ZÁKLADNÍ PRINCIPY A VYUŽITÍ KVANTITATIVNÍ PCR S OHLEDEM NA ONKOLOGICKOU DIAGNOSTIKU

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie ZÁKLADNÍ PRINCIPY A VYUŽITÍ KVANTITATIVNÍ PCR S OHLEDEM NA ONKOLOGICKOU DIAGNOSTIKU Bakalářská práce Magdaléna Dvořáková Brno 2007

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie ZÁKLADNÍ PRINCIPY A VYUŽITÍ KVANTITATIVNÍ PCR S OHLEDEM NA ONKOLOGICKOU DIAGNOSTIKU Bakalářská práce Magdaléna Dvořáková Školitel: RNDr. Irena Koutná, Ph.D. Centrum analýzy biomedicínského obrazu Masarykova univerzita, ILBIT 3A, Kamenice 3, Brno Brno 2007 2

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci Základní principy a využití kvantitativní PCR s ohledem na onkologickou diagnostiku vypracovala samostatně, pouze s pomocí uvedené literatury... Magdaléna Dvořáková 3

Poděkování Děkuji paní RNDr. Ireně Koutné, Ph. D. za vedení a poskytnutí materiálů a studijní literatury k danému tématu a udělení mnoha cenných rad. 4

OBSAH 1 Úvod...8 2 Historie PCR...10 3 Mechanismus reakce...11 3.1 Postup práce...11 3.2 Složení reakční směsi...12 3.3 Reakční podmínky jednotlivých kroků cyklu...17 3.4 Detekce amplifikovaného produktu PCR...18 4 Kvantitativní PCR... 20 4.1 Fluorescence...20 4.1.1 Fluorescenční barviva...21 4.2 RT PCR...24 5 Vybavení přístroje...24 5.1 Termocyklery...24 5.2 Historie...24 5.3 Technický popis...25 5.4 Přístroje pro real-time PCR...25 5.4.1 Zdroje excitačního záření...26 5.4.2 Filtry...26 5.4.3 Monochromátory...27 5.4.4 Detektory záření...27 5.5 Jednotlivé typy přístrojů...28 5.5.1 ABI Prism Systems...28 5.5.2 Roche Applied Science...28 6 Využití metody PCR...29 6.1 Archeologie...30 6.2 Biologie...30 6.2.1 Moderní systematika...30 6.2.2 Zoologie - chování zvířat...31 6.2.3 Ekologické studie...31 6.3 Biomedicínské aplikace...31 6.3.1 Klonování genů...31 6.3.2 Určování otcovství...31 5

6.3.3 Zjišťování virových a bakteriálních nemocí...31 6.3.4 Zjišťování dědičných chorob a mutací...35 6.3.5 Onkologická diagnostika...36 6.3.5.1 Onkologická onemocnění způsobená viry a bakteriemi...36 6.3.5.2 Vyhledávání dědičných onemocnění...38 6.3.5.3 Zjišťování zbytkové nemoci u pacientů s rakovinou...39 7 Závěr...47 8 Seznam použité literatury...48 SEZNAM ZKRATEK ALL akutní lymfoblastická leukémie (acute lymphoblastic leukemia) ALT alanin-aminotransferasa AML akutní myeloidní leukémie (acute myeloid leukemia) ASO PCR PCR s alelově-specifickými oligonukleotidy bp pár bází CALLA běžný ALL antigen (common ALL antigen) CD diferenciační skupina (cluster of differentiation) cdna komplementární DNA CML chronická myeloidní leukémie (chronic myeloid leukemia) CMV cytomegalovirus CT Chlamydia trachomatis CytIg cytoplazmatický imunoglobulin (cytoplasmatic immunoglobulin) ddntp dideoxyribonukleosidtrifosfát dntp deoxyribonukleosidtrifosfát dsdna dvouvláknová DNA (double-stranded DNA) ELISA enzymimunoanalýza (enzyme-linked immunosorbent assay) EtBr ethidium bromid FISH fluorescenční in situ hybridizace (fluorescent in situ hybridization) FMTC familiální medulární karcinom štítné žlázy HBV hepatitida B HCV hepatitida C HD Hodgkinův lymfom (Hodgkin s disease) 6

HPLC HPV LPNHD MC MDS MEN MRD mrna MTB NG NS Ph qpcr RS buňky RT-PCR SNP SSCP ssdna SurfIg TdT vysokotlaká kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) lidský papillomavirus nodulární Hodgkinův lymfom s lymfocytární predomonancí (lymphocyte-predominant nodular Hodgkin s disease) smíšená buněčnost (mixed cellularity) myelodysplastický syndrom (myelodysplastic syndrome) mnohočetné endokrinní neoplazie minimální zbytková nemoc (minimal residua disease) mediátorová RNA Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoea nodulární skleróza (nodular sclerosing) chromozom Philadelphia kvantitativní PCR Reed-Sternbergovy buňky reverzně-transkripční PCR jednonukleotidový polymorfismus (single nucleotide polymorphism) konformační polymorfismus jednovláknové DNA (single strand conformation polymorphism) jednovláknová DNA (single-stranded DNA) povrchový imunoglobulin (surface membrane immunoglobulin) koncová deoxynukleotidyl transferasa (terminal deoxynucleotidyl transferase) 7

1 ÚVOD Polymerasová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) je biochemická a molekulárně biologická metoda, která slouží k enzymatické replikaci DNA bez použití živého organismu. Tato metoda se postupem času od svého objevení stala nedílnou součástí laboratoří ať již v oblasti biomedicínské, biologické, ale i archeologické a dalších. Své obliby a používanosti dosáhla vzhledem k tomu, že k jejímu provedení teoreticky stačí jediná molekula DNA nebo RNA a není náročná na realizaci. V dnešní době se její použití zaměřuje na detekci zbytkové nemoci (MRD) u onkologických pacientů, u nichž se zjišťuje přítomnost i jen několika rakovinných buněk, které nemohou být odhaleny běžnými laboratorními technikami. Testy na MRD mohou zjistit nádor již v jeho počátku a u pacienta, který byl léčen toto zjištění poukazuje na to, že léčba nebyla úspěšná. MRD může tedy odlišit pacienta, který potřebuje intenzivní a eventuálně toxičtější léčbu od toho, který ji nepotřebuje. Obecný předpoklad základu MRD je, že znalost MRD může účinně vést klinickou péči a zvýšit počet vyléčených. Ve své práci se budu nejprve věnovat historii PCR a mechanismu této reakce. Dále podrobněji rozeberu kvantitativní PCR a vybavení, které se používá k jejímu provedení, především se zaměřením na nejnovější přístroje. Na závěr bude následovat kapitola zabývající se aplikacemi této metody v praxi s důrazem na onkologickou diagnostiku, zejména detekci zbytkové nemoci u onkologických pacientů, virů a bakterií způsobujících onkologická onemocnění a dědičných forem rakoviny. 8

1. INTRODUCTION Polymerase chain reaction (PCR) is a method largely applied in biochemistry and molecular biology. Its purpose is enzyme-catalyzed DNA replication without the necessity of presence of any viable organism. Since its introduction, this method has become a consistent component of laboratories not only in the realm of biochemistry and biology but also archaeology etc. It has gained its popularity and frequency of application due to the fact that only one single molecule of DNA or RNA is required for its completion. It is also notably easy to perform. Today its primary application is aimed at detection of minimal residua disease (MRD) with oncological patients. The proof of the presence of residual cancer cells, i. e. when only a few cancer cells undetectable by common up-to-date techniques are present, is of highest importance. MRD testing may reveal cancer growth in its early stage and with cancer patients it may suggest that their treatment has not been completed. MRD may also predict which patient needs more aggressive and potentially toxic treatment and which does not. Thus the general point of MRD is to direct the course of treatment and increase the survival rate. In my thesis, I begin to deal with the history of PCR and its mechanism. I further elaborate on the quantitative PCR and the gear necessary for its completion emphasizing the most up-to-date technology available. Special chapter is targeted on PCR applications in use stressing the oncological diagnostics, the detection of viruses and bacteria responsible for cancer as well as hereditary cancer disease. The last chapter in thesis deals with real application of the Method with respect to oncological diagnostics. Eventually a chapter will follow on PCR applications in use stressing the oncological diagnostics, the detection of viruses and bacteria responsible for cancer as well as hereditary cancer disease. 9

2 HISTORIE PCR První zveřejněná práce o PCR, která popisovala hlavní principy, tedy replikaci části DNA použitím primerů, byl dvaceti stránkový dokument publikovaný v časopise Journal of Molecular Biology v roce 1971 norským vědcem Kjellem Kleppeem a laureátem Nobelovy ceny za lékařství pro rok 1968 Harem Gobundem Khoranaou. Rozvoj metody byl na několik let zastaven vzhledem k problémům se syntézou primerů a čištěním DNA polymerasy. Za objevitele této metody je však považován Dr. Kary Banks Mullis, který přišel s myšlenkou PCR na jaře roku 1983, kdy pracoval pro společnost Cetus Corporation, v souvislosti s novým způsobem analýzy mutací DNA. Později téhož roku se se svým asistentem Fredem Fallonou pokusil tuto myšlenku realizovat. Brzy se k nim připojili další zaměstnanci společnosti Cetus, neboť viděli, že tato metoda má velký potenciál. Část týmu tvořili vědci, kteří se zabývali diagnostikou DNA a identifikací mutací lidského genomu. První článek popisující tuto metodu byl stručný a byl publikován v roce 1985 v časopise Science. Metody PCR bylo použito ke stanovení mutace genomické DNA způsobující srpkovitou anémii. Detaily a použití PCR byly odhaleny v plné šíři v článcích uveřejněných v následujících dvou letech. Nakonec se z metody na analýzu mutací DNA stala také metoda na amplifikaci jakékoli části DNA. Metodu Dr. Mullis postupně zdokonaloval od teoretického schématu k praktickému provedení. Jeho pracovní postup byl následující: malé množství DNA obsahující požadovaný gen, velká skupina volných oligonukleotidů a primery se vložily do zkumavky, která se zahřála na teplotu blízkou 100 C a poté zchladila. Ke směsi se následně přidala DNA polymerasa a tím došlo k syntéze DNA. Proces zahřátí a zchlazení se několikrát opakoval. Vzhledem k tepelné denaturaci DNA polymerasy ji bylo nutné přidat k reakční směsi před každým cyklem. Tento proces zajišťoval mnohonásobnou amplifikaci daného úseku DNA a tedy jeho pozdější snadnější detekci. Postup byl ovšem velmi neefektivní, protože vyžadoval neustálou pozornost, byl časově náročný a měl velkou spotřebu DNA polymerasy. Časová náročnost způsobená nutností přidávat DNA polymerasu před každým cyklem přiměla vědce hledat způsob automatizace procesu. To vedlo ke konstrukci prvního termocykleru, který pomohl celý proces urychlit. Při vývoji těchto zařízení vstoupil Cetus do strategického partnerství s firmou PerkinElmer. Jejich spolupráce vedla nejen k vývoji termocyklerů, ale také reakčních souprav pro lékařský výzkum. Dalším problémem byla termolabilita přidávané DNA polymerasy. Díky ní byla spotřeba této látky během reakce vysoká a otevíráním zkumavky po každém cyklu se zvyšovala možnost kontaminace reakční směsi a tím znehodnocení celé analýzy. 10

Proto bylo vynaloženo velké úsilí v hledání látky, která by měla stejné vlastnosti jako přidávaná DNA polymerasa ovšem její termolabilita by byla minimální. Tato práce se vyplatila a po několika letech výzkumu byla představena termostabilní DNA polymerasa, která byla izolována z bakterie Thermus aquaticus žijící v termálních pramenech v Yellowstonenském národním parku. Spojení termocyklerů a termostabilní DNA polymerasy učinilo tuto metodu plně automatickou a nyní vyžaduje obsluhu pouze na vložení reakční směsi, zapnutí a poté vypnutí přístroje. Díky těmto vylepšením se metoda stala citlivější a přesnější. Technika PCR byla patentována firmou Cetus 28. července 1987 a jako hlavní vynálezce byl uveden Dr. Mullis. V následujícím roce firma obdržela mnoho žádostí o propůjčení licence na provádění PCR pro komerční diagnostické účely. 15. ledna 1989 Cetus oznámil rozhodnutí spolupracovat s firmou Hoffmann La Roche Incorporated na vývoji a komercializaci lidské in vitro diagnostiky a službách založených na PCR technologii. V následujících letech proběhlo několik soudních sporů o patentová práva na technologii a pracovní postupy. Všechny spory, včetně toho nejvýznamnějšího s DuPont Copany, byly pro Cetus vítězné. V roce 1992 firma Roche Molecular Systems po několika letech úspěšné spolupráce odkoupila od Cetusu patentová práva na PCR a další související technologie za $300 000 000 a vlastní je dodnes. V roce 1993 obdržel Dr. Kary B. Mullis Nobelovu cenu za chemii za objev PCR techniky [Konrád; Smithsonian Videohistory Collection 2004]. 3 MECHANISMUS REAKCE 3.1 Postup práce Metoda PCR je cyklická reakce sloužící k amplifikaci určitého úseku molekuly DNA a je prováděna ve zkumavce, ve které je obsažen vzorek s dsdna s cílovou sekvencí, pufrovací roztok s DNA polymerasou, oligonukliotidové primery, čtyři druhy dntp a kofaktor MgCl 2. Každá PCR reakce začíná počáteční denaturací, kdy je nutné, aby nastala kompletní denaturace templátu, a tak vznikla vazebná místa pro primery. Pokud je denaturace nekompletní dochází k neúplnému použití templátu v první amplifikačním cyklu a tím k celkově nízkému zisku PCR produktu. Počáteční denaturace se provádí při 95 C po dobu 2 až 5 minut. U vzorků bohatých na G/C páry je doba prodloužena na 10 minut. 11

Po ukončení počáteční denaturace následuje cyklus, který se skládá ze tří kroků: 1. DENATURACE zkumavka s reakční směsí se zahřeje na teplotu 94 96 C. Dochází k relaxaci a denaturaci molekuly dsdna do dvou ss molekul, tzv. templátových DNA. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerů a příliš dlouhá denaturace může způsobit snížení aktivity DNA polymerasy. 2. PŘIPOJENÍ PRIMERŮ ochlazení reakční směsi na 50 65 C umožňuje navázání primerů k jejich komplementárním sekvencím na ssdna. Teplota určuje specifičnost vazby primeru na templát a stanovuje se empiricky. 3. PRODLOUŽENÍ PRIMERŮ, POLYMERIZACE zahřátí reakční směsi na 70 72 C, následuje navázání DNA polymerasy a prodloužení vlákna DNA od každého primeru až na konec templátové DNA pomocí volných dntp. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus reakce. Tento cyklus se mnohokrát opakuje a během krátké doby tak dochází k mnohonásobné amplifikaci sekvence DNA. Během každého cyklu dojde ke zdvojnásobení počtu těchto sekvencí, takže po 30 cyklech bude teoretický počet takto vzniklých sekvencí dosahovat hodnoty 1 073 741 824. Celkový počet skutečně vzniklých produktů bude nižší než tento údaj v důsledku postupné degradace enzymu. PCR reakce končí závěrečnou extenzí. Vzorek je ponechán při 72 C po dobu 5 až 15 minut, aby mohlo dojít k dokončení syntézy a renaturaci jednovláknových produktů [Bustin 2004]. 3.2 Složení reakční směsi Templátová DNA Tato DNA obsahuje gen (cílovou sekvenci), který chceme amplifikovat a slouží jako matrice pro syntézu komplementárních řetězců. Jako zdroj této DNA se používají mikroorganismy, buňky tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy a podobně [Bustin 2004]. Primery Primery jsou krátké uměle vytvořené oligonukleotidové úseky jednovláknové DNA o délce 20 30 nukleotidů, výjimečně může jejich délka dosáhnout až 80 nukleotidů a pro některé rozbory jsou naopak nejvhodnější primery o délce 13 či méně nukleotidů. Jestliže jsou primery příliš dlouhé a nepurifikované, hrozí zvýšení počtu nesprávně zařazených bází do oligonukleotidu. Neobsahují vnitřní sekundární struktury (např. vlásenka), mají rovnoměrné 12

rozložení oblastí bohatých na G/C a A/T páry a obsah G/C párů by měl být 40 60 %. Sekvence primerů by se měla v místě vazby co nejvíce shodovat se sekvencí templátu, to platí zejména pro poslední bázi na 3 -konci a neměla by obsahovat repetitivní sekvence, aby nedocházelo k vazbě primerů na více různých míst najednou. Dva protilehlé primery by neměly být vůči sobě komplementární, aby nedocházelo ke vzniku stabilních duplexů. Dvě různé primerové sekvence se váží na vlákna templátové DNA a ohraničují tak oblast, která má být amplifikována. Jeden primer je komplementární se začátkem cílové oblasti jednoho vlákna DNA a druhý primer je komplementární s koncovou sekvencí cílové oblasti na druhém vlákně DNA. Oba primery mají 3 -konce uzpůsobené tak, aby se na ně mohly vázat volné dntp. Navázání primerů na vlákna DNA umožňuje připojení DNA polymerasy a může tak začít syntéza cílové sekvence [Bustin 2004]. Následující příklady různých primerů se používají u jednotlivých modifikacích klasické PCR: GSP (gene specific primer) specifické oligonukleotidy, které se používají při syntéze vybrané části mrna používají se u RT PCR oligo dt umělý jednovláknový oligomer s 5 - a 3 -hydroxylovými konci, počet nukleotidů se pohybuje v rozmezí 12 až 18 používají se u RT PCR při syntéze cdna random hexametr primery směs jednovláknových náhodných hexanukleotidů s 5 - a 3 - hydroxylovými konci používají se u RT PCR při syntéze cdna nested primery používají se dva páry primerů pro dvě následné PCR reakce první pár je použit pro vznik DNA produktů, které kromě cílové sekvence mohou obsahovat ještě nespecifické fragmenty DNA, které jsou následně odstraněny při amplifikaci těchto produktů pomocí druhého páru, jehož vazebná místa jsou částečně nebo zcela odlišná od vazebných míst prvního páru a výsledný produkt je díky tomuto kratší používají se zejména při amplifikaci dlouhých fragmentů DNA u Nested PCR stair primery jsou ekvimolární oligonukleotidy různé délky nahrazující klasické primery 5 -koncové sekvence zůstávají nezměněny (délka amplifikovaného úseku je konstantní), ale 3 -konec je postupně báze po bázi odstraněn používají při zjišťování přítomnosti enterovirů u kvantitativní PCR 13

alelově specifické oligonukleotidy používají se jako primery při zjišťování bodových mutací a malých delecí Pufrovací roztok pufr Pufr je nezbytná součást reakční směsi, která zajišťuje vytvoření potřebných podmínek pro aktivitu DNA polymerasy. Určuje hodnotu ph, která se pohybuje v rozmezí 8,3 až 9,0. Ve většině případů obsahuje Tris-HCl, KCl a někdy také MgCl 2 [Bustin 2004]. DNA polymerasa DNA polymerasa je enzym, v důsledku jehož činnosti dochází k syntéze DNA. Jeho typickou vlastností je schopnost rozpoznávat ssdna jako templát a současně vázat dntp. Váže se na primer, vzniká tak řetězec komplementární s templátem, a slouží k jeho prodloužení, k čemuž se Obrázek 1: DNA polymerasa, převzato z používají jednotlivé druhy volných http://www.biopro.de/en/region/rhein/magazin/01172/index.html dntp. V dnešní době se již používá termostabilní DNA polymerasa, která odolává teplotám až 98 C. Výběr vhodné DNA polymerasy pro danou reakci se řídí několika vlastnostmi tohoto enzymu a to: délkou života při 95 C, rychlostí prodlužování řetězce, přesností, RT aktivitou, 5 3 a 3 5 exonukleasovou aktitivou. Aktivita DNA polymerasy je ovlivněna reakčními podmínkami, a to například ph nebo koncentrací přítomných solí. V následujícím přehledu jsou zmíněny nejčastěji používané DNA polymerasy s jejich charakteristickými vlastnostmi. Následně jsou nejdůležitější vlastnosti shrnuty v tabulce na konci tohoto přehledu [Bustin 2004]. Taq Thermus aquaticus (mnoho dodavatelů) první, nejznámější a nejlevnější termostabilní DNA polymerasa má RT aktivitu při teplotě 68 78 C s rychlostí prodloužení řetězce 2 6 nukleotidů za vteřinu, nemá 3 5 exonukleasovou aktivitu a optimální přesnosti je dosaženo při 70 C a ph 5 6 14

Tth Thermus thermofilus (různí dodavatelé) aktivita je obdobná jako u Taq polymerasy s podobným množstvím chyb, ale s nižší rychlostí prodlužování řetězce a proto je její množství používané v reakčních směsích vyšší je méně termostabilní než Taq polymerasa při standardní PCR je její použití pouze omezené, ale její RT aktivita při vyšší teplotě a v přítomnosti Mn 2+ iontů se využívá při RT-PCR Tfl Thermus flavus (Promega) jeho vlastnosti jsou velmi podobné vlastnostem Tth polymerasy, ale je termostabilnější při vyšších teplotách a v přítomnosti Mn 2+ iontů může 5 3 exonukleasová aktivita vystupovat jako RT aktivita Pfu Pyrococcus furiosus (Stratagene) velmi stabilní a přesný enzym, ale s nízkou rychlostí prodlužovaní řetězce nepoužívá se při přítomnosti dutp Vent Thermococcus litoralis (NEB) enzym s vysokou přesností, který neprodlužuje templáty obsahující dutp Deep Vent Pyrococcus species GB-D (NEB) velmi stabilní, umožňuje použití rozpouštědel jako je formamid a DMSO 3 5 exonukleasová aktivita je 4 x vyšší než u Vent DNA polymerasy a 5-15 x vyšší než u Taq polymerasy stejně jako Vent neprodlužuje templáty s dutp Tgo Thermococcus gorgonarius (Roche) u tohoto enzymu je skloubena vysoká termostabilita s přesnost Pwo Pyrococcus woesei (Roche) tento enzym se vyznačuje vyšší termostabilitou (přežívá více než 2 hodiny při 100 C) při jeho použití se upřednostňuje MgSO 4 před MgCl 2 a nepoužívá se v přítomnosti dutp KOD HiFi rekombinantní forma Thermococcus kodakaraensis (Novagen) velmi výrazná 3-5 exonukleasová aktivita, která se projevuje nízkým počtem chyb a velkou rychlostí prodlužování řetězce (2 x rychlejší než Taq a 5x než Pfu polymerasa) 15

Enzym Délkou života při 95 C (h) Rychlost prodloužení řetězce (nt/s) RT aktivita 5 3 exonukleasová aktivita 3 5 exonukleasová aktivita Taq 1,6 60 ano ano ne Tth 0,3 25 33 ano ano ne Tfl 0,6 40 ano ano ne Pfu 6 18 25 ne ne ano Vent 6,7 67 ne ne ano Deep Vent 23 23 ne ne ano Tgo 2? ne ne ano Pwo? 40 50 ne ne ano KOD HiFi 12 100 130 ano ne ano Tabulka 1: Přehled vlastností nejběžněji používaných DNA polymeras, převzato z [Bustin, 2004] dntp dntp jsou deoxynukleotidtrifosfáty, které se v tomto případě vyskytují v roztoku samostatně. Jako cukerná složka vystupuje deoxyribosa, mezi přítomné nukleové kyseliny patří adenin, cytosin, guanin a thymin a poslední složkou jsou tři zbytky kyseliny fosforečné. Tyto dntp se v reakční směsi vyskytují ve formě sodných nebo litných solí. Během prodlužování primeru se váží svou OH-skupinou poslední kyseliny fosforečné na 3 OH konec posledního nukleotidu prodlužovaného řetězce. Váže se vždy ten dntp, který je komplementární k nukleotidu na templátovém řetězci [Bustin 2004]. MgCl 2 Mg 2+ iont tvoří rozpustný komplex s dntp a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymerasu. Přítomnost volných Mg 2+ iontů je nezbytná pro aktivitu DNA polymerasy, ale jejich nadbytek má za následek snížení její přesnosti a zvýšení hladiny nespecifických amplifikací. Koncentrace Mg 2+ se určuje empiricky a závisí na konečné koncentraci dntp, primerů a templátů a ovlivňuje T m duplexů primer-templát, primer-primer a templát-templát vznikajících během cyklů [Bustin 2004]. PCR voda Přidávání vody do reakčních směsí musí být obezřetné. Voda totiž může být zdrojem kontaminace a může dojít ke znehodnocení pokusu. Používá se speciálně upravená voda, většinou redestilovaná (RNase-free water, Ambion DEPC treated water) [Bustin 2004]. 16

3.3 Reakční podmínky jednotlivých kroků cyklu Pro každou PCR reakci je nutné určit hodnoty teplot a dobu, po kterou budou aplikovány před jejím začátkem. Při jejich určování se řídíme obecně platnými hodnotami. Denaturační čas a teplota Během denaturačního kroku je důležité, aby došlo k oddělení všech dsdna na jednovlákna. K tomuto účelu je vhodné zahřívat reakční směs na teplotu 94 až 96 C po dobu okolo 45 vteřin, avšak u sekvencí bohatých na G/C páry může být potřeba zvýšit dobu denaturace na 3 až 4 minuty nebo zvýšit teplotu na 97 C či dokonce 98 C. V takovémto případě je nutné zvolit vhodnou DNA polymerasu. Doba zahřívání směsi závisí také na objemu reakční směsi a tloušťce stěn zkumavky. Čas a teplota pro připojení primerů Teplota pro připojení primerů (T a ) se stanovuje empiricky nebo pomocí teplotního gradientu. Její hodnota se odvíjí od hodnoty T m duplexu primer-templát a obvykle se pohybuje v rozmezí 50 65 C. V případě výskytu nespecifických produktů může být teplota optimalizována jejím zvýšením o 1 až 2 C. Doba provedení se pohybuje mezi 30 a 90 vteřin. primer produkt Optimální hodnota se vypočítá podle vztahu: Τ = 0,3 Τ + 0,7 Τ 25 a m primer Τ m je hodnota T m nejméně stabilního páru primer-templát produkt Τ m je hodnota T m amplifikačního produktu Orientačně ji lze vypočítat ze vztahu: T a = 2 (A+T) + 4 (G+C) 5 C = T m 5 C, kdy je zohledněno zastoupení jednotlivých bází. Polymerizační čas a teplota Obvyklá teplota při polymerizaci je 70 72 C, protože nejčastěji používaná Taq polymerasa má optimální aktivitu okolo 70 C. Pro 5 - nukleasový rozbor se používá teplotního rozmezí 60 62 C [Bustin 2004]. Doba trvání reakce se stanovuje na základě délky syntetizovaných sekvencí a aktivitě DNA polymerasy a obvykle se pohybuje mezi 45 a 90 vteřinami. Počet cyklů Počet cyklů závisí na množství templátové DNA v reakční směsi a očekávaném výtěžku reakce. Nejčastěji se pohybuje v rozmezí 25 až 40 cyklů. m 17

3.4 Detekce amplifikovaného produktu PCR Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou, detekce obarvením a pozorováním pod UV světlem. Hlavním principem elektroforézy je pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli. Vzhledem k tomu, že pentosofosfátová kostra všech nukleových kyselin nese stejně velký záporný náboj, budou se fragmenty pohybovat vždy směrem k anodě a rychlost této migrace bude závislá pouze na jejich velikosti. Kratší fragmenty se pohybují rychleji a urazí tedy větší vzdálenost nežli delší fragmenty. Používají se agarosové nebo polyakrylamidové gely. Polyakrylamidové gely se používají, když je vyžadována větší citlivost analýzy. Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů. Restrikčními enzymy jsou restrikční endonukleasy, které se váží na specifické rozpoznávací sekvence dsdna, dlouhé zpravidla 4-6 bp. Oba řetězce jsou štěpeny buď uvnitř, nebo poblíž této sekvence. Činností restriktas je DNA štěpena na fragmenty o různé délce, které lze od sebe oddělit elektroforézou. Fragmenty DNA jsou na gelu detekovány autoradiografií (většinou 32 P a 35 S) nebo fluorescenčními barvivy (například biotin). Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmů. Při této separaci se nepoužívají agarosové gely, ale speciální polyakrylamidové gely, které umožňují zvýšení citlivosti analýz a současně úsporu času. Používá se například u analýzy SSCP (konformační polymorfismus jednovláknové DNA), při které se amplifikované produkty podrobí denaturaci přidáním formamidu a NaOH a zahřátím. Denaturované molekuly DNA (ssdna) jsou rychle zchlazeny a přeneseny na gel. Citlivost této analýzy je velmi vysoká, protože i substituce jediného nukleotidu většinou vede ke změně sekundární struktury molekuly DNA. Hybridizace s neradioaktivně značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku a detekce enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce. Amplifikovaná sekvence se nejprve podrobí hybridizaci s neradioaktivně značenou sondou. Jako značení se nejčastěji používají enzymy peroxidasa, alkalická fosfatasa, β- galaktosidasa nebo glykosid oxidasa. Poté se nanese na mikrotitrační destičku, na jejíž povrch 18

je sorbována protilátka, na kterou se váže značená sekvence. Vazbou protilátky a značené sekvence dochází k chemické reakci a nejčastěji barevné změně. Barevná změna se poté měří fotometricky. Imobilizace produktů na membráně a tečková hybridizace se značenými alelově - specifickými oligonukleotidy nebo zpětná tečková hybridizace s různými alelově - specifickými oligonukleotidy imobilizovanými na membráně. Tečková hybridizace se používá k detekci specifických sekvencí vzorků nukleových kyselin imobilizovaných na membráně nitrátu celulosy nebo nylonu. Denaturovaná DNA se v roztoku nanáší na membránu v podobě teček a následuje hybridizace se sondou (alelově-specifické oligonukleotidy). Vyhodnocení je buď vizuální, denzitometrické nebo pomocí β-spektrometru. Zpětná tečková hybridizace spočívá v tom, že na membránu se nejprve fixuje sonda a teprve poté dochází k hybridizaci s DNA z vlastního vzorku. Hybridizace na DNA čipech DNA čipy jsou oligonukleotidové matice, které se připravují in situ pomocí fotolitotrofie a chemické syntézy oligonikleotidů na pevném nosiči. Umožňují na principu alelověspecifické oligonukleotidové hybridizace opakované a rychlé testování přítomnosti nebo sekvenční analýzy značených nukleových kyselin. Detekce se provádí speciálním laserovým skenerem, který zaznamenává intenzitu fluorescenčního záření. Stanovení sekvence DNA Stanovuje se pořadí nukleotidů v molekule, tedy primární struktura molekuly. Lze použít chemickou (Maxam-Gilbertovu) metodu, která je založena na bázově-specifické chemické modifikaci a následném štěpení DNA, kdy se nejdříve připraví ssdna obsahující danou sekvenci a rozdělí se do 4 zkumavek. V každé zkumavce proběhne chemická modifikace jednoho nebo více typů bází a štěpení DNA v místech, kde došlo modifikace. Následuje elektroforéza na denaturačním polyakrylamidovém gelu a autoradiografická detekce ( 32 P) vzniklých DNA fragmentů. Nebo enzymatickou (Sangerovu) metodu, která je založena na terminaci replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence ddntp. Postup je obdobný jako u chemické metody. Připravená ssdna se rozdělení do 4 zkumavek a do každé je přidán jeden druh ddntp. Při syntéze nového řetězce DNA polymerasa zařadí místo dntp jeho analog, ddntp což způsobí ukončení syntézy. V každé zkumavce vzniknou fragmenty, které jsou 19

zakončeny příslušným ddntp. Produkty se podrobí denaturaci a elektroforéze v denaturačním polyakrylamidovém gelu. Posledním krokem je autoradiografická detekce. 4 KVANTITATIVNÍ PCR Základem kvantitativní real-time PCR je možnost průběžného sledování množství amplifikovaného produktu během jednotlivých cyklů reakce. Množství produktu je sledováno jako množstevní přírůstek na základě změny intenzity fluorescenčního záření, protože intenzita fluorescenčního záření je přímo úměrná množství produktu. Samotné produkty nejsou schopné fluorescenčního záření, a proto se do reakční směsi přidávají fluorescenční barviva, která tuto schopnost mají a žádným způsobem neovlivňují průběh reakce [Bustin 2004]. 4.1 Fluorescence Fluorescenční záření neboli fluorescence je třífázový cyklický proces, během kterého dochází k absorpci a emisi fotonu: 1. fáze elektron látky, která pohltila foton o určité energii, je excitován ze základního do energeticky bohatšího Obrázek 2: Přechod elektronu mezi základním a excitovaným stavem, převzato z http://probes.invitrogen.com/han- stavu. 2. fáze vybuzený elektron zůstává dbook/figures/0664.html a upraveno v tomto stavu po dobu 10-8 až 10-7 s a poté se vrací zpět do základního stavu. 3. fáze po návratu elektronu dochází k vyzáření (emisi) přebytečné energie elektronu ve formě fotonu (fluorescenční záření), který má nižší energii (vyšší vlnovou délku) než-li foton absorbovaný. Fluorescenční vlastnost látce uděluje její specifická část, tzv. fluorofor, což je funkční skupina dané látky, většinou heterocyklické nebo polyaromatické povahy, která absorbuje a emituje energii pouze určité vlnové délky. Intenzita fluorescenčního záření je rovněž ovlivněna jeho zhášením. Toto zhášení má několik příčin a to například: blízkost fluoroforu a purinové báze (zejména guaninu); sekundární strukturu sekvence, na kterou se fluorofor váže; ale také přítomnost zhášeče. Zhášeč je nefluoreskující barvivo, které sice světelnou energii absorbuje, ale nevyzařuje ji jako fluorescenční záření nýbrž jako teplo nebo světlo s vyšší vlnovou délkou než je fluorescenční. To 20

umožňuje návrat excitovaného elektronu fluoroforu od základního stavu bez vyzáření fluorescence [Bustin 2004]. 4.1.1 Fluorescenční barviva Fluorescenční barviva rozdělujeme podle charakteru jejich vazby na nespecifická a specifická. Nespecifické chemické látky Interkalační barviva Interkalační barviva se reverzibilně váží barviva Ab max (nm) Em max (nm) na jakoukoli dsdna vznikající během PCR a Cy5 643 667 zvyšují intenzitu fluorescenčního záření. Tyto Cy7 743 767 sloučeniny většinou obsahují postranní řetězec, DABCYL 453 který se s omezenou specifitou váže do žlábku EtBr 288 602 dsdna molekuly. Real-time PCR rozbory, Fluorescein 492 520 FAM 494 518 které využívají těchto barviv (např. SYBR LightCycler 625 640 Green I a II, SYBR Gold) detekují fluorescenci, Oregon Green 499 519 která je vázána na menší žlábek dsdna. Rhodmine 524 550 Důvod proč se tato barviva stále používají je, že ROX 585 605 jejich fluorescenční emisní spektrum je velmi SYBR Green 498 522 SYBR Gold 495 538 blízké spektru fluoresceinu, na které jsou často TAMRA 565 580 optimalizovány PCR fluorimetry. Dalšími výhodami Texas Red 583 603 je jejich citlivost, jednoduchost použití YoYo 490 508 a cena, protože oproti barvivům používajícím Yo-Pro 491 506 se pro sondy jsou levné. Nevýhodami těchto Tabulka 2: Přehled nejpoužívanějších fluorescenčních barviv je, že se váží na jakoukoli dsdna a některá barviva se váží dokonce na ssdna a způsobují barviv s jejich absorpčními a emisními maximy, převzato z [Bustin 2004] a upraveno tak nespecifickou fluorescenci a proto je nutné, aby výsledky byly ověřeny následnými rozbory. Použití některých barviv: SYBR Green kvantifikace mrna, detekce variant spojení mrna, virových a bakteriálních patogenů, zjišťování genotypu a detekce zbytkové nemoci u pacientů s rakovinou. další barviva detekce a kvantifikace nukleových kyselin [Bustin 2004]. Specifické chemické látky Vazba těchto látek na templát je specifická a děje se tak prostřednictvím sondy, která se vyrábí pro každý PCR rozbor zvlášť, protože každá cílová sekvence potřebuje vlastní son- 21

du. Používaná barviva mají většinou jako základ fluorescein, rhodamin nebo cyanin. Uplatňuje se zde molekula zhášeče, která ovlivňuje detekci fluorescence. Princip použití je následující: fluorescenční signál vzniká pouze tehdy, jestliže amplikon-specifická sonda hybridizuje s její komplementární cílovou sekvencí. Zvýšení fluorescence může nastat na konci kroku, kdy se prodlužují primery nebo na konci polymerizačního kroku. Výhodou oproti interkalárním barvivům je, že sondy mohou být označeny různými barvivy a mohou tak být detekovány produkty několika různých sekvencí během jediné qpcr reakce. Na druhou stranu jsou zde i nevýhody. Díky vlastní specifitě nemohou být artefakty detekovány a ovlivňují tak efektivitu amplifikace. A dále je to cena pro každou sekvenci je nutné vyrobit novou sondu. Sondy se dělí do dvou kategorií: Lineární sondy jejich výhodou je, že nepřítomnost sekundární struktury poskytuje ideální efektivitu hybridizace. HyBeacons Tyto sondy využívají jako zhášeč vlastnosti molekuly DNA. Fluorescenční záření je větší jestliže sonda hybridizuje s komplementární cílovou sekvencí než když je jednovláknová. Fluorescenční barvivo je připojené na vnitřní nukleotid oligonukleotidové sondy, která dále obsahuje skupinu na 3 -konci, která brání prodlužování řetězce. Používají se při analýze SNP mutací [Bustin 2004]. Hydrolysis (TaqMan ) Probes Tento rozbor byl poprvé popsán již v roce 1991 a vychází z 5-3 exonukleasové aktivity Taq polymerasy, která štěpí značenou TaqMan sondu, jestliže hybridizovala s komplementární cílovou sekvencí. Fluorofor je připojen na 3 - a zhášeč na 5 -konec sondy. Excitovaný fluorofor předává svou energii zhášeči, který fluoreskuje, ale jedná se o fluorescenci jiné vlnové délky než vydává fluorofor a její hladina je nízká. Při vazbě sondy na komplementární sekvenci se aktivuje Taq polymerasa, která začíná sondu štěpit od 5 -konce. Dochází tak k oddělení fluoroforu a zhášeče a díky tomu nedochází ke zhášení fluorescence fluoroforu, která nevratně vzroste. Nárůst produktů PCR reakce je zjištěno nepřímo pomocí sledování nárůstu fluorescence fluoroforu. Této metody se používá při analýze SNP mutací, kdy jsou sondy pro každou alelu označeny jiným fluoroforem. Je to nejoblíbenější qpcr metoda [Bustin 2004]. Strukturní sondy mají strukturně přirozenou stavbu např. s vlásenkovou strukturou a mají významně vyšší hybridizační přesnost než lineární sondy. mezi nejvýznamnější druhy těchto sond patří Molecular Beacons a Scorpion. Druhé jmenované jsou považovány za o něco více specifické, ale 22

specifita těchto sond závisí také na reakčních podmínkách a způsobu použití, takže v některých případech to může být i naopak. Molecular Beacons Tyto sondy jsou tvořeny oligonukleotidovým řetězcem jehož 5 - a 3 -konce jsou navzájem komplementární, takže při jejich spojení dochází ke vzniku vlásenky. Ke koncům jsou připojeny fluorofor se zhášečem a to tak, že každý se nachází na jednom konci. Volně v roztoku sonda zaujímá tuto konformaci, takže vzhledem k blízkosti fluoroforu a zhášeče dochází ke zhášení fluorescence. Při vazbě sondy na cílovou sekvenci se vlásenková struktura otevře, fluorofor a zhášeč se oddělí a vzniká tak fluorescenční záření. Specifita sondy spočívá ve faktu, že jestliže není cílová sekvence zcela komplementární se sondou, sonda se nenaváže a fluorescence nevznikne. Hlavním problémem těchto sond je v jejich konstrukci. Oligonukleotid musí být navržen tak, aby nemohly vznikat struktury, ve kterých by fluorofor a zhášeč neležely v těsné blízkosti. Kdyby tato situace nastala, mohlo by dojít k tomu, že fluorofor by vyzařoval fluorescenční záření bez ohledu na to jestli je sonda navázána či ne. Těchto sond se používá při zkoumání interakcí DNA-protein, detekci enzymatického štěpení ssdna, k provedení a kvantitativní analýze hybridizace, analýze SNP mutací, přesné detekci Y-chromozomů u blastomer [Bustin 2004]. Scorpions U tohoto druhu sond je spojena přítomnost primeru a sondy v jediné molekule. Molekula je tvořena dvěma oligonukleotidovými řetězci. Jeden z nich tvoří specifický primer, PCR blokátor (neamplifikovatelný monomer, který odděluje primer od sondy a zabraňuje přepisu sekvence sondy), sonda a fluorofor na 5 -konci sondy. Druhý oligonukleotidový řetězec má na svém 3 -konci zhášeč, je komplementární se sekvencí sondy a váže se na ni. To má za následek zhášení fluorescence. Molekula se v oblasti primeru váže na cílovou sekvenci a dochází k jejímu prodloužení. Poté nastává tepelná denaturace, při které je prodloužený primer oddělen od cílové sekvence a oligonulkeotid se zhášečem disociuje. Po snížení teploty se prodloužený Scorpion nově uspořádá a sonda se váže na prodloužený primer. Vzniká vlásenka a fluorescenční záření. Scorpions se používají při analýze SNP mutací, detekci druhu a množství lidského pappilomaviru a patogenů plísňových onemocnění rostlin [Bustin 2004]. 23

4.2 RT PCR RT-PCR je modifikací PCR, která slouží k detekci a kvantifikaci mrna. RNA však nemůže sloužit jako templát PCR, a proto je nejdříve převedena na cdna pomocí retrovirové zpětné trankriptasy (RT) a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. Nevýhodou je, že RT je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42 C. V případech, kdy je sekundární struktura RNA složitá znemožňuje její převod do cdna. Proto se používá Tht polymerasa, která je schopná převést RNA do cdna v přítomnosti Mn 2+ iontů. V současné době je nejcitlivější metodou detekce a kvantifikace mrna a v porovnání s Northern blot a RNase protection assay, dvěma dalšími používanými technikami kvantifikace mrna, se při RT-PCR používá mnohem menších vzorků. Metoda je tak citlivá, že je detekce možná již u jediné buňky. 5 VYBAVENÍ PŘÍSTROJE 5.1 Termocyklery Termocyklery jsou přístroje sloužící pro automatickou regulaci teploty během jednotlivých cyklů PCR reakce. Používají se při klasické PCR a jejich dalších modifikacích buď samostatně nebo spolu s dalšími přístroji k amplifikaci cílových sekvencí popřípadě jejich detekci. 5.2 Historie Na počátku byla PCR metoda náročná na čas a materiál a vynucovala si neustálou pozornost, což bylo nežádoucí. Proto se Cetus Corporation v roce 1985 rozhodnul spojit s firmou PerkinElmer a vznikla tak firma PerkinElmer Cetus Instrument (PECI), která svou činnost zaměřila na sestrojení zařízení, které by bylo automatické a obsluhovalo by celou PCR reakci samo. Snaha inženýrů byla úspěšná a již scientist.com/article/display/36690/ Obrázek 3: "Mr. Cycle", převzato z http://www.the- téhož roku byl sestrojen první prototyp termocykleru. Mr. Cycle, jak je prototyp z roku 1985 nazýván, byl vyroben úpravou vícekanálové automatické kapalinové jednotky a dvou hliníkových bloků. Přes kapalinovou jednotku byl 24

napojen na lázně s teplou a studenou vodou, které střídavě oteplovaly a chladily bloky se zkumavkami s reakční směsí. Přístroj však nebyl plně automatický, protože po každém cyklu, kdy došlo k zahřátí směsi musela obsluha do směsi přidat čerstvý enzym. V následujících letech PECI představila několik druhů termocyklerů, ale plně automatické přístroje byly uvedeny na trh až po objevu termostabilní DNA polymerasy [Sharrer 2006; Smithsonian Videohistory Collection 2004]. V dnešní době jsou na trhu různé druhy termocyklerů i od jiných firem, které postupem času vstoupily na trh. Tyto přístroje jsou dnes programovatelné a objemy analyzovaných vzorků dosáhly mikrolitrových množství. 5.3 Technický popis Důležitými součástmi termocyklerů jsou tepelný blok a u moderních přístrojů i vyhřívané víko. Tepelný blok má otvory, do kterých se vkládají zkumavky s reakční směsí a umožňuje programovatelnou regulaci teploty v jednotlivých cyklech. Některé termocyklery jsou vybaveny několika bloky, které umožňují současné provedení několika různých PCR reakcí. Přístroje mohou mít dále funkci gradientu, která umožňuje nastavení různých teplot v různých částech bloku. Této funkce se využívá zejména při určování teplot vhodných pro vazbu primerů na templátovou DNA. Vyhřívané víko doléhá k víčkům zkumavek a zabraňuje tak nežádoucí kondenzaci vody na spodní straně víčka, ke které by mohlo docházet při zahřívání. PCR reakce se provádí v úzkých zkumavkách, které umožňují rychlé opakování cyklů a syntézu DNA v průběhu 20 vteřin [Rice 2006]. 5.4 Přístroje pro real-time PCR Při kvantitativní real-time PCR vzniká fluorescenční záření. Přístrojové vybavení proto odpovídá této skutečnosti a nepoužívá se klasického termocykleru, ale kombinovaného termocykleru s fluorimetrem, který slouží k měření změny intenzity fluorescenčního záření. Fluorimetr má jednoduché uspořádání. Je tvořen zdrojem excitačního záření, filtry nebo monochromátorem a detektorem záření. Záření vznikající ve zdroji excitačního záření prochází filtrem nebo monochromátorem, kde dochází k úpravě jeho vlnové délky, vstupuje do vzorku a jeho interakcí s ním vzniká fluorescenční záření, které ze vzorku vychází a průchodem přes filtr dopadá na detektor záření. Vznik fluorescenčního záření ve vzorku je dáno chemickými vlastnostmi fluoroforu a zhášeče [Bustin 2004]. 25

5.4.1 Zdroje excitačního záření Ve zdroji excitačního záření vzniká světlo, jehož energie dokáže excitovat elektron fluoroforu. Halogenové žárovky Jejich konstrukce je podobná s klasickou žárovku s wolframovým vláknem, ale plyn vyplňující žárovku obsahuje stopu halogenu (obvykle brom). Tyto žárovky vysílají nepřetržité světlo v rozmezí vlnových délek od 350 nm do 2600 nm. Vzhledem k tomu, že obsáhnou všechny vlnové délky viditelného světla, jsou tyto žárovky označovány jako zdroje bílého světla. Toto široké rozmezí vlnových délek velmi usnadňuje výběr fluorescenčního barviva pro daný vzorek. Lze vybrat nejvhodnější typ bez ohledu na vlnovou délku záření potřebnou k excitaci jeho fluoroforu. Oblast vlnové délky excitačního záření se na požadovanou délku zúží při použití filtrů nebo monochromátoru. Hodnotu fluorescence přístroj zobrazí po dopadu světla emitovaného vzorkem na detektor záření [Bustin 2004]. Lasery Vysílají světlo určité vlnové délky, které je monochromatické. Intenzita tohoto světla je vysoká, ale rozmezí vlnových délek je malé. Hodnotu fluorescence přístroje využívající laser získávají matematickým výpočtem jako rozdíl dvou fluorescenčních signálů. Hlavní nevýhodou laserů je, že emise záření má pevně danou vlnovou délkou, protože většina fluorescenčních barviv má excitační spektrum mimo toto rozmezí a proto je výběr barviv velmi omezen [Bustin 2004]. LED diody Mají charakter polovodiče, emitované světlo má vlnové délky 430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm s rozmezím 30 až 40 nm, což vyhovuje velké části fluorescenčních barviv. S použitím nových materiálů LED diody emitují světlo také v UV oblasti. Hlavními výhodami je poměrně nízká cena vzhledem k laserům, malá velikost, nízká spotřeba energie, nízké přehřívání, vysoká spolehlivost a odolnost proti nárazům a otřesům. Nevýhodou je omezený výběr vlnové délky a nutnost přítomnosti rezistoru [Bustin 2004]. 5.4.2 Filtry Optické filtry se používají k vybrání světla určité vlnové délky, která je pro daný pokus vyžadována. Dají se rozdělit do dvou hlavních skupin a to na filtry excitační a filtry emisní. Excitačními filtry prochází světlo, které vychází ze zdroje a to zejména ze zdrojů bílého světla a někdy také LED diod. Emisní filtry se nacházejí mezi vzorkem a detektorem záření. Slouží k výběru fluorescenčního záření, které se bude sledovat a také k odstranění rozptýlené- 26

ho světla. Optická kvalita filtrů a jejich optimální postavení v optické dráze světla hrají důležitou roli ve výkonu a přesnosti přístroje[bustin 2004]. 5.4.3 Monochromátory K výběru světla určité vlnové délky lze také použít difrakční mřížku nebo hranol. Difrakční mřížka Dopad polychromatického světla na mřížku způsobí jeho rozdělení na paprsky, a to destruktivní, které se dále neuplatňují, a konstruktivní. Vlnová délka konstruktivních paprskům závisí na úhlu, pod kterým se šíří po průchodu mřížkou. Úhel lomu světla můžeme přizpůsobit potřebám pokusu a tím získat světlo potřebné pro danou analýzu [Bustin 2004]. Hranol Slouží k disperzi, polychromatického světla na jeho monochromatické složky, ke které dochází na rozhraní hranol-prostředí. K následnému výběru paprsku, který projde analyzovaným vzorkem, se používá štěrbina. V dnešní době je většinou nahrazen difrakční mřížkou. 5.4.4 Detektory záření Detektor záření mění světelnou energii určité vlnové délky, která na něj dopadá na elektrický signál. CCD (Charge-Coupled Device, zařízení s vázanými náboji) Je elektronická polovodičová součástka, jejíž pole je rozděleno do mnoha samostatných komůrek pixely. Světlo dopadající na každý pixel je převedeno na elektrický náboj. Velikost elektrického náboje je přímo úměrná množství dopadajícího světla. Elektrony se hromadí v pixelech po celou dobu, kdy je osvícen a teprve po zhasnutí světla jsou zpracovávána výsledná data [Bustin 2004]. Fotonásobič Je složen z fotokatody a dynod. Fotokatoda přijímá fotony všech vlnových délek viditelného oblasti elektromagnetického spektra, které mají dostatečnou energii. Tyto fotony vyrážejí fotoelektrony, které jsou urychlovány směrem k dynodám, kde po jejich dopadu dochází ke kaskádovému efektu a vzniku dalších elektronů. Tento efekt má za následek vznik 10 5 až 10 7 elektronů z jediného elektrofotonu fotokatody. Vznikající elektrický signál dopadá na anodu, kde je změřen. 27

5.5 Jednotlivé typy přístrojů 5.5.1 ABI Prism Systems Firma Applied Biosystems (ABI) je předním výrobcem přístrojů pro real-time PCR, protože byla první firmou, která tyto přístroje začala vyrábět. Chemické látky používané v souvislosti s těmito přístroji jsou TaqMan a SYBR Green a této skutečnosti je přizpůsoben i instalovaný software [Bustin 2004]. ABI 7300 Jedná se o přístroj s halogenovou žárovkou, jedním excitačním a čtyřmi emisními filtry a CCD kamerou. Jeho velikost je 34 x 45 x 49 cm (š x h x v) a hmotnost je 29 kg. Používá se mikrotitrační destička s 96 jamkami o objemu 0,2 ml [Bustin 2004]. ABI 7500 Je mnohem pokročilejší přístroj nežli ABI 7300. Jako zdroj excitačního záření rovněž používá halogenovou žárovku, ale místo jednoho má pět excitačních filtrů, což se odráží na větší citlivosti a přesnosti přístroje. Emisních filtrů je také pět a jako detektor se opět používá CCD kamera [Bustin 2004]. ABI Prism 7900 Je to poslední vysoce výkonný amplifikační a detekční systém určený pro real-time PCR s 384 jamkovou mikrotitrační destičkou. Je možno s ním zpracovat více než 5 000 vzorků denně. Používá laseru jako zdroje excitačního záření, jako detekčního zařízení spektrograf a chlazenou CCD kameru [Bustin 2004]. 5.5.2 Roche Applied Science LightCycler LightCycler je jeden z nejrychlejších, vzduchem ohřívaných termocyklerů se zabudovaným mikroobjemovým fluorimetrem pro detekci a kvantifikaci amplifikovaných produktů vznikajících během PCR. Amplifikované produkty se hromadí ve skleněných kapilárách a jejich detekce se provádí pomocí fluorescenčního dsdna vázajícího se barviva nebo fluorescenční sondy. Citlivost a přesnost tohoto přístroje není nižší na úkor rychlosti, ale je srovnatelná s ABI 7700. Přístroj může pracovat s 32 vzorky umístěnými v kruhovém karuselu, který se otáčí kolem modré LED diody a světlo mířící ke špičce kapiláry je filtrováno. Fluorescenční záření emitované vzorkem prochází dichroickým zrcadlem a dopadá na tři fotodetekční diody s třemi pásovými filtry (530 nm, 640 nm a 710 nm). Fluorescenční přírůstek je sledován v intervalech 28

10 100 ms a data jsou shromažďována jednou za cyklus, průběžně nebo postupně podle stanovených teplotních intervalů [Bustin 2004]. LightCycler 2.0 Tento přístroj je nejnovější qpcr zařízení od firmy Roche a vychází z původního LightCycler návrhu. Oproti němu však toto zařízení umožňuje sledování emise fluorescenčního záření pomocí šestikanálového fotometru při šesti různých vlnových délkách (530 nm, 555 nm, 610 nm, 640 nm, 670 nm a 705 nm). Signály se z jednotlivých detekčních kanálů přenášejí do fotohybridu ke konečnému vyhodnocení. Objem kapilár je přizpůsoben požadavkům dnešní doby a je tedy možné použít vzorky o objemu 20 µl a 100 µl. Obvyklý amplifikační cyklus trvá pouze 30 až 60 s, takže celý rozbor trvá méně než 45 minut [Roche, i]. Obrázek 4: Light Cycler 2.0, převzato z http://www.roche-diagnostics.cz/download/mol/analyzatory/lightcycler_2.0%20ivd_cz_low-res.pdf 6 VYUŽITÍ METODY PCR Tato molekulárně biologická metoda má široké použití v různých vědních disciplínách, kde se pracuje se vzorky DNA nebo RNA. Nejedná se tedy pouze o biologii a lékařství, ale také archeologii, trestní právo, ekologii a další. 29

6.1 Archeologie Archeologové využívají PCR různými způsoby při zkoumání svých objevů. Přitom využívají toho, že i několik tisíc let stará DNA stále plní svou funkci a lze ji použít pro identifikaci. Zkoumáním DNA desetitisíců kousků dva tisíce let starých pergamenových svitků pocházejících od Mrtvého moře vneslo do archeologického bádání nový impuls. Pomocí PCR lze určit příbuznost jednotlivých zvířat koz a gazel, z jejichž kůží byly pergameny vyrobeny, a tak je postupem času složit. Analýzou čtyř tisíc let starých nástěnných jeskynních maleb v Texasu, vědci zjistili, že tyto malby neměly pouze dekorativní, ale i náboženský a kouzelný (magický) charakter. Tehdejší lidé při jejich vytváření používali bizoní krev, která byla v této oblasti velmi vzácná a lidé pro jejích získání museli daleko putovat [Powledge 2004]. 6.2 Biologie 6.2.1 Moderní systematika Pomocí DNA lze také zkoumat vývojové vztahy a to nejen ze staré, ale i z DNA jedinců žijících v dnešní době. Systematičtí biologové pomocí PCR zjišťují rozdíly mezi sekvencemi DNA mezi příbuznými druhů a mezi hlavními třídami, a jestli se vybrané sekvence změnily během evoluce. Rychlost a mechanismus tohoto procesu umožňuje vědcům jednoduše srovnávat desítky až stovky jedinců, což dává jejich závěrům pevnější základ. Příkladem je pták Moa z Nového Zélandu, který byl donedávna považován za příbuzného ptáka kiwi či zebra kvaga dříve zástupce afrických koní. Zkoumáním její kůže bylo prokázáno, že je více příbuzná zebrám nežli koňům. Mezi další zkoumaná zvířata patří mamut severní, jehož ostatky byly nalezeny na Sibiři. Vědci shromažďují genetické informace z nejmenších zbytků plachých, vzácných zvířat moči, výkalů, nepatrných kousků srsti nebo odřené kůže. Mimoto, že tyto informace pomáhají ke klasifikaci živočichů, mohou být použity k určení velikosti populace na určitém místě nebo k určení zeměpisné oblasti pohybu jednotlivého zvířete či celé skupiny. Metoda může být přizpůsobena podobným studiím prováděných u rostlin, pro analýzu charakteru rozptylu semen a úspěchu jejich rozmnožení u zvláštních druhů rostlin. Do okruhu zájmu biologů však nepatří pouze zvířata a rostliny, ale také lidé. Studují se vztahy mezi skupinami lidí již vyhynulých druhů či se určuje původní obyvatelstvo, sleduje stěhování národů v průběhu dějin. Analýzy DNA se používá při studiu egyptských mumií a identifikaci ruských carů [Powledge 2004]. 30