PRODUKCE HYPERICINU V TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH HYPERICUM PERFORATUM

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOSIE Pavel Sazama PRODUKCE HYPERICINU V TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH HYPERICUM PERFORATUM (DIPLOMOVÁ PRÁCE) Datum odevzdání: 15.5.2016 Datum obhajoby: 1.6.2016 Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Jan Martin, Ph.D. Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jiřina Spilková, CSc. Oponent diplomové práce: PharmDr. Marie Kašparová, Ph.D.

Prohlašuji, že jsem tuto práci vytvořil samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce. Veškerá literatura a další informační zdroje jsou v práci řádně citovány a uvedeny v seznamu použité literatury. Práce nebyla využita k získání jiného, nebo stejného titulu (Mgr.). Pavel Sazama [2]

Za odborné vedení, cenné rady a přátelskou atmosféru při vypracování této diplomové práce děkuji PharmDr. Janu Martinovi Ph.D. a celému kolektivu katedry farmakognosie. [3]

Obsah Obsah...4 1. ÚVOD...6 2. CÍL PRÁCE...7 3. TEORETICKÁ ČÁST...8 3.1. Hypericum perforatum, Hypericaceae - Třezalka tečkovaná...8 3.1.1Botanický popis...8 3.1.2Výskyt...8 3.1.3Droga...8 3.1.4Obsahové látky...8 3.1.5Biologické účinky a užití drogy...10 3.1.6Lékové interakce a nežádoucí účinky drogy...12 3.2. Biosyntéza...14 3.2.1. Biosyntéza dianthronů...14 3.2.2. Biosyntéza flavonoidů...16 3.3. Rostlinné explantátové kultury...18 3.3.1. Obecná charakteristika...18 3.3.2. Druhy rostlinných explantátových kultur...19 3.3.3. Odvození kultury z matečné rostliny...19 3.3.4. Udržování kultury a faktory, ovlivňující kultivaci...19 3.3.5. Možnosti ovlivnění produkce sekundárních metabolitů v in vitro kulturách...21 3.4. Vybrané prekurzory naftodianthronů a flavonoidů...24 4. Experimentální část...25 4.1. Použité přístroje...25 4.2. Použité chemikálie...25 4.3. Kultivace explantátové kultury Hypericum perforatum...26 4.3.1. Původ kultury a odvození suspenzní kultury...26 4.3.2. Pasážování a kultivační půda...26 4.3.3. Podmínky kultivace...28 4.4. Experimenty s jednotlivými prekurzory dianthronů a flavonoidů...28 4.4.1. Přidání octanu draselného...28 4.4.2. Přidání octanu draselného a kyseliny skořicové...28 4.4.3. Přidání tyrosinu...29 4.4.4. Přidání kyseliny šikimové...29 [4]

4.4.5. Přidání skořicanu sodného...29 4.5. Odběr vzorků, jejich sušení a extrakce...29 4.6. HPLC analýza...30 4.6.1. Validace analytické metody HPLC...33 4.7. Statistické hodnocení výsledků...34 5. Výsledky...36 6. Diskuze...41 7. Závěr...44 8. Literatura...45 9. Abstrakt...48 10. Abstract...49 [5]

1. ÚVOD Rostliny jsou hlavním zdrojem potravy a získávají se z nich suroviny pro výrobu mnoha věcí. Lidé také odjakživa používali rostliny v léčitelství. Dnes víme, že hlavním důvodem působení rostlin na náš organismus je přítomnost sekundárních metabolitů. Rostlinná říše čítá asi 1 milion druhů a díky své velké rozmanitosti nám proto poskytuje nepřeberné množství látek, z nichž mnohé ještě neznáme. (1) Základním způsobem získávání látek rostlinného původu je jejich extrakce z matečné rostliny. Tento způsob má však svoje nevýhody. Mezi ty patří například velká proměnlivost obsahu látek v matečné rostlině v závislosti na počasí, půdě, přísunu vody a dalších podmínkách. Některé rostliny navíc rostou velmi pomalu, nebo obsahují jen malé množství žádaných látek a požadavky na produkci jejich sekundárních metabolitů jsou velmi vysoké. (2, 3) Další možností, jak tyto látky získat, je jejich totální chemická syntéza. Zde se však můžeme setkat se značnými úskalími, protože syntéza složitějších přírodních látek je často buď neekonomická, nebo zatím nemožná. (4) Další alternativou získávání látek rostlinného původu je biotechnologie, kam právě řadíme explantátové kultury rostlin. Ta se využívá k získávání právě těch látek, které nemůžeme získat přímo z rostlin, nebo chemickou syntézou. Možná nejznámějším příkladem takto získávané látky je taxol, látka užívaná jako cytostatikum. (3) Mezi výhody získávání látek z explantátových kultur patří kontinuální produkce nezávislá na klimatických podmínkách, častější sklizeň (explantáty rostou většinou rychleji, než matečná rostlina), možnost získat látky rostlin obtížně pěstovatelných a vzácných, možnost navýšení produkce upravením kultivačních podmínek a kultivačního média atd. (5) Využití explantátových kultur rostlin však přesahuje pouhé získávání sekundárních metabolitů rostlin. Explantátové kultury nám umožňují lepší výzkum biochemických drah rostlin, zlepšují možnosti šlechtitelství a podobně. (5) [6]

2. CÍL PRÁCE 1. Seznámení se s metodikou a zvládnutí kultivace explantátových kultur Hypericum perforatum 2. Stanovení vlivu vybraných prekurzorů na produkci hypericinu explantátovou kulturou Hypericum perforatum 3. Porovnání vlivu přidaných prekurzorů na produkci hypericinu a flavonoidů explantátovou kulturou Hypericum perforatum 4. Zvádnutí metodiky HPLC analýzy hypericinu, hyperosidu a quercitrinu [7]

3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1. Hypericum perforatum, Hypericaceae - Třezalka tečkovaná 3.1.1 Botanický popis Podzemní část rostliny tvoří vytrvalý oddenek, který nad zemí přechází v oblou, tuhou lodyhu se dvěma podélnými lištami. Listy jsou průsvitně tečkované (siličné nádržky), malé, přisedlé, vejčité, celokrajné, vstřícně postavené a z jejich úžlabí vyrůstají listnaté větvičky. Květy jsou jasně žluté, velké až 3 cm, mají kopinaté kališní lístky a pět nesouměrných korunních lístků, které mají po jedné straně zubatý okraj. Květ má tři svazky tyčinek, kterých je celkově 50-100. Květenstvím je vrcholičnatá složená lata s listeny. Na listech a korunních i kališních plátcích květů jsou černé tečky, tvořené žlázkami, které obsahují červené barvivo. Celá rostlina je vysoká až 60 cm. Kvete v červenci a srpnu. Plodem je třípouzdrá tobolka, obsahující velký počet malých hnědých semen.(6, 7, 8) 3.1.2 Výskyt Třezalka tečkovaná vyžaduje suchá stanoviště. Roste hojně na loukách, slunných stráních a lesních lemech, téměř ve všech nadmořských výškách. Vyskytuje se hojně v Evropě, Asii i Severní Americe. (7, 8) 3.1.3 Droga Drogou jsou celé, nebo řezané usušené kvetoucí vrcholky druhu Hypericum perforatum L. (Hyperici herba), sbírané od června do září, kdy třezalka kvete. Nemají obsahovat plody. Nať se suší buď ve stínu, nebo v sušárně. Teplota při sušení natě v sušárně nesmí přesáhnout 35 C a výsledná droga má rezavo-zelenou barvu, je bez pachu a má trpce nahořklou chuť. Obsahuje nejméně 0,08% hypericinu (6, 9) 3.1.4 Obsahové látky Obsah a vzájemný poměr obsahových látek kolísá podle původu drogy. Mezi nejdůležitější skupiny obsahových látek drogy i rostliny patří naftodianthrony, flavonoidní glykosidy, derivát fluoroglucinolu hyperforin, třísloviny a silice. Z naftodianthronů jsou zde zastoupeny hypericin a pseudohypericin (obsah asi 1%) a jejich předstupně protohypericin, proto-pseudohypericin a isohypericin. Obsah hypericinu a pseudohypericinu v květech je asi 0,1-0,2%. [8]

Obrázek č. 1: Obsahové látky Vzorce: Hypericin Pseudohypericin Hyperosid Hyperforin [9]

Katechin (strukturální základ katechinových tříslovin) Obsažen je také meziprodukt biosyntézy dianthronů frangulaemodin-anthron, emodinanthron a další. Tyto látky jsou příčinou červeného zabarvení třezalkových extraktů. (10, 11, 12) Z flavonoidních glykosidů jsou zastoupeny hyperosid, kvercetin, rutin, kvercitrin a další. Obsah katechinových tříslovin významně klesá s dobou skladování. Silice je v droze obsažena asi z 0,2-1%. Z dalších obsahových látek jsou zastoupeny například estery glycerolu, cholesterolu, cukry a cholin.(10, 13) 3.1.5 Biologické účinky a užití drogy Droga se užívá vnitřně, jako sedativum, antidepresivum, diuretikum a mírné antiflogistikum, také zlepšuje trávení. Zevně se používá jako adstringens, k hojení popálenin a ran.(13, 14) K vnitřnímu užití se z třezalky připravuje nálev, nebo extrakt. Extrakt se dle ČL 2009 standardizuje na obsah 0,1 až 0,3% hypericinu, nejméně 6% flavonoidů a maximálně 6% hyperforinu. (9, 13, 14) Sedativní a antidepresivní účinek drogy se v posledních studiích připisuje hlavně hyperforinu, tento účinek je ale prokázán i u hypericinu a některých flavonoidů (amenthoflavon, rutin, kvercetin, luteolin, kampferol). Mechanismus tohoto účinku u hyperforinu je snížení reuptake serotoninu, dopaminu a noradrenalinu na nervových synapsích. Mechanismus účinku u hypericinu je snížení [10]

reuptake dopaminu. Hypericin také in vitro inhibuje monoaminooxidasu A (MAO-A), pro tento účinek ale nedosahuje při podání člověku dostatečnou koncentraci v CNS. Flavonoidy způsobují taktéž inhibici MAO-A a katechol-o-methyltransferázy. Některé flavonoidy se navíc váží na GABA receptor a působí zde podobným mechanismem, jako benzodiazepiny. Prokázaný je antidepresivní účinek ethanolického extraktu z třezalky, který je takto účinný v dávce 500-800mg a vykazuje pouze relativně mírný výskyt nežádoucích účinků. Účinnost v léčbě deprese je však nižší, než u klasických antidepresiv (SSRI, TCA). Obsah hyperforinu v extraktu je silně ovlivněn skladováním, protože tato látka je na světle a vzduchu nestabilní. Extrakt se užívá k léčbě mírné až středně závažné deprese.(11, 14, 15) Z rostliny se dále připravuje olejový výtažek, který se dá použít jak zevně, tak i vnitřně. Výtažek se připravuje macerací 100 g čerstvě rozřezané kvetoucí natě ve 250 g lněného, nebo olivového oleje.(13) U tohoto výtažku byl při pokusech na izolovaném střevě morčete prokázán spasmolytický efekt, který je závislý na koncentraci hyperforinu a některých flavonoidů.(12, 15) Třezalka a zvláště její olejový výtažek vykazují antiseptické účinky a pozitivní vliv na hojení ran. Extrakt dokonce vykazuje účinek proti MRSA (meticilin rezistentní Staphylococcus aureus). Mezi látkami, které způsobují tento efekt, dominují hypericin a hyperforin. Hypericin inhibuje proteinkinasu C a reverzní transkriptázu a tím působí proti retrovirovým infekcím, dále působí slabě protizánětlivě. Hyperforin inhibuje G+ bakterie. Protimikrobní a protizánětlivou aktivitu vykazují také některé flavonoidy (amenthoflavon, hyperosid) a proanthocyanidiny. Olejový výtažek byl v několika studiích použit k léčbě kožních a vaginálních infekcí a byl signifikantně lepší než placebo. Byly také zkoušeny extrakty s různými vyluhovadly a ukázalo se, že extrakty organickými rozpouštědly mají širší spektrum antibakteriálního účinku, než vodné. K lepšímu hojení popálenin a ran přispívá hemostatický a adstringentní účinek, způsobený vysokým obsahem tříslovin. Ve studii srovnávající hojení jizev u pacientek po porodu císařským řezem byl olejový výtažek z třezalky tečkované a měsíčku lékařského signifikantně účinnější než placebo (olej z pšeničných klíčků). Tento účinek je dán zvýšením produkce kolagenu fibroblasty v ráně. (12, 16) [11]

U několika obsahových látek byla také testována cytotoxicita a potenciál k léčbě rakoviny. Hypericin, jakožto významný fotosenzitizér má potenciál k využití při fotodynamické terapii nádorových onemocnění (PDT). Jeden z mechanismů působení hypericinu při této terapii je poškození mitochondrií, čímž se do cytosolu buňky dostane cytochrom C, který následně aktivuje kaspázy, které spustí apoptózu buněk.(17) Ve studii z roku 2014, kde testovali cytotoxickou aktivitu hypericinu in vitro na kulturách buněk lidského ovariálního nádoru a buněk promyeloidní leukémie, byl prokázán aditivní cytotoxický efekt této látky v kombinaci s methotrexátem a cisplatinou. Také se prokázalo, že hypericin snižuje rezistenci nádorových buněk na cytostatickou léčbu.(18) Další látkou, která má potenciál v protinádorové léčbě je hyperforin. Vykazuje antiproliferativní efekt na nádorové buňky a působí synergisticky s hypericinem.(19) 3.1.6 Lékové interakce a nežádoucí účinky drogy Farmakokinetické interakce Třezalka významně působí na metabolismus mnoha léčiv. Indukuje jaterní mikrosomální enzymy cytochromu P450, izoformy CYP3A4, CYP2C9 a CYP1A2. Indukcí těchto enzymů se zrychluje metabolizace a potažmo se tím snižuje účinek některých léčiv. Nejvýznamněji se jeví interakce na CYP3A4, přes který se metabolizuje více než 73 léků. Jedná se zde i o léčiva s úzkým terapeutickým indexem, jako je například warfarin, digoxin, theofylin a cyklosporin. Významná je také zvýšená metabolizace ethinylestradiolu a následná neúčinnost perorálních kontraceptiv. (20, 21) Důležitá je také indukce P-glykoproteinu, efluxního transportéru, který zabraňuje absorbci léčiv už ve střevě a tím snižuje jejich biodostupnost. Tímto mechanizmem interaguje třezalka například s digoxinem, amiodaronem a doxorubicinem.(20, 21) [12]

Farmakodynamické interakce Třezalka zvyšuje vyplavování serotoninu na synapsích, proto může v kombinaci s některými léčivy, které taktéž zvyšují hladinu serotoninu vyvolat serotoninový syndrom. Jedná se především o antidepresiva ze skupiny SSRI (inhibitory reuptake serotoninu) a triptany (agonisté serotoninových receptorů). (20, 21) Nežádoucí účinky Mezi nežádoucí účinky Třezalky a jejích extraktů patří fototoxicita hypericinu. Mechanismus této toxicity je produkce kyslíkových radikálů, které vznikají po ozáření směsi hemoglobinu a hypericinu světlem. Tyto radikály poškozují hemoglobin a způsobují rozpad erytrocytů. Tato toxická reakce se navenek projevuje zčervenáním, svěděním kůže a otoky. Zajímavostí je, že pseudohypericin, látka nejvíce strukturálně blízká hypericinu, tuto vlastnost nevykazuje. Některé současné výzkumy mají za cíl využít tuto vlastnost hypericinu k fotosenzitivizaci při fotodynamické terapii rakoviny. (12) [13]

3.2. Biosyntéza 3.2.1. Biosyntéza dianthronů Dianthrony vznikají dimerizací anthrachinonů. Biosyntéza anthrachinonů vychází z acetátové (polyketidické) biosyntetické cesty, nebo z kombinace šikimátové a mevalonátové biosyntetické cesty. Z acetylkoenzymu A vychází polyketidová biosyntetická cesta. Z jedné molekuly acetylkoenzymu A (AcCoA) vzniká postupným připojením sedmi molekul malonylkoenzymu A (MaCoa) okta-β-ketoacyl-coa. Z něj pak postupně cyklizací (aldolovou kondenzací) vzniká tricyklický emodinanthron, který je výchozí látkou pro další syntézu dianthronů.(7, 18) Obrázek č. 2: Biosyntéza emodinanthronu a emodinu [14]

Ze vzniklého emodinanthronu pak dimerizací a oxidací vznikají dianthrony hypericin a pseudohypericin.(22, 23) Obrázek č. 3: Dimerizace emodinanthronu a vznik hypericinu Další možnou cestou vzniku anthrachinonů v rostlině je jejich syntéza z erythroso-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu přes kyselinu šikimovou. Touto cestou vzniká například alizarin, obsahová látka rostlin rodu Rubia spp., pro biosyntézu hypericinu však tato cesta není významná. (23) [15]

3.2.2. Biosyntéza flavonoidů Do skupiny flavonoidů patří všechny polyfenolické sloučeniny se zabudovaným benzo-γ-pyranovým skeletem, jedná se tedy o více než 4000 různých sloučenin. Výchozími látkami pro jejich vznik jsou erythroso-4-fosfát a fosfoenolpyruvát, ze kterých vzniká kyselina šikimová. Kyselina šikimová je prekurzorem pro vznik některých aminokyselin (tyrosin, fenylalanin). Z fenylalaninu pak vzniká kyselina skořicová a z ní p-kumaroyl-coa. Ten je následně (podobně, jako při syntéze anthrachinonů AcCoA) prodloužen o tři molekuly malonyl-coa a pomocí enzymu chalkonsyntázy zacyklen. Cyklizace je, stejně jako u anthrachinonů, aldolová kondenzace. Z těchto chalkonů (např. naringenin-chalkon, isoliquirigenin) už se pak přímo odvozují jednotlivé druhy flavonoidů. (24, 25, 26) Obrázek č. 4: Syntéza kys. skořicové z kys. šikimové [16]

Obrázek č. 5: Syntéza flavanonu z p-kumarylkoenzymu A a některé další modifikace struktury (flavonol, flavon) Struktura se může ještě dále měnit. Například redukcí dvojné vazby a oxoskupiny na pyranovém kruhu flavonolů na alkoholickou vznikají flavandioly atd. Oxidativní dimerizací flavonů a flavonolů vznikají biflavonoidy. Například amenthoflavon, který se podílí na antimikrobiální aktivitě třezalky, vzniká dimerizací apigeninu. (24, 25) [17]

3.3. Rostlinné explantátové kultury 3.3.1. Obecná charakteristika Explantátovými kulturami rostlin rozumíme kultivaci jenotlivých buněk, pletiv, nebo celých rostlinných orgánů, odebraných z intaktní rostliny, nebo z již existující kultury in vitro. Děje se tak ve sterilním prostředí, při použití specifických živných půd a za definovaných podmínek. (5) To, že se dá z části rostliny odvodit explantátová kultura a naopak z jedné nediferenciované buňky vypěstovat zpětně rostlinu, umožňuje totipotence rostlinných buněk. Totipotence znamená, že každá rostlinná buňka obsahuje veškerý genetický materiál v takové formě, že se dá využít k regeneraci celé rostliny. Proto se také mohou buňky v kultuře vegetativně množit a je možné kulturu téměř neomezeně dlouho (při dostatečném přísunu nezbytných látek a dostatečně častém přesazování) udržovat v aktivním stavu. (5) Explantátové kultury se pak využívají například k výzkumu metabolismu rostlin, ke šlechtění a genovému inženýrství, k vegetativnímu rozmnožování rostlin, a především k produkci farmaceuticky významných rostlinných produktů. Výhodou produkce farmaceuticky významných látek explantátovými kulturami je možnost v relativně krátké době a na malém prostoru vypěstovat velké množství buněk, u kterých je navíc možné navyšovat produkci požadovaných látek přidáním jejich prekurzorů, optimalizací složení živné půdy a podobně. Proto se tato možnost v produkci léčivých látek užívá v případech, kdy matečná rostlina roste pomalu, je náročná na podmínky pěstování a podobně. Typická je produkce taxolu rostlinnými kulturami rodu Taxus. Další výhody produkce léčivých látek explantátovými kulturami jsou například stále stejná kvalita, homogenita a čistota produktů, nezávisle na klimatických podmínkách a ročním období, získávání látek, které matečná rostlina přirozeně neprodukuje a využití kultur k biotransformaci dodaných látek. (5, 3) Nevýhodami při využití explantátů k produkci léčivých látek je vysoká energetická náročnost, nutnost aseptických podmínek, nároky na prostory, dále nestabilita kultur, jejich genetická labilita atd. [18]

3.3.2. Druhy rostlinných explantátových kultur Dělení dle morfologické stavby kultury: - Orgánové kultury rostlinné orgány, nebo jejich části, při zachování jejich původní stavby a funkce, buňky jsou diferencované. Například kultury listů, kořenů atd. - Tkáňové kultury nediferencované buňky, tvořící soudržné pletivo (tzv. kalus). - Suspenzní kultury suspenze jednotlivých nediferencovaných buněk a malých buněčných shluků v živném médiu. - Protoplastové kultury jednotlivé nediferencované buňky, zbavené stěn, obalené pouze cytoplasmatickou membránou. Orgánové kultury a tkáňové kultury se většinou kultivují na pevném podkladě (agarový gel, papírový můstek), nasyceném živnou půdou. Suspenzní a protoplastové kultury se kultivují přímo v tekuté živné půdě. - Buněčné kultury jednotlivé volné buňky, kultivované v tekuté nebo polotuhé živné půdě, nebo na pevném nosiči. (33, 34) 3.3.3. Odvození kultury z matečné rostliny Pro založení kultury je nutné nejprve vybrat vhodnou část rostliny, která se musí vypěstovat za aseptických podmínek, nebo povrchově vysterilizovat. Tato část se pak inkubuje na tuhé živné půdě při teplotě 23-28 C. Z hojivého pletiva na povrchu odebrané části se pak za určitou dobu vyvine primární kalus, ten se odebere a dále kultivuje. Při pravidelném pasážování je toto pletivo schopné trvale proliferovat. Rozdrobněním a přenesením kalusu do tekuté živné půdy a následnou kultivací za použití třepačky můžeme odvodit suspenzní kulturu. (5) 3.3.4. Udržování kultury a faktory, ovlivňující kultivaci Základním předpokladem pro udržení kultury je její pravidelné pasážování do čerstvé živné půdy za aseptických podmínek, jinak dojde vlivem nedostatku živin k jejímu odumření. U suspenzních kultur je nezbytné neustálé promíchávání na třepačce, z důvodu dodávky kyslíku buňkám v médiu. Důležitá je jeho správná [19]

rychlost. Při pomalém promíchávání se ke kultuře nedostává dostatek kyslíku, při příliš rychlém míchání může dojít k destrukci buněk. Provzdušňování půdy může být také zajištěno rotováním nádob, nebo zavedením proudu sterilního vzduchu do kultury. Dále jsou důležité fyzikální podmínky (světlo, teplota, vlhkost vzduchu). Živné půdy a jejich složení: Živná půda je velice důležitá, neboť musí dodat kultuře dostatek všech látek, potřebných k jejímu růstu. Základní složky: - čištěná voda - makroelementy anorganické soli vápníku, sodíku, fosforu, dusíku, hořčíku, draslíku a síry - mikroelementy železo, kobalt, mangan, zinek, měď, bor, molybden - zdroj organického uhlíku jednoduché cukry, nejčastěji sacharóza - zdroj dusíku většinou aminokyseliny (glycin), hydrolyzované proteiny (kasein), nebo ve formě nitrátů a amonných solí - organické složky např. kasein, kvasnicový extrakt, kokosové mléko atd. - vitamíny kyselina listová, pyridoxin, thiamin, atd. - růstové regulátory (fytohormony) auxiny (např. kyselina indolyl-3-octová), gibereliny (např. kys. giberelová), cytokyniny (např. kinetin), kyselina abscisová, atd. - gelotvorné látky (pouze u orgánových a kalusových kultur) nejčastěji agar (kalus je možné uchytit i na můstku z filtračního papíru, který je namočený v živné půdě) Nejčastěji používaným médiem pro kultivaci explantátových kultur je půda dle Murashigeho a Skooga (MS půda) a její různé modifikace. Mezi dalšími častými půdami můžeme zmínit například médium dle Gamborga a médium dle Schenka a Hildebrandta. (29) [20]

Fyzikální faktory kultivace: Teplota se při kultivaci udržuje většinou mezi 20-25 C, když je potřeba, aby kultura rostla pomalu, nastaví se teplota nižší. Intenzita osvětlení se pohybuje mezi 2000 a 5000 luxy, často se během dne nastavuje interval osvětlení 12-16 hodin. (5) 3.3.5. Možnosti ovlivnění produkce sekundárních metabolitů v explantátových kulturách rostlin Obsah sekundárních metabolitů v explantátové kultuře bývá většinou nižší, než v matečné rostlině. Proto častým cílem výzkumu na těchto kulturách je zvýšení jejich produkce. Toho se dá docílit několika způsoby: 1) Změna kultivačních podmínek Požadovanou změnu v produkci lze někdy vyprovokovat pouhou změnou fyzikálních podmínek kultivace, například změnou intenzity osvětlení (přemístění kultur do temna, zkrácení, či prodloužení fotoperiody apod.). Změnu produkce lze docílit také pozměněním složení živného média. Příkladem může být navýšení množství některých mikroelementů. Například malým zvýšením obsahu zinečnatých solí se může zvýšit produkce proteinů (zinek je kofaktorem RNA polymerázy a dalších enzymů) apod. (29, 30, 31) 2) Biotransformace Při biotransformaci je využíván enzymový aparát kultury k upravování látek, které se v ní přirozeně nevyskytují. Některé z těchto reakcí (hydroxylace, glykozylace) nelze provést chemicky, ani mikrobiologicky. Předpokladem pro úspěšnou biotransformaci je však to, že kultura látky přidané do média vstřebá a také, že tyto látky reagují s enzymy podobně, jako látky rostlině vlastní. Typickým příkladem biotransformace je využití kultury Digitalis lanata k přeměně β-metyl-digitoxinu na β- metyldigoxin. Výhodou je, že kultura často produkuje jen jeden stereoizomer dané látky. (5, 30) [21]

3) Prekurzory Přidáním výchozích látek některé z biosyntetických cest (často jednoduché organické kyseliny, aminokyseliny, apod.) do živného média můžeme navýšit množství cílových produktů. Z průmyslového hlediska se toto vyplatí pouze, když přidávaný prekurzor je levnější a dostupnější, než cílová látka. Základním předpokladem pro úspěšnost tohoto postupu je to, aby se daný prekurzor dobře dostával z půdy do buněk kultury. Mezi často volené prekurzory patří amino-kyseliny, například přidáním fenylalaninu k suspenzní kultuře Salvia officinalis bylo docíleno navýšení obsahu kyseliny rozmarýnové. (30, 31) 4) Selekce buněčných kmenů s vyšší produktivitou požadovaných látek Počátek tohoto procesu je už v době, kdy se pro založení kultury vybere rostlina, která má nejvyšší obsah požadovaných látek. Z její části se pak získá kalusová kultura, ze které se pomocí různých metod vyberou k další kultivaci buněčné linie s nejvyšší produkcí požadovaných látek. Výběr je značně usnadněn, pokud požadovaná látka je barvivo, jinak se k detekci používá například HPLC analýza. K selekci se také často používá vystavení kultur působení různých antimetabolitů (fluorofenylalanin, 5-methyltryptofan, atd.). (30) 5) Elicitace Mnohé rostliny tvoří sekundární metabolity, jako obranné látky proti patogenům a různým stresovým podmínkám. Metoda elicitace tedy vychází z předpokladu, že buněčná kultura bude reagovat obdobně. Elicitor tedy působí jako stresový katalyzátor biosyntézy. Jako stresory se často používají například soli těžkých kovů, peroxid vodíku, či různé organické sloučeniny. Výhodou elicitoru je to, že ke stimulaci biosyntézy často stačí i jeho velmi malá koncentrace v kultuře. (30, 32) 6) Permeabilizace Přidané prekurzory a další látky, které mají ovlivnit metabolismus kultury, se často nedostanou do buněk, nebo do organel, které je mají zpracovávat. Propustnost buněčné stěny a membrán organel se dá ovlivnit přidáním některých vhodných látek do média. V praxi se k tomuto účelu používají například některá [22]

organická rozpouštědla (dimethylsulfoxid, isopropanol) a polysacharidy (chitosan). (30) 7) Genetická manipulace Spočívá v izolaci genetické informace, jejím vhodném upravení a následném vpravení zpět do buňky například pomocí virových vektorů. Toho se využívá k získání zemědělsky využívaných rostlin s výhodnějšími vlastnostmi, ale geneticky upravené explantátové kultury se využívají i k produkci látek pro rostlinu cizích. Příkladem můžou být rostlinné explantátové kultury, produkující lidské monoklonální protilátky. Nejčastěji používanými pro tyto účely jsou kultury rodu Nicotiana tabacum. (30, 5, 33) 8) Imobilizace Jednotlivé buňky, organely, nebo enzymy jsou zde přichyceny k polymerové matrici, což napodobuje přirozené uspořádání buněk v pletivu. Částice matrice s buňkami jsou promývány roztokem živného média. Díky této zvýšené organizovanosti kultury se někdy docílí vyšší produkce sekundárních metabolitů oproti suspenzním kulturám. Díky vyšší dostupnosti živné půdy je také produkce sekundárních metabolitů většinou lepší než v kalusové kultuře. Jako matrice se může použít například gel alginátu vápenatého (nejčastější), želatiny, agaru, nebo polyakrylamidu. Často se také jako nosič používá polyuretanová pěna. (30, 34) [23]

3.4. Vybrané prekurzory naftodianthronů a flavonoidů Acetát Acetylkoenzym A představuje výchozí látku jak biosyntézy naftodianthronů, tak i flavonoidů. Z acetátu a malonátu postupně vzniká základní struktura emodinanthron, jejíž dimerizací vznikají následně hypericin a pseudohypericin. U biosyntézy flavonoidů může být použita spolu s malonátem k prodlužování řetězce na p-kumarylkoenzymu A, které je následováno zacyklením tohoto řetězce a vznikem chalkonů. (23) Kyselina šikimová Vzniká u rostlin z erythrózy a fosfoenolpyruvátu a je základním prekurzorem syntézy flavonoidů a aminokyselin s aromatickým kruhem. U některých druhů z ní však vznikají i anthrachinony (např. Rubia spp). (25, 35) Kyselina skořicová Vzniká z fenylalaninu a je meziproduktem v biosyntéze flavonoidů. Skořican sodný Organické kyseliny o větší molekulové hmotnosti mají často odlišnou biodostupnost oproti svým solím. Důvodem bývá rozpustnost ve vodě a rozdílný transport přes membrány. Výsledkem může být i rozdílný vliv na biosyntézu. Tyrosin Tyrosin je u některých rostlin mezičlánkem v biosyntéze anthrachinonů, je součástí jejich vzniku šikimátovou cestou. Od fenylalaninu se tyrosin liší pouze přítomností OH skupiny v poloze para na benzenovém jádru. Může z něj proto, stejně jako z fenylalaninu, vznikat p-kumarylkoenzym A a to by mohlo vést ke zvýšení produkce flavonoidů. (25, 35) [24]

4. Experimentální část 4.1. Použité přístroje - Analytické váhy, Sartorius A 200 S, Sartorius, Göttingen, SRN - Autokláv, PS 20A, Chirana, Brno - Horkovzdušný sterilizátor HS 31A, Chirana, Brno - Sušárna, HS 61A, Chirana, Brno - Laminární box, Fatran LF, výrobné družstvo Pokrok, Žilina - HPLC chromatograf JASCO, (čerpadlo PU-289, detektor MD-2015, autosampler AS 2055), Jasco International, Tokyo, Japonsko - Chromatografická kolona LiChrospher RP-18 250x4 (5μm) s předkolonkou, Merck, Darmstadt, SRN - Třepačka VKS-75, Edmund Bühler, SRN - Vodní lázeň KL1, Laboratorní přístroje, Praha - další laboratorní pomůcky (pipety, pinzety, baňky, chladič, nálevky atd.) 4.2. Použité chemikálie - kyselina α-naftyloctová č., myo-inositol puriss.: Sigma-Aldrich, USA - enzymatický hydrolyzát kaseinu: Imuna, Sarišské Michalany - komplex vitaminů B: chlorid thiaminia puriss., chlorid pyridoxinia puriss., Koch- Light Laboratories, Hampshire, UK - acetonitril pro HPLC - ethanol 96%, Penta a.s.,chrudim - octan draselný, Penta a.s., Chrudim - kyselina šikimová, Sigma-Aldrich, USA - kyselina skořicová, Sigma-Aldrich, USA - skořican sodný, Sigma-Aldrich, USA [25]

- tyrosin, Sigma-Aldrich, USA - hypericin, hyperosid, quercitrin - standardy pro HPLC, Sigma-Aldrich, USA - 6-benzylaminopurin pro zvláštní účely, dihydrogenfosforečnan draselný č., dusičnan amonný p.a., dusičnan draselný p.a., hydrogenfosforečnan sodný p.a., chlorid vápenatý p.a., chlorid kobaltnatý p.a., jodid draselný p.a., kyselina boritá p.a., glycin č., kyselina o-fosforečná č., kyselina nikotinová č., methanol p.a., molybdenan sodný p.a., sacharóza p.a., síran hořečnatý p.a., síran měďnatý p.a., síran manganatý p.a., síran zinečnatý p.a., síran železnatý p.a.: Lachema, Brno, ČR. 4.3. Kultivace explantátové kultury Hypericum perforatum 4.3.1. Původ kultury a odvození suspenzní kultury Kultura, použitá k pokusům v této práci, byla odvozena z nati a udržována jako kalusová kultura na katedře farmakognosie FaF UK. Ke kultivaci bylo používáno médium dle Murashigeho a Skooga (MS půda) s agarovým gelem. K odvození suspenzní kultury a samotným pokusům byla použita pasáž 118-127. Z kalusové kultury byla při zachování aseptických podmínek odvozena kultura suspenzní. Odvození proběhlo tak, že část kalusu, pěstovaného na agarovém gelu, byla mechanicky pinzetou rozdrobněna a přenesena do tekutého MS média. Po několika pasážích přestaly shluky buněk držet pohromadě a vznikla tak suspenzní kultura. 4.3.2. Pasážování a kultivační půda Pasážování bylo prováděno vždy ve sterilním boxu s laminárním prouděním vzduchu. Sterilní prostředí bylo zajištěno vymytím boxu etanolem 96%, dále hodinovým vyzářením boxu UV lampou a zapnutím proudění vzduchu v předstihu asi 15 minut tak, aby se mohl před přesazováním ustálit. Erlenmayerovy baňky pro kultivaci byly před pasážováním naplněny 20 ml MS média, uzavřeny hliníkovou fólií a vysterilizovány 15 minut v autoklávu při tlaku páry 0,1 MPa a teplotě 121 C. Pipety pro pasážování byly vysterilizovány stejným postupem. Nástroje (pinzety, atd.) byly sterilizovány teplotou 200 C po dvě hodiny. [26]

Vlastní pasážování pak probíhalo vždy po 14 dnech kultivace přenesením 10ml suspenzní kultury, narostlé v předchozí pasáži, pomocí pipety do nové baňky s živnou půdou. Složení kultivační půdy je uvedeno v tabulce 1. Byla použita půda dle Murashigeho a Skooga (MS půda), obohacená o růstový stimulátor - kyselinu α-naftyl octovou (αnaa). Půda byla vždy čerstvě připravena před přesazováním kultury smísením odměřených zásobních roztoků a dovážením sacharózy, myo-inositolu, kaseinového hydrolyzátu a doplněním vody na objem 1 litr. Tabulka 1: CaCl 2.2H 2 O 440 KNO 3 1900 MgSO 4.7H 2 O 370 NH 4 NO 3 1650 KH 2 PO 4 170 FeSO 4.7H 2 O 27,84 Na 2 EDTA 37,35 MnSO 4.4H 2 O 22,30 ZnSO 4.7H 2 O 11,50 H 3 BO 3 6,20 KI 0,83 CuSO 4.5H 2 O 0,025 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 CoCl 2.6H 2 O 0,025 myo-inositol 100 glycin 2,00 k. nikotinová 0,50 pyridoxin hydrochlorid 0,50 thiamin hydrochlorid 0,10 [27] makroelementy (mg.l -1 ) mikroelementy (mg.l -1 ) vitaminy (mg.l -1 ) kaseinový hydrolyzát 1000 zdroj aminokyselin (mg.l -1 ) sacharóza 30000 zdroj uhlíku (mg.l -1 ) k. α-naftyl octová 10 růstový stimulátor (mg.l -1 )

4.3.3. Podmínky kultivace Samotná kultivace pak probíhala v uzavřené místnosti bez oken, při teplotě 25 C a světelné periodě 16 hodin. Baňky s kulturami byly umístěny na rotační třepačku (otáčky 120/min) a kultivace trvala vždy 14 dní. 4.4. Experimenty s jednotlivými prekurzory dianthronů a flavonoidů Pokusy byly prováděny s cílem zjistit, jestli má zvýšení koncentrace daných prekurzorů pozitivní vliv na produkci hypericinu a flavonoidů v suspenzní kultuře. 4.4.1. Přidání octanu draselného Po 14 dnech kultivace bylo vybráno 24 baněk se zdravou kulturou. Octan draselný jsme navážili do Erlenmayerových baněk a rozpustili ve vodě tak, aby vznikly roztoky o koncentracích 300 mg.l -1, 1500 mg.l -1 a 3000 mg.l -1. Tyto roztoky byly vysterilizovány v autoklávu a za aseptických podmínek jsme přidali vždy 1 ml roztoku do šesti baněk s kulturou. Tímto postupem nám tedy vzniklo 6 baněk s kulturou a s přidaným octanem o výsledné koncentraci v kultuře 10 mg.l -1, dalších 6 baněk s octanem o koncentraci 50 mg.l -1 a 6 baněk s octanem o koncentraci 100 mg.l -1. Posledních 6 baněk bylo kontrolních, byl do nich tedy vždy přidán 1 ml vysterilizované čištěné vody. 4.4.2. Přidání kombinace octanu draselného a kyseliny skořicové Roztoky pro přidání ke kulturám vznikly rozpuštěním octanu draselného a kyseliny skořicové. Výsledné koncentrace byly tedy 300 mg.l -1 octanu + 300 mg.l -1 kyseliny skořicové, 1500 mg.l -1 + 1500 mg.l -1 a 3000 mg.l -1 + 3000 mg.l -1. Z těchto zásobních roztoků byl za stejných podmínek, jako v předchozím pokusu přidán vždy 1 ml ke kulturám. Vznikly tak opět tři soubory šesti baněk o různých koncentracích prekurzorů (výsledné koncentrace v baňkách 10 mg.l -1 + 10 mg.l -1, 50 mg.l -1 + 50 mg.l -1, 100 mg.l -1 + 100 mg.l -1 ). Poslední soubor šesti baněk byl kontrolní, přidán byl opět 1 ml vody. [28]

4.4.3. Přidání skořicanu sodného Byl použit stejný postup a koncentrační řada, jako v kapitole 4.4.1. 4.4.4. Přidání tyrosinu Při tomto pokusu byla opět použita výsledná koncentrace přidané látky (tyrosinu) v suspenzní kultuře 10 mg.l -1, 50 mg.l -1 a 100 mg.l -1. Postup byl stejný, jako v kapitole 4.4.1. 4.4.5. Přidání kyseliny šikimové Byl použit stejný postup a koncentrační řada, jako v kapitole 4.4.1. 4.5. Odběr vzorků, jejich sušení a extrakce Odběr kultur byl proveden vždy po třech a pěti dnech od počátku kultivace s přidaným prekurzorem. Odebrané kultury byly zfiltrovány přes filtrační papír a na tomto papíře byly usušeny v sušárně při 40 C. Po usušení byly vzorky odebrány z filtračního papíru, rozdrobeny a zváženy. Vzorky byly dvakrát extrahovány 10 ml metanolu 80% na vodní lázni a pod zpětným chladičem. Po vychladnutí byl metanolický výluh přefiltrován přes chomáček vaty do odměrného válce a doplněn do 20 ml. Z těchto 20 ml byly odebrány asi 2 ml a zfiltrovány přes mikrofiltr (0,22 µm) do vialek. Takto vzniklé vzorky byly následně podrobeny HPLC analýze. [29]

4.6. HPLC analýza Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) byla jako analytická metoda zvolena pro svou rychlost, přesnost a možnost z malého množství vzorku stanovit zároveň identitu i koncentraci obsahových látek. Analýzy byly prováděny na chromatografu Jasco (čerpadlo PU-289, detektor MD-2015, autosampler AS 2055). Chromatografická sestava byla vybavena předkolonovým filtrem a kolonou LiChrospher RP-18 250x4 (5μm) s ochrannou předkolonkou. Vzorky byly analyzovány dvakrát, jednou na obsah hypericinu a jednou na obsah flavonoidů (hyperosid a quercitrin). Při analýze hypericinu byl nastřikovaný objem 20 µl a průtok 1,5 ml/min. Složení mobilní fáze se měnilo gradientově podle tabulky 2. Eluent A byl vodný roztok s 8% acetonitrilu a 0,15% kyseliny fosforečné. Eluent B byl 100% acetonitril. Tabulka 2: Čas (min.) Eluent A Eluent B 0 45% 55% 12 10% 90% Flavonoidy hyperosid a quercitrin byly analyzovány simultánně. Nastřikovaný objem byl 20 µl a průtok 1,5 ml/min. Složení mobilní fáze se měnilo gradientově podle tabulky 3. Eluenty byly stejné, jako při analýze hypericinu. Tabulka 3: Čas (min.) Eluent A Eluent B 0 90% 10% 10 80% 20% 23 75% 25% Detekce probíhala při obou analýzách spektrometricky v rozmezí vlnových délek 200-650 nm. Hypericin měl absorbční maximum v λ=590 nm. Flavonoidy měly absorbční maximum v λ=254 nm. Obsah sledovaných látek byl zjištěn z píků v chromatogramu při jejich absorbčních maximech pomocí matematické metody normalizace a porovnáváním s kalibračními křivkami standardů daných látek. [30]

Kalibrační křivky hypericinu, hyperosidu a quercitrinu byly vytvořeny metodou vnějšího standardu. Obrázek č. 6: Kalibrační křivka hypericinu Obrázek č. 7: Kalibrační křivka hyperosidu [31]

Obrázek č. 8: Kalibrační křivka quercitrinu Obrázek č. 9: Ukázka chromatogramu při analýze hypericinu ve vzorku [32]

4.6.1. Validace analytické metody HPLC Validace je ověření platnosti dané analytické metody. Instrumentální validaci zajištuje pomocí normy ISO 9001 (International Organisation for Standardisation) výrobce chromatografické sestavy Jasco International. Přesnost sestavy byla dále prověřena testem opakovaného nástřiku, při kterém se provádí celkem šestkrát analýza stejného vzorku a směrodatná odchylka, vypočtená z výsledků nesmí být větší, než 1,5%. Dále byl proveden test linearity, kdy se lineární regresní analýzou pěti různých koncentrací standardu zjistí hodnota korelačního koeficientu r, která musí být větší, než 0,9900. Při hodnocení jednotlivých chromatogramů byla použita metoda Asymetrie píku a metoda Počtu teoretických pater, tyto metody byly převzaty z Evropského lékopisu. Pro hodnocení celé analytické metody byly použity tyto validační parametry: Kvantitativní limit = nejmenší hodnota, která může být měřena danou metodou s dostatečnou přesností a správností. Správnost metody = statisticky významný rozdíl mezi skutečnou a naměřenou hodnotou. Získává se porovnáním dané metody se standardem, referenčním materiálem, nebo jinou dostatečně osvědčenou analytickou metodou. [33]

4.7. Statistické hodnocení výsledků Statistická významnost naměřených hodnot byla hodnocena pomocí T-testu významnosti rozdílu dvou průměrů. Byly použity následující matematické vztahy: Aritmetický průměr: = x = aritmetický průměr, x i = naměřené hodnoty, a = počet členů souboru Směrodatná odchylka: = ( ) s = směrodatná odchylka, x = aritmetický průměr, x i = naměřené hodnoty, a = počet členů souboru Testovací kritérium: = + ( + ) + T = testovací kriterium, x 1 = aritmetický průměr kontrolního souboru, x 2 = aritmetický průměr pokusného souboru, a 1 = počet členů kontrolního souboru, a 2 = počet členů pokusného souboru, s 1 = směrodatná odchylka kontrolního souboru, s 2 = směrodatná odchylka pokusného souboru Stupeň volnosti: = + v = stupeň volnosti, a 1 = počet členů kontrolního souboru, a 2 = počet členů pokusného souboru [34]

Testovacímu kritériu (T) přísluší t rozdělení se stupněm volnosti. Vypočtená hodnota testovacího kritéria se porovná s příslušnou kritickou hodnotou T p pro vypočtený stupeň volnosti a zvolenou hladinu významnosti p. Jestliže je hodnota T větší, než hodnota T p, je výsledek statisticky významný na hladině p. Zvolená hladina významnosti byla p = 0,05. (36) [35]

5. Výsledky V následujících tabulkách a grafech jsou uvedeny a znázorněny koncentrace sledovaných látek v kultuře po přidání jednotlivých prekurzorů. Uvedené výsledky jsou průměrem ze tří měření. Statisticky významné výsledky jsou v tabulkách zvýrazněny. Tabulka 4: Prekurzor octan draselný Koncentrace prekurzoru (mg.l -1 ) 0 Doba Obsah sledovaných látek (%) odběru vzorku (hod) hypericin hyperosid quercitrin 72 0,044 0,020 0,000 168 0,011 0,009 0,002 72 0,028 0,012 0,000 10 168 0,007 0,004 0,000 72 0,023 0,009 0,000 50 168 0,008 0,016 0,000 72 0,041 0,015 0,000 100 168 0,003 0,015 0,000 Obsah (%) 0,05 0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 kontrola (c=0), 72h. Graf 1: Vliv octanu draselného kontrola (c=0), 168 h. c=10 72 h. c=10 168 h. [36] c=50 72 h. c=50 168 h. c=100 72 h. Rozdělení podle koncentrace prekurzoru a času odběru c=100 168 h. hypericin hyperosid quercitrin

Tabulka 5: Prekurzory octan draselný + kys. skořicová Koncentrace prekurzorů (mg.l -1 ) 0 Doba Obsah sledovaných látek (%) odběru vzorku (hod) hypericin hyperosid quercitrin 72 0,022 0,019 0,000 168 0,009 0,003 0,000 72 0,019 0,023 0,000 10 168 0,009 0,003 0,000 72 0,023 0,016 0,000 50 168 0,008 0,003 0,000 72 0,017 0,015 0,000 100 168 0,015 0,004 0,000 Obsah (%) 0,05 0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 Graf 2: Vliv octanu draselného a k. skořicové kontrola (c=0), 72h. kontrola (c=0), 168 h. c=10 72 h. c=10 168 h. c=50 72 h. c=50 168 h. c=100 72 h. Rozdělení podle koncentrace prekurzoru a času odběru c=100 168 h. hypericin hyperosid quercitrin [37]

Tabulka 6: Prekurzor - skořican sodný Koncentrace prekurzoru (mg.l -1 ) 0 Doba Obsah sledovaných látek (%) odběru vzorku (hod) hypericin hyperosid quercitrin 72 0,019 0,008 0,000 168 0,013 0,002 0,001 72 0,017 0,010 0,000 10 168 0,019 0,012 0,000 72 0,009 0,008 0,000 50 168 0,003 0,016 0,002 72 0,021 0,014 0,000 100 168 0,022 0,048 0,000 0,05 Graf 3: Vliv skořicanu sodného 0,045 0,04 0,035 Obsah (%) 0,03 0,025 0,02 0,015 hypericin hyperosid quercitrin 0,01 0,005 0 kontrola (c=0), 72h. kontrola (c=0), 168 h. c=10 72 h. c=10 168 h. c=50 72 h. c=50 168 h. c=100 72 h. Rozdělení podle koncentrace prekurzoru a času odběru c=100 168 h. [38]

Tabulka 7: Prekurzor - tyrosin Koncentrace prekurzoru (mg.l -1 ) 0 Doba Obsah sledovaných látek (%) odběru vzorku (hod) hypericin hyperosid quercitrin 72 0,003 0,006 0,000 168 0,010 0,001 0,000 72 0,023 0,004 0,000 10 168 0,009 0,000 0,000 72 0,021 0,012 0,000 50 168 0,011 0,002 0,000 72 0,030 0,009 0,000 100 168 0,014 0,000 0,000 0,05 Graf 4: Vliv tyrosinu 0,045 0,04 0,035 Obsah (%) 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 hypericin hyperosid quercitrin 0,005 0 kontrola (c=0), 72h. kontrola (c=0), 168 h. c=10 72 h. c=10 168 h. c=50 72 h. c=50 168 h. c=100 72 h. Rozdělení podle koncentrace prekurzoru a času odběru c=100 168 h. [39]

Tabulka 8: Prekurzor - kys. šikimová Koncentrace prekurzoru (mg.l -1 ) 0 Doba Obsah sledovaných látek (%) odběru vzorku (hod) hypericin hyperosid quercitrin 72 0,005 0,003 0,000 168 0,006 0,017 0,000 72 0,001 0,000 0,000 10 168 0,005 0,041 0,000 72 0,000 0,002 0,000 50 168 0,004 0,032 0,000 72 0,007 0,002 0,000 100 168 0,004 0,037 0,000 0,05 Graf 5: Vliv kys. šikimové 0,045 0,04 0,035 Obsah (%) 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 hypericin hyperosid quercitrin 0,005 0 kontrola (c=0), 72h. kontrola (c=0), 168 h. c=10 72 h. c=10 168 h. c=50 72 h. c=50 168 h. c=100 72 h. Rozdělení podle koncentrace prekurzoru a času odběru c=100 168 h. [40]

6. Diskuze Cílem této diplomové práce bylo zjistit vliv vybraných prekurzorů naftodianthronů a flavonoidů na produkci těchto sekundárních metabolitů v explantátových kulturách Třezalky tečkované. Pro provedení těchto experimentů bylo nezbytné odvodit z kalusové kultury kulturu suspenzní, zvládnout správnou techniku pasážování a kultivace těchto kultur a zvládnout metodu HPLC stanovení hypericinu, hyperosidu a quercitrinu. Pro experimenty byly vybrány tyto prekurzory: Octan draselný z acetylkoenzymu A vychází biosyntéza emodinanthronu, z něhož pak dimerizací vznikají dianthrony hypericin a pseudohypericin. (viz kapitola 3.2.1.) Kyselina skořicová vzniká z fenylalaninu a je meziproduktem v biosyntéze flavonoidů. (viz kapitola 3.2.2.) Skořican sodný díky vyšší rozpustnosti ve vodě (oproti k. skořicové) může mít po přidání do média vyšší biodostupnost pro buňky kultury. (viz kapitola 3.4.) Tyrosin je součástí biosyntézy flavonoidů (podobně, jako fenylalanin), u některých druhů se účastní také biosyntézy anthrachinonů (čeleď Rubiaceae) (viz kapitola 3.4.) Kyselina šikimová je výchozí látkou pro biosyntézu flavonoidů a aminokyselin s aromatickým kruhem. Kyselina šikimová se u některých rostlin účastní i biosyntézy anthrachinonů. (viz kapitola 3.2.2. a 3.4.) Octan draselný v koncentracích 10 a 50 mg.l -1 způsobil v čase 72 hodin po přidání do média statisticky významný pokles obsahu hypericinu a hyperosidu v kulturách. Tento pokles je možné vysvětlit pomalou adaptací buněk na přítomnost cizorodé látky a zpomalením biosyntézy sekundárních metabolitů, které nejsou pro buňky nezbytně důležité. K významnému poklesu obsahu hypericinu došlo také u kultur s koncentrací octanu 100 mg.l -1 v čase 168 hodin po jeho přidání. Je možné, že takto vysoká koncentrace octanu už na kulturu při delší době kultivace působí toxicky. Je také pravděpodobné, že přidaný octan se v kultuře nepřeměňuje na acetylkoenzym A, který se účastní biosyntézy dianthronů. [41]

Kombinace octanu draselného a kyseliny skořicové v kultuře nezpůsobila zvýšenou produkci sekundárních metabolitů. Naopak nejvyšší použitá koncentrace (obě látky po 100 mg.l -1 ) při době kultivace 168 hodin opět způsobila pokles obsahu hypericinu. Tento jev lze vysvětlit tak, že vysoká koncentrace těchto prekurzorů může působit na kultury při delší době expozice toxicky. Obecně lze výsledky prvního a druhého experimentu shrnout tak, že octan nemá pozitivní vliv na obsah sledovaných látek, a to ani v kombinaci s kyselinou skořicovou. Oproti tomu přídavek skořicanu sodného měl pozitivní vliv na produkci flavonoidu hyperosidu v kultuře při všech koncentracích po 168 hodinách od přidání. To, že se koncentrace hyperosidu zvýšila až po 168 hodinách, lze vysvětlit pomalou adaptací buněk na přidanou látku. Vyšší produkci flavonoidu oproti kultuře s přidanou kyselinou skořicovou v kombinaci s octanem draselným je možné vysvětlit toxickým působením octanu, nebo rozdílným vstřebáváním kyseliny skořicové a její soli do buněk. Vyšší vliv skořicanu (oproti kyselině skořicové) na produkci flavonoidů byl zaznamenán také v pokusech s explantátovými kulturami Scutellaria baicalensis Georgii. (37) Přídavek tyrosinu měl pozitivní vliv na obsah hypericinu ve všech přidaných koncentracích. Po 72 hodinách kultivace došlo až k desetinásobnému nárůstu koncentrace hypericinu, po 168 hodinách se vrátila jeho hladina na původní úroveň, srovnatelnou s kontrolní kulturou. K drobnému nárůstu došlo i u obsahu hyperosidu. Z výsledků vyplývá, že tyrosin se přednostně spotřebovává na biosyntézu hypericinu a obsah flavonoidů není příliš ovlivněn. Tyrosin není součástí acetátové polyketidové biosyntetické cesty anthronů, je tedy možné, že navzdory očekávání v kultuře vznikají anthrony také šikimátovou biosyntetickou cestou, jejíž je tyrosin součástí. Velice pravděpodobnou možností je také to, že tyrosin není v kultuře spotřebováván jako prekurzor, ale působí na ni jako stresující faktor (elicitor) a tím zvyšuje produkci dianthronů. Po přidání kyseliny šikimové došlo k významnému nárůstu obsahu flavonoidu hyperosidu. Nárůst byl u všech koncentrací přidaného prekurzoru po 168 hodinách [42]

přibližně dvojnásobný oproti kontrolní kultuře. Oproti tomu obsah hypericinu spíše poklesl. Z výsledků tedy vyplývá, že kyselina šikimová je kulturou přijata a využita k produkci flavonoidů. Kyselina šikimová je přímým prekurzorem fenylalaninu a fenylpropanových kyselin, ze kterých vznikají flavonoidy. Pozitivní vliv kyseliny šikimové, tyrosinu a fenylalaninu na produkci flavonoidů byl popsán také při pokusech s naklíčenými semeny rodu Fagopyrum a Lens.(38,39) Přídavek kyseliny šikimové neměl vliv, na rozdíl od tyrosinu, na produkci dianthronů. Závěrem je nutno dodat, že ke zpřesnění výsledků této práce by bylo do budoucna potřeba rozšířit rozsah koncentrací prekurzorů, které jeví vliv na produkci sledovaných látek. Jmenovitě se jedná hlavně o skořican sodný a tyrosin. Skořican zvýšil produkci hyperosidu v nejvyšší přidané koncentraci více než dvacetinásobně, v ostatních koncentracích nebyl nárůst obsahu flavonoidu tak markantní. Proto by bylo potřeba zpřesnit vliv koncentrace na obsah flavonoidů a stanovit ideální koncentraci prekurzoru. Pozitivní výsledky tyrosinu naznačují jeho velký vliv na produkci hypericinu v kulturách Třezalky, kterou zvýšil až desetinásobně. V budoucnu by bylo vhodné rozšířit spektrum použitých koncentrací a tím zpřesnit výsledky publikované v této práci. [43]

7. Závěr Během vypracovávání této diplomové práce byla zvládnuta kultivace kalusových a suspenzních explantátových kultur Hypericum perforatum. Současně byla zvládnuta analýza obsahu hypericinu, hyperosidu a quercitrinu v kultuře pomocí HPLC. Následně byl během experimentů sledován vliv vybraných prekurzorů flavonoidů a naftodianthronů (octan draselný, k. skořicová, skořican sodný, tyrosin, k. šikimová) na produkci hypericinu, hyperosidu a quercitrinu v suspenzních kulturách Hypericum perforatum. Nejvyšších koncentrací hypericinu v kultuře bylo dosaženo po přidání tyrosinu. Nejlepší výsledky byly zaznamenány v kultuře s koncentrací tyrosinu 100 mg.l -1 (nejvyšší použitá koncentrace), obsah hypericinu se zde zvýšil oproti kontrolní kultuře z 0,003% na 0,03%. K tomuto nárůstu došlo po 72 hodinách kultivace. Největší vliv na obsah flavonoidu hyperosidu v kultuře byl zjištěn u skořicanu sodného. Obsah hyperosidu v kultuře s koncentrací skořicanu 100 mg.l -1 (nejvyšší použitá koncentrace) se po 168 hodinách kultivace zvýšil z 0,002% na 0,048% (porovnáváno s kontrolní kulturou). Statisticky významný obsah flavonoidu quercitrinu v kultuře nebyl zaznamenán. [44]

8. Literatura 1. Opletal L., Volák J.: Rostliny pro zdraví, Aventinum, Praha 1999, s. 9. 2. Hubík, J., Dušek, J., Spilková, J.: Farmakognosie I, SPN, Praha 1989, s. 11. 3. Malik S. et al.: Production of the anticancer drug taxol in Taxus baccata suspension cultures: A rewiew. Process biochemistry 2011; 46: 23-34. 4. Raskin J. et al.: Plants and human health in the twenty-first century, Trends Biotechnol. 2002; 20: 522-531. 5. Sikyta B., Dušek J.: Biotechnologie pro farmaceuty, Karolinum, Praha 2001, s.75-83. 6. Janča J., Zentrich J.: Herbář léčivých rostlin 5. díl, Eminent, Praha 1997, s. 40. 7. Hrouda L.: Rostliny luk a pastvin, Academia, Praha 2013, s. 70. 8. Spohn M., Golte-Bechtle M.: Co tu kvete? Květena střední Evropy, Euromedia Group, Praha 2010, s. 131 9. Ministerstvo zdravotnictví ČR: Český lékopis 2009, Grada, Praha 2009, s. 2294 (2. svazek). 10. Hubík J., Dušek J., Spilková J.: Obecná farmakognosie II. Sekundární látky, Státní pedagogické nakladatelství, Praha 1989, s. 55-56. 11. Mennini T., Gobbi M.: The antidepressant mechanism of Hypericum perforatum. Life Sciences 2004;75:1021 1027. 12. Saddiqe Z., Naeem I., Maymoona A.: A rewiew of the antibacterial activity of Hypericum perforatum L.. Journal of Ethnopharmacology 2010;131:511-521. 13. Korbelář J., Endris Z.: Naše rostliny v lékařství, Avicenum, Praha 1985, s. 434-435. 14. Jindrová J.: Léčivé rostliny Ottův průvodce přírodou, Ottovo nakladatelství, Praha 2010, s. 231-232. 15. Chatterjee S. et al.: Hyperforin as a possible antidepressant component of Hypericum extracts. Life Sciences 1998;63:499-510. 16. Orhan I.E. et al.: Assessment of antimicrobial and antiprotozoal activity of the olive oil macerate samples of Hypericum perforatum and their LC-DAD-MS analyses. Food Chemistry 2013;138:870-875. 17. Agostinis P. et al.: Hypericin in cancer treatment: more light on the way. The Internatinal Journal of Biochemistry and Cell Biology 2002;34:221-241. [45]