MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2013 ALENA JURČEKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Výzkum genetického založení zbarvení u jorkšírského teriéra Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík, Ph.D. Vypracoval: Bc. Alena Jurčeková Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Výzkum genetického založení zbarvení u jorkšírského teriéra vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěla poděkovat panu Ing. Liboru Stehlíkovi, Ph.D. a paní Ing. Ireně Vrtkové za vedení, odborné konzultace a pomoc při zpracování diplomové práce. Paní Alici Kučerové a paní Lence Roznětínské za poskytnutí vzorků, odborných kynologických konzultací a možnost nahlédnout do chovu jorkšírského teriéra u nás. Dále pak jmenovitě Lence, Lucce a Lence z laboratoře, které byly vždy po ruce při jakékoliv nesnázi. V neposlední řadě bych chtěla velmi poděkovat rodičům, bratrovi a přátelům za veškerou podporu a pomoc během celého studia.

ABSTRAKT U jorkšírského teriéra rozlišujeme několik barevných variant klasického black/blue and tana, biewera, golddusta, čokoládové zbarvení, biro biewera, goldena, hořčicové zbarvení a zbarvení ocean pearl. V České republice je Mezinárodní kynologickou federací (FCI) uznaná pouze kombinace black/blue and tan, přesto se u nás najdou chovatelé, kteří si oblíbili některou z barevných variant a postupně u nás chov rozšiřují. Barevné varianty se ve vrzích vyskytovaly vždy. Aby je mohli chovatelé cíleně křížit a produkovat, bylo by vhodné provádět u psů analýzu DNA v lokusech pro zbarvení. Přenos světlých odstínů srsti (žlutá, zlatá, krémová) zajišťuje gen MC1R a jeho recesivní projev e/e, čokoládoví psi jsou homozygoti b/b v genu TYRP1. Gen MITF se projevuje u recesivních homozygotů (s p /s p ) jako nepravidelná bílá skvrnitost (biewer, biro bewer, golddust). Různé způsoby zesvětlování nebo šednutí jsou pravděpodobně způsobeny genem MLPH nebo progresivním šedivěním. Cílem práce je charakterizovat genetické založení a vybrat vhodné kandidátní geny s působením na různé barevné varianty u jorkšírského teriéra. Byla sestavena skupina zvířat, u kterých byly geny s vlivem na zbarvení analyzovány. Byly testovány dva geny MC1R a TYRP1. Projev recesivního homozygota v MC1R by měl být pes světlého zbarvení. V naší zkoumané skupině zvířat nebyla tato hypotéza potvrzena. Světle zbarvení psi (golddusti, goldeni, hořčicově a ocean pearl zbarvení jedinci) nesli genotypy E/E nebo E/e, a to i přes opakované analýzy za různých podmínek. Funkčnost metody byla potvrzena testováním zlatého retrívra a žlutého labradorského retrívra. Výsledek této analýzy nám naznačuje možný vliv jiného genu na světlé zbarvení u jorkšírských teriérů, případně možnost dokonalejší optimalizace stávající metody. Gen TYRP1 se projevuje hnědým zbarvením. Testují se u něj 3 možné mutace. Nejprůkaznější mutací je mutace Q331ter na 5. exonu. Hnědí jedinci byli v této mutaci recesivně homozygotní. U mutací 345delP a S41C se projevovali pouze jako dominantní homozygoti, příp. heterozygoti. Neustále probíhá výzkum interakcí jednotlivých genů a objevují se nové mutace a geny, které spolu vytváří nové barevné varianty nebo vysvětlují princip stávajících známých barev. Klíčová slova: Jorkšírský teriér, kandidátní geny zbarvení, MC1R, TYRP1.

ABSTRACT There are several color variants of the Yorkshire terrier recognized - classic black / blue and tan, Biewer, Golddust, chocolate color, Biro Biewer, Golden, mustard color and the color of ocean pearl. The Fédération Cynologique Internationale (FCI) recognizes only black / blue and tan combination in the Czech Republic. Nevertheless, one can also find breeders who favor other color variants and gradually expand their breeding. Color variations always occur in litters. To maintain efficient color reproduction and provide an effective crossbreeding the utilization of DNA analysis is desirable. Transmission of light shades of hair (yellow, gold, cream) is carried by MC1R gene and its expression of the recessive e/e, chocolate dogs are homozygous b/b for TYRP1. MITF gene occurs in recessive homozygotes (s p /s p ) expressed as irregular white spotting (Biewer, Biro biewer, Golddust). Various forms of lightening or greying may be caused by MLPH gene or by progressive greying. Purposes of work is to characterize the genetic basis of coloring and select suitable candidate genes possessing the influence on different color variations of Yorkshire terriers. Genes influencing the color were analyzed on the selected group of dogs. The presence of genes MC1R and TYRP1 was tested. Recessive homozygous allele MC1R should provide red/yellow coat color. Nevertheless, this was not confirmed in our work despite repetitive analysis under various conditions. We have found that pale dogs (Golddust, Golden, mustard and ocean pearl color) carry E/E or E/e genotypes. The functionality of analysis was successfully confirmed by testing Golden Retriever and Yellow Labrador Retriever for the presence gene of MC1R. The result of this analysis show possible effect of other gene, eventually suggests possibilities for a better optimization of the current method. Gene TYRP1 is manifested by brown hair color. Usually, presence of three mutations is tested. The most conclusive mutation is Q331ter on exon 5. Most of brown individuals were recessive homozygous in this mutation. In muatations 345delP and S41C they were dominant homozygous, eventually heterozygous. New mutations and genes are being discovered and creating together new color variants or uncovering the principles of manifestation of known existing colors. Keywords: Yorkshire terrier, candidate genes of colors, MC1R, TYRP1.

OBSAH 1 ÚVOD... 9 2 CÍL PRÁCE... 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 12 3.1 Jorkšírský teriér... 12 3.1.1 Barevné varianty... 13 3.2 Pigmentace srsti... 21 3.3 Charakteristika a struktura genomu psa domácího... 22 3.4 Genetický polymorfismus... 22 3.4.1 Genetické markery... 23 3.5 Přehled genů s vlivem na zbarvení u psů... 23 3.5.1 Základní zbarvení srsti... 25 3.5.2 Odstíny základního zbarvení srsti... 31 3.5.3 Skvrnité vzory a bílé odznaky... 33 3.6 Výzkum zbarvení u jorkšírského teriéra... 38 3.7 Molekulárně biologické metody pro detekci polymorfismů DNA... 42 4 MATERIÁLY A METODY ZPRACOVÁNÍ... 44 4.1 Sledované soubory zvířat a odběr vzorků... 44 4.2 Izolace DNA... 44 4.3 Detekce alel MC1R pomocí PCR-RFLP... 45 4.3.1 PCR... 45 4.3.2 RFLP... 46 4.4 Detekce alel TYRP1 pomocí PCR-RFLP... 47 4.4.1 PCR pro mutace na exonu 5... 47 4.4.2 RFLP pro mutace na exonu 5... 49 4.4.3 PCR pro mutace na exonu 2... 49

4.4.4 RFLP pro mutace na exonu 2... 50 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE... 52 5.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR)... 52 5.2 Stanovení polymorfismů MC1R pomocí PCR-RFLP... 52 5.3 Stanovení polymorfismů TYRP1 pomocí PCR-RFLP... 55 5.4 Verifikace přenosu alel mezi příbuznými jedinci... 61 6 ZÁVĚR... 64 7 SEZNAM LITERATURY... 66 8 SEZNAM TABULEK... 76 9 SEZNAM OBRÁZKŮ... 77

1 ÚVOD Domestikace psa dala vzniknout plemenům rozmanitých typů, velikostí a zbarvení. Právě zbarvení se někdy stává tak pestrým, že by jim neumožnilo přežít ve volné přírodě. Lehce by se stali kořistí a zároveň by pro svoji nápaditost nebyli schopni ulovit nic ke své potravě. Všechna čistokrevná plemena mají ve svém standardu přesně určené zbarvení srsti, které je u nich žádoucí, přijatelné nebo vylučující (Dostál, 2007). Pigmenty eumelanin a feomelanin ovlivňují základní zbarvení srsti. Jejich zastoupení, intenzita a rozmístnění je ovlivněno několika geny. Ty nejvýznamnější jsou melanocortin 1 receptor (MC1R), beta-defensin 103 (CBD103), agouti signaling protein (ASIP), tyrosinase-related protein 1 (TYRP1), melanophilin (MLPH) a microphthalmia-associated transcription factor (MITF). U většiny savců je eumelanin a feomelanin regulován geny MC1R a ASIP, u domestikovaných psů hraje důležitou roli i gen CBD103. V dědičnosti barev byla popsána hierarchie a vzájemné ovlivňování genů s podílem na zbarvení. Gen MC1R má nadřazený účinek vůči ostatním genům zodpovědných za zbarvení. Z toho vyplývá, že braní projevům alel jiného lokusu a očekávaný znak se proto vůbec neprojeví (www.genomia.cz). U jorkšírského teriéra rozlišujeme několik barevných variant. Nejčastěji se vyskytují bieweři, golddusti a čokoládoví teriéři. Dále se pak mohou objevit goldeni, biro biewři a hořčicově nebo ocean pearl zbarvení psi (Javorčeková, 2011). Souhrnně se tito psi nazývají parti-colour jorkové (www.yorkiepower.com). FCI ale uznává převážně pouze jorkšírského teriéra klasického zbarvení černého/modrého s pálením (black/blue and tan). Každá jiná barevná varieta je v chovu považována za vadu (Javorčeková, 2011). Čokoládoví jorkšíři se většinou rodí klasicky zbarveným rodičům. Štěňata byla z chovu dříve vyřazována a utrácena, i když u nich nikdy nebyly popsány žádné vrozené vady, nemoci nebo jiné indispozice. Biewer byl vyšlechtěn v Německu na základě posilování bílé barvy. Má černobílé tělo, bílé břicho a nohy. Hlavu musí mít trikolórní. Golddust je vyšlechtěn z biewra. Je u něj preferována zlatá barva. Na těle nesmí mít přítomný tmavý pigment a štěňata se rodí zlato-bílá. Oproti tomu zlatý jorkšír se rodí ve zlaté barvě s tmavými znaky (mustard) nebo v tmavé barvě a zlatá barva se objeví kolem 8 týdne (creme) (Javorčeková, 2011). 9

Šlechtění je dlouhodobý proces, kde změnami v genotypu přetváříme fenotypový projev zvířat (změny ve znacích nebo vlastnostech) (Šubrt, Hrouz, 2011). V průběhu šlechtění jorkšírských teriérů se objevují lidé se zájmem o odlišné barevné varianty a snaží se cíleně tyto psy mezi sebou křížit. Tím se potomstvo barevných yorků ustaluje a může být, stejně jako v Německu nebo USA, uznáno za samostatné plemeno. Tyto pestrobarevné varianty se nadále intenzivně rozšiřují po celém světě (Cheroglo, 2011). 10

2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je: charakterizovat genetické založení zbarvení u jorkšírského teriéra vybrat vhodné kandidátní geny pro diskriminaci různých variant zbarvení (black and tan, golddust, biewer, chocolate) sestavit skupiny sledovaných zvířat na základě fenotypového projevu analyzovat kandidátní geny pro určení genotypu zbarvení u jorkšírského teriéra 11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Jorkšírský teriér Nomenklatura FCI plemen psů rozlišuje deset skupin. Jorkšírský teriér patří do třetí skupiny teriérů. Ta se dále člení na 4 sekce velcí a středně velcí teriéři, malí teriéři, teriéři bull typu a toy teriéři. Jorkové spadají do sekce toy teriérů (Šebková, 2009). Jedná se o dlouhosrstého psa, jehož černá nebo modrá srst s pálením stejnoměrně splývá po obou stranách těla a je rozdělena pěšinkou od nosu až po konec ocasu. Tělo je elegantní, kompaktní s dobrou stavbou. Vysoce nesená hlava a jisté chování psů dodává vzhledu sílu a důležitost (www.kennelclubusa.com, www.cmkchyt.cz). Jorkšírský teriér, původem z malých plemen teriérů, pochází ze Skotska a z Anglie. Před dvěma stoletími patřil mezi neohrožené lovce krys. Byli to malí černozlatí psi s jemnou srstí, nezkrotnou povahou a obrovskou odvahou, a tak i temperament současných jorků své teriérské předky nezapře (Šebková, 2009). První zmínka pochází z roku 1850 (www.cmku.cz). Předkem je staré, již vyhynulé, plemeno Waterside teriér a skotská plemena Clydesdale teriér a Paysley teriér (Šebková, 2009). Dále pak maltézský psík a skye teriér (www.cmku.cz). Svou dnešní podobu získal jorkšírský teriér v Británii, v hrabstvích Yorkshire a Lancashire. V roce 1886 bylo plemeno zapsáno do chovné knihy English Kennel Club a v roce 1898 byl v Anglii založen první Yorkshire Terrier Club na světě (Šebková, 2009). Mozkovna psa je spíše malá a plochá, nosní houba černá. Tlama by neměla být příliš dlouhá a měla by mít dokonalý, pravidelný a úplný nůžkový skus s dobře rozmístněnými zuby. Jorkové mají střední, tmavé, zářivé oči, posazené tak, že hledí přímo vpřed. Nevystupují. Okraje očních víček by měli mít tmavé. Uši jsou malé, tvaru písmene V, vztyčené, pokryté krátkou srstí. Jejich zbarvení je stejnoměrné, intenzivně tříslové. Trup by měl být kompaktní s rovným hřbetem, pevnými bedry a středně klenutými žebry. Ocas je obvykle kupírován. Končetiny by měly být rovné, bohatě osrstněné a tlapky kulaté s černými drápy. Pohyb by měl být prostorný se značným posunem vpřed. Hřbetní linie zůstává v pohybu rovná. Srst na trupu by měla být středně dlouhá, rovná, lesklá, jemné hedvábné textury. Nesmí bránit v pohybu. Jorkové by na hlavě měli mít dlouhou srst, zlatě tříslového odstínu, který by neměl zasahovat na krk. Nejintenzivnější zbarvení je po stranách hlavy, v místě nasazení uší a na čumáku. V tříslově zbarvených plochách nesmí být 12

nikdy přimíchány tmavé či černé chlupy. Tmavě ocelově modrá barva se rozprostírá od týlního hrbolu ke kořeni ocasu, nesmí být smíchaná se žlutými, bronzovými ani tmavými chlupy. Hruď je tříslová. Veškerá tříslová srst je u kořínků tmavší. Každá odchylka od exteriéru se u klasického jorkšírského teriéra posuzuje jako vada. Vyřazující chybou jsou také agresivní nebo bázliví jedinci, pes jasně vykazující tělesné nebo povahové abnormality (www.cmku.cz). Obr. 1 Jorkšírský teriér (http://www.jaapes.estranky.cz/) 3.1.1 Barevné varianty Biewer jorkšírský teriér (biewer) Biewer jorkšírský teriér byl v roce 1984 vyšlechtěn v Německu manželi Gertrudou a Wernerem Biewrovými. Biewer se od klasického jorka liší bílými odznaky. K jeho vzniku došlo pravděpodobně zkřížením heterozygotních rodičů nesoucích recesivní alelu pro bílé zbarvení. Rodiče prvního biewra byli zapsáni pod FCI jako jorkšírští teriéři zbarvení blue and tan. Štěňata atypického zbarvení se manželům zalíbila a proto v selekci a šlechtění dalších biewrů pokračovali. Toto nově vytvořené plemeno nazvali Biewer Yorkshire Terrier à la Pom Pon (www.equisitebiewers.com). Množitelé psů s vidinou snadného výdělku díky zvyšující se oblibě nového plemene získávali strakaté jorky křížením jiných plemen jako shi-tzu, lhasa apso, maltézský psík. Tito psi ale neměli typické znaky jorkšírského teriéra, změnil se jejich celkový exteriér (www.americancanineregistry.com). Biewer je oblíbeným psím společníkem v USA, kde byl poprvé uznán samostatným plemenem americkým psím registrem (ACR). ACR založil Biewer Yorkie 13

Association. USA vede registr o čistokrevnosti biewera a podporuje produkci těchto trikolorních jorků díky F1 a F2 křížení. Jedince těchto generací nazýváme spaltbiewer. První biewer klub byl uznán v roce 2003 v Německu (Javorčeková, 2011). Bieweři mají dlouhou splývavou srst s hedvábnou strukturou. Barva těla je bíločerná (modrá), hlava trikolorní. V místech zlaté barvy se mohou vyskytovat odstíny hnědé. Nohy, břicho a hrudník jsou bílé. Oči a oční víčka jsou tmavá, stejně jako kůže čumáku a polštářky tlapek. Vadou je jakákoliv odchylka od výše uvedených znaků (www.biewers.com). Připařením klasického black/blue and tan jorka a čistého biewra získáme F1 generaci, tzv. spaltbiewera (halbbiewera). Vzhledem se podobá klasickému jorkovi, ale najdeme u něj drobné bílé znaky. Spojením F1 generace s klasickým jorkem získáme zase psa v klasické barvě, spojením F1 generace s čistokrevným biewerem získáme F2 generaci spaltbiewerů jedná se o potomstvo klasické a trikolorní ve vrhu nebo pouze klasické. Trikolorní štěňata ještě nemůžeme prohlásit za čisté biewery, i když tak vypadají. Spojením F2 generace s čistým biewrem získáme generaci F3 narodí se opět buď klasická nebo trikolorní štěňata, která však za čisté biewry označit můžeme. Čistý vrh biewerů získáme až spojením F3 spaltbiewerové generace s čistokrevným biewerem. Dalším krytím těchto štěňat získáváme pouze čistokrevné biewery, ovšem s klasickým teriérem získáme zase potomstvo klasických jorků. Gen biewera se upevňuje po několik generací (Javorčeková, 2011). Obr. 2 Biewer jorkšírský teriér (Ailin) (foto A. Kučerová) 14

Golddust ( biewer bílé zlato ) Také golddust pochází z Německa. Jedná se o barevnou variantu biewera. Pro svůj nesoulad se standardem biewera byli tito jedinci vyřazováni z chovu. Díky Kirsten Sanchez-Meyerové a dalších chovatelů byla tato barevná varianta v roce 2007 uznána za samostatné plemeno (Javorčeková, 2011). Jedná se o statnějšího psa než klasický jorkšírský teriér s rovnoměrně zlatě nebo bílo-zlatě zbarvenou malou jemnou hlavou. Nos je tmavý s růžovými nebo játrovými skvrnami. Oči jsou zelenohnědé až tmavohnědé barvy (Javorčeková, 2011). Kůže těla je růžová se zlatými skvrnami. Srst je dlouhá, ne tolik jemná, v bílo-zlaté barvě v různých poměrech a v ne příliš sytých odstínech. Srst nohou a hrudi je čistě bílá. Dospělá zvířata nesmí na sobě mít žádné černé chlupy. Pouze štěňata se rodí s černými špičkami chlupů, které později zesvětlají (www.biewers.com). Pro zisk golddusta bychom mezi sebou měli pářit golddusty nebo psy s golddustem v blízkém původu. Spáříme-li golddusta a biewera získáme biewera, který nese alelu pro zlaté zbarvení (goldspalter). Spojením klasického jorka a golddusta se rodí black/blue and tan goldspalteři. Potomci golddusta a goldspaltra jsou golddusti a black and tan jorkové goldspalteři. Spaltbieweři a golddusti nám dají potomky biewera a goldspalterů klasických jorků (Javorčeková, 2011). Obr. 3 Golddust (O Collin) (http://biewer.majestat.cz/) 15

Čokoládové zbarvení (chocolate, choco tan, brown and tan) Původ hnědého zbarvení u jorků se dodnes nepodařilo úplně vysvětlit. Domníváme se, že se hnědý odstín vyskytoval vždy. Občas se objevil ve vrhu klasicky zbarveným rodičům a není proto důsledkem žádného hlubšího šlechtění (www.americancanineregistry.com). Čokoládová štěňata byla z chovu vždy vyřazována. FCI toto zbarvení, i přes absenci jakýchkoliv zdravotních problémů, dosud neuznala (Javorčeková, 2011). Čokoládový jorkšír má po celém těle hnědý odstín srsti. Hlava a končetiny nesou zlaté pálení. Polštářky tlapek, oční víčka a kůže čumáku jsou játrové barvy. Srst je dlouhá, hedvábná, bez podsady. Oči jsou tmavé (Javorčeková, 2011). Hnědé zbarvení je podmíněno recesivním genem pro hnědou barvu (TYRP1) a vyžaduje vždy dvě kopie (jednu od každého rodiče) k produkci hnědého pigmentu (www.americancanineregistry.com). Čokoládově zbarvený vrh získáme spojením čistě čokoládových rodičů nebo jednoho čokoládového psa s jorkem, který nese recesivní alelu pro hnědou barvu (www.americancanineregistry.com). Dále se hnědě zbarvený jedinec může vyskytnout ve vrhu u black and tana, biewera nebo rodičů s různým odstínem žluté barvy, kteří jsou oba heterozygotní v genu TYRP1 (B/b). Ve všech ostatních případech dostaneme psy zbarvené v jejich původní barvě, tzn. například spojením čokoládového psa a black and tan dominantního homozygota pro hnědou barvu (B/B) získáme podle Javorčekové (2011) černá štěňata s pálením, ale s jednou alelou pro hnědé zbarvení (jedná se o přenašeče). Připářením čokoládového psa a biewra bez recesivní alely pro hnědou získáme klasicky zbarvená štěňata (black and tan) nebo spaltbiewry s vlohami pro hnědé zbarvení (Javorčeková, 2011). 16

Obr. 4 Čokoládové zbarvení (Viviana) (foto A. Kučerová) Biro biewer Jedná se o bílo-čokoládovou barevnou variantu s pálením, která byla poprvé zaznamenána v Německu v chovu Roberta Kraha roku 2004 (Javorčeková, 2011). Rodiče této první registrované fenky byli vícegenerační klasičtí biewři (www.wagg-ntails.webs.com). Biro biewer je toy teriér s rovnoměrně splývající srstí po obou stranách těla od lebky až po ocas. Zbarvení srsti je bílo - čokoládové nebo úplně čokoládové s bílou hrudí a bez černých odznaků. Chlupy na hrudi, břichu a nohou jsou čistě bílé (www.biewers.com). Hlava by měla být spíše malá a plochá s čokoládově-bílo-zlatým zbarvením. Čumák nesmí být příliš dlouhý. Nos nese čokoládovou nebo játrovou barvu. Oči jsou středně velké, tmavé a jiskřivé s inteligentním výrazem (http://www.pamperedbiewers.com). Hnědé zbarvení se vyskytuje i na očních víčkách a polštářcích tlapek. Mimo hlavu nesmí být nikde zlaté zbarvení. Poslední třetina ocasu by měla být bílá (Javorčeková, 2011). 17

Obr. 5 Biro biewer (http://wagg-n-tails.webs.com/) Krémové (golden) a hořčicové zbarvení Krémově zbarvení jorkové se také označují jako goldeni. Podle amerického registru psů (ACR) krémoví psi nesou gen pro červenou barvu nebo hořčicový (mustard) gen. Pravděpodobnost výskytu této barvy je velmi nízká, většinou pouze čistě krémoví psi jsou schopni produkovat krémově zbarvené potomstvo. Někdy se může vyskytnout krémové štěně ve vrhu, kde jsou oba rodiče jiné barvy, ale nesou jednu recesivní alelu pro toto zbarvení (www.americancanineregistry.com). Existují dva způsoby jak tohoto zbarvení u jorků dosáhnout. V prvním případě se krémový pes rodí jako černý (způsobeno ASIP) a současně nese gen, který redukuje černou barvu na červenou (MC1R) a další gen, tzv. činčila (CCH) způsobuje zabarvení srsti do žlutého nebo plavého odstínu. U tohoto krémového zbarvení se nejedná o odstín červené (www.americancanineregistry.com). Barvy creme dosáhnou štěňata ve věku 8 týdnů (Javorčeková, 2011). Druhý způsob je založen na přítomnosti genu pro zbarvení hořčice spolu s genem pro šedivění (greying). Ten změní černou v hořčičnou barvu srsti. Jedná se o stejný princip jako zesvětlení černé srsti na modrou u blue and tana. Podle ACR se hořčicový gen vždy přenáší na potomstvo vzniklé spojením jedince mustard zbarvení s jakýmkoliv psem jiného zbarvení, s výjimkou blue and tana (www.americancanineregistry.com). 18

Barva nosu bude černá. Pokud ovšem pes ponese hnědý gen, projeví se tato hnědá v barvě nosu a na polštářcích tlapek (www.americancanineregistry.com). Obr. 6 Golden jorkšírský teriér (Collete) (foto A. Kučerová) Zlaté, ocean pearl a white ocean pearl zbarvení Zlatý jorkšír je barevnou mutací klasického jorka s úplnou absencí bílé barvy. Je celozlatý, bez genu skvrnitosti (MITF). Zlatý jork se rodí již jako štěně celozlatý. Zbarvením ocean pearl se označuje štěně s melírem zlaté a tmavé nebo černé barvy. V dospělosti se vybarví do sytě zlaté, která se rozprostírá po celém těle (Javorčeková, 2011). Nos mají černý (Baštýřová, Cibulková, 2012). White ocean pearl jorkové jsou bílí psi se zlatohnědým melírem, u štěňat s červenohnědými nebo černými konečky chlupů, které během dospívání můžou, ale také nemusí změnit barvu. Do 1 roku života barva srsti světlá až do smetanového zbarvení. Límec kolem krku, břicho, hruď, končetiny a třetina ocasu nese bílou barvu. Nos je černý (Baštýřová, Cibulková, 2012). 19

Obr. 7 Ocean pearl (první zleva), white ocean pearl (první a druhý zprava) (foto A. Kučerová) Další barevné varianty Baštýřová a Cibulková (2012) popisují několik dalších barevných variant, které vychází z výše uvedených. U hnědě zbarvených jorků rozlišují tři barevné odstíny, které nazvaly tmavá čokoláda, čokoláda a bílé kafe. Golddust s modrýma očima získal pojmenování blue diamond golddust jorkšírský teriér. Dále popsali tzv. gepard jorkšírského teriéra, který se vyskytuje ve třech variantách. Blue merle je jasně stříbřitý pes s černým tečkováním. Může nést syté pálení. Bílá barva je tolerována na krku, hrudníku, nohách, spodní straně čumáku a spodní straně těla. Na hlavě by neměla být dominantní. Oblast kolem očí musí být pigmentovaná. Celkový dojem zbarvení musí být modrý. Nos je černý. Oči jiskrné, hnědé, jantarové nebo modré. Red merle odpovídá popisu blue merle, liší se pouze jasně zlatavě červenou nebo rezavou srstí s černým tečkováním. Brown merle je čokoládově hnědý pes s černým tečkováním. Bílá barva je zastoupena podobně jako u předchozích dvou. Nos je hnědý nebo játrový. Oči jiskrné, hnědé, jantarové, modré nebo zelené. Merle jorkšírští teriéři se rovněž vyskytují ve třech odstínech blue, red a brown. Popisem se shodují s jorky zbarvení gepard. Liší se pouze výskytem černého mramorování místo tečkování na podkladové barvě srsti podle barevné varianty. Preferujeme syté pálení a velké černé plotny. Rozmístnění bílé je totožné jako u zbarvení gepard. Pro zbarvení merle je charakteristické, že věkem tmavne (Baštýřová, Cibulková, 2012). 20

Blueberry jorkšírský teriér je bílý pes se znaky blue merle a s jiskrnýma hnědýma nebo modrýma očima (Baštýřová, Cibulková, 2012). Obr. 8 Zleva blue diamond golddust, blue merle gepard, brown merle (http://www.vonweitra.com/) 3.2 Pigmentace srsti Barva kůže a srsti zvířat prošla během staletí chovu a šlechtění značnými změnami. Přestože zbarvení srsti nemá větší biologický význam, stalo se nejnápadnějším exteriérovým znakem. Pigment je zastoupen v zárodečné části pokožky a chrání škáru spolu s vnitřními orgány před UV zářením. Dále se vyskytuje přímo v chlupech. Chlup se skládá z dřeně, kůry a povrchové blanky chlupu. Dřeň je tvořena jednou nebo více řadami hranolovitých buněk, které obsahují zrna pigmentu, eleidinu a tuku. Dřeň probíhá středem chlupu, ale nemusí být vytvořena u všech chlupů. Kůra se skládá z několika vrstev podélně oválných až vřetenovitých buněk s kulovitým jádrem. Buňky kůry obsahují pigment (Komárek, Sova, 1971). Základním barvivem savců a ptáků je melanin, který se vyskytuje podle barvy a tvaru granul ve dvou typech. Eumelanin obsahuje černé a hnědé tyčinkovité granuly. Feomelanin se vyskytuje ve formě žlutých nebo červenohnědých kulovitých granul. Výchozí složkou pro tvorbu melaninu je aminokyselina fenylalanin. Jeho oxidací vzniká tyrozin. Účinkem tyrozinázy se dále oxiduje na dioxyfenylalanin (DOPA), což je bezbarvý chromogen. DOPA je enzymem I oxidován na červený a žlutý pigment a enzymem II za spoluúčasti enzymu I na tmavý nebo černý pigment. Granuly pigmentu jsou uloženy v melanoblastech, speciálně větvených buňkách, které se nacházejí např. v bazální vrstvě epidermis, ve škáře nebo přímo v chlupech. 21

Intenzivně pigmentovaná zvířata mají granuly v buňkách rovnoměrně rozmístněné, středně zbarvení jedinci mají granula pouze u jednoho pólu buňky a slabě pigmentovaní mají tuto polární lokalizaci pigmentu ještě více vystupňovanou. Enzymatické reakce, které katalyzují vznik melaninů, lze ovlivnit teplotou. K pigmentaci kůže mají velmi úzký vztah žlázy s vnitřní sekrecí (nadledvinky, štítná žláza, hypofýza) (Komárek, Sova, 1971). 3.3 Charakteristika a struktura genomu psa domácího Karyotyp psa domácího je v diploidním stavu tvořen 78 chromozomy, tj. 38 páry autozomů a jedním párem gonozomů XX nebo XY. Obr.9 Idiogram psa domácího 39 párů chromozomů (http://www.ensembl.org/) 3.4 Genetický polymorfismus Polymorfismus je termín označující mnohotvarost neboli různorodost (Zahrádková, 2009). Četnost některých alel může být pouze 1%, někdy i menší. K určení jejich množství nebo třeba jen k jejich odhalení je potřeba mít velkou skupinu zvířat. Jestliže má druhá nejčetnější alela genu četnost větší než 1 % hovoříme o genetickém polymorfismu (Simmons, 2009). 22

3.4.1 Genetické markery Na úsecích DNA můžeme detekovat určité rozdílnosti, pomocí kterých jsme schopni jedince navzájem od sebe odlišovat. Jedná se o tzv. genetické markery. Jsou přenášeny z rodičů na potomstvo. Každý jedinec ve svém genomu nese určitý marker se specifickou délkou chromozomů. Markery tak dokážou přesně vymezovat úsek genomu. Šlechtění hospodářských zvířat používá pojem genetický marker ve smyslu označení konkrétního genu se známým fenotypovým projevem v populaci nebo bývá využíván pro určení úseku DNA bez známé funkce, ale ve vědomé vazbě a schopnosti přenosu na potomstvo se známým genem (Zahrádková, 2009). Rozlišujeme tři typy genetických markerů: genetické markery 1. typu označující konkrétní geny pro určitou užitkovost. genetické markery 2. typu jsou variabilní úseky DNA, které vlivem vysokého stupně polymorfismu dostatečně informují v populační genetice a při určování otcovství nebo rodičovství. Jsou bez fenotypového projevu. genetické markery 3. typu jsou jednonukleotidové polymorfismy (SNPs), které se nachází uvnitř kódujících genů anebo častěji v nekódujících intronech nebo integrovaných oblastech (Knoll, Vykoukalová, 2002). 3.5 Přehled genů s vlivem na zbarvení u psů Dostál (2007) uvádí, že zbarvení psů je ovlivněno 10 geny z celkem 10 lokusů. Označuje je A, B, C, D, E, G, M, P, S a T. Některé geny mají pouze dvě odlišné alely, které jsou proti sobě dominantní nebo recesivní, jiné jsou vícealelové a vzájemně působí mezi sebou. To pak udává výsledné zbarvení psů. My jsme vycházeli ze souhrnu genů a lokusů uvedených v tabulce podle Schmutzové a Berryere, kde se některé lokusy shodují s těmi, které udává Dostál (2007): 23

Tab.1 Geny a lokusy s vlivem na pigmentaci srsti u psů (Schmutz, Berryere, 2007) Gen Lokus Poloha Alely Zbarvení srsti ZÁKLADNÍ BARVY a y žlutohnědá/sobolí agouti signalní protein (ASIP) A (agouti) CFA24 a w a t divoký typ zbarvení black and tan, brown and tan a černá tyrosinase related protein 1 (TYRP1) B (brown) CFA11 B b (b s, b d, b c ) černá hnědá melanocortin 1 receptor (MC1R) E (extension) CFA5 E M E e melanistická maska černá, hnědá, modrá červená, žlutá, krémová beta-defensin 103 (CBD103) K (black) CFA16 K B k br k y černá, hnědá, modrá žíhaná exprese alely agouti, vyjadřuje možný feomelanin ŘEDÍCÍ BARVY melanophilin D (dilutes (MLPH) eumelanin) CFA25 G (progresivní (dominantní/recesivní) šedivění) BÍLÉ ZNAKY (SILV) (kodominantní) M (merle) CFA10 microphtalmia asociační transkripční faktor S (spotting) CFA20 (MITF) D neředěný d ředěný pigment d2? ředěný pigment s kožními problémy G postupné šednutí věkem g nešedne M nebarevný m merle S celistvě barevný s i s p s w irské skvrnění strakatý bílý (dominantní/recesivní) T (ticking) T t tečkování bez tečkování R (roan) R r bílá barevná (dominantní/recesivní) H (harlekýn) H h harlekýn, za přítomnosti genotypu M/m nebo M/M bez harlekýn zbarvení 24

3.5.1 Základní zbarvení srsti Melanocortin 1 receptor (MC1R) Jedná se o první gen, který byl u psů studován pomocí molekulárních metod (Schmutz et al, 2001). Gen MC1R byl u psa mapován na 5. chromozomu pomocí mikrosatelitu ZuBeCa6 v délce 6cM. Dále byl tento gen sledován u lidí v pozici 16q24, u myší na 8. chromozomu (Becker-Follman et al., 1997), u prasat na chromozomu 6 (Mariani et al., 1996) a u skotu na chromozomu 18 (Werth et al., 1996). Lidský projev genu MC1R na pozici 16 je homologní k 5. chromozomu psa (Schmutz et al., 2001). Melanocortin 1 receptor kóduje lokus Extension u mnoha druhů savců. Ztráta funkce genu způsobuje produkci výhradně červeného nebo žlutého feomelaninu (Newton et al., 2000). Tato mutace byla u psů popsána Newtonem et al. (2000) a Everstem et al. (2000) jako mutace 914C T s projevem čistě červeného zbarvení srsti. Příčinou této mutace je záměna aminokyseliny argininu předčasným stop kodonem (R306ter). Černí nebo hnědí psi předčasný stop kodon nemají nebo to jsou heterozygoti (Schmutz et al. 2002). Mutace se vyskytuje u širokého spektra plemen psů (Newton et al., 2000; Schmutz et al., 2002). Little (1957) tuto mutaci pojmenoval písmenem E nebo také jako Extension lokus, její alela byla označena e a divoký typ alely E. U domestikovaných psů je zástupcem divokého typu alely E např. dobrman, plemenem s alelou e je zlatý retrívr, který produkuje výhradně žlutý pigment. Černě zbarvená srst u novofundlandského psa a jemu podobných plemen je příčinnou alely Agouti, která kóduje fyziologický ligand pro MC1R. Porovnáváním dobrmana, novofundlandského psa, černého labradora, žlutého labradora, flat-coated retrívra, irského setra a zlatého retrívra bylo odhaleno šest sekvenčních variant. Varianta S90G částečně korelovala s černou/hnědou barvou srsti a R306ter pak s červeným/žlutým zbarvením. R306ter byla objevena u žlutého labradora, zlatého retrívra a irského setra. Retrívr a setr měli také identické haplotypy (Newton et al., 2000). Alela e neovlivňuje pigmentaci nosu, pysků, očních víček a polštářků tlapek, působí pouze na zbarvení srsti. Díky tomu rozeznáváme žluté jedince genotypu e/e s tmavou pigmentací od žlutých jedinců genotypu a y /a y s žlutým nebo masovým zbarvením nosu, pysků, víček a polštářků (Dostál, 2007). Třetí alela, E M, způsobuje jednonukleotidovou substituci (799A G) (Schmutz et al., 2003). Melanistická maska, vyjádřená jednou kopií této alely, je viditelná pouze 25

u žlutohnědých nebo žíhaných psů. Celočerní, hnědí nebo modří psi nemají melanistickou masku. U psů, kteří šednou s věkem, se melanistická maska časem objeví. Psi s bílým čumákem neprodukují v této oblasti melanin, proto se u nich maska nenachází, dokonce ani když tuto alelu nesou (Schmutz, Berryere, 2007). Obr. 10 Zleva zlatý retrívr (ee) (http://www.excellentbahati.com/), flat coated retrívr (Ee, EE) (http://www.fallflightkennels.com/), bullmastif s melanistickou maskou (EM) (http://www.remarkabledogs.com/) Tyrosinase related protein 1 (TYRP1) Tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) je protein melanocytu, který se přeměňuje na barevný pigment kůže a chlupů u zvířat (Jackson, 1988). Gen TYRP1 způsobuje u psů hnědé zbarvení. Byl mapován na 11. chromozomu mezi mikrosatelity CO3109 a FH2004 (Schmutz et al., 2002). Little (1957) tento gen označil jako lokus B, který zapříčiní produkci hnědého eumelaninu. Jeho projev je recesivní k černému zbarvení. V genu TYRP1 byly detekovány tři různé alely, které způsobují hnědé zbarvení. Detekce hnědého zbarvení vyžaduje testování všech mutací: předčasného stop kodonu na exonu 5 (Q331ter) (c.991c T) (b s ), deleci prolinového zbytku na exonu 5 (c.1033_1035del, p.p345delp) (b d ) a substituci páru bází na exonu 2, která způsobuje záměnu serinu za cystein (p.s41c) (c.121t A) (b c ) (Schmutz et al., 2002). Ukázalo se, že některá plemena s prokazatelně hnědými jedinci, nemusí nést všechny tyto alely. Je možné, že se jedná o doplňkové vzácné alely genu TYRP1 (Schmutz, Berryere, 2007). Také u myší jsou 3 alely s vlivem na hnědé zbarvení, u nich je ale každá připsaná jinému odstínu hnědé (Jackson 1988; Zdarsky et al., 1990; Javeratz & Jackson, 1998). Ačkoliv i u psů najdeme různé odstíny hnědé, souhlasná korelace s jednotlivými kombinacemi alel b u nich nebyla nalezena. U některých psích plemen nazýváme hnědé 26

zbarvení jako čokoládové nebo játrové. U dobrmana a australského ovčáka se hnědá označuje jako červená (Schmutz et al., 2002). Alely TYRP1 interagují s alelami MC1R (Schmutz et al., 2002) a kromě srsti determinují také zbarvení kůže na čumáku a na polštářcích tlapek. U psů s genotypem e/e pro MC1R (Dreger, Schmutz, 2011) nebo s žíhaným či žlutohnědým zbarvením spojeným s alelou E v MC1R a současně s alelou a y (Berryere et al., 2005) nebo a w v ASIP genu (Dreger, Schmutz, 2011), sledujeme projev recesivní alely TYRP1 na barvě čumáku a polštářků tlapek. U žlutých labradorů je takový efekt nežádoucí a hnědý čumák je u nich považován za vadu. Proto je detekce hnědých alel u černých a žlutých psů toho plemene žádoucí. U psů s genotypem b/b nebyly pozorovány žádné zdravotní komplikace, přesto je u některých plemen přítomnost těchto alel záměrně potlačována. Na druhou stranu jsou alely b rozšířeny u mnoha jiných plemen psů a hnědá je pro ně žádoucí barvou, zvláště u loveckých plemen (Schmutz et al., 2002). Alela B kontroluje odstín žlutého zbarvení u a y jedinců. Vzniká tak tmavší žluté zbarvení než u psů s b/b genotypem. Rozlišit tyto jedince můžeme pomocí zbarvení nosu, pysků nebo sliznic. Psi s dominantní alelou mají tyto části zbarvené černě, recesivní homozygoti hnědě (Dostál, 2007). Obr. 11 Vlevo dobrman (červená) (http://www.dobermann.sk/), vpravo žlutý labradorský retrívr s hnědým čumákem (Benji) (foto L. Buchtová) Agouti signal peptide (ASIP) Agouti signal protein (ASIP) kontroluje lokalizaci exprese červeného a černého pigmentu u psů prostřednictvím interakcí s jinými geny, například Melanocortin 1 Receptor a Beta-Defensin 103 (Dreger, Schmutz, 2011). ASIP má vliv na různé varianty zbarvení srsti u celé řady domácích zvířat - koně (Rieder et al., 2001), skot (Girardot et 27

al., 2005), prasata (Drögemüller et al., 2006) a psi (Berryere et al., 2005). ASIP byl mapován na chromozomu 24 mezi mikrosatelity AHT 118 a AHT 125 (Kerns et al., 2004). U psů popisujeme čtyři alely v následující dominantní hierarchii a y a w a t a. Specifické alely ASIP jsou nezbytné pro různé barevné odznaky u psů jako například black and tan a saddle tan. (Dreger, Schmutz, 2011). Pro vlkošedou alelu a w je charakteristické páskované zbarvení srsti dosažené střídáním sekcí eumelaninu a feomelaninu po celé délce chlupu. U vlkošedých psů převládá feomelanin na ventrální straně těla, pruhované chlupy se objeví na dorzální straně a na hlavě (obr. 12A) (Dreger, Schmutz, 2011). Sekvence ASIP této alely je homologní se sekcencí vlka (Berryere et al., 2005) i kojota (Schmutz et al., 2007). Recesivní alela a způsobuje u psů černé zbarvení (obr. 12D). Mutace R96C (c.288c T) se vyskytuje především u německých ovčáků a šeltií (Kerns et al., 2004; Berryere et al., 2005). Tato alela byla také identifikována u bílých psů, samojeda a německého špice. Výskyt alely u samojeda byl nečekaný a matoucí (Schmutz, Berryere, 2007). Často vyskytující se alelou u domestikovaných psů je alela a y (obr. 12C). Vyznačuje se recesivní dědičností s touto mutací v kódovaném úseku genu c. 246G T a c. 250G A. Fenotypový projev se u většiny plemen označuje jako světle žlutohnědé zbarvení, méně pak jako sobolí barva. Tato alela byla identifikována téměř u 22 plemen. Mutace nebyla objevena ani u vlka, ani u kojota (Berryere et al., 2005). Čtvrtá alela, známá jako a t (obr. 12B), existuje u psů se zbarvením black and tan (Schmutz, Berryere, 2007). Všichni psi se sedlovým fenotypem jsou a t /a t. Black and tan fenotyp má feomelaninové znaky rozprostřené na eumelaninovém podkladě, a to distálně na nohách, po stranách čumáku, kolem očí a na ventrální straně ocasu. U saddle tan fenotypu jsou feomelaninové body rozsáhlejší (Dreger, Schmutz, 2011). Rozdíly pozorujeme v kódující sekvenci (exon 2 4) mezi psy tohoto fenotypu a psy s pruhovaným chlupem divokého typu fenotypu. Předpokládaná alela musí být pravděpodobně rozdílná v jedné z oblastí promotoru. U myší tyto střídavé dorzální a ventrální promotory jsou (Vrieling et al., 1994), ale u psů nebyl promotor v ASIP genu identifikován. Některá plemena požadují detekci ještě páté alely, a s, pro rozložení barvy v podobě sedla. Zatím neexistují o takové alele důkazy (obr. 12E) (Schmutz, Berryere, 2007). 28

A B C D E Obr. 12 Barevné variace podmíněné lokusem ASIP. (A) vlkošedý (a w ) keeshond,(b) black and tan (a t ) gordonsetr, (C) sobolí (a y ) šeltie, (D) recesivně černý (a) německý ovčák a (E) saddle tan německý ovčák (http://keeshond.cz/, http://www.psii.estranky.cz/, http://www.edar.daraskar.cz/ ) 29

Beta defensin 103 (CBD103) Symbol K byl vybrán k označení lokusu s dominantně děděným černým zbarvením srsti. Little (1957) předpokládal, že lokus agouti (A) nás informuje o pevném zbarvení srsti, ale jen málo plemen mutaci ztráty funkce v agouti, která černé zbarvení přenáší jako recesivní znak, má. Proto musí být u velkého množství plemen pro pevné zbarvení srsti eumelaninem (černá, hnědá nebo šedá) přítomna ještě nejméně jedna z alel E nebo E M a jedna dominantní alela v lokusu K (Schmutz, Berryere, 2007). Symbol K označuje gen beta-defensin 103 a byl objeven na 16. chromozomu. V tomto lokusu existují ještě další dvě alely. Jedna kopie alely k br za přítomnosti alely k y je příčinou exprese fenotypu psa známém jako žíhané zbarvení (Kerns et al., 2007). Žíhání u psů se sestává ze střídání pruhů feomelanini a eumelaninu v rozmanitých odstínech. U některých psů může dojít k nadměrné produkci eumelaninu a jedinec bude černě zbarvený, naopak u jiných může být páskování eumelaninem velmi slabé. Žíhání se na ventrální straně těla psů rozloží za přítomnosti genotypu a y / a y (Berryere et al., 2005). Psi s genotypem k y / k y mohou být žlutohnědí, vlkošedí nebo v barvě způsobené eumelaninem s tan odznaky závislé na genu ASIP (Schmutz, Berryere, 2007). DNA testování úspěšně předpovídá pigmentaci eumelaninem nebo feomelaninem. U některých plemen, třeba u labradorského retrívra, požíváme pouze MC1R genotypování. Příčina je pravděpodobně v tom, že toto plemeno je ve skutečnosti fixováno K B /K B genotypem a e/e je epistatický k K B a k k br. U jiného plemene, např. německá doga, je eumelanin vs. feomelanin kontrolován K B /- a k y /k y, tady se objeví fixace pro a y /a y genotyp v přítomnosti E nebo E M (Schmutz, Berryere, 2007). Obr. 13 Různá intenzita žíhání u greyhounda (kbr) (http://www.hbgatristate.org/, http://www.fordogtrainers.com/, http://www.pedigreedatabase.com/) 30

3.5.2 Odstíny základního zbarvení srsti Melanophilin (MLPH) Psi s ředěnou nebo šedou barvou srsti se vyskytují v řadě psích plemen. Některá plemena označujeme jako modrá, jiná mají stříbřité, fialové, hnědošedé nebo izabela zbarvení srsti (Welle et al., 2009). Tito jedinci se rodí buď jako šedí psi (výmarský ohař) anebo se s věkem vybarvují z černé na šedou (bobtail). Little (1957) tento fenotyp popsal jako progresivní šedivění a přidělil mu lokus G. Ne u všech plemen psů se vyskytují oba typy šedivění. Tyto děděné vlastnosti vyvolávají blednutí pigmentů eumelaninu a feomelaninu. Feomelanin se neředí tak dramaticky jako eumelanin. Ředění barvy srsti (d) je děděno jako Mendelistický autozomálně recesivní znak. Jedná se o chybný přenos melanozomů ve folikulech melanocytů, který je regulován třemi interagujícími proteiny MLPH, MYO5A a RAB27A (Welle et al, 2009). Ředění barev se vyskytuje u různých druhů savců a jejich mutace uvnitř genu melanophilinu (MLPH) byla identifikována u lidí (Matesic et al, 2001), myší (Ménasché et al., 2003) a koček (Ishida et al., 2006). Gen MLPH byl detekován na 25. chromozomu (Schmutz, Berryere, 2007). Šedivění jsme také pozorovali u plavých psů s melanistickou maskou (Schmutz, 2003). Červení psi s genotypem e/e na MC1R (Newton, 2000) se při ředění obtížněji detekují. Žíhaní a ředění psi (vipeti, greyhoundi) mají šedé pruhy na světle plavém podkladu. Výmarští ohaři recesivní v TYRP1 (Schmutz, 2002) a současně i v MLPH genu spoluvytváří stříbrošedé zbarvení srsti. Kůže nosu a tlapek těchto psů je v podobném odstínu světle hnědé. Dobrman, německý pinč, velký münsterlandský ohař a bígl s ředěným fenotypem, kosegregují se specifickými haplotypy melanophilinu (MLPH) (Philipp, 2005). 31

Obr. 14 Výmarský ohař se v šedé barvě rodí (vlevo) (http://ustinadlabem.olx.cz/), bobtail šedne s věkem (http://www.tiptopglobe.com/) Progresivní šedivění Little (1957) se domnívá, že psi s fenotypem progresivního šedivění mají mutaci odlišnou od D lokusu. Šedivění se vyskytuje na různých částech těla, v různém věku. U některých psů se oblasti poškozené vakcinací nebo zraněním vrátí do svého původního mladistvého vzhledu. V průběhu několika měsíců tyto tmavější chlupy budou zase světlat. Progresivní šedivění je podle Liittla (1957) kontrolováno lokusem G. Progresivní šednutí se vyskytuje také u koní. Tento znak mapoval oblast ECA25q (Pielberg et al., 2005), který koresponduje s HSA9q. Na základě reciproké chromozomové korelace důležitá sekce HSA9 koresponduje s 11 chromozomem u psů. Hledání G lokusu u psů, ve spojitosti s progresivním šednutím, nás odkazuje na tento chromozom. Koně s progresivním šednutím mají sklony k vývoji kožních tumorů (Rieder et al., 2000). Tento pleiotropní efekt nebyl u psů pozorován (Schmutz, Berryere, 2007). Krémové nebo bílé zbarvení Několik plemen psů se narodí v bílé nebo krémové barvě s pigmentovanou kůží čumáku a polštářky na tlapkách. To nám demonstruje, že migrace pigmentu uvnitř chlupu a keratinizace kůže není kontrolována stejnými geny (Schmutz, Berryere, 2007). Příklad plemene fixovaného pro bílé zbarvení je samojed. Samojedi byli genotypováni a označeni e/e v MC1R a a/a pro ASIP. Také další bílá plemena nesou e/e (Schmutz, Berryere, 2007) - akita inu, šarpej, pudli, puli, německý ovčák, kavkavzský 32

horský pes a malý knírač. Žádný z těchto psů nemá červený projev ve fenotypu, ovšem fixace těchto alel pro toto plemeno nám dokazuje, že se jedná o jedince e/e, kteří pouze světlají. Některé jedince častěji nazýváme krémový pes z důvodu přítomnosti feomelaninu, nejčastěji na uších. Také žlutí labradoři nebo zlatí retrívři jsou pigmentováni feomelaninem a mají genotyp e/e v MC1R. Tito psi mají značnou varibilitu v odstínu žluté, od zlatě žluté až do krémové, ale nikdy nejsou bílí. Ve studii rodin, které tyto odstíny segregují, se objevilo, že krémový odstín je děděn jako autozomálně recesivní znak (Schmutz, Berryere, 2007). Krémová barva nesegreguje s polymorfismem v tyrozináze (TYR) ani s SLC45A2, formálně nazvaným MATP. První gen, který je popsán pro ředění feomelaninu je SLC7A11 (Chintala, 2005). Ačkoliv Chintala (2005) našel zkrácené mrna produkty u myší s ředěným feomelaninem, u světle žlutých psů byla získána sekvence mrna v plné délce (GenBank EF143580). U krémových/bílých plemen afgánský chrt a pudl, byly objeveny alely E nebo E M na MC1R. Genetický mechanismus je proto v současné době pořád nejasný (Schmutz, Berryere, 2007). Obr. 15 Bíle zbarvený samojed (http://www.lejonbols.info/) 3.5.3 Skvrnité vzory a bílé odznaky Microphtalmia associated transcription factor (MITF) Výzkumy na Iowa State University kompletovaly studium genů s vlivem na skvrnitost a identifikovaly MITF jako kandidátní gen pro nepravidelnou skvrnitost (Rothschild, 2006). Objevili kompletní kosegregaci SNP v intronu 3 a recesivní dědičnost nepravidelné nebo tečkované strakatosti u psů (Schmutz, Berryere, 2007). 33

Výzkumníci z britského Broad Instute a ze Švédské zemědělské univerzity (SLU) identifikovali jeden významný gen spojený s bílým zabarvením. Zhlédnutím genomu označili 20. chromozom jako útočiště genu pro bílé zbarvení u boxerů (Karlsson et al., 2007). Kandidátní gen v této oblasti byl MITF. Little (1957) předpověděl, že dalmatini by měli nést stejnou alelu pro bílé znaky jako boxeři, i oni se rodí bílí a malé černé tečky se u nich tvoří ve věku několika měsíců, pod vlivem jiného genu. Mutace v MITF může působit na zbytek melanoblastu v řadě generací odvozených od neutrálního znaku buněk, co je nakonec příčinou pigmentace srsti (Bismuth, 2005). Nedostatek pigmentace nebo bílých znaků můžeme předvídat. U myší a u člověka bylo popsáno několik isoformů MITF (Udono, 2000). MITF-M považujeme za hlavní isoform, který vyjadřuje melanocyty u nejvíce druhů živočichů. Získáme MITF-M mrna sekvenci s a bez 18 bp na exonu 6A (GenBank AY240952). Bílkovina MITF je kódována exony 5-9 a přítomnost nebo absence exonu 6A v produktu je ve vztahu s různými regulačními elementy (Bismuth et al., 2005). Ačkoliv byl polymorfismus detekován v kódující oblasti (GenBank DQ923322) a přilehlá 3 -UTR sekvence exonu 9, nic z tohoto se nepřihodí u psů s žádnou konkrétní formou bílých znaků. Několik mutací MITF u myší prokázalo příčinu tečkování (Goding, 2000) a tyto mutace se nacházejí vně kódujícího exonu (Schmutz, Berryere, 2007). Odznaky u boxerů považujeme za děděné kodominantní znaky: barevní psi (S/S), bílá obličejová maska a dolní část těla (S/s), dominantní bílá (s/s) (Karlsson et al., 2007). Ačkoliv jsou si bílé znaky divokých boxerů (S/s) a border kolií velmi podobné, u border kolií se jedná o vzácně převládající bílou, kterou postrádají jen občas (Schmutz, Berryere, 2007). Obr. 16 Vlevo celistvě pigmentovaný boxer s minimálním zastoupením bílé barvy (http://www.mytopdogs.com/), uprostřed tzv. irské skvrnění (http://fantasticaanimal.blogspot.cz/) a bílý boxer (http://www.gotpetsonline.com/) 34

Merle (grošování) Clark et al. (2006) demonstrovali, že SINE element a spouštěč nukleotidů thymidin v intronu 10 na exonu 11 genu SILV jsou příčinou znaků merle. Alela je díky Littlovi (1957) známá jako M lokus. Sposenberg (1985) potvrdil schopnost jeho přenosu z rodičů na potomstvo shrnutím záznamů chovatelů o narozených merle štěňatech merle rodičům. Pokládal to za očekávanou embyonální reverzi. Také Hedan et al. (2006) mapoval merle znak na 10. chromozomu a to v oblasti, kde je lokalizován SILV. Mediátorová RNA byla získána od heterozygotních australských ovčáků pro SINE inzerci doprovázenou spouštěčem thymidinu pro část exonu 9, 10 a 11 přes stop kodon. Nesmí obsahovat nesprávně spojený produkt, protože ten rychle degraduje. To ilustruje, jak je snadné tuto mutaci ztratit, pokud je studována pouze jedna kódující sekvence u psa s merle fenotypem (Schmutz, Berryere, 2007). Někteří chovatelé označují psy, kterým se střídavě rodí štěňata s nebo bez merle zbarvení, jako tajné merle nebo fantom merle. Clark et al. (2006) navrhnul, že samotný SINE element nedoprovázený řetězcem thymidinu je vysvětlením pro tajné merle. Samotný SINE element byl pozorován u několika psů bez merle fenotypu. Jedna trikolórní šeltie měla 7 vrhů štěňat, ale žádné merle zbarvení nemělo (Schmutz, Berryere, 2007). Od dob, kdy byla mutace objevena, se rozšířily možnosti analýz merle mutací u rozmanitých genotypů zbarvení srsti na různých lokusech. U žlutohnědých psů se merle znaky objevují minimálně. Mohou se vyskytovat u plavých jezevčíků, tady se označují jako kropenatost, nebo u německých dog. Zbarvením merle označujeme rozprostřený tmavý eumelanin mezi světlejší zbarvení. Psi s genotypem e/e na MC1R neprodukují eumelanin, a proto, i když je merle mutace přítomná, se u nich merle fenotyp neprojevuje (Schmutz, Berryere, 2007). Při studii merle zbarvení byla u australských ovčáků vyjmuta funkce genu KITLG s příčinou merle zbarvení (Schmutz at al., 2003). Tito psi byli genotypováni pro mutaci v SILV a 27 jich bylo homozygotních. Všichni ale byli slepí, i když někteří měli modré nebo nestejnobarevné duhovky. Pouze pět chovatelů oznámilo vážnou anomálii očí (microphthalmia). Baxter a Pavan (2003) demonstrovali, že myši s mutovaným MITF, co vede k absenci melanoblastů, neexpresuje SILV v jejich sítnicovém epiteálním pigmentu. To dokazuje, že MITF a SILV interagují. 35

Obr. 17 Zbarvení merle u autralského ovčáka (vlevo) (http://www.pedigreedatabase.com/), tzv. kropenatost u jezevčíka (vpravo) (http://www.bestdackel.com/) Harlekýn Harlekýn je znak vyskytující se u německých dog a sestává se z nezarovnaných černých ploch na bílém pokladě. Sponenberg (1985) uvádí, že tento vzor vyžaduje přítomnost jedné kopie merle mutace a jedné kopie mutace označené H, na jiném lokusu. Clark et al. (2006) toto potvrzuje testováním německých dog se zbarvením harlekýn. Všechny dogy měly nejméně jednu kopii merle mutace. Obr. 18 Německá doga (harlekýn) (http://www.internosgreatdanes.com/) Ticking (tečkování) Little (1957) popsal typ skvrnitosti, který je tvořený z velmi malých teček na bílém podkladě. Nevyskytuje se ihned po narození, ale objevuje se v několika týdnech. Druh 36

skvrnitosti můžeme vidět u dalmatinů, u nich je považován za unikátní plemenný znak. Safra et al. (2006) navrhnul, že u dalmatinů jsou geny asociovány s atypickou produkcí močoviny místo alantoinu a to je příčinou tohoto znaku. Je možné, že je tento gen buď těsně vázaný k tečkování u dalmatinů nebo že je tento gen zapojený do fenotypového projevu tečkování. Tečkování je způsobeno dominantní alelou T (Schmutz, Berryere, 2007). Obr. 19 Tečkování u dalmatina (http://www.svetpejsku.cz/) Roan Roan je zbarvení, kde dochází ke střídání bílých a pigmentovaných chlupů. Objeveno a popsáno bylo např. u kokršpanělů (Petrusová, 2010). Často se vyskytuje u psů s tečkováním. Little (1957) se zabýval otázkou, jestli je roan samostatný znak nebo jestli se jedná jen o variantu tečkování. Jako příčina roan zbarvení u skotu byla objevena mutace v KITLG (Seitz et al., 1999), proto byla studována jako kandidátní gen i u psů. Ve studovaných rodinách nebyla prokázána kosegregace s tečkováním nebo roan zbarvením. Mimo to, se někteří psi označují jako modří setkávají se u nich černé a bílé chlupy. U jiných zvířat, např. u skotu, se tento jev nazývá roan. Zbarvení roan je rovněž přenášeno jako autozomálně recesivní znak (Schmutz, Berryere, 2007). 37

Obr. 20 Roan zbarvení u kokršpaněla (http://www.cocker.cz/) 3.6 Výzkum zbarvení u jorkšírského teriéra Schmutz a Melekhovets (2012) zařadili jorkšírského teriéra do svých výzkumů genů MC1R a TYRP1. MC1R testovali u 8 psů, z nichž dva nesli genotyp E/E, jeden E/e a zbývající čtyři e/e. U některých plemen (čau čau, puli, německý ovčák) se genotyp e/e projevuje bílým zbarvením namísto červeného nebo žlutého. Toto musí být podmíněno ještě nějakým jiným, dosud neidentifikovaným genem, který je v interakci s e/e genotypem MC1R a který způsobuje ředění červeného pigmentu na bílý (Schmutz, Melekhovets, 2012). Alelu pro hnědou barvu Schmutz a Melekhovets (2012) u jorkšírského teriéra a francouzského buldočka neočekávali, ale byla tam. Testovali celkem 20 psů, u 11 byl genotyp B/B, 7 psů neslo B/b a dva měli genotyp b/b. Všichni jedinci byli testováni pro všechny tři mutace (b s, b d, b c ). Výsledky ale bohužel nejsou blíže dohledatelné (fenotypy zkoumaných zvířat). Tato data ilustrují, že testování zbarvení má chovatelům pomoct porozumět, proč se ve vrhu objevují neočekávaně barevná štěňata. Vědomí o DNA profilu jim bude pomáhat eliminovat přenos nechtěných alel pro budoucí chovy. Na druhou stranu může tato vědomost vést k tvorbě linie psů s novou barvou srsti. Příkladem toho je nepravidelná bílá skvrnitost biewer jorkšírských teriérů zapříčiněná inzercí v MITF genu. 38

Přítomnost e alely u devíti komerčně testovaných jorků ukazuje, že nepravidelná bílá skvrnitost u tohoto plemene nazvaná particolour byla pravděpodobně zavedena z chovu, kde se e alela vyskytuje běžně (Schmutz, Melekhovets, 2012). Molekulární diagnostické a výzkumné centrum HealthGene v kanadském Torontu provádí mimo jiné testování DNA pro zbarvení u psů a nabízí test zbarvení srsti a čumáku u jorkšírského teriéra. Jorkšírští teriéři se všichni narodí jako black and tan (a t /a t pro lokus A) a postupně zešednou působením lokusu G. Tito psi mohou být vystavováni, protože si zachovávají barevný standard. Kromě toho, někteří psi nesou recesivní bílou alelu pro strakatost s p. DNA test je schopný detekovat přenos bílého skvrnění (S/s p ). Tito psi jsou nazýváni bieweři (www.healthgene.com). Kanadská asociace jorkšírského teriéra (The Canadian Yorhkshire Terrier Association CYTA) se také zmiňuje o výskytu čokoládového nebo hnědého zbarvení. DNA testování může detekovat přenos až tří hnědých alel. Některá štěňata jorků se rodí modrá, a i když se toto zbarvení příliš netestuje a není úplně jasné, kterou z mutací skutečně nesou, podle CYTA pravděpodobně jedná o projev genotypu d/d genu MLPH (www.healthgene.com). Společnost DDC (DNA Diagnostic Center) Veterinary z amerického Fairfieldu nabízí DNA testování psů, koní koček a ptáků. Pro jorkšírské teriéry poskytuje analýzy zbarvení na lokusech E, B, D, S a tan bodů (www.vetdnacenter.com), tzn. že jsou schopni testovat světle zbarvené jorky (golddust, golden), čokoládové psy, biewery, biro biewry a psy, kterým srst světlá (blue and tan) a klasické jorky. Bílo-strakatí psi (bieweři, biro bieweři a golddusti) jsou testováni na přítomnost alely s p v genu MITF. Bílá u nich může zahrnovat více než 50% těla a tito psi jsou označováni jako strakatí. Strakaté geny pochází z nekompletních dominantních sérií. Chovatelé biewerů, kteří využívají zpětného křížení k udržení barvy, někdy získají psy, u kterých dojde k úplnému vytlačení barvy (s p /s p ) (Sandelin, 2007). V České republice podobné testování zajišťuje firma Genomia s. r. o. a pro zbarvení u jorkšírského teriéra nabízí testování lokusů E a B. Genomia s. r o. na svých stránkách prezentuje genotypy jednotlivých barevných variant. Pro zbarvení black and tan předpokládá v lokusu B přítomnost genotypů B/B nebo B/b, pro lokus E E/E nebo E/e. Golden, biewer a golddust disponují stejným genotypem pro lokus B jako black and tan, ale u goldena a golddusta předpokládají výskyt genotypu e/e. Biewer má pro tento 39

lokus stejnou predispozici jako black and tan, pouze se u něj navíc vyskytuje lokus S pro bílou skvrnitost (s p /s p ), stejně jako u biro biewra. Genotyp b/b očekávají u psů zbarvení chocolate a biro biewer (www.genomia.cz). Jak můžeme vytušit z výše uvedených poznatků, prozatím není jasně stanoveno, který lokus u jorků způsobuje ředění barvy, stejně jako dosud nebyl objasněn princip přenosu zbarvení u méně známých, a hlavně ne tak často zastoupených, barevných variant (merle, gepard), stejně jako nebyly dosud potvrzeny interakce mezi zbarvením srsti a barvou očí u blueberry nebo blue diamond jorkšírský teriérem. Následující tabulka předpokládaných genotypů u jorkšírského teriéra vychází ze souhrnu informací z literatury o jednotlivých lokusech s vlivem na zbarvení a z popisu známých fenotypů jednotlivých barevných variant uvedených v předchozích kapitolách. Analýza DNA nám tuto hypotézu potvrdila, příp. vyvrátila. 40

Tab. 2 Přehled předpokládaných genotypů u známých barevných variant jorkšírského teriéra gen ASIP TYRP1 MC1R MLPH Greying SILV MITF Ticking lokus A B E D G M S T fenotyp genotyp black and tan a t /a t B/- E/- D/- g/g M/- S/- t/t blue and tan a t /a t B/- E/- d/d G/- M/- S/- t/t biewer a t /a t B/- E/- D/-; d/d g/g M/- s p /s p t/t golddust a t /a t B/- e/e D/-; d/d g/g M/- s p /s p t/t chocolate a t /a t b/b E/- D/-; d/d g/g M/- S/- t/t biro biewer a t /a t b/b E/- D/- g/g M/- s p /s p t/t mustard a t /a t B/-; b/b e/e d/d G/- M/- S/- t/t zlatý a t /a t B/-; b/b e/e D/- g/g M/- S/- t/t golden a/a B/- e/e d/d g/g M/- S/- t/t ocean pearl a t /a t B/- e/e d/d g/g m/m S/- t/t white ocean pearl a t /a t B/- e/e d/d g/g m/m s p /s p t/t blue diamond golddust a t /a t B/- e/e D/- g/g M/- s p /s p t/t gepard JT blue merle a t /a t B/- E/- D/- g/g m/m S/- T/- gepard JT red merle a t /a t B/- e/e D/- g/g m/m S/- T/- gepard JT brown merle a t /a t b/b E/- D/- g/g m/m S/- T/- blue merle a t /a t B/- E/- D/- g/g m/m S/- t/t red merle a t /a t B/- e/e D/- g/g m/m S/- t/t brown merle a t /a t b/b E/- D/- g/g m/m S/- t/t blueberry JT a t /a t B/- E/- D/- g/g m/m s p /s p t/t Pozn.: Přehled očekávaných genotypů barevných variant jorkšírského teriéra byl vytvořen na základě informací přejatých z recentních zdrojů literatury uvedené v seznamu literatury a prostřednictvím výsledků vlastního pozorování. 41

3.7 Molekulárně biologické metody pro detekci polymorfismů DNA Izolace DNA Purifikační procesy slouží k zisku co největšího množství kvalitní DNA v nativním stavu a k odstranění kontaminantů. Často používanou metodou je kolonková metoda pomocí některého z komerčních kitů (např. Genomic DNA Mini Kit) (Knoll, Vykoukalová, 2002; Šmarda et al., 2005). DNA se inkubuje ze vzorku pomocí proteinázy, která štěpí peptidové můstky mezi aminokyselinami, a pufru. Etanolem se vzorek purifikuje. Do připravených centrifugačních zkumavek se vloží kolonky, které slouží k zachycení DNA na křemičitou membránu. Vzorky se opakovaně centrifugují s různými pufry. Na závěr se usazená DNA na kolonce promyje elučním pufrem, inkubuje a naposledy centrifuguje. Kvalita vyizolované DNA se ověří elektroforézou (Šmarda et al., 2005). Elektroforéza Elektroforéza se využívá ke kontrole koncentrace izolované DNA, k ověření amplifikačního produktu nebo k vyhodnocení PCR RFLP. Používáme polyakrylamidový nebo agarózový gel s ethidium bromidem pro zviditelnění vzorku. Agaróza je vhodná pro separaci DNA fragmentů dosahující velikosti od mála stovek párů bází asi do 20 kbp. Polyakrylamid je preferován pro kratší DNA fragmenty (Primrose et al., 2001). Vzorky, záporně nabité fragmenty DNA, se vkládají do jamek gelu o různých koncentracích. Částice jsou přitahovány ke kladné elektrodě. Na gelu dojde k oddělení fragmentů o rozdílných délkách (Kočárek, 2004). PCR Během polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction - PCR) dojde k amplifikaci vzorků pomocí primerů specifických krátkých sekvencí DNA (Kočárek, 2004). Reakční směs je tvořena pufrem, MgCl 2, nukleotidy, Taq polymerázou a specifickými primery (Schmutz et al., 2002). Primery komplementárně nasedají na úseky DNA a vymezují oblast určenou k amplifikaci. K namnožení molekul DNA dochází za cyklického opakování tří fází lišících se teplotními podmínkami: denaturace, annealing a elongace (Kočárek, 2004). 42

PCR RFLP Jedná se o stanovení polymorfizmu délky restrikčních fragmentů PCR produktů získaných během předchozí amplifikace. Produkt má díky primerům určitou požadovanou délku. Amplikony jsou pak štěpeny pomocí specifických restrikčních endonukleáz. Na gelu analyzujeme různé délky fragmentů, které odlišují jednotlivé genotypy (Šmarda et al., 2005). Sekvenování Sekvenováním DNA určujeme pořadí nukleotidů v molekulách DNA. Znalost sekvencí umožňuje přesné stanovení polymorfismů nebo mutací v genomu organismů. Výchozím materiálem pro sekvenování jsou fragmenty získané PCR s přesně definovanými konci. Sekvenování se už dnes většinou provádí pomocí automatizovaného sekvenátoru. Jedná se o přesnější a rychlejší analýzu. K detekci reakčních produktů se používají čtyři fluorescenční značky detekující dusíkaté báze. Existují dva odlišné přístupy značení barevně značené primery nebo barevně značené terminátory. Při značených terminátorech jsou fluorecsenční značkou označeny 3 konce molekuly a totožné báze. Reakce se provádí v jedné zkumavce obsahující templátovou DNA, primer, čtyři dntp a čtyři značené ddntp. Reakční produkty jsou v kapiláře obsahující elektroforetický gel, rozděleny pomocí laserového detektoru napojeného na počítač. K vyhodnocení výsledků je nezbytnou součástí výpočetní technika a speciální programy k tomu určené (např. Sequence Scanner Software v1.0) (Šmarda et al., 2005). 43

4 MATERIÁLY A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Sledované soubory zvířat a odběr vzorků Jako biologický materiál pro izolaci DNA byl zvolen stěr bukální sliznice psů plemene jorkšírského teriéra. Se svolením majitelů byl odebrán stěr z ústní sliznice pomocí Cytobrush (Medilab) kartáčků, kterým byla sliznice otírána po dobu 30 sekund. Vybraná skupina psů zahrnuje 63 různě barevných jedinců, z toho 6 psů představuje zbarvení biro biewer (biro carrier), 21 biewrů, 12 black and tanů, 6 blue and tanů, 6 psů zbarvení chocolate, 4 golddusti, 4 goldeni, po jednom jedinci zbarvení mustard a ocean pearl a dva psi white ocean pearl. Barvy psů byly určeny chovateli. Z důvodu verifikace přenosu alel mezi rodiči a potomky byly sestaveny tři kompletní rodiny (otec matka potomci). Dále jsem získala 6 matek s potomky a dva páry příbuzných jedinců ve vztahu sourozenců. Dále bylo odebráno sedm jednobarevných psů, kteří byli využiti pro účely ověření správnosti postupu a funkčnosti metody. Jedná se o 3 černé flat coated retrívry, 1 zlatého retrívra a 3 labradory 2 hnědí a 1 žlutý pes s hnědým čumákem. 4.2 Izolace DNA Vzorky byly naizolovány pomocí komerčního kitu Genomic DNA Mini Kit Tissue (Geneaid), určeného k purifikaci genomické DNA z různých druhů tkání. Izolace byla prováděna podle následujícího protokolu. Tab. 3 Genomic DNA Mini Kit Tissue protokol Krok 1 Rozklad tkáně Krok 2 Lýze buněk Krok 3 Vysrážení DNA a navázání na membránu Kartáček se stěrem byl vložen do 1,5 ml zkumavky Bylo přidáno 200 µl GT pufru, homogenizace Bylo přidáno 20 µl proteinázy K, vortex Inkubace 60 C/přes noc Bylo přidáno 200 µl GBT pufru, vortex Inkubace 60 C/20 min, průběžně vortex Bylo přidáno 200 µl etanolu, vortex GD kolona byla vložena do 2 ml zkumavky Směs se přenesla do kolony, centrifugace 14-16 000 x g/2 min Zkumavka s odpadem se vyhodila, použila se nová 44

Krok 4 Promývání navázané DNA Krok 5 Eluce Bylo přidáno 400 µl W1 pufru do kolony, centrifugace 14-16 000 x g/30 s Zkumavka s odpadem se vyhodila, použila se nová Bylo přidáno 600 µl promývacího pufru s etanolem, centrifugace 14-16 000 x g/30 s Zkumavka s odpadem se vyhodila, použila se nová Centrifugace 14-16 000 x g/3 min Kolona byla přemístěna do čisté 1,5 ml zkumavky Bylo přidáno 100 µl elučního nebo TE pufru Nechalo se 5 minut stát pro úplnou absorpci pufru Centrifugace 14-16 000 x g/30 s, zisk přečištěné DNA Kvalita izolované DNA byla ověřena pomocí gelové elektroforézy na 2% agarózovém gelu vizualizovaném ethidium bromidem a UV světlem. 4.3 Detekce alel MC1R pomocí PCR-RFLP Během výzkumu genetického založení zbarvení u jorkšírského teriéra byly detekovány alely genu MC1R. Mutace genu v podobě předčasného stop kodonu (R306X) působí na výskyt světlého (červená, žlutá, krémová) nebo tmavého (černá, hnědá, modrá) zbarvení. Byla sledována přítomnost alel E a e, kde alela e je spojována se světlým projevem ve fenotypu (Schmutz, 2002). K analýze genotypů byla využita metoda PCR-RFLP převzatá od S. M. Schmutz et al. (2002) a optimalizovaná pro laboratorní podmínky. 4.3.1 PCR Reakční směs se sestává z 5 µl DNA a do celkového objemu 25 µl z HotStarTaq TM Master Mixu (Qiagen), přímého a zpětného primeru a PCR vody. Jeho složení a koncentrace jsou uvedeny v následující tabulce. 45

Tab. 4 Složení a koncentrace PCR reakční směsi na jeden vzorek DNA Složky Objem [µl] Koncentrace HSTaq Master Mix 12,5 Přímý primer 0,1 10 ng/µl Zpětný primer 0,1 10 ng/µl DNA 5,0 H 2 O 7,3 Tab. 5 Primery použité pro PCR u MC1R genu (Schmutz, 2002) Primer Přímý Zpětný Sekvence primeru 5 CATCTACGCCTTCCGCAGCCAGGAGCGC3 5 CTGCCCAGCACCCTGGCCTC3 K amplifikaci DNA byl použit automatický termocykler PTC-200 MJ Research. Podmínky reakce jsou uvedeny v následující tabulce. Tab. 6 Teplotní podmínky amplifikace DNA Cyklus Čas Teplota Úvodní denaturace 15 min 94 C Denaturace 50 s 94 C Annealing 50 s 69 C Elongace 50 s 72 C Finální extenze 4 min 72 C 30 cyklů Výsledek PCR reakce a kvalita amplifikované DNA byla ověřena pomocí gelové elektroforézy. 5 µl PCR produktu bylo naneseno na 2% agarózový gel s ethidium bromidem. Primery ohraničily PCR produkt o velikosti 99 bp (Schmutz, 2002). Vizualizace byla provedena UV zářením. 4.3.2 RFLP PCR produkt o velikosti 99 bp získaný předchozí amplifikací byl následně u jedinců s předčasným stop kodonem štěpen enzymem AfeI na 28 a 71 bp (Schmutz, 2002). V tabulce je uvedeno složení restrikční směsi pro jeden vzorek. 46

Tab. 7 Složení restrikční směsi Složky Objem [µl] Koncentrace AfeI 0,5 10000 U/ml NEBpufr 3 1,5 H 2 O 3,0 Celkem 5,0 Restrikční směs o objemu 5 µl byla přidána k 20 µl PCR produktu. Vzorek byl inkubován přes noc při teplotě 37 C. Výsledek byl pozorován na 4% agarózovém gelu vizualizovaném ethidium bromidem při UV záření. 4.4 Detekce alel TYRP1 pomocí PCR-RFLP Hnědé zbarvení srsti je ovlivněno genem TYRP1. Jsou detekovány 3 mutace: předčasný stop kodon na exonu 5 (Q331X), delece prolinového zbytku na exonu 5 (345delP) a substituce páru bází na exonu 2 (S41C). U mutace Q331X popisujeme výskyt alel B a b s a u 345delP byly alely označeny B a b d. Hnědé zbarvení se projevuje za přítomnosti neštěpených alel b s a b d (Schmutz, 2002). U mutace S41C sledujeme výskyt alel B a b c a hnědě se projevuje štěpená alela b c (Schmutz, 2012). 4.4.1 PCR pro mutace na exonu 5 Reakční směs se sestává z 5 µl DNA a celkový objem 25 µl je doplněn Combi PPP Master Mixem s Mg 2+ (Top Bio), přímým a zpětným primerem a PCR vodou. Jeho složení a koncentrace jsou uvedeny v následující tabulce. 47

Tab. 8 Složení a koncentrace PCR reakční směsi na jeden vzorek DNA Složky Objem [µl] Koncentrace PPP Master Mix 12,5 75 mm Tris-HCl, ph 8,8; 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,01% Tween 20; 2,5 mm MgCl 2 ; 200 µm datp, 200 µm dctp, 200 µm dgtp, 200 µm dttp; 50 U/ml Taq Purple DNA polymeráza; anti-taq (19nM) Přímý primer 0,5 10 ng/µl Zpětný primer 0,5 10 ng/µl DNA 5 H 2 O 6,5 Tab. 9 Primery použité pro 5. exon genu TYRP1 (Schmutz, 2002) Primer Sekvence primeru Přímý 5 ACCAATGGTGCAACGTCTTCCTGAACCG 3 Zpětný 5 GCCTTCCACTGTGTTTCGGAAACTG 3 K amplifikaci DNA byl použit automatický termocykler PTC-200 MJ Research. Podmínky reakce jsou uvedeny v následující tabulce. Tab. 10 Teplotní podmínky amplifikace DNA Cyklus Čas Teplota Úvodní denaturace 4 min 94 C Denaturace 50 s 94 C Annealing 50 s 57 C Elongace 50 s 72 C Finální extenze 4 min 72 C 30 cyklů Výsledek PCR a kvalitu amplifikované DNA ověřujeme pomocí gelové elektroforézy na 2% agarózovém gelu. K elektroforéze bylo použito 5 µl produktu. Primery ohraničily PCR produkt o velikosti 121 bp (Schmutz, 2002). Vizualizace byla provedena ethidium bromidem a UV světlem. 48

4.4.2 RFLP pro mutace na exonu 5 Získaný PCR produkt o velikosti 121 bp byl předčasným stop kodonem (Q331X) štěpen enzymem AciI (BioLabs) na 28 a 93 bp. U mutace 345delP došlo k poštěpení enzymem MnlI (Biolabs) na fragmenty o velikosti 48 a 73 bp (Schmutz, 2002). V tabulce je uvedeno složení restrikční směsi pro jeden vzorek. Tab. 11 Složení restrikční směsi pro mutace Q331X a 345delP Složky Objem [µl] Koncentrace AciI/MnlI 0,5 10000 U/ml; 5000 U/ml NEBpufr 3/ NEBpufr 4 1,5 H 2 O 3,0 Celkem 5,0 Restrikční směs o objemu 5 µl byla přidána k 10 µl PCR produktu. Vzorek byl inkubován přes noc při teplotě 37 C. Výsledek byl pozorován na 4% agarózovém gelu vizualizovaném ethidium bromidem při UV záření. 4.4.3 PCR pro mutace na exonu 2 Reakční směs se sestává z 5 µl DNA a celkový objem 25 µl je doplněn HotStarTaq TM Master Mixem (Qiagen), přímým a zpětným primerem a PCR vodou. Jeho složení a koncentrace jsou uvedeny v následující tabulce. Tab. 12 Složení a koncentrace PCR reakční směsi na jeden vzorek DNA Složky Objem [µl] Koncentrace HSTaq Master Mix 12,5 Přímý primer 0,5 10 ng/µl Zpětný primer 0,5 10 ng/µl DNA 5 H 2 O 6,5 49

Tab. 13 Primery použité pro 2. exon genu TYRP1 (Schmutz, 2012) Primer Sekvence primeru Přímý 5 TTGTTCTTCACTCTTGCTTAAAGC 3 Zpětný 5 GGGGACAGGTCTGGGCGAC 3 K amplifikaci DNA byl použit automatický termocykler PTC-200 MJ Research. Podmínky reakce jsou uvedeny v následující tabulce. Tab. 14 Teplotní podmínky amplifikace DNA Cyklus Čas Teplota Úvodní denaturace 15 min 94 C Denaturace 50 s 94 C Annealing 50 s 65 C Elongace 50 s 72 C Finální extenze 4 min 72 C 35 cyklů Výsledek PCR a kvalitu amplifikované DNA ověřujeme pomocí gelové elektroforézy na 2% agarózovém gelu. K elektroforéze bylo použito 5 µl produktu. Primery ohraničily PCR produkt o velikosti 167 bp (Schmutz, 2012). Vizualizace byla provedena ethidium bromidem a UV světlem. 4.4.4 RFLP pro mutace na exonu 2 Získaný PCR produkt o velikosti 167 bp byl díky substituci páru bází štěpen enzymem HinfI (Fermentas) na fragmenty o velikosti 20 a 147 bp (Schmutz, 2012). V tabulce je uvedeno složení restrikční směsi pro jeden vzorek. 50

Tab. 15 Složení restrikční směsi pro mutaci S41C Složky Objem [µl] Koncentrace HinfI 0,5 2000 U/ml Pufr R 1,5 H 2 O 3,0 Celkem 5,0 Restrikční směs o objemu 5 µl byla přidána k 20 µl PCR produktu. Vzorek byl inkubován přes noc při teplotě 37 C. Výsledek byl pozorován na 4% agarózovém gelu vizualizovaném ethidium bromidem při UV záření. 51

5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE 5.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Výsledek PCR reakce byl po každé amplifikaci kontrolován na 2% agarózovém gelu. Ke kontrolní elektroforéze bylo odebráno 5µl PCR produktu. Vizualizace vzorku byla provedena přidáním ethidium bromidu a za použití UV záření transiluminátoru (Herolab). Pro určení správné délky produktu byl použit marker (M100 nebo M50). Obr.21 Výsledek PCR reakce MC1R (99 bp) 5.2 Stanovení polymorfismů MC1R pomocí PCR-RFLP Neštěpený fragment o délce 99 bp neobsahuje mutaci, jedná se o dominantní homozygoty. Heterozygoti mají fragmenty 99, 71 a 28 bp a psi se světlým zbarvení se jeví jako recesivní homozygoti o délce fragmentů 71 a 28 bp. PCR produkty byly štěpeny enzymem AfeI, který byl součástí restrikční směsi popsané v předchozí kapitole a došlo ke štěpení fragmentů. Výsledek byl vizualizován na 4% agarózovém gelu za použití ethidium bromidu a UV záření. Obr. 22 Výsledek PCR-RFLPMC1R, u štěpeného heterozygota sledujeme přítomnost fragmentů o velikosti 99 a 71 bp, detekovat nejkratší fragment nelze 52

Obr. 23 4% gel se štěpenými PCR produkty genu MC1R, jedná se o soubor světlých psů, výsledné štěpení nám vyvrací přítomnost předpokládaných genotypů e/e Obr. 24 Výsledek restrikce MCIR u různě zbarvených psů Obr. 25 Výsledek PCR-RFLP MC1R u jednobarevných psů, kteří byli využiti pro účely ověření správnosti postupu a funkčnosti metody 53

Obr. 26 Soubor sledovaných světlých psů. Popis zleva doprava po řádcích. Collete ve věku několik týdnů a v dospělosti (PB3), jasně zlatá matka Collete Zuzana (foto A. Kučerová), O Collin (PB8), Baroness Lou (PB7) (http://biewer-de.majestat.cz), Chanell (AL1) (foto A. Kučerová) Souhrnné výsledky štěpení jsou uvedeny v tabulce 16. Největší četnost zastoupení měl genotyp E/E a to u 45 jedinců jorkšírského teriéra, z toho u 6 jedinců biro carrier, 14 biewerů, 10 black and tanů, 4 blue and tanů, u 2 čokoládových psů a golddustů, u 4 goldenů (tzn. u všech), u jediného psa zbarvení mustard a obou psů zbarvení white 54

ocean pearl. Zbývající skupina 15 psů nese genotyp E/e (6 biewerů, jeden black and tan, 2 blue and tani, 3 čokoládoví psi, dva golddusti a jeden pes zbarvení ocean pearl). U jorkšírského teriéra nebyl stanoven žádný recesivní homozygot. Důvodem nepřítomnosti genotypu e/e u světlých jedinců, kde byl tento genotyp předpokládán (golddust, mustard, zlatý, golden, ocean pearl a white ocean pearl) může být více. Mohlo zde docházet k nedostatečnému štěpení, což se odráží i v hůře definovatelných genotypech heterozygotů. Neúplné štěpení může být způsobeno špatným enzymem nebo nespecifickou Taq polymerázou v HSTaq Master Mixu, stejně jako nedostatečnou optimalizací reakčních podmínek nebo složením reakční, příp. restrikční směsi. Dále u jorkšírského teriéra může být toto zbarvení způsobeno jiným lokusem. Vzorky světlých psů byly opakovaně analyzovány vždy se stejným výsledkem. Byly různě obměňovány reakční podmínky. Pokoušeli jsme se také o optimalizaci vzorku pro sekvenování, ale nepodařilo se získat čistý PCR produkt. Tyto výsledky jsou vysoce neprůkazné, proto zde nebylo doloženo žádné statistické zpracování. Jedná se o náhodný soubor zvířat s nedokonalou interpretací výsledků štěpení. 5.3 Stanovení polymorfismů TYRP1 pomocí PCR-RFLP Výzkum alel pro hnědé zbarvení vyžaduje analýzu tří různých polymorfismů. Na exonu 5 se vyskytují dvě mutace Q331X a 345delP. U obou těchto mutací se hnědé zbarvení recesivních homozygotů projevuje jako neštěpený, 121 bp dlouhý, fragment. Heterozygoti v Q331X mají fragmenty o délce 121, 93 a 28 bp a dominantní homozygoti 93 a 28 bp. Heterozygoti v mutaci 345delP mají délku fragmentů 121, 73 a 48 bp, dominantní homozygoti 73 a 48 bp. Třetí mutace, S41C, se nachází na 2. exonu. Dominantní homozygoti mají fragmenty o délce 167 bp, heterozygoti167, 147 a 20 bp a recesivní homozygoti s projevem hnědého zbarvení 147 a 20 bp. Výsledek byl vizualizován na 4% agarózovém gelu za použití ethidium bromidu a UV záření. 55

Obr. 27 Štěpení genu TYRP1 enzymem AciI (Q331X) recesivní homozygoti (121 bp) Obr. 28 Štěpení genu TYRP1 enzymem AciI (Q331X) přenašeči (121 a 93 bp) Obr. 29 Štěpení genu TYRP1 enzymem MnlI (345delP) pouze u sedmi psů byla analyzována recesivní alela, žádný pes pro tuto mutaci nebyl stanoven jako recesivní homozygot Obr. 30 Štěpení genu TYRP1 enzymem HinfI (S41C) výskyt nespicifit může být způsoben degradací templátové DNA, u čistých vzorků pozorujeme dominantní homozygoty (167 bp) a přenašeče hnědé alely o délce fragmentů 167 a 147 bp, ani zde nebyl stanoven žádný recesivní homozygot 56

Obr. 31 Soubor sledovaných hnědých psů. Popis zleva doprava po řádcích. Tofife (AK1), Viviana (PB4), Ema Tudom (RB14), Belis (PB21), Beatrice (PB19) a celý vrh z Tofife a otce Fridi (biro biewer) (foto A. Kučerová) 57

Souhrnné výsledky štěpení jsou uvedeny v tabulce 16. Četnost zastoupení je u každého polymorfismu jiná. Pouze u mutace Q331del jsme stanovili recesivní homozygoty. U zbývajících dvou polymorfismů se recesivní alely vykytovaly málo a pouze jako součást heterozygotního páru. V mutaci Q331X bylo označeno devět psů za recesivní homozygoty, jednalo se o 6 psů biro carrier z čokoládově zbarvené matky a otce označeného biro biewer, proto byl tento genotyp u nich předpokládán. Dále se jednalo o 3 psy čokoládového zbarvení. Alela b s byla určena i u obou hnědých labradorů a u žlutého labradora s hnědým čumákem. Ve sledovaném vzorku se nacházeli ještě další 3 čokoládový jorkšíři, ale u nich jsme určili přítomnost pouze jedné recesivní alely. Mohlo zde dojít k nedokonalému štěpení nebo k chybnému odečtu výsledku. Šestnáct psů bylo označeno za heterozygoty, tzn. přenašeče hnědého zbarvení. Na základě tohoto výsledku můžeme určit, které barevné varianty podporují produkci hnědých jedinců ve vrhu. Jedná se o biewery (5 jedinců), kteří mají určitě vliv na zbarvení a přítomnost biro biewerů, 6 black and tanů ti působí na vznik čokoládových psů a mohou sloužit jako přenašeči hnědé barvy pro biro biewery. U blue and tana jsme nezaznamenali žádného přenašeče hnědého zbarvení, a to ani u jedné mutace. Z toho můžeme usuzovat, že se jedná o samostatnou větev zbarvení, u které přenos hnědé barvy nemusíme vůbec očekávat. Díky malému počtu jedinců tohoto zbarvení, ale nemůžeme tuto hypotézu určitě potvrdit. Tento názor by se mohl stát předmětem dalšího výzkumu. Nepřítomnost žádné alely pro hnědé zbarvení byla potvrzena také u golddustů. Platí pro ně stejná myšlenka jako u předchozích blue and tanů. Ze čtyř zlatých psů bylo přenašečství alely b s potvrzeno u 3 jedinců. Hnědá barva se u těchto psů může projevovat v barvě nosu nebo polštářků tlapek. Toto zbarvení má pravděpodobně významné postavení pro produkci jedinců s hnědými znaky. Hnědá alela byla objevena i u jediného zástupce zbarvení ocean pearl. Přítomnost heterozygotů u mutace 345delP je častější než u S41C. Jak bylo uvedeno výše, nebyl zde určen žádný recesivní homozygot. Alela b d byla stanovena u sedmi jedinců 2 bieweři, 2 black an tani, 1 čokoládový pes, u 1 goldena a psa zbarvení mustard. Alela b c mutace S41C byla objevena pouze u pěti psů, a to u dvou biewerů a u tří klasicky zbarvených jorků. Z toho může vyplývat, že tato alela se přenáší pouze u jedinců těchto dvou zbarvení a jsou schopni si ji mezi sebou přenášet. U biewerů se 58

popisuje, že v místě zlaté barvy se může vyskytovat hnědý odstín. Tato hnědá barva může být způsobena právě přenašečstvím této alely při tvorbě nových jedinců zbarvení biewer z black and tan jedinců. Přítomnost více alel pro hnědé zbarvení u jednoho jedince bylo také pozorováno. U sedmi psů jsme objevili přítomnost dvou různých alel pro hnědou barvu (u 4 psů v kombinaci b s a b d, u dvou psů v kombinaci b c a b s a u jednoho psa alely v kombinaci b c a b d. Pouze jeden pes klasického zbarvení nesl všechny 3 alely. Všichni tito psi byli heterozygoti, tzn. že pes pravděpodobně nemůže být recesivní homozygot ve více mutacích. Z toho vyplývá, že je důležité provádět analýzu všech tří mutací. Ovšem podle četnosti výskytu alel můžeme určit pořadí testovaných polymorfismů. Pokud se nám objeví přítomnost recesivní alely v první analýze, není potřeba provádět testování zbývajících dvou. Pořadí důležitosti testování jednotlivých mutací podle námi prokázané četnosti alel bych určila následovně: 1. Q331ter, 2. 345delP a 3. S41C. Alela b s se vyskytovala u hnědých psů nejčastěji. V následující tabulce č. 16 je uveden souhrn všech výsledků analýz. 59

Tab. 16 Testování MC1R (R306X) a TYRP1(S41C, Q331X a 345delP) mutací (Schmutz, 2002) u jorkšírského teriéra, barva biroc biro carrier, B/T black and tan, BL/T blue and tan, ocean ocean pearl, oceanw white ocean pearl, pomlčka značí neprovedenou analýzu z důvodu neúspěšného testování (mnoho smíru) nebo nedostatečného množství vzorku Pes Vzorek Plemeno Barva R306X S41C Q331X 345delP Bastien PB22 JT biroc E/E B/B b s /b s B/B Beatrice PB19 JT biroc E/E B/B b s /b s B/B Becky PB23 JT biroc E/E B/B b s /b s B/B Belis PB21 JT biroc E/E B/B b s /b s B/B Bibi PB18 JT biroc E/E B/B b s /b s B/B Bigi PB20 JT biroc E/E B/B b s /b s B/B Ailin PB5 JT biewer - - B/b s B/B Aloren PB14 JT biewer E/E - B/B B/B Angelína AI1 JT biewer E/E B/B B/B B/B Bayles AL8 JT biewer E/E B/B B/B B/B Buchta 1 AJ6 JT biewer E/E B/B B/B B/B Carlita AL7 JT biewer E/E B/B B/B B/B Casandra KI2 JT biewer E/E B/B B/B B/B Collin KA3 JT biewer E/e B/B B/B B/b d Cookie PB11 JT biewer E/E B/B B/B B/B Cristobal KI1 JT biewer E/E B/B B/b s B/B Falco AL2 JT biewer E/E B/B B/b s B/B Gečita KA7 JT biewer E/E B/B B/B B/B Gwen KA9 JT biewer E/E B/B B/B B/B Jamajka PB13 JT biewer E/E B/B B/B B/B Janina PB12 JT biewer E/E B/B B/B B/B Koffe PB10 JT biewer E/e - B/b s B/B Lara KA5 JT biewer E/E B/b c B/B B/b d Medy RB8 JT biewer E/e B/b c B/b s B/B Munchy KA6 JT biewer E/e - B/B B/B Panda KA2 JT biewer E/e B/B B/B B/B - AL3 JT biewer E/E B/B B/B B/B Ariadna RB13 JT B/T E/E B/B B/B B/B Babu PB15 JT B/T E/E - B/B B/B Gina PB17 JT B/T E/E B/B B/B B/B Halbik 1 RB4 JT B/T E/E B/B B/b s B/b d Halbik 2 RB5 JT B/T E/E B/b c B/b s B/B Jesica PB6 JT B/T E/e - B/B B/B Kuša RB9 JT B/T E/E B/b c B/B B/B Maruška RB6 JT B/T - - B/b s B/B 60

Sesi PB16 JT B/T E/E B/B B/B B/B Terez 1 RB2 JT B/T E/E B/b c B/b s B/b d Terez 2 RB3 JT B/T E/E B/B B/b s B/B Violette AK2 JT B/T E/E B/B B/b s B/B Buchta 2 AJ5 JT BL/T E/E B/B B/B B/B Čikita KA1 JT BL/T E/e B/B B/B B/B Dýna RB7 JT BL/T E/E B/B B/B B/B Egon Lee RB10 JT BL/T E/e - B/B B/B Monika KA4 JT BL/T E/E B/B B/B B/B Vera RB12 JT BL/T E/E B/B B/B B/B Anutel PB2 JT chocolate E/e B/B b s /b s B/B Baddy RB16 JT chocolate E/e B/B B/b s B/B Ema RB14 JT chocolate E/E B/B B/b s B/b d Muffin RB11 JT chocolate - - B/b s B/B Tofife AK1 JT chocolate E/E B/B b s /b s B/B Viviana PB4 JT chocolate E/e B/B b s /b s B/B Baroness PB7 JT golddust E/E - B/B B/B Emilka KA8 JT golddust E/E B/B B/B B/B Leonise PB9 JT golddust E/e B/B B/B B/B O Collin PB8 JT golddust E/e B/B B/B B/B Amálka KA10 JT golden E/E B/B B/b s B/B Colette PB3 JT golden E/E B/B B/b s B/B Chanell AL1 JT golden E/E B/B B/B B/B Tereza RB1 JT golden E/E - B/b s B/b d Cindulka RB15 JT mustard E/E - B/b s B/b d - AL4 JT ocean E/E B/B B/b s B/B - AL5 JT oceanw E/E B/B B/B B/B - AL6 JT oceanw E/E B/B B/B B/B - AJ1 flat black E/E B/B B/B B/B - AJ2 flat black E/E B/B B/b s B/B - AJ3 flat black E/E B/B B/b s B/B Sam AJ4 zlatý ret. yellow e/e B/B B/B B/B Benji AJ7 labrador yellow e/e B/B b s /b s B/B Bax GF5 labrador brown E/e B/B b s /b s B/B - AJ8 labrador brown E/e B/B b s /b s B/B 5.4 Verifikace přenosu alel mezi příbuznými jedinci V následujících tabulkách jsou uvedeni příbuzní jedinci. Byly získány 3 kompletní rodiny rodičů s potomky, 6 matek s potomky a dva páry příbuzných jedinců ve vztahu sourozenců. Byl potvrzen přenos alel mezi příbuznými jedinci. 61

Tab. 17 Potomci golden matky Chanell (AL1) a biewer otce Falca (AL2) Vzorek MC1R TYRP1 Matka MC1R TYRP1 Otec MC1R TYRP1 AL3 E/E B/B AL4 E/E B/b s AL5 E/E B/B AL6 E/E B/B AL1 E/E B/B AL2 E/E B/b s Obr. 32 Štěňata Chanelly a Falca (foto A. Kučerová) Tab. 18 Potomci biewer matky Angelíny (AI1) a biewer otce Falca (AL2), potomci jsou všichni zbarvení biewer Vzorek MC1R TYRP Matka MC1R TYRP Otec MC1R TYRP1 AL7 E/E B/B KI2 E/E B/B AI1 E/E B/B AL2 E/E B/b s KI1 E/E B/b s Otec Falco nese po svém otci recesivní alelu b s, kterou v obou vrzích předal jednomu svému potomkovi. K upevnění hnědé alely by bylo vhodné tyto potomky křížit buď s heterozygotem pro mutaci Q331X nebo recesivním homozygotem (čokoládovým psem nebo biro biewerwm). 62

Tab. 19 Potomek Emilka (golddust, KA8), rodiče blue and tan Čikita (KA1) a biewer Collin (KA3) Vzorek MC1R TYRP Matka MC1R TYRP Otec MC1R TYRP1 KA8 E/E B/B KA1 E/e B/B KA3 E/e B/b d Emilka byla v MC1R stanovena jako dominantní homozygot, rodiče jsou heterozygoti. K přenosu dominantních alel mohlo dojít, ale vzhledem k fenotypu Emilky je tato interpretace považována za chybnou. U otce Collina je přítomná alela b d, která se u Emilky nevyskytuje, není proto sama přenašečkou hnědého zbarvení. Tab. 20 Psi s ověřeným přenosem zbarvení po matce Vzorek MC1R TYRP1 Matka MC1R TYRP1 Otec PB22 E/E b s /b s AK1 E/E b s /b s biro PB19 E/E b s /b s AK1 E/E b s /b s biro PB23 E/E b s /b s AK1 E/E b s /b s biro PB21 E/E b s /b s AK1 E/E b s /b s biro PB18 E/E b s /b s AK1 E/E b s /b s biro PB20 E/E b s /b s AK1 E/E b s /b s biro PB2 E/e b s /b s AK1 E/E b s /b s chocolate PB5 - B/b s PB12 E/E B/B biewer PB14 E/E B/B PB13 E/E B/B - PB11 E/E B/B PB10 E/e B/b s - KA9 E/E B/B KA5 E/E B/b d biewer RB2 E/E B/b s RB1 E/E B/b s biewer RB3 E/E B/b s RB1 E/E B/b s biewer V tabulce 20 je uvedeno šest matek se svými potomky. Čokoládová matka Tofife (AK1) předává svým potomkům recesivní alelu b s. V kombinaci s hnědými otci se narodili hnědí jedinci b s /b s. I přes absenci vzorků otců můžeme stanovit, že se jednalo o psy, kteří nesli alelu b s také, a to buď v podobě genotypu B/b s anebo vzhledem ke známým fenotypům spíše b s /b s. Biewer Ailin (PB5) získala od své matky dominantní alelu B, recesivní alela b s byla pravděpodobně přenesena od heterozygotního otce. U biewera Gwen (KA9) nedošlo k přenosu alely b d od heterozygotní matky biewera Lary (KA5). Potomci Terezy (RB1) Terezka 1 (RB2) a Terezka 2 (RB3) získali recesivní alelu b s od matky. Tereza 1 současně získala i recesivní alely b c pravděpodobně od otce. a b d, které získala 63

6 ZÁVĚR Cílem práce bylo charakterizovat genetické založení zbarvení u jorkšírského teriéra. Na základě recentních zdrojů literatury byl vytvořen seznam genů s vlivem na barvu u různobarevných jorkšírských teriérů. Jeho přehledný souhrn se nachází v tabulce č. 2. Celkem byly u jorkšírských teriérů stanoveny dva genotypy pro gen MC1R - E/E a E/e. Nebyl zde potvrzen projev recesivních homozygotů u golddustů, goldenů, psů zbarvení mustard, ocean pearl a white ocean pearl, a to i přes pozitivní ověření funkčnosti metody u zlatého retrívra a žlutého labradorského retrívra, kde byl genotyp e/e prokázán. Testování genu MC1R by mělo být lépe optimalizováno (nedocházelo k dostatečnému štěpení, smír ve vzorcích), měla by být získána kompletní dokumentace světlých jedinců a jejich předků. Také se nám nabízí myšlenka dalších analýz k potvrzení nebo vyvrácení vlivu jiného genu na světlé zbarvení u jorkšírských teriérů. U genu TYRP1 byly stanoveny všechny tři možné genotypy pouze pro mutaci Q331ter. U zbývajících dvou byli detekováni pouze dominantní homozogyti a heterozygoti (B/b d, B/b c ). Zřejmé výsledky testování v korelaci s hnědým fenotypem byly získány pouze pro mutaci Q331ter v genu TYRP1. V další studii by mohla být sledována četnost výskytu recesivních alel u mutací 345delP a S41C, výskyt v podobě recesivních homozygotů u jorkšírského teriéra a jejich projev ve fenotypu. V práci není dokumentováno testování genu MITF, které se nepodařilo optimalizovat. Důvodem může být také v tomto případě vliv jiného genu na bílé odznaky u jorkšírského teriéra. Analýza genu s tímto projevem je důležitá pro zjištění přenosu bílé strakatosti a vzniku psů zbarvení golddust, biewer a biro biewer. U vybraných skupin barevných variant jorkšírských teriérů je velmi důležité pro další studie přenosu kandidátních genů shromáždit co nejkompletnější informace o studovaném jedinci. Nedílnou součástí by měla být fotografická dokumentace, kompletní popis zbarvení i s případnými odchylkami nebo změnami zbarvení v průběhu času, ucelené informace o rodičích, příp. prarodičích a v případě možnosti i s jejich dodanými stěry. V práci bylo sestaveno celkem deset skupin barevných variant jorkšírských teriérů. Byl pozorován předpokládaný výskyt podobných genotypů v rámci skupiny, s výjimkou světle zbarvených psů. 64

Jsou zde také shrnuty informace o přenosu alel pro určitý projev zbarvení mezi rodiči a potomky. Podařilo se získat tři kompletní rodiny (oba rodiče a potomky) a byl u nich prokázán správný přenos alel. U těchto psů jsme si genotyp nejdříve navrhli podle známého fenotypu a posléze jsme jej analýzou prokázali. Dají se tak vytvářet přibližné genotypové profily pro zbarvení ze známých fenotypů. Potvrzen byl také přenos alel pouze ze strany matky u 13 jedinců. Podle známého fenotypu otce a známých genotypů matek jsme si rovněž navrhli profily otců, i když je v práci neuvádím kvůli nepodloženosti dat testováním. Celkem bylo stanoveno 265 genotypů. Na základě literatury, testování a pozorování byl vytvořen komplexní přehled známých barevných variant a předpokládaný souhrn lokusů s vlivem na rozmanité barvy u jorkšírského teriéra. Neustálým křížením různě barevných psů mezi sebou je zatím v České republice tato populace poměrně nestabilní. Právě porozumění genetické podstaty a umožnění testování a následné záměrné připařování těchto psů by mělo vést ke stabilizaci a rozšíření chovu. 65

7 SEZNAM LITERATURY ANDERSON N. AMERICAN CANINE REGISTRY. Class Act Kennel: All about the Red, Crème and Brown Yorkshire Terriers [online]. 2008 [cit. 2013-03-24]. Dostupné z: http://www.americancanineregistry.com/classactkennel/pages/creme,red,brown.htm BAXTER, L. L. a W. J. PAVAN. Pmel17 expression is Mitf-dependent and reveals cranial melanoblast migration during murine development. Gene Expression Patterns. 2003, č. 3, 703 707. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0925477303001801# BAŠTÝŘOVÁ, M. a I. CIBULKOVÁ - BAŠTÝŘOVÁ. Color yorkshire terrier "von Weitra" [online]. 2012 [cit. 2013-04-07]. Dostupné z: http://www.vonweitra.com/ BECKER-FOLLMANN, J., A. GAA, E. BAÚSCH, E. NATT, G. SCHERER a O. DEIMLING. High-resolution mapping of a linkage group on mouse chromosome 8 conserved on human chromosome 16Q. Mammalian Genome. 1997, roč. 8, č. 3, s. 172-177. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s003359900384. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/s003359900384 BERRYERE, T. G., J. A. KERNS, G. S. BARSH a S. M. SCHMUTZ. Association of an Agouti allele with fawn or sable coat color in domestic dogs. Mammalian Genome. 2005, roč. 16, č. 4, s. 262-272. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s00335-004-2445-6. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/s00335-004-2445-6 BISMUTH, K., D. MARIC a H. ARNHEITER. MITF and cell proliferation: the role of alternative splice forms.pigment Cell Research. 2005, roč. 18, č. 5, s. 349-359. ISSN 0893-5785. DOI: 10.1111/j.1600-0749.2005.00249.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1600-0749.2005.00249.x BISSON, A. FURKIDS BIEWER YORKSHIRE TERRIER. Golddust Biewer standards, BIRO standards [online]. 2010, 2013 [cit. 2013-03-28]. Dostupné z: http://www.biewers.com/permanent/golddust_biewer_standards.htm CANDILLE, S. I., C. B. KAELIN, B. M. CATTANACH, B. YU, D. A. THOMPSON, M. A. NIX, J. A. KERNS, S. M. SCHMUTZ, G. L. MILLHAUSER a G. S. BARSH. A 66

β-defensin Mutation Causes Black Coat Color in Domestic Dogs. Science. 2007, roč. 318, č. 5855, s. 1418-1423. ISSN 0036-8075. DOI: 10.1126/science.1147880. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.1147880 ČESKOMORAVSKÝ KLUB CHOVATELŮ YORKSHIRE TERRIERŮ. O plemeni YT [online]. 2003, 14. 3. 2013 [cit. 2013-01-14]. Dostupné z: http://www.cmkchyt.cz/ ČESKOMORAVSKÁ KYNOLOGICKÁ UNIE. Plemena standardy: Yorkšírský teriér [online]. 2008 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.cmku.cz/index2.php?plemena_skupiny=3 CLARK, L. A., J. M. WAHL, Ch. A. REES a K. E. MURPHY. Retrotransposon insertion in SILV is responsible for merle patterning of the domestic dog. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2006, roč. 103, č. 5, s. 1376-1381. ISSN 0027-8424. DOI: 10.1073/pnas.0506940103. Dostupné z: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0506940103 DDC VETERINARY. Yorkshire Terrier DNA Tests [online]. 2013 [cit. 2013-04-15]. Dostupné z: http://www.vetdnacenter.com/search-breed-result.php?breed=129 DOSTÁL, J. Genetika a šlechtění plemen psů. České Budějovice: Dona, 2007, 261 s., [16] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-7322-104-1. DREGER, D. L. a S. M. SCHMUTZ. A SINE Insertion Causes the Black-and-Tan and Saddle Tan Phenotypes in Domestic Dogs. Journal of Heredity. 2011-08-16, roč. 102, Suppl 1, S11-S18. ISSN 0022-1503. DOI: 10.1093/jhered/esr042. Dostupné z: http://jhered.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.1093/jhered/esr042 DRÖGEMÜLLER, C., A. GIESE, F. MARTINS-WESS, S. WIEDEMANN, L. ANDERSSON, B. BRENIG, R. FRIES a T. LEEB. The mutation causing the blackand-tan pigmentation phenotype of Mangalitza pigs maps to the porcine ASIP locus but does not affect its coding sequence. Mammalian Genome. 2006, roč. 17, č. 1, s. 58-66. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s00335-005-0104-1. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/s00335-005-0104-1 EVERTS, R. E,, J. ROTHUIZEN a B. A. VAN OOST. Identification of a premature stop codon in the melanocyte-stimulating hormone receptor gene (MC1R) in Labrador 67

and Golden retrievers with yellow coat colour. Animal Genetics. 2000, č. 31, 194-199. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2052.2000.00639.x/pdf EXQUISITE BIEWERS & GOLDDUST. Biewer Yorkshire Terrier: Info & History [online]. 2011 [cit. 2013-03-28]. Dostupné z: http://www.exquisitebiewers.com/biewer&golddust%20info.htm FCI. Standards and Nomenclature: Breeds nomenclature [online]. 1998, 2013 [cit. 2013-02-19]. Dostupné z: http://www.fci.be/nomenclature.aspx GENOMIA S. R. O. Barvy srsti u psů: Úvod do problematiky zbarvení srsti u psů [online]. 2008 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.genomia.cz/cz/dogcolor/ GIRARDOT, M., J. MARTIN, S. GUIBERT, H. LEVEZIEL, R. JULIEN a A. OULMOUDEN. Widespread expression of the bovine Agouti gene results from at least three alternative promoters. Pigment Cell Research. 2005, roč. 18, č. 1, s. 34-41. ISSN 0893-5785. DOI: 10.1111/j.1600-0749.2004.00195.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1600-0749.2004.00195.x HEALTHGENE. Canine Coat and Nose Color Testing: C128-Canine Coat and Nose Color Test Yorkshire Terrier [online]. Kanada, 2000, 2013 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.healthgene.com/canine-dna-testing/color-testing/?tid=4&btid=92 HÉDAN, B., S. CORRE, Ch. HITTE, S. DRÉANO, T. VILBOUX, T. DERRIEN, B. DENIS, F. GALIBERT, M.-D. GALIBERT a C. ANDRÉ. Coat colour in dogs: identification of the Merle locus in the Australian shepherd breed. BMC Veterinary Research. 2006, roč. 2, č. 9, s. 1-10. ISSN 17466148. DOI: 10.1186/1746-6148-2-9. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/1746-6148/2/9 CHEROGLO, L. Lux Liurex: Yorkshire Terrier & Biewer [online]. Itálie, 2011 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.luxliurex.com/joomla/ CHINTALA, S. Slc7a11 gene controls production of pheomelanin pigment and proliferation of cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005, roč. 102, č. 31, s. 10964-10969. ISSN 0027-8424. DOI: 10.1073/pnas.0502856102. Dostupné z: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0502856102 68

ISHIDA, Y., V. A. DAVID, E. EIZIRIK, A. A. SCHÄFFER, B. A. NEELAM, M. E. ROELKE, S. S. HANNAH, S. J. O BRIEN a M. MENOTTI-RAYMOND. A homozygous single-base deletion in MLPH causes the dilute coat color phenotype in the domestic cat. Genomics. 2006, č. 6, s. 698-705. ISSN 08887543. DOI: 10.1016/j.ygeno.2006.06.006. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/s0888754306001777 JACKSON, I. J. A cdna encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mouse. Proc. Nati. Acad. Sci. 1988, č. 85, s. 4392-4396. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc280435/ JAVERZAT, S. a I. J. JACKSON. White-based brown ( Tyrp1 B-w ) is a dominant mutation causing reduced hair pigmentation owing to a chromosomal inversion. Mammalian Genome. 1998-6-1, roč. 9, č. 6, s. 469-471. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s003359900798. Dostupné z: http://www.springerlink.com/openurl.asp?genre=article JAVORČEKOVÁ, S. Jorkšírský teriér a jeho barevné varianty. Vyd. 1. Praha: Plot, 2011, 178 s. Portréty (Plot). ISBN 978-80-7428-081-8. KARLSSON, E. K., I. BARANOWSKA, C. M. WADE, N. H. C. SALMON HILLBERTZ, M. C. ZODY, N. ANDERSON, T. M. BIAGI, N. PATTERSON, G.R. PIELBERG, E. J. KULBOKAS, K. E. COMSTOCK, E. T. KELLER, J. P. MESIROV, H. VON EULER, O. KÄMPE, A. HEDHAMMAR, E. S. LANDER, G. ANDERSSON, L. ANDERSSON a K. LINDBLAD-TOH. Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association. Nature Genetics. 2007, roč. 39, č. 11, s. 1321-1328. ISSN 1061-4036. DOI: 10.1038/ng.2007.10. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/ng.2007.10 KENNEL CLUB USA. Yorkshire Terrier: This is the breed standard for the Yorkshire Terrier [online]. USA, 2007 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.kennelclubusa.com/yorkshire_terrier.htm KERNS, J., A., J. NEWTON, T. G. BERRYERE, E. M. RUBIN, J.-F. CHENG, S. M. SCHMUTZ a G. S. BARSH. Characterization of the dog Agouti gene and a nonagoutimutation in German Shepherd Dogs. Mammalian Genome. 2004, roč. 15, č. 69

10, s. 798-808. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s00335-004-2377-1. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/s00335-004-2377-1 KERNS, J. A., E. J. CARGILL, L. A. CLARK, S. I. CANDILLE, T. G. BERRYERE, M. OLIVIER, G. LUST, R. J. TODHUNTER, S. M. SCHMUTZ, K. E. MURPHY a G. S. BARSH. Linkage and Segregation Analysis of Black and Brindle Coat Color in Domestic Dogs. Genetics. 2007, roč. 176, č. 3, s. 1679-1689. ISSN 0016-6731. DOI: 10.1534/genetics.107.074237. Dostupné z: http://www.genetics.org/cgi/doi/10.1534/genetics.107.074237 KNOLL, A. a Z. VYKOUKALOVÁ. Molekulární genetika zvířat: (Metody detekce polymorfizmů DNA genů). Vyd. 1., Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2002, 100 s. ISBN 80-715-7616-6. KOČÁREK, E. Genetika. 1. vyd. Praha: Scientia, 2004, 211 s. ISBN 80-718-3326-6. KOMÁREK, V. a Z. SOVA. Anatomie a fyziologie hospodářských zvířat. Druhé, přepracované vydání. Praha: SZN, 1971, s. 495-512. ISBN 07-059-71. LITTLE, C. C. The inheritance of coat color in dogs. 7. vyd. New York: Howell Book House, 1976. ISBN 08-760-5621-4. MARIANI, P., M. JOHANSSON MOLLER, B. HOYHEIM, R. MARKLUND, W. DAVLES, H. ELLEGREN a L. ANDERSSON. The Extension Coat Color Locus and the Loci for Blood Group O and Tyrosine Aminotransferase Are on Pig Chromosome 6. The Journal of Heredity. 1996, 87 (4), s. 272-276. Dostupné z: http://jhered.oxfordjournals.org/content/87/4/272.long MATESIC, L. E., R. YIP, A. E. REUSS, D. A. SWING, T. N. O'SULLIVAN, C. F. FLETCHER, N. G. COPELAND a N. A. JENKINS. Mutations in Mlph, encoding a member of the Rab effector family, cause the melanosome transport defects observed in leaden mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001, č. 18, s. 10238-10243. ISSN 0027-8424. DOI: 10.1073/pnas.181336698. Dostupné z: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.181336698 MÉNASCHÉ, G., C.H. HO, O. SANAL, J. FELDMANN, I. TEZCAN, F. ERSOY, A. HOUDUSSE, A. FISCHER a G. de Saint BASILE. Griscelli syndrome restricted to 70

hypopigmentation results from a melanophilin defect (GS3) or a MYO5A F-exon deletion (GS1). Journal of Clinical Investigation. 2003, roč. 112, č. 3, s. 450-456. ISSN 0021-9738. DOI: 10.1172/JCI18264. Dostupné z: http://www.jci.org/articles/view/18264 NEČÁSEK, Jan. Genetika. 2. vyd. Praha: Scientia, 1997, 112 s. ISBN 80-718-3085-2. NEWTON, J. M., A. L. WILKIE, L. HE, S. A. JORDAN, D. L. METALLINOS, N. G. HOLMES, I. J. JACKSON a G. S. BARSH. Melanocortin 1 receptor variation in the domestic dog. Mammalian Genome. 2000, č. 11, s. 24-30. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007%2fs003350010005#page-1 PAMPERED BIEWERS. The Biro Yorkshire Terrier [online]. 2010 [cit. 2013-03-28]. Dostupné z: http://www.pamperedbiewers.com/pages/birobiewer.aspx PARIS, Y. a G. PARIS. History of the Biro: Yorkshire Terrier Breed History. Biro,Biewer a la Pom Pon,Yorkshire&Maltese [online]. 2009 [cit. 2013-03-28]. Dostupné z: http://wagg-n-tails.webs.com/historyofthebiro.htm PETRUSOVÁ, H. Dědičnost barev u psů. Angelic Paws [online]. 2010 [cit. 2013-04- 13]. Dostupné z: http://angelicpaws.webnode.cz/zajimave-clanky/ostaffbulicich/dedicnost-barev-u-psu/ PHILIPP, U., H. HAMANN, L. MECKLENBURG, S. NISHINO, E. MIGNOT, A.-R. GÜNZEL-APEL, S. M. SCHMUTZ a T. LEEB. Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute coat color in dogs. BMC Genetics. 2005, roč. 6, č. 1, s. 34-49. ISSN 14712156. DOI: 10.1186/1471-2156-6-34. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/1471-2156/6/34 PIELBERG, G., S. MIKKO, K. SANDBERG a L. ANDERSSON. Comparative linkage mapping of the Grey coat colour gene in horses. Animal Genetics. 2005, roč. 36, č. 5, s. 390-395. ISSN 02689146. DOI: 10.1111/j.1365-2052.2005.01334.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1365-2052.2005.01334.x PRIMROSE, S. B., R. M. TWYMAN a R. W. OLD. Principles of Gene Manipulation. 6. vyd. Boston: Blackwell Scientific, 2001, s. 8-25. ISBN 0-632-059540. 71

RIEDER, S., C. STRICKER, H. JOERG, R. DUMMER a G. STRANZINGER. A comparative genetic approach for the investigation of ageing grey horse melanoma. Journal of Animal Breeding and Genetics. 2000, roč. 117, č. 2, s. 73-82. ISSN 0931-2668. DOI: 10.1111/j.1439-0388.2000x.00245.x. Dostupné z: http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0388.2000x.00245.x RIEDER, S., S. TAOURIT, D. MARIAT, B. LANGLOIS a G. GUÉRIN. Mutations in the agouti (ASIP), the extension (MC1R), and the brown (TYRP1) loci and their association to coat color phenotypes in horses (Equus caballus). Mammalian Genome. 2001, roč. 12, č. 6, s. 450-455. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s003350020017. Dostupné z: http://www.springerlink.com/openurl.asp?genre=article ROTHSCHILD, M. F., P. S. VAN CLEAVE, K. L. GLENN, L. P. CARLSTROM a N. M. ELLINWOOD. Association of MITF with white spotting in Beagle crosses and Newfoundland dogs. Animal Genetics. 2006, roč. 37, č. 6, s. 606-607. ISSN 0268-9146. DOI: 10.1111/j.1365-2052.2006.01534.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1365-2052.2006.01534.x SAFRA, N., R. H. SCHAIBLE a D. L. BANNASCH. Linkage analysis with an interbreed backcross maps Dalmatian hyperuricosuria to CFA03. Mammalian Genome. 2006, roč. 17, č. 4, s. 340-345. ISSN 0938-8990. DOI: 10.1007/s00335-005- 0137-5. Dostupné z: http://www.springerlink.com/index/10.1007/s00335-005-0137-5 SANDELIN, B. Biewer Terrier Club of America, Inc.: Canine Genetics 101. [online]. 2007 [cit. 2013-04-15]. Dostupné z: http://www.biewerbtca.com/caninegenetics101.html SEITZ, J. J., S. M. SCHMUTZ, T. D. THUE a F. C. BUCHANAN. A missense mutation in the bovine MGF gene is associated with the roan phenotype in Belgian Blue and Shorthorn cattle. Mammalian Genome. 1999, č. 10, 710 712. Dostupné z: http://download.springer.com/static/pdf/410/art%253a10.1007%252fs00335990107 6.pdf?auth66=1365194740_259060b19b4b58a994cf61ec786bb81b&ext=.pdf SCHMUTZ, S. M., J. S. MORKER, T. G. BERRYRE, K. M. CHRISTISON a G. DOLF. An SNP is used to map MC1R to dog chromosome 5. Animal Genetics. 2001, č. 72

32, 43-44. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2052.2001.0647d.pp.x/pdf SCHMUTZ, S. M., T. G. BERRYERE a A. D. GOLDFINCH. TYRP1 and MC1R genotypes and their effects on coat color in dogs.mammalian Genome. 2002, č. 13, 380-387. Dostupné z: http://download.springer.com/static/pdf/205/art%253a10.1007%252fs00335-001- 2147-2.pdf?auth66=1364563304_8ae9de3b506664b689c0b0aeec6f036c&ext=.pdf SCHMUTZ, S. M. MC1R Studies in Dogs With Melanistic Mask or Brindle Patterns. Journal of Heredity. 2003, roč. 94, č. 1, s. 69-73. ISSN 14718505. DOI: 10.1093/jhered/esg014. Dostupné z: http://jhered.oupjournals.org/cgi/doi/10.1093/jhered/esg014 SCHMUTZ, S. M. a T. G. BERRYERE. Genes affecting coat colour and pattern in domestic dogs: a review. Animal Genetics. 2007, roč. 38, č. 6, s. 539-549. ISSN 02689146. DOI: 10.1111/j.1365-2052.2007.01664.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1365-2052.2007.01664.x SCHMUTZ, S. M. a Y. MELEKHOVETS. Coat color DNA testing in dogs: Theory meets practice. Molecular and Cellular Probes. 2012, roč. 26, č. 6, s. 238-242. ISSN 08908508. DOI: 10.1016/j.mcp.2012.03.009. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/s0890850812000473 SNUSTAD, D. a M. J. SIMMONS. Genetika. 5. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2009, 871 s. ISBN 978-802-1048-522. SPONENBERG, D. P. Inheritance of the harlequin color in Great Dane dogs. The Journal of Heredity. 1985, č. 76, s. 224-225. Dostupné z: http://cinnamonssirius.fr/sponenberg-inheritance%20harl%20color.pdf ŠEBKOVÁ, N. a J. DYTRYCHOVÁ. Jorkšírský teriér. Vyd. 1. Rudná u Prahy: Robimaus, 2009, 70 s. Abeceda chovatele. ISBN 978-80-87293-05-8. ŠMARDA, J. Metody molekulární biologie. 1. vyd., 2. dotisk. Brno: Masarykova univerzita, 2010, 188 s. ISBN 978-80-210-3841-7. 73

ŠUBRT, J. a J. HROUZ. Obecná zootechnika. 3. nezm. vyd. Brno: Mendelova univerzita, 2011, 204 s. ISBN 978-80-7375-511-9. TEMPLETON, J. W., A. P. STEWART a W. S. FLETCHER. Coat colour genetics in the Labrador Retriever.The Journal of Heredity. 1977, č. 68, s. 134-136. Dostupné z: http://jhered.oxfordjournals.org/content/68/2/134.full.pdf UDONO, T., K. YASUMOTO, K. TAKEDA, S. AMAE, K. WATANABE, SAITO, N. FUSE, M. TACHIBANA, K. TAKAHASHI a M. TAMAI. Structural organization of the human microphthalmia-associated transcription factor gene containing four alternative promoters. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 2000, č. 1491, 205 219. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0167478100000518 VRIELING, H., D. M. J. DUHL, S. E. MILLAR, K. A. MILLER a G. S. BARSH. Differences in dorsal and ventral pigmentation result from regional expression of the mouse agouti gene. Proc. Natd. Acad. Sci. 1994, č. 91, s. 5667-5671. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc44057/pdf/pnas01134-0458.pdf WELLE, M., U. PHILIPP, S. RUFENACHT, P. ROOSJE, M. SCHARFENSTEIN, E. SCHUTZ, B. BRENIG, M. LINEK, L. MECKLENBURG, P. GREST, M. DROGEMULLER, B. HAASE, T. LEEB a C. DROGEMULLER. MLPH Genotype- Melanin Phenotype Correlation in Dilute Dogs. Journal of Heredity. 2009, roč. 100, Supplement 1, S75-S79. ISSN 0022-1503. DOI: 10.1093/jhered/esp010. Dostupné z: http://jhered.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.1093/jhered/esp010 WERTH, L. A., G. A. HAWKINS, A. EGGEN, E. PETIT, C. ELDUQUE, B. KREIGESMANN a M. D. BISHOP. Rapid communication: melanocyte stimulating hormone receptor (MC1R) maps to bovine chromosome 18.Journal of Animal Science. 1996, č. 74, s. 262. Dostupné z: http://www.journalofanimalscience.org/content/74/1/262.long WINGE, O. Inheritance in Dogs with Special Reference to Hunting Breeds. New York: Comstock Pub. Associates, 1950. ISBN 08-014-0458-4. YORKIE POWER. Parti Color Yorkies [online]. 2008, 2013 [cit. 2013-03-27]. Dostupné z: http://www.yorkiepower.com/index.html 74

ZAHRÁDKOVÁ, R. Masný skot: od A do Z. 1. vyd. Praha: Český svaz chovatelů masného skotu, 2009, 397 s. ISBN 978-80-254-4229-6. ZDARSKY, E., J. FAVOR a J. JACKSON. The Molecular Basis of brown, an Old Mouse Mutation, and of an Induced Revertant to Wild Type. Genetics. 1990, č. 126, s. 443-449. Dostupné z: http://www.genetics.org/content/126/2/443.long 75

8 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Geny a lokusy s vlivem na pigmentaci srsti u psů... 24 Tab. 2 Přehled předpokládaných genotypů barevných variant... 41 Tab. 3 Genomic DNA Mini Kit Tissue protokol... 44 Tab. 4 Složení a koncentrace PCR reakční směsi... 46 Tab. 5 Primery použité pro PCR u MC1R... 46 Tab. 6 Teplotní podmínky amplifikace MC1R... 46 Tab. 7 Složení restrikční směsi MC1R... 47 Tab. 8 Složení a koncentrace PCR reakční směsi MC1R... 48 Tab. 9 Primery použité pro 5. exon TYRP1... 48 Tab. 10 Teplotní podmínky amplifikace 5. exonu TYRP1... 48 Tab. 11 Složení restrikční směsi pro mutace Q331X a 345delP... 49 Tab. 12 Složení a koncentrace PCR reakční směsi... 49 Tab. 13 Primery použité pro 2. exon genu TYRP1... 50 Tab. 14 Teplotní podmínky amplifikace 2. exonu TYRP1... 50 Tab. 15 Složení restrikční směsi pro mutaci S41C... 51 Tab. 16 Výsledky testování MC1R a TYRP1... 60 Tab. 17 Potomci matky Chanell a otce Falca... 62 Tab. 18 Potomci matky Angelíny a otce Falca... 62 Tab. 19 Potomek Emilka... 63 Tab. 20 Psi s jednostranně ověřeným přenosem zbarvení... 63 76

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Jorkšírský teriér... 13 Obr. 2 Biewer jorkšírský teriér... 14 Obr. 3 Golddust... 15 Obr. 4 Čokoládové zbarvení... 17 Obr. 5 Biro biewer... 18 Obr. 6 Golden jorkšírský teriér... 19 Obr. 7 Ocean pearl, white ocean pearl... 20 Obr. 8 Blue diamond golddust, blue merle gepard, brown merle... 21 Obr. 9 Idiogram psa domácího... 22 Obr. 10 Příklad zbarvení MC1R... 26 Obr. 11 Příklad zbarvení TYRP1... 27 Obr. 12 Příklad zbarvení ASIP... 29 Obr. 13 Příklad zbarvení CBD103... 30 Obr. 14 Příklad zbarvení MLPH... 32 Obr. 15 Bílé zbarvení... 33 Obr. 16 Příklad zbarvení MITF... 34 Obr. 17 Merle zbarvení... 36 Obr. 18 Zbarvení harlekýn... 36 Obr. 19 Tečkování... 37 Obr. 20 Roan zbarvení... 38 Obr. 21 Výsledek PCR reakce MC1R... 52 Obr. 22 Výsledek PCR-RFLP MC1R... 52 Obr. 23 Výsledek PCR-RFLP MC1R... 53 Obr. 24 Výsledek PCR-RFLP MC1R... 53 Obr. 25 Výsledek PCR-RFLP MC1R... 53 77

Obr. 26 Soubor sledovaných světlých psů... 54 Obr. 27 Štěpení enzymem AciI (Q331X)... 56 Obr. 28 Štěpení enzymem AciI (Q331X)... 56 Obr. 29 Štěpení enzymem MnlI (345delP)... 56 Obr. 30 Štěpení enzymem HinfI (S41C)... 56 Obr. 31 Soubor sledovaných hnědých psů... 57 Obr. 32 Štěňata Chanelly a Falca... 62 78

PŘÍLOHY Barevní jorkšírští teriéři testovaní pro geny MC1R (lokus E) a TYRP1 (lokus B). 1. Biro carrier Beatrice (PB19) 2. Biro carrier Belis (PB21) genotyp: E/E, b s /b s genotyp: E/E, b s /b s 3. Biewer Ailin (PB5) 4. Biewer Angelína (AI1) genotyp: B/b s genotyp: E/E, B/B 5. Bieweři Bayles (AL8) a Carlita (AL7) 6. Biewer Buchta 1 (AJ6) genotyp obou: E/E, B/B genotyp E/E, B/B

7. Biewer Falco (AL2) 8. genotyp E/E, B/b s Bieweři Jamajka (PB13) genotyp: E/E, B/B; Koffe (PB10) genotyp: E/e, B/b s a Janina (PB12) genotyp: E/E, B/B 9. Black and tan Gina (PB17) 10. Čokoládová Tofife (AK1) genotyp: E/E, B/B genotyp: E/E, b s /b s 11. Biro carrier štěňata 12. Čokoládová Viviana (PB4) všechny genotyp: E/E, b s /b s genotyp: E/E, b s /b s

13. Golddust Baroness (PB7) 14. Golddust O Collin (PB8) genotyp: E/E, B/B genotyp: E/e, B/B 15. Golden Chanell (AL1) 16. Golden Collete (PB3) genotyp: E/E, B/B genotyp: E/E, B/b s 17. Zleva ocean pearl (AL4) genotyp: E/E, B/b s, biewer (AL3) a zprava dva psi zbarvení white ocean pearl (AL5, AL6) všichni genotyp: E/E, B/B