VÝROBA EXTRUDOVANÝCH CEREÁLNÍCH POTRAVIN

VÝROBA EXTRUDOVANÝCH CEREÁLNÍCH POTRAVIN Vedoucí práce: Doc. Ing. Evžen Šárka, CSc., Ing. Petra Smrčková, PhD. Místnosti: Budova B: 47, S 41. Úkol Práce: Připravit premixy z jemné kukuřičné krupice s přídavkem vody 20%, 10%, 5% na hmotnost vzorku. Tyto premixy postupně nadávkovat do laboratorního extrudéru KE19/25 (Brabender, Německo) a odebrat reprezentativní vzorky. V odebraných vzorcích stanovit sušinu, expanzní faktor, obsah rezistentního a celkového škrobu a proměřit viskozitní křivky pomocí přístroje RVA 4500 (Perten Instrument, Australia). Průběh projektu: První den: Příprava premixů - laboratorní extruze (místnost 47, S 41) 1. Příprava premixů (přídavek vody). 2. Laboratorní extruze a vyčištění extrudéru. 3. Stanovení expanzního poměru. 4. Mletí vzorků. Druhý a třetí den: Analytické rozbory (místnost 47) 1. Stanovení sušiny vstupního a výstupního materiálu. 2. Stanovení rezistentního škrobu a celkového škrobu. 3. Proměření viskozitních křivek na RVA. 1. den 1. PŘÍPRAVA PREMIXŮ PRO EXTRUZI K20: Navážíte 0,5 kg jemné kukuřičné krupice do mísy hnětače. Přidáte 100 g destilované vody. Vodu postupně přidáte ke kukuřičné krupici a promícháte 5 minut na hnětači. Vzorek uložíte cca na 1 hod odpočívat v zazipovaném igelitovém pytli. K10: Navážíte 0,5 kg jemné kukuřičné krupice do mísy hnětače. Přidáte podle uvážení koření a necháte 1 min promíchat na hnětači. Do Kádinky navážíte 1g chloridu sodného a přidáte tolik vody, aby konečná hmotnost roztoku byla 50g. Roztok chloridu sodného přilejete k okořeněné kukuřičné krupici a promícháte 5 minut na hnětači. Vzorek uložíte cca na 1 hod odpočívat v zazipovaném igelitovém pytli. K5: Navážíte 0,5 kg jemné kukuřičné krupice do mísy hnětače. Přidáte podle uvážení koření a necháte 1 min promíchat na hnětači. Do Kádinky navážíte 2,5 g chloridu sodného a přidáte tolik vody, aby konečná hmotnost roztoku byla 25g. Roztok chloridu sodného přilejete k okořeněné kukuřičné krupici a promícháte 5 minut na hnětači. Vzorek uložíte cca na 1 hod odpočívat v zazipovaném igelitovém pytli. 1

2. EXTRUZE (VIZ PŘÍLOHA 1) 3. PŘÍPRAVA VZORKŮ NA LABORATORNÍ ROZBORY 3.1. Mletí extrudátů na mlýně Perten 3.2. Založení 16 hodinové Inkubace vzorků s pankreatickou α-amylasou pro stanovení rezistentního škrobu (viz kapitola 5.1 na str. 3) 2. den Úkol: Stanovte ve vstupním a výstupním materiálu rezistentní a celkový škrob, sušinu na sušících vahách a proměřte viskozitní křivky pomocí přístroje RVA 4500. 4. PROMĚŘENÍ VISKOZITNÍCH KŘIVEK NA RVA 4500 Princip metody: Analyzátor RVA 4500 (Rapid Visco Analyser) firmy Perten Instr. (Austrálie) je rotační viskozimetr, jenž funguje na bázi nejnovější technologie, která se vyznačuje variabilním ohřevem, chlazením a možností míchání, resp. aplikací smykového tření ve vzorku během měření. Měří viskozitu suspenze pevného podílu (mouka, šrot, škrob, atd.) a vody za průběžného míchání a teplotních změn dle zvoleného protokolu. RVA analyzátor je připojen k počítači a řízen programem TCW (Thermo Clime for Windows, Perten Instr.of Australia). Tento program umožňuje provádět celou řadu testů, analyzovat získané výsledky a zpracovávat je do podoby tabulek a grafů. K dispozici jsou standardizované zkušební profily, z nichž některé jsou schváleny Americkou společností pro cereální chemiky (AACC) a Mezinárodní společností pro cereální vědu a technologii (ICC). Postup měření: 4.1. Výběr testu 1. Ve spuštěném programu TCW běžte do menu Run a vyberte Select Configuration to Run (Vybrat konfiguraci ke spuštění testu). 2. Ze seznamu vyberte konfigurační soubor testu s názvem Extrudáty_kukuřice a klikněte na Open (Otevřít). 3. Pokud budete vyzváni, zadejte název projektového souboru. 4. Pokud budete vyzváni, zadejte údaj o hmotnosti vzorku. 5. Nyní se otevře okno kalkulátoru. 4.2. Výpočet hmotnosti vzorku pomocí kalkulátoru Program TCW obsahuje kalkulátor pro výpočet hmotnosti vzorku, kterým je možné rychle vytvořit korekci na požadovaný obsah vlhkosti (12%), tím, že spočítáte množství vzorku a vody, které chcete použít k jeho přípravě. Kalkulátor pro výpočet hmotnosti vzorku můžete nechat zobrazit automaticky před každým testem. Zobrazená data jsou následně uložena do projektového souboru a mohou být zobrazena v projektovém reportu. 2

1. Vložte požadovanou standard sample weight 3g pro vzorek kukuřice. 2. Vložte požadovanou standard water weight jmenovitě 25,0 g. 3. Vložte hodnotu základní vlhkosti (Moisture Basis) (12 %). 4. Vložte hodnotu naměřené vlhkosti vašeho vzorku do kolonky Moisture content (např. 13,5 %). 5. Zaškrtněte políčko Fix water weight (konstantní hmotnost vody). 6. Hmotnosti vzorku a vody budou automaticky vypočítány a zobrazeny v okně. Po dokončení stiskněte tlačítko Close (Zavřít). 4.3. Příprava vzorku 1. Navažte 25 g destilované vody do hliníkové nádobky. 2. Na lodičku navažte vzorek s přesností na dvě desetinná místa podle hodnoty vypočtené pomocí kalkulátoru. 3. Těsně před začátkem testu kvantitativně převeďte vzorek do hliníkové nádobky s vodou. Zavřete gumovou zátkou a důkladně promíchejte. 4. Vložte do nádobky míchadlo a několikrát jím pohybujte výrazně nahoru a dolů. Všechny zbytky vzorku, které ulpívají na stěnách, setřete dolů do vody. 4.4. Vložení vzorku do analyzátoru 1. Zkontrolujte, že stavové světýlko bliká zeleně, což znamená, že přístroj dosáhnul požadované teploty pro provádění testů. 2. Vložte míchadlo s lopatkami do nádobky a zasuňte jeho horní hranu do úchytu. 3. Zkontrolujte, že míchadlo je dobře usazeno jeho silnějším zatlačením proti úchytu. 4. Pomalu zasuňte věž s motorem dolů, dokud neuslyšíte cvaknutí. Poté jej okamžitě uvolněte. Stavové světýlko změní svou barvu ze zelené na oranžovou a ihned dojde ke spuštění testu. 3

4.5. Ukončení testu 1. Změní se barva stavového světýlka z oranžové na zelenou a dojde k vysunutí vzorku z analyzátoru. Pootočte rukou úchyt míchadla tak, aby otvor mířil směrem k vám. 2 Pomocí izolačních ochranných rukavic odolných teplu vyndejte nádobku s míchadlem tak, že ji uchytíte pevně za její horní část a vytáhnete směrem k sobě. 3 Nádobku s míchadlem umyjte. RVA 4500 je připraven k analýze dalšího vzorku. 5. STANOVENÍ REZISTENTNÍHO A CELKOVÉHO ŠKROBU ENZYMOVĚ Při stanovení celkového a rezistentního škrobu budete používat enzymový set: Resistant starch procedure ( Megazyme, Irsko). Postup stanovení je založen na standardních mezinárodních metodách (AOAC method 2002.02 a AACC Method 32-40.01) Princip metody Umletý vzorek se inkubuje s pankreatickou α-amylasou a amyloglukosidasou (AMG) po dobu 16 hodin ve vodní lázni 37 C teplé za intenzivního třepání. Během tohoto kroku dochází působením dvou enzymů ke ztekucení stravitelného škrobu (nerezistentního) a jeho hydrolýze na glukosu. Hydrolýza se ukončí přídavkem ekvivalentního množství denaturovaného etanolu a rezistentní škrob zůstane po odstředění v nerozpustném podílu (sedimentu). Sediment se dvakrát promyje 50% denaturovaným etanolem s následným odstředěním. Kapalný podíl (supernatant) se důkladně slije a uchová pro stanovení rozpustného škrobu. Rezistentní škrob přítomný v sedimentu se rozpustí v 2M KOH za intenzivního míchání v ledové lázni. Vzniklý roztok se zneutralizuje pomocí acetátového pufru a škrob je kvantitativně hydrolyzován na glukosu působením AMG. Glukosa je stanovena po reakci s glukoso-oxidasovým/peroxidasový činidlem (GOPOD), které tvoří barevný komplex s glukosou a její obsah je stanoven spektrofotometricky při 510 nm. Obsah glukosy v roztoku je přímo úměrný obsahu rezistentního škrobu ve vzorku. Nerezistentní škrob (stravitelný škrob) se stanoví tak, že se sbírají do 100 ml odměrné baňky etanolové frakce, kterými byl promýván vzorek po inkubaci s pankreatickou α- amylasou a amyloglukosidasou (AMG). Po úpravě objemu na 100 ml se také stanoví obsah glukosy pomocí GOPODu. Postup měření: 5.1. Inkubace vzorků 16 hodin s pankreatickou α-amylasou (Provádí se 1. den) 5.1.1 Přesně navažte 100 ± 5 mg vzorku přímo do zkumavky se závitem a jemně poklepejte zkumavkou, abyste zajistili, že se vzorek dopadne až na dno. 5.1.2 Připravte si roztok pankreatické α-amylasy (10 mg/ml), tak že si navážíte 0,2 g pankreatické α-amylasy do 50 ml kyvety a pak přidáte 20 ml pufru s maleátem sodným a 0,2 4

ml amyloglukosidasy. Vniklá suspenze se nechá 5 minut míchat na laboratorní třepačce. Poté se odstředí 10 minut při 3000 rpm. (tento se musí připravovat každý den čerstvý). 5.1.3 Přidejte 4 ml roztoku připraveného podle bodu 5.1.2 do každé zkumavky. Poté zkumavky pevně zavřete, dobře promíchejte na vortexu a vložte je vodorovně do vodní lázně ve směru pohybu třepání a připevněte pomocí gumových úponů (viz obrázek 3). Obr. 3. Připevnění zkumavek s víčkem na rám třepací vodní lázně pomočí gumových úponů 5.1.4 Nechte zkumavky Inkubovat při 37 C za kontinuálního třepání 200 úderů/min, po dobu přesně 16 hodin. 5.2. Oddělení nerezistentního (stravitelného) škrobu (2. den) 5.2.1 Po 16 hodinách inkubace vyndejte zkumavky z vodní lázně a odstraňte přebytek povrchové vody papírovou utěrkou. Sundejte uzávěry ze zkumavek a přidejte 4,0 ml etanolu (99 %) a intenzivně pro míchejte na vortexu. 5.2.2 Odstřeďte zkumavky při 3000 rpm po dobu 10 minut (nezavřené). 5.2.3 Opatrně slijte supernatant do 100 ml odměrné baňky a resuspendujte sediment ve 2 ml 50% etanolu za intenzivního míchání na vortexu. Přidejte dalších 6 ml 50% etanolu, promíchejte zkumavky a odstřeďte opět při 3000 rpm po dobu 10 minut. 5.2.4 Znovu slijte supernatanty stejně, jako v bodě 5.2.3 opakujte znovu resuspendaci a odstředění při 3000 rpm po dobu 10 min. 5.2.5 Ještě jednou slijte supernatanty do příslušných odměrných baněk a převraťte zkumavky na filtrační papír dnem vzhůru, aby se odsála přebytečná tekutina ze sedimentu. 5.2.6 Supernatanty slité z jednotlivých vzorků doplňte v odměrné baňce (V = 100 ml) destilovanou vodou po značku. Dobře promíchejte a použijte ke stanovení rozpustného škrobu. Inkubaci s GOPOD činidlem provádějte společně s inkubací rezistentního škrobu. 5

5.3. Stanovení rezistentního škrobu 5.3.1 Zkumavky obsahující sediment zbylý po odstranění supernatantu (viz bod 5.2.5) umístěte do ledové vodní lázně, která stojí na magnetické míchačce (viz obr. 4). Do Každé zkumavky vložte magnetickou míchací tyčinku (5 x 15 mm) a přidejte 2 ml KOH (c=2 mol.l 1 ). Suspenzi nechte míchat po dobu 20 minut. Obr. 4. Vodní lázeň s ledem umístěná na magnetickém míchadle (tyčinková míchadla jsou uvnitř zkumavek) 5.3.2 Po ukončení míchání přidejte do každé zkumavky 8 ml acetátového pufru (c=1,2 M, ph 3,8) a promíchejte. Potom přidejte 0,1 ml AMG (3300 U/ml), znovu dobře promíchejte a inkubujte zkumavky ve vodní lázni při teplotě 50 C po dobu 30 minut. Každých 10 minut, však promíchejte obsah zkumavek. 5.3.3 Obsah zkumavky odstřeďte při 3000 rpm po dobu 10 minut. 5.3.4 Z každé zkumavky pipetujte 0,1 ml roztoku do skleněné zkumavky (l6x100 mm), Přidejte 3,0 ml činidla GOPOD a inkubujte při 50 C po dobu 20 minut. Změřte absorbanci při vlnové délce 510 nm proti slepému pokusu (ΔA RS ). Vypočítejte obsah rezistentního škrobu podle rovnice 1. 5.3.5 Z každé 100 ml odměrné baňky (viz bod 5.2.6) pipetujte 0,1 ml roztoku do skleněných zkumavek (l6x100 mm) a inkubujte se 3,0 ml rekčního činidla GOPOD po dobu 20 minut při 50 C. Změřte absorbanci při vlnové délce 510 nm proti slepému pokusu (ΔA NS ). Vypočítejte obsah stravitelného (nerezistentního) škrobu podle rovnice 2. 5.3.6 Spolu s každou sadou vzorků inkubujte také slepý pokus, který připravíte smícháním 0,1 ml acetátového pufru (c = 0,1 M, ph 4,5) a 3,0 ml reakčního činidla GOPOD a dále 2 standardy glukosy připravené smícháním 0,1 ml standardního roztoku glukózy (1 mg/ml, který je součástí enzymového setu) a 3,0 ml reagenčního činidla GOPOD. 6

5.4. Výpočet obsahu rezistentního, stravitelného (nerezistentního) a celkového škrobu 5.4.1 rezistentní škrob xrs(%) = A RS F w FV 0,9 (1) Kde je: xrs obsah rezistentního škrobu ve vzorku (%) A RS absorbance rezistentního škrobu měřená proti slepému pokusu F = 100(μg D glucosy) absorbance 100 μg D glucosy FV konečný objem (10,3 ml) 0.9 = 162 180 Přepočet absorbance na μg přepočet z volné D-glukosy na anhydroglukosu, která je přítomná ve škrobu 5.4.2 Nerezistentní (stravitelný) škrob xns(%) = A NS F w FV 0.9 (2) A NS absorbance stravitelného škrobu měřená proti slepému pokusu FV konečný objem (100 ml) 5.4.3 celkový škrob xts se vypočte: xts = xrs + xns (3) 6. STANOVENÍ SUŠINY NA SUŠICÍCH VAHÁCH Princip metody: Principem metody je thermogravimetrické stanovení vlhkosti sypkého materiálu. Používají se sušicí váhy na stanovení vlhkosti a sušiny. Tyto váhy obsahují dva halogenové křemenné zářiče, každý o výkonu 200 W. Teplotu sušení lze nastavit v rozmezí 40 až 250 C, krok 1 C. Po spuštění programu probíhá plně automatické sušení do konstantní hmotnosti. Nastavená teplota je 105 C. Postup měření: Do hliníkové misky se na sušicích váhách naváží 2 g vzorku. Zavře se poklop a stiskne tlačítko Start. Po 10-15 minutách svítí na displeji pouze symbol + a hodnota sušiny v hmotnostních procentech. Stanovení sušiny proveďte třikrát. 3. den Dokončení rozborů. 7