MS analyzátory - II Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Sektorový analyzátor (Sector Mass Analyzer) Umožňuje dosažení vysokého rozlišení Využívá magnetické pole často v kombinaci s polem elektrostatickým Ionty vytvořené v iontovém zdroji jsou urychlovány 4-8 kv do magnetického pole analyzátoru Zakřivení dráhy letu iontu s jistou hodnotou m/z souvisí s intenzitou magnetického pole Ionty odlišné hodnoty m/z lze dělit a detekovat užitím změn magnetického pole nebo zdrojového napětí Pro dosažení vysokého rozlišení je magnetický sektor B většinou spojen s elektrostatickým sektorem E
Používá se řada tandemů: EB, BE, EBE apod. Vyšší kolizní energie vede k větší fragmentaci a podrobnější strukturní informaci Rozlišení: jednofokusační-střední dvoufokusační-vysoké (do 100 000) Rozsah: 20 000 amu Skenovací rychlost: malá Potřebné vakuum: 10-7 torr
Základní fyzikální vztahy pro magnetické a elektrostatické analyzátory Pokud je iont o hmotnosti m s nábojem q akcelerován v iontovém zdroji potenciálovým rozdílem U, získá kinetickou energii E k : mv 2 E k = = 2 qu kde q = ez Působení magnetického pole Pokud je směr magnetického pole vzhledem ke směru letu iontu kolmý, působí na iont síla F M, kde B je intenzita magnetického pole: F M = qvb
Iont se začne pohybovat po kruhové dráze o poloměru r, s tím, že se vyrovná odstředivá a magnetická síla: qv B = mv r 2 m v = qbr vyplýva z toho, že ionty se stejnou hybností a nábojem se budou budou pohybovat po stejné kruhové dráze r, magnetický analyzátor tedy separuje ionty podle jejich hybnosti, nicméně z iontového zdroje do něj vstupují ionty s definovanou kinetickou energií (jak byla výše specifikována), lze tedy psát: mv 2 = 2qU m q = 2 r B 2U 2 Pokud je poloměr r dán tvarem/rozměry letové trubice, pak pro určitou hodnotu B projdou analyzátorem jen částice o jisté hodnotě poměru m/q. Ovšem skenováním intenzity magnetického pole v čase je možno dosáhnout postupného registrování iontů s různými hodnotami m/q. Pokud tedy z iontového zdroje vycházejí všechny částice se stejnou kinetickou energií, lze tento analyzátor užít ke zjištění jejich hmotností (resp. přesně řečeno jejich m/q hodnot).
Kromě možnosti skenování intenzity magnetického pole je ale možno také alternativně využít skutečnosti, že ionty se stejnou kinetickou energií, ale odlišnou hodnotou m/q mají odlišné hodnoty poloměrů drah, r. Tyto ionty pak vystupují z oblasti působení magnetického pole s odlišnými trajektoriemi. Instrumenty umožňující toto měření se označují jako disperzní. Spojením výše uvedených vztahů lze dostat: r = 2mE qb k z čehož je vidět, že ionty s identickou hmotností a nábojem jsou magnetickým polem vychýleny podle jejich kinetické energie, proto je patrné, že kinetická energie separovaných iontů musí být pod důkladnou kontrolou, toho je dosahováno pomocí kombinace s elektrostatickým analyzátorem, jak bude vysvětleno později
Působení elektrostatického pole Pokud je použit zahnutý válcový kondenzátor, vytvoří se v něm radiální elektrostatické pole. Trajektorie iontu v takovém poli je kruhová stále orientována kolmo na směr pole.
Odstředivá síla se zase dostane do rovnováhy tentokrát s elektrostatickou silou podle následující rovnice, kde E je intenzita elektrostatického pole: qe = mv r 2 r = 2Ek qe Ze vztahu je patrné, že trajektorie iontu je nezávislá na hmotnosti iontu. Elektrostatický analyzátor tedy separuje ionty podle kinetické energie a ne podle jejich hmotnosti
Disperze proudu iontů Disperze, a tím pokles spektrálního rozlišení, je způsobován třemi faktory: 1. Pokud vstupují do analyzátoru ionty s rozdílnými kinetickými energiemi, budou sledovat odlišné trajektorie (energy dispersion) 2. Pokud vstupují do analyzátoru ionty pod různými úhly, může se v analyzátoru tato divergence ještě zvětšit (angular dispersion) 3. Ionty nejsou z iontového zdroje emitovány jako z bodového zdroje, ale jako ze štěrbiny, která má jisté reálné rozměry a to také přispívá k nežádoucí disperzi iontů
Směrová fokusace, eliminace angulární disperze Vhodnou volbou tvaru geometrie magnetického nebo elekrického sektoru, je možné dosáhnou fokusace/zaostření svazku iontů
Energetická fokusace Pokud jsou ze zdroje emitovány ionty s různými kinetickými energiemi, elektrický nebo magnetický sektor při vhodné geometrii zajistí směrovou fokusaci, ale disperze způsobená odlišnými energiemi eliminována nebude Pokud je ale disperze související s rozdílnou kinetickou energií korigována druhým sektorem s vhodnou geometrií, lze dosáhnout i fokusace energetické. Proto jsou často užívány instrumenty s dvojí fokusací (double-focusing instruments)
Praktické poznámky Iontové zdroje v magnetických instrumentech pracují při napětích U s na úrovni 10 kv, používané vakuum musí být hluboké pro potlační vzniku výboje Sektorové analyzátory nejsou příliš vhodné pro spojení s rychlými separačními technikami (GC-MS), protože neumožňují rychlé skenování magnetického sektoru Magnetické sektory pracují při konstantní rozlišovací síle R = m/ m pro širokou škálu m/z, a m se tedy mění úměrně se změnou m
Tandemová hmotnostní spektrometrie na sektorových analyzátorech Provádí se na instrumentech s dvojí fokusací, kombinovány jsou sektory elektrostatické s magnetickými, smyslem je získat detailnější informaci o struktuře iontů Pokud je první sektor elektrostatický a druhý sektor magnetický, označuje se systém EB (Nier-Johnson), to je častější uspořádání než geometrie obrácená BE (reverse Nier-Johnson)
Detekce metastabilních iontů v normálním skenu (skenování jen magnetického sektoru) Na výstupu z iontového zdroje mají v ideálním případě všechny ionty stejnou kinetickou energii. Pokud dojde k jejich fragmentaci v prostoru bez magnetického nebo elektrostatického pole (field-free region) mají také vzniklé fragmenty přibližně stejnou rychlost jako původní prekurzorové ionty, a v důsledku toho ovšem odlišnou kinetickou energii. Protože elektrostatický sektor separuje ionty podle kinetické energie, všechny metastabilní ionty, které vzniknou před E sektorem v normálním spektru nejsou pozorovány. Toto platí pro uspořádání EB pokud k fragmentaci dojde v první oblasti bez pole a obecně pro uspořádání BE. Jen při geometrii EB a fragmentaci v druhé oblasti bez pole (mezi sektory), jsou potenciálně měřitelné metastabilní ionty. Metastabilní ionty ve spektrech poskytují zdánlivé hodnoty hmotnosti, m*, ze kterých je možné vypočítat skutečné hmotnosti fragmentů, m f, platí vztah: m m m 2 f * = kde m p je hmotnost prekurzoru fragmentu p Kinetická energie uvolněná při fragmentaci vede k disperzi rychlosti a ke zhoršení rozlišení, tj. rozšíření pozorovaného píku ve spektru
BE instrumenty a MIKES (mass-analyzed ion kinetic energy spectroscopy) MIKES je nejjednodušší pozorovací metoda metastabilních iontů nebo fragmentových iontů vzniklých kolizně indukovanou disociací (collision-induced dissociation, CID), technika vyžaduje uspořádání typu BE. Pokud dojde k fragmentaci iontu mezi B a E sektorem, jsou vytvořeny podmínky pro detekci fragmentů pokud bude napětí na E sektoru skenováno, a platí vztah: E p = kde E p a E f jsou intenzity elektrického pole na E sektoru potřebné pro průchod prekurzoru o hmotnosti m p a fragmentu o hmotnosti m f E f m m p f Pokud je znám poměr E p / E f a m p, lze zjistit m f Na sektoru B je tedy izolován prekurzor (konstantní hodnota intenzity magnetického pole) a skenován je elektrostatický sektor v tomto případě se tedy nejedná o linked scans techniku
Poznámka: Při vzniku metastabilního iontu většinou dojde k přeměně části vnitřní energie v energii kinetickou, takže kinetická energie fragmentů nabývá hodnot v určitém rozmezí, a proto je pozorovaný pík ve spektru rozšířený, MIKES tedy poskytuje také přímá měření uvolněné kinetické energie při vytvoření fragmentů
Často se při tandemových experimentech využívá tzv. spřažených skenů, linked scans. Jedná se o měření, kdy jsou oba sektory, jak E, tak B, současně synchronizovaně skenovány s využitím daného matematického vzájemného vztahu, který může navíc záviset na geometrii uspořádání
Linked scans B/E linked scan => B/E = konst. => produktová spektra Využívá se fragmentace před prvním analyzátorem Pro detekci fragmentů musí být splněna podmínka: B E p p = B E f f = konst. Experiment je prováděn tak, že je nejprve detekován prekurzorový iont za příslušného B p a E p, následně jsou oba sektrory současně skenovány při zachování poměru B/E (snižováním hodnot B a E oproti původním hodnotám), tak jsou nalezeny fragmenty daného prekurzoru Technika je možná na instrumentech typu EB a BE Rozlišení je vyšší než při MIKES, ale stejně dosahuje jen několika stovek Tento přístup neposkytuje informaci o uvolněné kinetické energii při vzniku fragmentů (narozdíl od MIKES)
B 2 /E linked scan => B 2 /E = konst. => prekurzorová spektra Pro detekci prekurzorů jistého fragmentu musí být splněna podmínka: B E 2 f f = B E ' 2 f ' f = konst. B f a E f jsou hodnoty intenzit magnetického a elektrického pole umožňující průchod vybraného fragmentu, který vznikl v iontovém zdroji B f a E f jsou hodnoty intenzit magnetického a elektrického pole umožňující průchod vybraného fragmentu, který vznikl v prostoru před prvním sektorem Výchozí podmínky na obou sektorech jsou nastaveny tak, aby byl detekován vybraný fragment vznikající v iontovém zdroji. Následně jsou současně skenovány oba sektory za podmínky B 2 /E = konst., a tak jsou nalezeny prekurzory daného fragmentu
Další technika umožňující naměření prekurzorových spekter tzv. acceleration voltage scan or defocussing Pokud iont fragmentuje mezi iontovým zdrojem a prvním sektorem, má vzniklý fragment stejnou rychlost jako prekurzor, ale podstatně menší kinetickou energii a nebude detekován, pokud je analyzátor nastaven na detekci prekurzoru. Nicméně pokud je daný prekurzor urychlen na potřebnou rychlost, tak po jeho rozpadu bude kinetická energie vzniklého fragmentu taková, že projde analyzátorem a detekován bude. Experiment je prováděn tak, že v první fázi je pozornost věnována fragmentu, který má být monitorován a ke kterému jsou hledány všechny jeho prekurzory. Pro jeho detekci, kdy vzniká rozpadem prekurzoru ve zdroji je třeba použít určité urychlovací napětí v iontovém zdroji, U s. Následně je napětí U s postupně skenováno, zvětšováno, intenzita elektrického a magnetického pole ponechána nezměněna a sledovaný fragment vznikající mezi zdrojem a prvním sektorem z různých prekurzorů je detekován při různých charakteristických napětích U s, platí vztah: m p U = U, s s m f
B 2 (1-E)/E 2 linked scan => B 2 (1-E)/E 2 = konst. => skenování neutrální ztráty Některé prekurzorové ionty ztrácejí typické neutrální částice, sledování právě takových prekurzorů bývá cílem MS experimentů, protože tyto ztráty mohou mít velkou vypovídací hodnotu a jsou selektivní Pokud prekurzor ztrácí neutrální částici mezi iontovým zdrojem a prvním sektorem, musí být splněna výše uvedená podmínka proto, aby tato ztráta mohla být detekovana. Pro odhalení všech prekurzorů poskytujících danou charakteristickou neutrální ztrátu musí být tedy oba sektrory odpovídajícím způsobem skenovány.
Mapy metastabilních iontů, B = f(e) Mapa detekovaných iontů bývá znázorněna jako závislost B na E. Při získávání jednotlivých experimentálních bodů takové závislosti je postup založen na skenování B za konstantního E. Následně je zvýšeno E a znovu skenováno B. Tato mapa zahrnuje všechny typy skenů B a E. B vzorek: heptadekan
Přístroje s více než dvěma sektory Instrumenty s více sektory umožňují složitější experimenty a dosažení vyššího rozlišení
Průletový analyzátor, Time-of-Flight, TOF Svou podstatou velmi jednoduchý systém založený na měřeníčasu, který ion potřebuje k překonání určité definované vzdálenosti (v oblasti, kde na něj nepůsobí vnější pole) Koncept popsán v roce 1946 Stephens, Wiley a McLaren v roce 1955 popsali lineární TOF, který byl komercializován Tehdy instrument dosahoval jen malého rozlišení V 80. tých letech renesance v souvislosti s technikou MALDI-TOF Na počátku mají všechny ionty stejnou kinetickou energii, z toho důvodu se v elektrickém poli budou pohybovat různou rychlostí v závislosti na m/z Separace včase - první doletí k detektoru ionty s nízkou hodnotou m/z Měří se tedy čas průletu definované dráhy Lineární TOF, TOF s reflektronem, tj. elektrostatickým zrcadlem kompenzace rozdílů kinetických energií iontů stejné m/z
Velmi vhodný pro spojení s velmi rychlým separačními technikami a pro tandemové systémy Velmi velká skenovací rychlost ~1000 skenů/sec, velký rozsah, vysoká citlivost v celém rozsahu Rozlišení: Rozsah: nízké nebo vysoké (podle uspořádání systému do ~60 000) nemá horní limit Skenovaní rychlost: velká > 10 6 amu/sec Potřebné vakuum: 10-7 torr
Všem iontům je udělena stejná kinetická energie, platí vztah: 2 mv E = = qu = 2 k S zeu S Čas potřebný pro průlet vzdálenosti d je roven: t = d v Kombinace vztahů vede k rovnici: t 2 = m d z 2U 2 S e
TOF umožňuje měření makromolekulárních látek s molekulovou hmotností stovek tisíc Da Instrumenty TOF jsou vysoce citlivé, lze dosahovat nízkých mezí detekce V lineárním modu ale nedosahují příliš vysokého rozlišení Na druhou stranu instrumenty s jedním a více reflektronem dosahují vysokého rozlišení, u komerčních přístrojů až do R = 60 000 Dosažení vysokého rozlišení je podpořeno také tzv. delayed pulsed extraction iontů do letové trubice Princip a smysl reflektronu:
Spojení TOF analyzátoru s kontinuální ionizací TOF analyzátor je přímo kompatibilní s pulzními ionizačními technikami, protože TOF pracuje také v pulzním režimu (např. MALDI-TOF) Kontinuální separační nebo ionizační techniky, typicky spojení s GC-MS nebo LC-MS, ESI, apod., lze ale s TOF analyzátorem po adaptaci také spojit, je třeba kontinuální proces převést na pulzní
Tandemová MS s TOF analyzátorem Kombinace měření v lineárním uspořádání a s reflektronem Post-source decay (PSD) ionty a jejich detekce
V případě vhodného instrumentálního uspořádaní i možnost výběru prekurzoru a následné měření fragmentů PSD v lineáním modu měření m/z prekurzoru a v geometrii reflektronové měření PSD fragmentrů
Curved field reflectron vylepšení detekce fragmentů PSD tím, že není třeba skenovat nebo po krocích měnit potenciál na reflektronu. Podstata: pro reflektrony s lineárním polem je dosahováno optimální fokusace vzhledem k energii pokud platí, L1 + L2 = 4x, kde je L1 a L2 dráha před a za reflektronem, x je vzdálenost v reflektronu do které se dostane iont. To vede k tomu, že ionty odlišných m/z mají odlišné ohniskové body a v důsledku je sníženo rozlišení. Pokud je adaptován potenciál na reflektronu podle m/z, je dosaženo vyššího rozlišení.
Tandemová MS s TOF-TOF analyzátorem
Hybridní tandemová MS s Q-TOF analyzátorem (V uspořádání)
Hybridní tandemová MS s Q-TOF analyzátorem (W uspořádání)
Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací Ion Cyclotron Resonance and Fourier Transform MS (ICR-FT) Měrná cela cyklotronu je umístěna v silném magnetické poli (~ 4-12 T) generovaném supravodivým magnetem chlazeným kapalným heliem Pokud je rychlost letu iontů poměrně malá a magnetické pole silné, lze zachytit ionty na kruhové dráze malého průměru Platí: F = qvb dostředivá síla a dále také: 2 mv F = odstředivá síla r
Pro ionty stabilizované na kruhové dráze platí: 2 mv qvb = qb = r mv r iont uskuteční jeden oblet kruhu odpovídající vzdálenosti 2πr s frekvencí: f = v 2πr úhlová rychlost o je rovna: v ωc = 2πf = = r q m B Úhlová rychlost je tedy dána (q/m)b a je nezávislá na rychlosti v. Nicméně poloměr kruhové dráhy roste pro iont daného poměru m/z s rychlostí v iontu.
Pokud je intenzita magnetického pole rovna 3 T, odpovídá cyklotronová frekvence 1,65 MHz pro iont m/z 28 a 11,5 khz pro iont o m/z 4000. Rozsah frekvencí je tedy značný. Ze vztahu mezi frekvencí a m/z je patrné, že měření hmotnosti se lze provádět přesným měřením frekvence iontů v cele a k tomu se obvykle užívá FT.
Prezantace a animace
Orbitrap Nový typ analyzátoru po dvaceti letech! (Makarov 2002) Kolem centrální elektrody rotují ionty, frekvence jejich pohybu je úměrná jejich m/z Převod frekvenčního signálu na MS spektrum se děje opět FT
2 2 = R R m ω r ω z 1 2 2 = R R m ω z ω ϕ z m k z / = ω Characteristic frequencies: Frequency of rotation ω φ Frequency of radial oscillations ω r Frequency of axial oscillations ω z r { } ) / ln( 2 / 2 ), ( 2 2 2 m R m r R r z k z r U + = z φ
Zařízení nevyužívá magnetické ani RF (dynamické elektrické) pole Radiální nelineární (logaritmické) pole je vytvářeno vložením stejnosměrnéno napětí mezi vnější elektrodu a elektrodu vnitřní (centrální) Vnější elektroda je rozdělena na dvě části a štěrbina umožňuje nastřelení iontů z C-pasti Analyzator je modifikací Kingdonovy (1922) a Knightovy pasti (1981) Ionty jsou do orbitrapu nastřelovány mimo osu ve směru kolmém na tuto z osu Ionty jsou nastřeleny s vhodnou kinetickou energií a začnou se pohybovat po kruhové dráze tak, aby došlo k vyrovnání dostředivé a odstředivé síly, poloměr r je tedy nazávislý na m/z iontů, takže jsou zachyceny ionty všech hodnot m/z Díky nehomegenitě elektrického pole v orbitrapu začnou ionty ve směru osy z oscilovat a právě frekvence těchto oscilací v ose z je závislá na m/z iontů Signál je detekován s využitím FT
Combination of LIT with Orbitrap
C-Trap (C-past) je velmi důležitá, jedná se o zvláštní typ prohnuté LIT umožňující efektivní elektrodynamické stlačení iontů v prostoru a jejich nastřelení ve velmi krátkém okamžiku do orbitrapu Teprve vybavení orbitrapu C-pastí umožnilo jeho praktické využití jako MS analyzátoru Nastřelení iontů do orbitrapu musí být velmi přesně koordinováno s nárůstem potenciálu na centrální elektrodě orbitrapu, aby došlo k efektivnímu přenostu iontů a jejich zachycení Protože frekvence oscilací iontů ve směru z není závislá na energii iontů, ale pouze na jejich m/z hodnotách, lze měření této frekvence využít pro zjískání vysoce rozlišených spekter Orbitrap má větší kapacitu pro ionty než 3D QIT a ICR, je robustní a téměř nevyžaduje udržbu, na druhou stranu vyžaduje velmi hluboké vakuum ~ 10-8 Pa
Rozlišení: vysoké; až 250 000 Rozsah: do 4000 amu Správnost měření m/z do 1 ppm (podle typu kalibrace) Dynamický rozsah 10 3
Prezentace a animace
Orbitrap and ICR-FT analysers
TOF analysers