UIVERZITA KARLVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KÁLVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KTRLY LÉČIV SYTÉZA BISKVARTERÍCH ESYMETRICKÝCH REAKTIVÁTRŮ ACETYLCHLIESTERASY DIPLMVÁ PRÁCE Stanislav Sopr Hradec Králové, 2010
Prohlašuji, že jsem vypracoval diplomovou práci samostatně pod vedením školitele a veškeré prameny jsem uvedl v seznamu použité literatury. Diplomová práce vznikla za podpory grantu SVV-2010-261-001. Hradec Králové, 2010 Stanislav Sopr 2
Děkuji Doc. PharmDr. Martinu Doležalovi, Ph.D. a PharmDr. Kamilu Musílkovi, Ph.D. za pomoc, podporu a trpělivost při realizaci této diplomové práce. 3
Seznam zkratek...7 1 Úvod 8 2 Teoretická část...9 2.1 Acetylcholinesterasa...9 2.1.1 Acetylcholin...9 2.1.2 Acetylcholinové receptory...9 2.1.2.1 ikotinové receptory...10 2.1.2.2 Muskarinové receptory...10 2.1.3 Vlastnosti acetylcholinesterasy...11 2.1.3.1 Struktura molekuly...11 2.1.3.2 Hydrolýza acetylcholinu...11 2.2 Inhibice acetylcholinesterasy...12 2.2.1 Reversibilní inhibitory acetylcholinesterasy...12 2.3 rganofosforové sloučeniny...13 2.3.1 Struktura P...14 2.3.2 Fyzikálně-chemické vlastnosti nervově paralytických látek...14 2.3.3 Mechanismus účinku...15 2.3.4 Regenerace a stárnutí inhibované AChE...16 2.3.5 Biotransformace organofosforových sloučenin...17 2.4 Intoxikace organofosfáty...18 2.4.1 Klinický obraz intoxikace...18 2.4.1.1 Akutní fáze...18 2.4.1.2 Přechodný syndrom...19 2.4.1.3 rganofosfáty navozená opožděná polyneuropatie...19 2.4.2 Terapie otravy organofosfáty...19 2.4.2.1 Anticholinergika...19 2.4.2.2 Antikonvulziva...20 2.5 Reaktivátory acetylcholinesterasy...21 2.5.1 Historie a přehled...21 2.5.2 Mechanismus účinku...22 3 Syntetická část...23 3.1 becná syntetická část...23 3.2 Příprava monokvarterní soli...24 3.3 Příprava biskvarterních solí...24 4 Určení reaktivačních parametrů...44 4.1 Princip metody...44 4.2 Postup měření...45 4.3 Výsledky měření...46 5 Diskuse 47 6 Závěr 48 4
Abstract...53 5
6
Seznam zkratek ACh AChE BuChE DMF DMS DTB GIT Glu His IAChE M machr MeC nachr PL T P Phe Ser Trp acetylcholin acetylcholinesterasa butyrylcholinesterasa,-dimethylformamid dimethylsulfoxid 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina gastrointestinální trakt glutamin histidin inhibitor acetylcholinesterasy muskarinový receptor muskarinový receptor pro acetylcholin acetonitril nikotinový receptor nikotinový receptor pro acetylcholin nervově paralytické látky neurotransmiter organofosforové sloučeniny fenylalanin serin tryptofan 7
1 Úvod rganofosforové sloučeniny (P) patří mezi uměle vytvořené sloučeniny používané v zemědělství, průmyslu i medicíně. První sloučeniny byly vyvinuty jako pesticidy (např. parathion, chlorpyrifos, ad.). Mezi P patří také sloučeniny používané ve vojenství jako chemické zbraně, tzv. nervově paralytické látky (PL). Mezi ně patří např. sarin, tabun, soman. Jejich toxicita je způsobena inhibicí důležitého enzymu acetylcholinesterasy (AChE). Inhibovaný enzym pak není schopný plnit svou biologickou funkci a dochází k hromadění jeho substrátu, acetylcholinu (ACh), na nervové synapsi. Proto se současně s vývojem PL začalo pracovat na přípravě vhodných antidot proti intoxikaci těmito látkami, tzv. reaktivátorů acetylcholinesterasy. Žádný z dosud vytvořených reaktivátorů však nepůsobí spolehlivě proti všem známým PL. Z důvodu hrozby použití těchto látek ve válkách nebo zneužití při teroristických útocích a také kvůli častým otravám organofosforovými pesticidy v zemědělství je výzkum nových reaktivátorů a snaha o nalezení vhodných antidot aktuální. Cílem této práce je příprava nových potenciálních reaktivátorů s xylenovým spojovacím řetězcem mezi dvěma pyridinovými kruhy a in vitro testování jejich účinnosti. 8
2 Teoretická část 2.1 Acetylcholinesterasa Acetylcholinesterasa (AChE; EC 3.1.1.7) patří do skupiny cholinesteras. To je obecný termín pro skupinu enzymů, které hydrolyzují estery cholinu rychleji než ostatní enzymy. V lidském těle existují dva typy cholinesteras, AChE a také butyrylcholinesterasa (BuChE; 3.1.1.8), také známá jako plasmová nebo nespecifická cholinesterasa. AChE se vyskytuje hlavně v nervových zakončeních, dále pak v membráně erytrocytů, bránici a plících (1). 2.1.1 Acetylcholin AChE katalyzuje hydrolýzu esterů s relativní specifitou pro acetylcholin (ACh; br. 1). ACh se jako neurotransmiter vyskytuje jak v centrálním, tak v periferním nervovém systému. Je to hlavní neurotransmiter v parasympatických postgangliových vláknech, ale účastní se přenosu vzruchu i ve vegetativních gangliích a na nervosvalové ploténce. Je syntetizován v cytoplazmě neuronů z acetyl-koenzymu A a cholinu enzymem cholinacetyltransferasou. Po jeho uvolnění z axonu do synaptické štěrbiny, kde se váže na receptory, AChE ukončuje jeho účinek rychlou hydrolýzou a ukončuje tak i přenos nervového impulsu (2). brázek 1 Struktura acetylcholinu. 2.1.2 Acetylcholinové receptory Existují dva základní typy receptorů pro ACh, muskarinové (machr) a nikotinové (nachr), podle afinity k přírodním alkaloidům muskarinu a nikotinu. machr jsou receptory spřažené s G-proteinem a jsou dále děleny na pět podtypů. nachr jsou spřažené s iontovým kanálem a dělí se na dva podtypy (3). 9
2.1.2.1 ikotinové receptory V lidském těle jsou známy dva podtypy nachr, které se liší svou strukturou a také lokalizací v těle. a nervosvalovém spojení se vyskytují tzv. muskulární nachr, které zprostředkovávají přenos signálu mezi neurony a buňkami. Druhý typ se nazývá neuronální a vyskytuje se v mozku a gangliích vegetativní nervového systému, kde zprostředkovává přenos signálu mezi neurony (2). Receptory jsou tvořeny pěti podjednotkami: dvěma α, jednou β, γ a δ a případně ještě ε (v závislosti na stadiu vývoje). Tyto podjednotky pak tvoří pentamerní strukturu, která obklopuje transmembránový pór, specificky propustný pro a +, Ca 2+ a K + (4). Muskulární receptory jsou složené ze dvou jednotek α 1, jedné β 1, δ, γ a případně ε. euronální receptory se skládají z α a β podjednotek různého druhu. Jejich exprese se mění během vývoje a stárnutí a také během onemocnění, jako jsou autismus, schizofrenie, Alzheimerova a Parkinsonova choroba (5). nachr obsahují dvě odlišné domény pro navázání ligandu, což vede k různým cholinergními účinkům. V hydrofilní extracelulární části obou α podjednotek je vazebné místo pro agonistu, jako je přirozený neurotransmiter ACh a pro kompetitivní antagonisty (např d-tubokurarin). Protože jsou obě α podjednotky shodné, zvýšená či snížená afinita agonistů je dána vzájemnou interakcí α a δ nebo γ řetěce. (6) 2.1.2.2 Muskarinové receptory Muskarinové receptory se vyskytují na postsynaptických membránách buněk efektorových orgánů inervovaných parasympatikem (hladké svaly, srdce, žlázy) a v centrální nervové soustavě (CS). Jsou na rozdíl od nachr spřaženy s G-proteinem a můžeme je rozdělit na pět subtypů (M 1 M 5 ). U tří z nich (M 1 M 3 ) je jejich funkce do značné míry objasněna. M 1 podtyp se vyskytuje v CS a parietálních buňkách žaludku, kde způsobuje jejich aktivaci. M 2 podtyp se vyskytuje hlavně v srdeční svalovině, kde jeho aktivita snižuje srdeční činnost. M 3 podtyp se vyskytuje především v hladké svalovině a v exokrinních žlázách. Aktivace způsobí zvýšení svalového tonu a zvýšení exokrinní sekrece (7). 10
2.1.3 Vlastnosti acetylcholinesterasy 2.1.3.1 Struktura molekuly Monomer AChE je molekula s molekulovou hmotností přibližně 60 000. Skládá se 12 centrálních β-skládaných listů propojených mezi sebou 14 α-helixy. V molekule se vyskytuje několik významných domén. Je to aktivní místo enzymu, aromatická štěrbina, v které aktivní místo leží a vnější anionické místo, které hraje hlavní roli při upevnění substrátu uvnitř aromatické štěrbiny (8) Aktivní místo enzymu je tvořeno dvěma podjednotkami: esteratickou a anionickou. Esteratickou podjednotku tvoří tzv. katalytická triáda složená z aminokyselin serinu (Ser), histidinu (His) a glutaminu (Glu). Anionická podjednotka se skládá z tryptofanu (Trp), fenylalaninu (Phe) a Glu. Její funkcí je interakce s kladně nabitou trimethylamoniovou skupinou ACh a je odpovědná za správnou orientaci substrátu na aktivním místě enzymu (9). Podrobnější studie trojrozměrné struktury AChE umisťují aktivní místo na dno úzké a zdánlivě nepřístupné prohlubně zasahující asi 20 Å hluboko dovnitř enzymu (23). V okolí aktivního místa se dále vyskytuje vysoký stupeň aromaticity, který vysvětluje, proč se ukazuje, že jsou hydrofobní, anionické vazebné místo a aktivní místo enzymu na sobě nezávislé (11). 2.1.3.2 Hydrolýza acetylcholinu Při hydrolýze je karbonylový uhlík ACh vystaven nukleofilnímu ataku hydroxylovou skupinou serinu v aktivním místě AChE a dočasně se vytváří kovalentní vazba mezi enzymem a substrátem. Imidazolový dusík histidinu z katalytické triády poté může vytvořit vodíkovou vazbu s hydroxylovou skupinou serinu a podpořit tím nukleofilní reakci. Uvolní se tím cholin, který jé následně zpětně vychytáván do presynaptické štěrbiny, kde slouží k nové syntéze ACh. Potom následuje rychlá spontánní hydrolýza acetylovaného enzymu za uvolnění kyseliny octové a znovuobnovení aktivního místa, čímž je umožněna vysoká efektivita enzymu (12). AChE, na rozdíl od BuChE, je inhibována vysokými koncentracemi substrátu. ACh se zde váže na další vazebné místo pro substrát, tzv. periferní anionické místo, které se nachází na okraje prohlubně s aktivním místem (13). Primární funkce periferní anionického místa může ovšem být také urychlení hydrolýzy ACh při nízkých koncentracích substrátu (14). 11
2.2 Inhibice acetylcholinesterasy Inhibitory AChE (IAChE) působí především jako parasympatolytika. Inhibicí AChE dochází ke zvýšení koncentrace ACh na všech místech, kde ACh působí jako neurotransmitter (T), tj. na efektorech parasympatiku (působí na machr), ve vegetativních gangliích (na neuronálních nachr) a na nervosvalovém spojení (na muskulárních nachr). Proto působí IAChE nejen parasympatolyticky, ale i cholinomimeticky. ěkteré IAChE se váží podobně jako ACh na enzym kovalentní vazbou a tím zabrání přístupu ACh k aktivnímu místo enzymu a jeho hydrolýze. Zpětná hydrolýza komplexu enzym inhibitor je navíc výrazně pomalejší oproti hydrolýze komplexu enzym ACh (1). ejdůležitější IAChE se dají rozdělit na dvě skupiny v závislosti na délce trvání jejich účinku: reversibilní estery kyseliny karbamové s alkoholy, délka trvání účinku je v závislosti na použité sloučenině 0,5 až 6 h ireversibilní organofosforové sloučeniny (P), hydrolýza komplexu enzyminhibitor může trvat až stovky hodin (7) 2.2.1 Reversibilní inhibitory acetylcholinesterasy Jde o estery od kyseliny karbamové, které ve své molekule obsahují terciární nebo kvarterní dusík a které svou strukturou připomínají ACh a jsou tedy jejími substráty. V průběhu hydrolytické reakce se kyselá skupina esteru váže na enzym stejně, jako tomu je při acetylaci během hydrolýzy ACh. Vzniklá vazba je však pevnější a její spontánní hydrolýza zpět na volný enzym trvá 30 min až 6 hod. Mezi tyto sloučeniny patří např. fysostigmin (br. 2), neostigmin-bromid (br. 2) a pyridostigmin-bromid (br. 2) (7). Mezi reversibilní IAChE můžeme také zařadit edrofonium-chlorid (br. 2). Ve své molekule neobsahuje zbytek karbamové skupiny, obsahuje pouze kvarterní dusík. Váže se pouze na anionické místo enzymu. Vzniklá iontová vazba je slabá a účinek krátký, přibližně 2-10 min (1). 12
+ Br - H + Br - fysosigmin brázek 2 Vybrané karbamátové IAChE neostigmin pyridostigmin H + Cl - edrophonium brázek 3 Edrofonium-chlorid. Reversibilní inhibitory lze použít i terapeuticky při některých onemocněních. Jedním z nich je např. Myasthenia gravis, autoimunitní onemocnění, při kterém dochází k poškození muskulárních nachr protilátkami. Tím se snižuje životnost a také dochází k neadekvátní odpovědi na stimulaci ACh. Z toho následně vzniká svalová slabost. Použitím reverzibilních inhibitorů dochází k delší exposici ACh na receptoru a tím k zesílení prodloužení účinku. Toho lze využít diagnosticky i terapeuticky. Reversibilní inhibitory lze využít i k prevenci a léčbě atonií GIT a močových cest, snížení nitroočního tlaku při léčbě glaukomu nebo ke zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby (15). 2.3 rganofosforové sloučeniny ěkteré organické sloučeniny fosforu se řadí mezi dlouhodobé (ireversibilní IAChE). emají však žádný terapeutický efekt, zato ale mají velký význam toxikologický. Vyznačují se rychlým nástupem účinku a dobrým průnikem do organismu všemi branami vstupu. Využívají se jako bojové chemické sloučeniny, v zemědělství pak jako pesticidy (16). První sloučeninou připravenou organofosforovou sloučeninou (P), byl tetraethylpyrofosfát, syntetizovaný v polovině 19. století ve Francii. V roce 1873 pak 13
byla připravena první sloučenina s přímou vazbou fosforu na uhlík a to methylfosforyldichlorid (br. 4). V první polovině 20. století bylo postupně připraveno velké množství P, původně zamýšlených k použití v zemědělství jako insekticidů. Brzy byl ale objeven jejich velký toxický potenciál, který předurčil jejich další použití jako chemických bojových látek, tzv. nervově paralytických látek (PL), mezi nejznámější patří sarin (br. 5), soman (br. 5), tabun(br. 5) a VX (br. 5). Vzhledem k jejich vysoké toxicitě a poměrně levné a snadné výrobě i v dnešní době přetrvává potenciální riziko jejich použití ve válkách nebo zneužití při teroristických útocích. Poměrně časté jsou také intoxikace pracovníků v zemědělství, kteří jsou s těmito jedy v přímém kontaktu (17). Cl Cl P brázek 4 Methylfosforyldichlorid. 2.3.1 Struktura P ejčastěji se jedná o organické sloučeniny kyseliny fosforečné a fosfonové, nebo jejich thioanaloga odvozené od kyseliny thiofosforečné a thiofosfonové. becnou chemickou strukturu vystihuje Schraderův vzorec pro P (br. 5). R 1 a R 2 mohou být vodík, alkyl, cykloalkyl, aryl, alkyloxy, alkylthio a amino skupina. Substituentem X bývá halogen, kyano, alkylthio skupina nebo zbytek organické či anorganické kyseliny (18). Y R 1 P X R 2 brázek 5 Schraderův vzorec pro P Y =, S 2.3.2 Fyzikálně-chemické vlastnosti nervově paralytických látek PL se podle fyzikálně-chemických vlastností dělí na dvě skupiny: 14
G-sloučeniny: mezi ně patří sarin (GB, -isopropylmethylfluorofosfonát, br. 6), soman (GD, -pinakolylmethylfluorofosfonát, br. 6), tabun (GA, - ethyldimethylamidokyanofosfát, br. 6) V-sloučeniny: VX (-ethyl-s-(2-diisopropylaminoethyl)-methylthiofosfonát, br. 6) a jeho analog VR (-isobutyl-s-(2-diethylaminoethyl)- methylthiofosfonát) (16). F Me P F Me P Et P Et Me P S tabun sarin soman VX brázek 6 Příklady některých PL. G-sloučeniny jsou bezbarvé, vodě podobné kapaliny bez výraznějšího zápachu. Jsou relativně dobře rozpustné ve vodě a dobře v organických rozpouštědlech. Jsou velmi těkavé, takže nejpravděpodobnější branou vstupu do organismu jsou dýchací cesty. Ve vnějším prostředí vydrží bez ztráty toxicity 12-24 hodin. V-sloučeniny jsou bezbarvé, viskózní kapaliny bez výraznějšího zápachu. ejsou příliš těkavé, takže vydrží ve vnějším prostředí a ve vodě velmi dlouho (týdny až měsíce). Ve vodě jsou velmi špatně rozpustné, zatímco v organických rozpouštědlech a v tucích jsou rozpustné velmi dobře (16). 2.3.3 Mechanismus účinku Průnik do organismu je usnadněn vysokou lipofilitou P. Po vstupu jsou P transportovány na místo účinku krevním oběhem, kde však dochází k vysokým ztrátám, protože zde P reagují s BuChE a dalšími enzymy, jejichž inhibice na rozdíl od inhibice AChE nevyvolává žádné klinické příznaky. a místo účinku se tak dostává pouze redukované množství oproti původní dávce (16). Základním mechanismem účinku P je zásah do cholinergního nervového systému inhibicí AChE. P nukleofilně atakují hydroxylovou skupinu serinu aktivního místa molekuly AChE. Dochází kde fosforylaci enzymu a vytvoření kovalentní vazby mezi enzymem a P za odštěpení části molekuly P (odstupující skupina, substituent X 15
ve Schraderově vzorci) (Schéma 1). Inhibice tak vede k akumulaci ACh v synaptických štěrbinách svalů a nervů, které vede k nadměrnému dráždění cholinergních receptorů, což může vyústit až v cholinergní krizi. P mohou navíc mít i přímý vliv na samotné receptory a působit jejich poškození (19) AChE + X P R2 AChE P R 2 X Schéma 1 Inhibice acetylcholinesterasy organofosforovou sloučeninou. R 1 R 1 2.3.4 Regenerace a stárnutí inhibované AChE Fosforylovaný enzym je velmi stabilní a jeho spontánní regenerace hydrolýzou vzniklé esterové vazby je velmi pomalá nebo téměř žádná. Jedná se o chemickou reakci, která je závislá na teplotě, ph, iontové síle a typu inhibitoru (20). Syntéza AChE de novo je také pomalá, jedinou možností rychlého obnovení aktivity AChE je proto reaktivace pomocí silně nukleofilních sloučenin, tzv. reaktivátorů AChE. To však může být komplikováno procesem stárnutí inhibovaného enzymu. Jde o dealkylaci fosforylové části komplexu enzym-inhibitor, při které je inhibovaná AChE převedena do tzv. nereaktivovatelné formy, kdy je tento komplex odolný proti reaktivaci a fosforylace se tak stává již plně ireversibilní (20). Rychlost dealkylace je výrazně závislá na chemické struktuře inhibitoru. Z PL je dealkylace nejrychlejší u AChE inhibované somanem, kde se poločas dealkylace pohybuje v řádech minut. aopak nejpomalejší je dealkylace u AChE inhibované látkou VX, zde se poločas pohybuje v řádech dnů. Rychlost dealkylace pak výrazně ovlivňuje efekt léčby intoxikací P (16). ba tyto procesy shrnuje Schéma 2. AChE P R 2 R 1 + H 2 Schéma 2 Regenerace a stárnutí inhibované AChE. regenerace AChE H AChE P R 2 stárnutí + P R 2 R 1 + H + R 1 H + H 16
2.3.5 Biotransformace organofosforových sloučenin V první fázi biotransformace probíhá metabolická transformace P šesti hlavními reakcemi, které jsou hlavně oxidativní a většinou také aktivační, tzn. že produkty těchto reakcí jsou toxičtější než původní substrát. Tyto reakce jsou: o xidativní desulfurace (přeměna thiofosfátu na toxičtější oxonovou formu, např. přeměna pesticidu parathionu na paraoxon, viz. Schéma 3, podobně probíhá u malathionu) o xidativní -dealkylace (probíhá např. u dicrotophosu nebo phosphamidonu) o o o o xidativní -dealkylace (např. chlorfenvinphos) Thioetherová oxidace (např. disulfoton, fenthion) xidace postranního řetězce (např. fenitrithion, diazinon) Různé neoxidativní reakce (např. trichlorfon) S P 2 ox. P 2 parathion paraoxon Schéma 3 xidativní desulfurace parathionu. Při druhé fázi biotransformace, která je definována jako detoxifikační, jsou P konjugovány s endogenními substráty jako jsou glukuronidy a sulfáty. P jsou detoxifikovány pomocí enzymů karboxylesteras (KarbE; např. malathion, soman, sarin tabun), fosforylfosfatas (např. pyrimiphos, paraoxon, soman, sarin, tabun) a glutathionového redoxního systému (např. methylparathion, methylparaoxon, dichlorvos). KarbE hraje významnou roli nejen při detoxifikaci P hydrolýzou jejich esterové vazby, ale také tím, že se P vážou na aktivní místo KarbE a tak se snižuje jejich koncentrace dostupná pro inhibici AChE. ejběžnější cestou metabolismu P je pomocí hydrolýzy, která vede k odštěpení nestabilní odstupující skupiny (substituent X ve Shraderově vzorci, br. 5). Enzym 17
který stojí za touto hydrolýzou je fosforylfosfatasa a je přítomen v mnoha tkáních s vysokou aktivitou v játrech, střevě a plazmě. Produkty hydrolýzy jsou následně vyloučeny močí a stávají se biomarkery intoxikace (19). 2.4 Intoxikace organofosfáty Intoxikace může nastat, u látek používaných jako pesticidů, náhodně, při práci s těmito látkami, často jsou tyto sloučeniny rovněž používány za účelem sebevraždy (21). ervově paralytické sloučeniny mohou být použity ve válkách nebo zneužity při teroristických útocích. Intoxikace může přitom proběhnout různými branami vstupu: přes kůži, přes gastrointestinální trakt, inhalací nebo intravenózně (21). 2.4.1 Klinický obraz intoxikace Inhibice AChE vede k narušení cholinergního přenosu nervového vzruchu, v důsledku nahromadění ACh na receptorech s jejich následným dlouhodobým drážděním. Klinickým důsledkem jsou potom muskarinové, nikotinové a centrální příznaky, charakteristické pro akutní fázi. Soubor těchto příznaků je nazýván akutní cholinergní krize. Po ní může dojít k tzv. přechodnému syndromu a následně až k polyneuropatii (16). 2.4.1.1 Akutní fáze Mezi muskarinové příznaky patří zvýšená sekrece žláz (hypersalivace, slzení a pocení a také zvýšená sekrece bronchiálních žláz), zvýšená gastrointestinální motilita (nevolnost, křeče a defekace), bronchokonstrikce (tíže na prsou a dušnost), mióza a porucha akomodace oka, hypotenze a bradykardie. K nikotinovým příznakům patří svalová ochablost a třes, následně pak tonicko-klonické křeče, které mohou vyústit až v paralýzu kosterního svalstva a tím i dýchacích svalů, což bývá jedna z hlavních příčin smrti v důsledku těžkých intoxikací. Centrální příznaky jsou hlavně deprese, napětí, neklid, bolest hlavy, závratě, zmatenost, nezřetelná mluva, kóma a deprese kardiovaskulárních a dechového centra v prodloužené míše (další hlavní příčina smrti) (22). 18
2.4.1.2 Přechodný syndrom Přibližně 1. až 4. den po akutní fázi se může objevit tzv. přechodný syndrom. Charakteristická je pro něj svalová slabost a obrna hlavových nervů. Může také dojít až k respiračnímu selhání doprovázenému obrnou dýchacích svalů a bránice (23) 2.4.1.3 rganofosfáty navozená opožděná polyneuropatie 7. až 21. den po otravě se objevuje tzv. opožděná neuropatie. Postihuje hlavně nervy periferního nervového systému a způsobuje symetrickou slabost periferních svalů rukou a nohou, s různým stupněm poruchy senzorických funkcí. Tato dysfunkce může být trvalá, ale je možná i následná částečná reparace. Způsobuje ji inhibice neurotoxické esterasy a histologické změny v periferních neuronech, degradace myelinu a degeneraci axonů. Klinicky se manifestuje bolestí a parestezií končetin, křečí a proximálně se šířící paralýzou svalů. Po následné denervaci se může dostavit až těžká atrofie svalů horních a dolních končetin (38). Kromě toho je navíc organismus zatížen následky dlouhodobé hypoxie a acidózy a dlouhou dobu také mohou přetrvávat neurologické obtíže jako nespavost, depresivní a úzkostné stavy, poruchy paměti, učení a koncentrace. Dalším problémem může být remise otravy v důsledku vyplavení PL z depotních míst nebo uvolněním z vazby na krevní bílkoviny (16). 2.4.2 Terapie otravy organofosfáty Při otravě P se používají tři skupiny léčiv s odlišným mechanismem účinku: anticholinergní léčiva (především atropin), reaktivátory AChE (oximy, např. pralidoxim, obidoxim, trimedoxim) a antikonvulziva (benzodiazepinová antikonvulziva, především diazepam) (19). 2.4.2.1 Anticholinergika Anticholinergika se v případě otravy P používají jako funkční antidota (symptomatická), protože neodstraňují příčinu otravy, ale zmírňují její následky. Anticholinergika obsazují cholinergní receptory a zabraňují tak jejich nadměrné stimulaci ACh. Základním léčivem v těchto případech je atropin (br. 7). Je možno použít i jiná anticholinergika, např. benaktyzin (br. 7) (16). 19
H H atropin benaktyzin brázek 7 Příklady používaných anticholinergik. 2.4.2.2 Antikonvulziva ejdůležitějším antikonvulzivem při terapii otravy P je diazepam (br. 8). Diazepam způsobí hyperpolarizaci neuronů, které pak nejsou citlivé k depolarizaci, kterou vyvolá ACh. Tím diazepam zastavuje křeče a zabrání vzniku tonicko-klonických křečí (25). Používá se u pacientů, u kterých se objevují křeče a fascikulace. Měl by se ale podávat i preventivně k zabránění vzniku křečí. Kromě tohoto účinku diazepam odstraňuje i úzkost a neklid a při podání s atropinem a reaktivátory AChE snižuje mortalitu (26). Cl diazepam brázek 8 Antikonvulzivum první volby při intoxikaci P. 20
2.5 Reaktivátory acetylcholinesterasy Reaktivátory AChE umožňují návrat k normálnímu přenosu cholinergního nervového vzruchu pomocí reaktivace organofosfáty inhibované AChE. Patří tedy mezi kauzální antidota P intoxikací (16). 2.5.1 Historie a přehled První sloučeninou, která byla schopná defosforylace inhibované AChE, byl hydroxylamin. Poprvé byl použit proti P v roce 1951. Jeho pomocí bylo dosáhnuto defosforylace AChE inhibované tetraethylpyrofosfátem (27). Dále se výzkum zaměřil na hledání specifických antidot, které by byly schopny nukleofilně atakovat fosforylovanou AChE a měly by strukturu podobnou ACh. První reaktivátor ze skupiny monopyridiniových sloučenin byl pralidoxim (2-PAM, br. 9), schopný reaktivovat AChE až milionkrát rychleji než hydroxylamin (28). Další vývoj se zaměřil na bispyridiniové sloučeniny, jako jsou obidoxim, trimedoxim, HI-6 (br. 9). Reaktivátory AChE jsou tedy mono nebo bispyridiniové sloučeniny používané ve formě solí jako např. chloridy, jodidy, bromidy, laktáty a methylsulfonáty (29). Cl H H 2 Cl H pralidoxim obidoxim H H 2 Br H 2 Cl trimedoxim HI-6 H 2 brázek 9 Příklady struktur reaktivátorů AChE. Existují určité vztahy mezi strukturou a schopností reaktivovat inhibovanou AChE. Jedná se o čtyři strukturní znaky ovlivňující afinitu reaktivátoru k inhibované 21
AChE. Přítomnost kvarterního dusíku (přičemž biskvarterní sloučeniny se vyznačují lepší afinitou než sloučeniny monokvarterní) (29), přítomnost nukleofilní oximové skupiny (30), její pozice na pyridiniovém jádru (vhodnější jsou sloučeniny s oximovou skupinou v pozici 2 a 4) (31). U bispyridiniových sloučenin je rozhodující také délka spojovacího řetězce mezi oběma jádry (32). Přes intenzivní výzkum zatím nebyl nalezen mezi velkým množstvím testovaných sloučenin žádný reaktivátor, který by byl schopen dostatečně reaktivovat inhibovanou AChE nezávisle na struktuře použitého P inhibitoru. 2.5.2 Mechanismus účinku Hlavním mechanismem účinku reaktivátorů AChE je odštěpení zbytku P na hydroxylové skupině serinu v aktivním místě AChE (33). Kladně nabitá část molekuly reaktivátoru nasměruje sloučeninu k aktivnímu místu enzymu. Silně nukleofilní oximová skupina následně napadá fosforylovanou část enzymu. Tak vznikne nestabilní komplex enzym-inhibitor-oxim, který se rozpadá na regenerovaný enzym a fosforylovaný oxim (Schéma 4) (34). Fosforylovaný oxim může být sám silným inhibitorem a znovu tak inhibovat reaktivovanou AChE. K tomu ale může dojít pouze v případě, že fosforylovaný oxim inhibuje AChE rychleji, než dochází k jeho eliminaci nebo rozkladu na netoxické produkty (35). AChE P R1 + R AChE + R 2 R 1 R 2 P R Schéma 4 Mechanismus účinku reaktivátorů AChE. 22
3 Syntetická část 3.1 becná syntetická část Rozpouštědla (aceton, DMF, MeC) a chemikálie byly dodány od firem Fluka a Sigma-Aldrich a použity bez dalšího přečištění. Reakce byly monitorovány pomocí TLC (DC-Alufolien Cellulose F, Merck, ěmecko) s použitím soustavy BuH- CH 3 CH-H 2 5:1:2 a detekovány Dragendorfovým činidlem. Teploty tání byly měřeny na bodotávku PHMK 05 (VEB Kombinat agema, Radebeul) a nejsou korigovány. MR spektra byla měřena na Varian Gemini 300 ( l H 300 MHz, l3 C 75 MHz, Palo Alto CA, USA). Chemické posuny pro 1 H i 13 C spektra jsou uvedeny v ppm (δ) v poměru k signálu rozpouštědla DMS (δ 2.50 pro 1 H; δ 39.43 pro 13 C). Signály jsou uvedeny jako s (sing1et), d (dublet), t (triplet) a m (multiplet). Elementární analýza byla provedena na přístroji EA 1110 CHS instrument (CE Instruments, Milano, Italy). ESI-MS spektra byla měřena s použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. HP1100 HPLC systém byl dodán z Agilent Technologies (Waldbronn, ěmecko). Skládá se z vakuového zplynovače G1322A, kvarterní pumpy G1311A, autosampleru G1313A a kvadrupólového hmotnostního spektrometru MSD1456 VL vybaveného zdrojem elektrospray-ionizace. Dusík pro hmotnostní spektrometr byl získán z dusíkového generátoru Whatman 75-720. Data byla odečtena v pozitivním iontovém módu s ESI sondou o napětí 4000 V. Tlak rozprašovaného plynu byl ustaven na 35 psig. Teplota sušícího plynu byla 335 DC a průtok 13 l/min. 23
3.2 Příprava monokvarterní soli dpovídající hydroxyiminomethylpyridin (1.0 g; 8.2 mmol) byl rozpuštěn v acetonu (100 ml) a byl přidán odpovídající dibromxylen (10.8 g; 40.9 mmol). Směs byla zahřívána při refluxu acetonu po dobu 8 hodin a poté ochlazena na l.t. Surový produkt byl odfiltrován za sníženého tlaku a rekrystalován v MeC (Schéma 5). Br H Br aceton H Br Br Schéma 5 becná příprava monokvarterních solí. Monokvarterní soli byly připraveny podobně jako v dříve publikované diplomové práci (37). Analytická data (MR, MS, CHS) připravených monokvarterních sloučenin se shodují s dříve publikovanými sloučeninami, proto nejsou součástí této diplomové práce. 3.3 Příprava biskvarterních solí dpovídající monokvarterní sůl (0.5 g; 1.3 mmol) byla rozpuštěna v DMF (10 ml) společně s odpovídajícím acetylpyridinem (0.24 g; 1.9 mmol). Směs byla zahřívána při 70 C po dobu 2,5-23 hodin a poté ochlazena na l.t. K reakční směsi byl přidán nadbytek acetonu (50 ml) a byla uchována v chladicím boxu přes noc. Surový pevný produkt byl dekantován, kapalná část reakční směsi odlita, surový produkt převrstven MeC (50 ml) a ponechán při l.t. přes noc. Surový produkt byl filtrován za sníženého tlaku a rekrystalován z MeC (Schéma 6). 24
H Br Br DMF CCH 3 H 2 Br CCH 3 1-18 Schéma 6 becná příprava biskvarterních solí. 25
3-acetyl-2 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,2-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (1) H=HC CCH 3 2 Br Doba reakce 30 h. Výtěžek 27 %. T.t. 214-216 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.81 (s, 1H, H 2), 9.30 (d, 1H, J = 6.2 Hz, H- 6), 9.12 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H-6 ), 9.04 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-4), 8.76-8.66 (m, 2H, H 5, -CH=H), 7.56 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-3 ), 8.43-8.35 (m, 1H, H 4 ), 8.26-8.18 (m, 1H, H 5 ), 7.52-7.38 (m, 2H, Ph), 7.31 (d, 1H, J = 7.0 Hz, Ph), 6.63 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ph), 6.38 (s, 2H, -CH 2 -), 6.29 (s, 2H, -CH 2 -), 2.79 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.10, 147.71, 146.24, 146.08, 145.86, 144.79, 141.29, 135.61, 132.40, 131.60, 130.12, 129.60, 129.30, 128.66, 128.14, 126.35, 126.02, 60.35, 57.94, 27.47. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.92% C, 4.31% H, 8.45%. 26
4-acetyl-2 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,2-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (2) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 5 h. Výtěžek 76 %. T.t. 204-206 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.43 (d, 1H, J = 5.7 Hz, H-2,6), 9.08 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6 ), 8.76-8.65 (m, 2H, H 3, -CH=H), 8.62-8.54 (m, 3H, H 3,5,4 ), 8.27-8.19 (m, 1H, H 5 ), 7.50-7.37 (m, 2H, Ph), 7.26 (d, 1H, J = 7.0 Hz, Ph), 6.62 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ph), 6.39 (s, 2H, -CH 2 -), 6.29 (s, 2H, -CH 2 -), 2.78 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.66, 148.81, 147.72, 146.80, 146.25, 146.08, 141.31, 132.48, 131.62, 130.14, 129.47, 129.29, 128.15, 126.33, 126.04, 60.31, 57.90, 27.50. ESI-MS: m/z 345.8 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.42% C, 4.46% H, 8.54%. 27
3-acetyl-3 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,2-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (3) H=HC CCH 3 2 Br Doba reakce 30 h. Výtěžek 27 %. T.t. 154-156 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.83 (s, 1H, H 2), 9.37 (s, 1H, H 2 ), 9.30 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6), 9.17 (d, 1H, J = 6.2 Hz, H-6 ), 9.10 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-4), 8.82 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-4 ), 8.42-8.32 (m, 2H, H 5, -CH=H), 8.27-8.20 (m, 1H, H 5 ), 7.54-7.48 (m, 2H, Ph), 7.35-7.29 (m, 1H, Ph), 7.24-7.18 (m, 1H, Ph), 6.35 (s, 2H, -CH 2 -), 6.28 (s, 2H, -CH 2 -), 2.77 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.05, 147.68, 145.91, 144.78, 143.19, 142.66, 142.15, 135.57, 133.77, 132.85, 132.28, 130.07, 129.28, 128.63, 60.40, 60.30, 27.44. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.85% C, 4.59% H, 8.49%. 28
3-acetyl-4 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,2-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (4) CCH 3 H=HC 2 Br Doba reakce 30 h. Výtěžek 39 %. T.t. 233-234 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.93 (s, 1H, H 2), 9.38 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H- 6), 9.21 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-2,6 ), 9.09 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-4), 8.48 (s, 1H, -CH=H), 8.38-8.32 (m, 2H, H 5), 8.29 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-3,5 ), 7.54-7.45 (m, 2H, Ph), 7.30-7.25 (m, 1H, Ph), 7.24-7.19 (m, 1H, Ph), 6.41 (s, 2H, -CH 2 -), 6.31 (s, 2H, -CH 2 -), 2.77 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.05, 149.02, 147.78, 146.03, 145.40, 144.94, 144.65, 135.58, 132.86, 132.70, 129.90, 129.61, 129.23, 128.59, 124.28, 60.17, 59.58, 27.42. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.37% C, 4.05% H, 8.30%. 29
4-acetyl-3 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,2-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (5) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 32 h. Výtěžek 30 %. T.t. neměřeno (amorfní). 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.40 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-2,6), 9.35 (s, 1H, H 2 ), 9.16 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6 ), 8.82 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-4 ), 8.56 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-3,5), 8.41 (s, 1H, -CH=H), 8.28-8.20 (m, 1H, H 5 ), 7.56-7.47 (m, 2H, Ph), 7.35-7.29 (m, 1H, Ph), 7.24-7.17 (m, 1H, Ph), 6.32 (s, 2H, -CH 2 -), 6.25 (s, 2H, -CH 2 -), 2.77 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.58, 148.83, 146.76, 144.75, 143.20, 142.64, 142.15, 133.77, 132.77, 132.39, 130.11, 129.88, 129.33, 128.54, 126.28, 60.34, 60.28, 27.45. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.65% C, 4.58% H, 8.62%. 30
4-acetyl-4 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,2-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (6) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 30 h. Výtěžek 42 %. T.t. 198-200 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.39 (d, 2H, J = 5.8 Hz, H-2,6), 9.12 (d, 2H, J = 5.8 Hz, H-2,6 ), 8.56 (d, 2H, J = 5.8 Hz, H-3,5), 8.49 (s, 1H, -CH=H), 8.30 (d, 2H, J = 5.8 Hz, H-3,5 ), 7.56-7.45 (m, 2H, Ph), 7.33-7.25 (m, 1H, Ph), 7.24-7.16 (m, 1H, Ph), 6.31 (s, 2H, -CH 2 -), 6.21 (s, 2H, -CH 2 -), 2.77 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.56, 149.00, 148.81, 146.71, 145.32, 145.04, 132.68, 132.63, 130.09, 130.02, 129.70, 129.37, 126.31, 124.37, 60.27, 59.62, 27.45. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.97% C, 4.40% H, 8.21%. 31
3-acetyl-2 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,3-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (7) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 19 h. Výtěžek 23 %. T.t. 142-144 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.83 (s, 1H, H 2), 9.37 (d, 1H, J = 5.6 Hz, H- 6), 9.29 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6 ), 9.04 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4), 8.71-8.61 (m, 2H, H 5, -CH=H), 8.42 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-3 ), 8.36-8.28 (m, 1H, H 4 ), 8.26-8.18 (m, 1H, H 5 ), 7.66-7.54 (m, 3H, Ph), 7.30 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ph), 6.14 (s, 2H, -CH 2 -), 6.01 (s, 2H, -CH 2 -), 2.76 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 193.99, 147.23, 147.07, 146.57, 145.99, 145.36, 144.54, 141.33, 135.61, 134.98, 130.01, 129.24, 128.58, 128.14, 127.92, 127.75, 126.11, 62.72, 59.94, 27.41. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.26% C, 4.48% H, 7.93%. 32
4-acetyl-2 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,3-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (8) CCH 3 CH=H 2 Br Doba reakce 30 h. Výtěžek 59 %. T.t. 219-221 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.47 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-2,6), 9.32 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6 ), 8.72-8.61 (m, 2H, H 4, -CH=H), 8.53 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-3,5), 8.42 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-3 ), 8.28-8.19 (m, 1H, H 5 ), 7.54-7.56 (m, 2H, Ph), 7.54-7.45 (m, 1H, Ph), 7.30 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ph), 6.15 (s, 2H, -CH 2 -), 6.00 (s, 2H, -CH 2 -), 2.74 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.53, 148.60, 147.06, 146.57, 146.22, 146.01, 141.39, 134.92, 130.06, 129.28, 128.23, 127.98, 127.93, 126.26, 126.16, 62.68, 59.93, 27.47. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.91% C, 4.38% H, 8.34%. 33
3-acetyl-3 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,3-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (9) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 50 h. Výtěžek 8 %. T.t. 157-159 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.53-9.45 (m, 3H, H-2,2,6), 9.23 (d, 1H, J = 6.2 Hz, H-6 ), 8.78 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-4), 8.57-8.50 (m, 2H, H-4,5), 8.40 (s, 1H, -CH=H), 8.25-8.18 (m, 3H, H 5 ), 7.84 (s, 1H, Ph), 7.65-7.49 (m, 3H, Ph), 6.02 (s, 2H, -CH 2 -), 5.95 (s, 2H, -CH 2 -), 2.74 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.56, 148.65, 146.38, 144.54, 143.19, 142.52, 141.93, 134.92, 133.71, 130.02, 129.75, 129.64, 129.43, 128.48, 126.26, 62.85, 62.77, 27.45. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.86% C, 4.28% H, 7.93%. 34
3-acetyl-4 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,3-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (10) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 16 h. Výtěžek 11 %. T.t. neměřeno (amorfní). 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.83 (s, 1H, H-2), 9.40 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H- 6), 9.21 (d, 2H, J = 6.2 Hz, H-2,6 ), 9.05 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4), 8.45 (s, 1H, -CH=H), 8.38-8.21 (m, 3H, H 3,5,5 ), 7.83 (s, 1H, Ph), 7.66-7.48 (m, 3H, Ph), 6.04 (s, 2H, -CH 2 -), 5.90 (s, 2H, -CH 2 -), 2.76 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.06, 148.77, 147.39, 145.49, 145.11, 145.04, 144.52, 135.65, 135.10, 134.92, 129.98, 129.59, 129.26, 128.59, 124.32, 62.80, 62.12, 27.45. ESI-MS: m/z 345.9 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.81% C, 4.56% H, 8.16%. 35
4-acetyl-3 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,3-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (11) CCH 3 H=HC 2 Br Doba reakce 23 h. Výtěžek 49 %. T.t. neměřeno (amorfní). 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.18-9.11 (m, 2H, H-2,6), 8.92 (d, 2H, J = 6.3 Hz, H-2,6 ), 8.74 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H-4 ), 8.47 (d, 2H, J = 6.3 Hz, H-3,5), 8.33 (s, 1H, -CH=H), 8.15-8.07 (m, 1H, H 5 ), 7.66-7.56 (m, 4H, Ph), 5.95 (s, 2H, -CH 2 -), 5.90 (s, 2H, -CH 2 -), 2.79 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 198.28, 149.77, 146.71, 145.27, 145.05, 143.50, 143.04, 134.47, 134.16, 131.46, 131.27, 130.34, 129.19, 127.21, 125.70, 64.92, 27.35. ESI-MS: m/z 345.9 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.45% C, 4.07% H, 8.34%. 36
4-acetyl-4 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,3-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (12) H=HC CCH 3 2 Br Doba reakce 15 h. Výtěžek 55 %. T.t. 161-162 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.49 (d, 2H, J = 6.2 Hz, H-2,6), 9.21 (d, 2H, J = 6.4 Hz, H-2,6 ), 8.53 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-3,5), 8.46 (s, 1H, -CH=H), 8.28 (d, 2H, J = 6.4 Hz, H-3,5 ), 7.82 (s, 1H, Ph), 7.64-7.48 (m, 3H, Ph), 6.02 (s, 2H, -CH 2 -), 5.90 (s, 2H, -CH 2 -), 2.75 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.57, 148.77, 148.65, 146.37, 145.12, 145.04, 135.13, 134.91, 130.03, 129.65, 129.33, 126.28, 124.33, 62.80, 62.11, 27.45. ESI-MS: m/z 345.9 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.80% C, 4.49% H, 8.18%. 37
3-acetyl-2 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,4-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (13) CCH 3 CH=H 2 Br Doba reakce 32 h. Výtěžek 75 %. T.t. 219-221 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.87 (s, 1H, H-2), 9.40 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H- 6), 9.29 (d, 1H, J = 6.0 Hz, H-6 ), 9.03 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4), 8.73 (s, 1H, -CH=H), 8.69-8.60 (m, 1H, H-5), 8.43 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-3 ), 8.36-8.28 (m, 1H, H-4 ), 8.25-8.17 (m, 1H, H-5 ), 7.66 (d, 2H, J = 7.6 Hz, Ph), 7.35 (d, 2H, J = 7.6 Hz, Ph), 6.16 (s, 2H, -CH 2 -), 6.04 (s, 2H, -CH 2 -), 2.74 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.03, 147.23, 147.07, 146.44, 145.96, 145.38, 144.51, 141.30, 135.69, 135.13, 134.98, 134.63, 129.58, 127.97, 126.05, 62.56, 59.69, 27.37. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.54% C, 4.39% H, 7.79%. 38
4-acetyl-2 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,4-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (14) CH=H 2 Br CCH 3 Doba reakce 32 h. Výtěžek 61 %. T.t. 217-219 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.50 (d, 2H, J = 5.8 Hz, H-2,6), 9.30 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6 ), 8.73 (s, 1H, -CH=H), 8.68-8.61 (m, 1H, H-4 ), 8.52 (d, 2H, J = 5.6 Hz, H-3,5), 8.43 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H-3 ), 8.24-8.17 (m, 1H, H-5 ), 7.65 (d, 2H, J = 7.4 Hz, Ph), 7.35 (d, 2H, J = 7.6 Hz, Ph), 6.16 (s, 2H, -CH 2 -), 6.01 (s, 2H, -CH 2 -), 2.72 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.47, 148.63, 147.06, 146.44, 146.24, 145.96, 141.29, 135.23, 135.06, 134.65, 129.59, 128.02, 127.88, 126.28, 126.05, 62.53, 59.66, 27.38. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.30% C, 4.41% H, 7.92%. 39
3-acetyl-3 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,4-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (15) H=HC CCH 3 2 Br Doba reakce 25 h. Výtěžek 68 %. T.t. 216-218 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.88 (s, 1H, H-2), 9.49 (s, 1H, H-2 ), 9.42 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6), 9.25 (d, 1H, J = 6.2 Hz, H-6 ), 9.03 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4), 8.75 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4 ), 8.39-8.28 (m, 2H, H-5, -CH=H), 8.23-8.16 (m, 1H, H-5 ), 7.75-7.64 (m, 4H, Ph), 6.06 (s, 2H, -CH 2 -), 5.96 (s, 2H, -CH 2 -), 2.75 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.06, 147.26, 145.41, 144.51, 144.41, 143.18, 142.34, 142.00, 135.69, 135.14, 133.73, 129.66, 129.60, 128.59, 128.49, 62.66, 62.57, 27.41. ESI-MS: m/z 345.9 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.21% C, 4.39% H, 8.32%. 40
4-acetyl-3 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,4-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (16) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 25 h. Výtěžek 27 %. T.t. neměřeno (amorfní). 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.54-9.43 (m, 3H, H-2,6,2 ), 9.23 (d, 1H, J = 5.9 Hz, H-6 ), 8.74 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4 ), 8.52 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-3,5), 8.36 (s, 1H, -CH=H), 8.23-8.15 (m, 1H, H-5 ), 7.68 (s, 4H, Ph), 6.02 (s, 2H, -CH 2 -), 5.95 (s, 2H, -CH 2 -), 2.72 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 195.51, 148.64, 146.26, 144.41, 143.18, 142.34, 142.01, 135.22, 135.16, 133.73, 129.64, 128.49, 126.30, 62.67, 62.61, 27.41. ESI-MS: m/z 346.0 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.79% C, 4.43% H, 8.11%. 41
3-acetyl-4 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,4-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (17) H=HC CCH 3 2 Br Doba reakce 25 h. Výtěžek 70 %. T.t. 255-256 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.86 (s, 1H, H-2), 9.40 (d, 1H, J = 6.2 Hz, H- 6), 9.21 (d, 2H, J = 5.9 Hz, H-2,6 ), 9.03 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-4), 8.43 (s, 1H, -CH=H), 8.37-8.22 (m, 3H, H-3,5,5 ), 7.76-7.60 (m, 4H, Ph), 6.04 (s, 2H, -CH 2 -), 5.89 (s, 2H, -CH 2 -), 2.74 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 194.06, 148.75, 147.24, 145.39, 145.01, 144.53, 135.70, 135.37, 135.07, 129.65, 129.48, 128.59, 124.36, 62.63, 61.97, 27.36. ESI-MS: m/z 345.9 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.60% C, 4.40% H, 8.40%. 42
4-acetyl-4 -hydroxyiminomethyl-1,1 -(1,4-fenyldimethylenyl)-bispyridinium-dibromid (18) H=HC 2 Br CCH 3 Doba reakce 25 h. Výtěžek 61 %. T.t. 248-250 C. 1 H MR (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9.67-9.39 (m, 2H, H-2,6), 9.36-9.07 (m, 2H, H-2,6 ), 8.72-8.11 (m, 5H, H-3,3,5,5, -CH=H), 7.68 (s, 4H, Ph), 6.21-5.72 (m,4h, -CH 2 -), 2.72 (s, 3H, CH 3 -). 13 C MR (75 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 193.95, 148.78, 148.74, 146.28, 145.03, 135.49, 135.46, 135.11, 129.68, 126.32, 124.38, 62.63, 61.94, 27.42. ESI-MS: m/z 345.9 [M 2+ -H] (kalkulováno pro [C 21 H 20 3 2+ 2 ] 346.16). EA: vypočítáno 49.73% C, 4.17% H, 8.28% ; nalezeno 49.65% C, 4.13% H, 7.80%. 43
4 Určení reaktivačních parametrů 4.1 Princip metody K určení reaktivační/inhibiční schopnosti syntetizovaných sloučenin byla použita spektrofotometrická metoda, známá jako Ellmanova metoda. Tato spektrometrická metoda je velmi citlivá a je použitelná při malém množství tkáně nebo při nízkých koncentracích enzymu. Při této metodě je jako substrát použit acetylthiocholin, analog přirozeně se vyskytujícího acetylcholinu. Principem této metody je měření míry produkce thiocholinu při hydrolýze acetylthiocholinu pomocí AChE (Schéma 7). To je umožněno průběžnou reakcí thiocholinu s 5-dithiobis-2-nitrobenzoátovým iontem za vzniku žlutého iontu 5-thio-2-nitrobenzoové kyseliny (Schéma 8) (36). S CH 3 + H 2 AChE S + + 2 H Schéma 7 Hydrolýza acetylthiocholinu. S C + S 2 S 2 C S S 2 C + C S 2 Schéma 8 Vznik 5-thio-2-nitrobenzoové kyseliny. 44
4.2 Postup měření Reaktivační/inhibiční schopnost sloučenin byla měřena na multikanalálovém spektrofotometru Sunrise (Tecan, Salzburg, Rakousko). Jako reakční kyvety byly zvoleny standardní polystyrenové destičce s 96 komorami (unc, Rochlide, Dánsko). Při experimentech byla použita AChE z lidských erytrocytů (Sigma-Aldrich). Pesticid paraoxon byl získán od firmy Sigma-Aldrich. Během všech experimentů byl použit 50 mm fosfátový pufr ph 7,4. Aktivita enzymu byla upravena na 0.002 U/µl. Jedna komora byla naplněna následujícímí sloučeninami roztok enzymu (15 µl), fosfátový pufr (60 µl), 0.4 mg/ml 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTB; 20 µl). Enzym byl inhibován 10-4 M roztokem paraoxonu (5 µl) v čistém propan-2-olu nebo byl použit samotný propan-2-ol pro kontrolní měření. Směs byla ponechána 5 minut pro inhibici AChE. ásledně byla AChE reaktivována přidáním oximového reaktivátoru o koncentraci 10-4 M/10-6 M rozpuštěném ve fosfátovém pufru. Enzymová aktivita byla měřena po patnácti minutách inkubace přidáním 1 mm acetylthiocholin chloridu (20 µl, ATChCl). ximolýza byla určena stejným způsobem nahrazením enzymu fosfátovým pufrem obsahujícím albumin o koncentraci 1 mg/ml. Destička byla protřepána zabudovaným robotickým systémem těsně před samotným měřením. Absorbance byla měřena proti fosfátovému pufru při 412 nm. Schopnost reaktivace byla vypočítána podle následující rovnice. (%) = Ar A 0 A A ox i 100 A r znamená absorbanci při 412 nm způsobenou reaktivovanou cholinesterasou; A ox absorbance způsobená oximolýzou; A 0 absorbance způsobená neinhibovanou cholinesterasou; A i absorbance způsobená inhibovanou cholinesterasou. Všechna měření byla provedená třikrát a reaktivační data jsou vyjádřena jako průměrná hodnota ± směrodatná odchylka (SD). 45
4.3 Výsledky měření Všechny sloučeniny byly testovány při dvou koncentracích. (10-4 M, 10-6 M). Paraoxon byl použit jako P inhibitor. Jako referenční látky byly použity pralidoxim, HI-6 a obidoxim. Testované sloučeniny a výsledky reaktivace, které jsou spočítány jako průměr tří nezávislých měření, jsou shrnuty v Tabulce 1. Reaktivace [%] Reaktivátor / Koncentrace reaktivátoru 10-4 M 10-6 M pralidoxim 8.6 ± 2.4 6.5 ± 2.1 HI-6 9.6 ± 1.6-3.0 ± 0.6 obidoxim 42.4 ± 4.0 4.0 ± 0.5 1 5.1±0.5 1.4±0.3 2 7.5±0.5 10±0.4 3 4.1±0.3 8.7±0.8 4 8.8±1.0 6.9±0.3 5 2.0±0.5 5.2±0.4 6 7.7±0.4 1.9±0.5 7-1.0±1.5 3.1±0.4 8 18.2±2.2 4.8±0.7 9 2.9±0.4 1.5±0.5 10 2.7±0.4 2.7±0.4 11 1.1±0.4 2.4±0.3 12 4.1±0.4 3.7±0.2 13 3.7±0.7 1.8±0.4 14 2.5±0.5 1.4±0.2 15 1.3±0.2 0.0±0.3 16-1.0±1.1 0.5±0.7 17 0.8±0.7 0.0±0.9 18 7.0±0.4 1.7±0.3 Tabulka 1 Výsledky reaktivace paraoxonem inhibované AChE. 46
5 Diskuse Schopnost reaktivace sloučenin vhodných pro testování in vivo by měla přesahovat 10 % účinnost při testování in vitro (35). Při koncentraci 10-4 mol/l byl z referenčních sloučenin tuto hranici překonal pouze obidoxim. Pralidoxim i HI-6 měli reaktivační aktivitu nížší než 10 %. Při koncentraci 10-6 mol/l žádná z referenčních látek nedokázala překonat hranici 10 %. Žádná z nově syntetizovaných sloučenin nesplnila podmínku 10 % aktivity při obou měřených koncentracích. Při koncentraci 10-4 mol/l překonala hranici 10 % aktivity pouze sloučenina číslo 8. Její aktivita však nebyla vyšší než v případě obidoximu. Sloučenina číslo 4 měla reaktivační aktivitu nižší než 10 % a byla na úrovni reaktivace standardu pralidoximu. Pouze sloučenina číslo 2 vykazovala alespoň 10 % aktivity při koncentraci 10-6 mol/l. Další sloučeniny (3-4) dosáhly vyšší aktivity než všechny tři komerční sloučeniny. U pěti sloučenin (2-3, 5, 7, 11) byla naměřena vyšší schopnost reaktivace inhibované AChE při nižší koncentraci, což je způsobeno současnou reaktivační i inhibiční schopností daných sloučenin (38). Dvě sloučeniny (2, 16) vykazovaly při koncentraci 10-4 mol/l záporné hodnoty reaktivační aktivity. To je způsobeno jevem známým jako oximolýza. To je reakce kdy s acetylthiocholinem reaguje testovaný reaktivátor místo reaktivované AChE a barevná reakce vzorku bez enzymu tak překrývá barevnou reakci daného vzorku s enzymem (A ox >A r ). Z uvedených výsledků vyplývá určitý vztah mezi strukturou a reaktivačním účinkem připravených sloučenin. ejvětší aktivitu vykazovaly sloučeniny, u kterých byl spojovacím řetězcem o-xylen. aopak nejnižší aktivitu vykazovaly sloučeniny s p-xylenovým spojovacím můstkem. Pro účinek reaktivátoru je nezbytná přítomnost oximové skupiny na pyridiniovém jádře. Z uvedených výsledků vyplývá, že pozice hydroxyiminomethylového uskupení také ovlivňuje schopnost reaktivace sloučenin. Perspektivní se ukázala oximová skupina v polohách 2- nebo 4- (2, 4, 6, 8, 18) na pyridiniovém jádru. 47
6 Závěr Bylo připraveno 18 potenciálních biskvarterních reaktivátorů AChE s dvěma pyridiniovými jádry propojenými xylenovým řetězcem. In vitro byla stanovena jejich reaktivační aktivita na paraoxonem inhibované AChE. Pouze sloučenina 8 dokázala výrazněji reaktivovat AChE při koncentraci 10-4 mol/l. Při koncentraci 10-6 mol/l byla pouze sloučenina 2 schopna dosáhnout reaktivačních parametrů nutných pro případné testování in vivo. Jako nejvíce perspektivní se tedy ukázaly kromě sloučeniny 2 také sloučeniny 3 a 4, které sice nedosáhly 10 % reaktivační aktivity, ale obě překonaly všechny referenční sloučeniny ve schopnosti reaktivace při koncentraci 10-6 mol/l. 48
Seznam použité literatury (1) Aldridge W. Serum esterases. 1. Two types of esterases (A and B) hydrolysing p-nitrophenylacetate, propionate and butyrate, and a method for their determination. Biochem J. 1953, 53, 110-124. (2) Lincová D., Farghali H. et al. Základní a aplikovaná farmakologie. Galén: Praha, 2002; st. 59-120. (3) Harel M., Quin D. M., air H. K., Silman I., Sussman J. L. The x-ray structure of a transition state analog complex reveals the molecular origins of the catalytic power and substrate specifity of acetylcholinesterase. J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 2340-2346. (4) Lindstrom J. M. Acetylcholin receptors and myasthenia. Muscle & erve, 2000, 23, 453-477. (5) Court J., Martin-Ruiz C., Graham A., Perry E. icotinic receptors in human brain: Topography and pathology. J. Chem. euroanat,. 2000, 20, 281-298. (6) Arias H. Topology of ligand binding sites on the nicotinic acetylcholine receptor, Brain Res. Rev., 1997, 25, 133-191. (7) Lüllmann H., Mohr K., Wehling M. Farmakologie a toxikologie. Grada publishing: Praha, 2004; st. 82-89. (8) Sussman J. L., Harel M., Frolow F. et al. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: A prototypic acetylcholine-binding protein Science, 1991, 253, 872-879. (9) Quinn D. M., Acetylcholinesterase Enzyme structure, reaction dynamics, and virtual transition-states. Chem. Rev., 1987, 87, 955-979. (10) Harel M., Schalk L., Ehret-Sabatier F. et al. Quarternary ligand binding to aromatic residues in the active-site gorge of acetylcholinesterase. Proc. atl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 9031-9035. (11) Berman H., Leonard K. Ligand exclusion on acetylcholinesterase. Biochemistry, 1990, 29, 10640-10649. (12) Soreq H., Gnatt A., Loewenstein Y., Seville L. Excavations into the active-site gorge of acetylcholinesterase. TIBS, 1992, 17, 353-358. 49