoří-li se v těle ketolátky, přecházejí i do moči, kde jsou prokazatelné jednoduchými testy. Přítomnost ketolátek v moči se nazývá ketonurie. kyselina acetoctová kyselina -hydroxymáselná aceton Jedna ze zmíněných ketolátek není keton (neobsahuje KETO skupinu). Která? Bude tato látka prokazatelná níže uvedenými testy? ANO NE Důkaz acetonu je založen na barevné reakci s nitroprusidem sodným: Na 2 [Fe(CN) 5 NO] 1. Lestradetova zkouška Z krabičky vyndejte malý filtrační papír a položte jej nesložený na bílou dlaždici. Do malé plastové naběračky (je uvnitř plastové nádobky s činidlem) naberte Lestradetovo činidlo a nasypte jej doprostřed filtračního papíru. Lestradetovo činidlo je pevná směs nitroprusidu sodného, síranu amonného a bezvodého uhličitanu sodného. Činidlo pokápněte vodným roztokem acetonu. (buďte trpěliví, hodnoťte výsledek až cca po 30-60 sekundách) 2. Legalova zkouška Ve zkumavce si připravte čerstvý roztok nitroprusidu sodného ve vodě. Naberte několik zrnek pevného nitroprusidu sodného a rozpusťte asi v 1 ml vody. Pak přidejte 3 kapky roztoku NaOH. Nakonec přidejte 3 kapky vodného roztoku acetonu. 1
b) Reakce aminokyselin a bílkovin 1. Reakce aminokyselin s ninhydrinem Aminokyseliny lze prokázat velice citlivou reakcí s ninhydrinem. Do zkumavky dejte asi 0,5 ml roztoku aminokyseliny. Přidejte pár kapek roztoku ninhydrinu a obsah zkumavky velice opatrně zahřejte nad kahanem. Pozor: ninhydrin je rozpuštěn v acetonu (hořlavina)! Kterou aminokyselinu jste použili? název: vzorec: 2. Biuretová reakce bílkovin Sloučeniny obsahující peptidovou vazbou -NH-CO- dávají pozitivní tzv. biuretovou reakci. Biuretové činidlo obsahuje Cu 2+ ionty v alkalickém prostředí. pozn. Biuretová reakce se jmenuje po nejjednodušší látce reagující pozitivně BIURETU Co to je biuret? Jak vzniká? Do zkumavky dejte asi 0,5 ml roztoku bílkoviny. Přidejte stejné množství biuretového činidla. 3. Srážení bílkovin varem v acetátovém pufru Bílkoviny tvoří ve vodě koloidní roztoky, které jsou neobyčejně citlivé na vliv prostředí (ph, teplota). Změnou podmínek obvykle denaturují. Do zkumavky dejte asi 0,5 ml roztoku bílkoviny. Přidejte přibližně 0,5 ml acetátového pufru (ph = 4,6). Obsah zkumavky velmi krátce povařte. 4. Důkaz bílkovin v moči kyselinou sulfosalicylovou Bílkoviny se v moči normálně nevyskytují. Jejich přítomnost může mít mnoho vesměs patologických příčin, nejtypičtější jsou poruchy funkce ledvin. Přítomnost bílkoviny v moči se nazývá proteinurie. Důkaz bílkovin v moči je založen na jejich poměrně snadném srážení. Nejčastěji se využívá velice citlivá reakce s kyselinou sulfosalicylovou. Do zkumavky dejte asi 0,5 ml roztoku bílkoviny a přidejte asi 0,5 ml roztoku kyseliny sulfosalicylové. Vzorec kys. sulfosalicylové: 2
c) Reakce sacharidů Glukóza je pro buňky asi nejuniverzálnější živina. Patří mezi monosacharidy, konkrétně aldohexózy. U sacharidů se užívá několik různých typů vzorců. Zakreslete D-glukózu různými typy vzorců: lineární vzorec (Fischerův) cyklický vzorec (Tollensův) cyklický vzorec (Haworthův) D-glukóza -D-glukopyranóza -D-glukopyranóza Redukční zkoušky Glukóza obsahuje aldehydickou skupinu, která může být poměrně snadno oxidována. Proto má glukóza redukční vlastnosti. Ty mohou být využity k jejímu důkazu. 1. Důkaz glukózy Fehlingovým činidlem Fehlingovo činidlo obsahuje komplexně vázané ionty Cu 2+. Komplex není příliš stálý, proto se činidlo připravuje těsně před použitím smícháním stejných objemů roztoku Fehling I (roztok CuSO 4 ) a Fehling II (alkalický roztok vínanu sodno-draselného). Ve zkumavce si připravte Fehlingovo činidlo. Smíchejte stejné množství (cca 1 ml) roztoku Fehling I a Fehling II. Barva činidla: Do nové zkumavky si odlijte asi polovinu (1 ml) připraveného Fehlingova činidla. Zbytek činidla si ponechte pro analýzu neznámého vzorku. Přidejte stejný objem roztoku glukózy. Obsah zkumavky opatrně krátce povařte. Která sloučenina vzniklá v průběhu reakce je zodpovědná za pozorované změny? Co se stalo v průběhu reakce s glukózou? ZOXIDOVALA SE ZREDUKOVALA SE JINÁ ZMĚNA název sloučeniny, na kterou se glukóza přeměnila: strukturní vzorec: Fehlingova reakce je klasická zkouška na důkaz glukózy v moči. Existuje několik modifikací této zkoušky, princip je stejný, rozdíl je jen v použité "komplexující přísadě". U Fehlingova činidla je komplexující přísadou vínan (tartarát), u Benediktova činidla je komplexující přísadou citrát. 3
Disacharidy vznikají ze dvou monosacharidových jednotek, které jsou spojeny O-glykosidickou vazbou. Podle schopnosti reagovat pozitivně s Fehlingovým činidlem klasifikujeme disacharidy na redukující a neredukující. Jak poznáte z chemické struktury, zda je disacharid redukující nebo neredukující? Z biochemického pohledu jsou nejdůležitějšími disacharidy: maltóza, laktóza a sacharóza..?.. cukr monosacharidy, ze kterých je složen typ vazby redukující/ neredukující maltóza laktóza sacharóza d) Vitamín C demonstrace redukčních vlastností Vitamín C má silné redukční schopnosti. Vzorec: Doporučená denní dávka: Chemický název pro vitamín C: 1. Reakce s Fehlingovým činidlem Ve zkumavce si připravte Fehlingovo činidlo. Smíchejte stejné množství (cca 1 ml) roztoku Fehling I a Fehling II. Přidejte stejný objem roztoku vitamínu C. Srovnejte reakci Fehlingova činidla s vitamínem C a s glukózou (viz reakce sacharidů): 4
2. Redukce Fe 3+ na Fe 2+ Do tří zkumavek připravte reakční směs podle tabulky: zkumavka 1 "pozitivní kontrola" 2 3 "negativní kontrola" roztok Fe 2+ asi 1 ml - - roztok Fe 3+ - asi 1 ml asi 1 ml roztok vitamínu C - asi 1 ml - destilovaná voda asi 1 ml - asi 1 ml roztok K 3 [Fe(CN) 6 ] 3 kapky 3 kapky 3 kapky zbarvení Vysvětlení pozorované změny e) Analýza neznámého vzorku Ve stojánku na pracovním stole máte zkumavku označenou číslem s neznámým vzorkem. Jedná se o imitaci moči, kterou máte za úkol analyzovat. Budete vzorek testovat na přítomnost ketolátek, proteinů a glukózy. Se vzorkem, který máte k dispozici, zacházejte zodpovědně. Musí vám vystačit na provedení všech potřebných zkoušek. Vzorek si nesmíte znehodnotit, proto nic nepřidávejte přímo do zkumavky se vzorkem. Pro jednotlivé testy používejte jen malý objem vzorku! Nový vzorek nedostanete! Vzorek číslo: Ketolátky (aceton) - Lestradetova zkouška Popište výsledek: Proteiny - precipitace kyselinou sulfosalicylovou Popište výsledek: Glukóza - Fehlingova zkouška Popište výsledek: Závěr co všechno je přítomno ve vzorku? 5