MTI Cvičení č. 2 Pasážování buněk 15.11./16.11.2016 Jana Horáková
Doporučená literatura M. Vejražka: Buněčné kultury http://bioprojekty.lf1.cuni.cz/3381/sylabyprednasek/textova-verze-prednasek/bunecnekultury-vejrazka.pdf I. Freshney: Culture of Animal Cells
Buňky Primární Sekundární (buněčné kultury) Kmenové možnost diferenciace za využití růstových faktorů Tkáňově diferencované
Buněčné kultury Výhody Nevýhody Pokusy na izolovaném, dobře charakterizovaném buněčném typu Neomezené množství experimentů Chybí interakce s ostatními buněčnými populacemi ( tkáňový kontext ) Nefyziologické podmínky kultivace (umělé médium, vyšší tlak kyslíku)!!! Interpretace výsledků!!!
Kultivace buněk in vitro Sterilní podmínky (jednorázový spotřební materiál, speciální chemikálie) Praktická cvičení: kultivace fibroblastů
Podmínky kultivace Přísun cukrů, solí, aminokyselin, vitaminů, mastných kyselin, proteinů bikarbonátový pufrovací systém udržující ph v rozmezí 7,2-7,4 5% CO 2, 37 C ph indikátor: fenolová červeň růžová barva při optimálním ph žlutá-kyselé ph, fialová- zásadité ph Médium s obsahem 10% FBS (proteiny, růstové faktory) Přídavek směsi antibiotik/antimykotik
Pasážování buněk Při dosažení 70-80% konfluence (souvislé vrstvy buněk) naředění buněk Uvolnění adherentních buněk od kultivačního povrchu i od sebe navzájem, přenesení do nové kultivační nádoby s čerstvým médiem Způsob: působení proteáz (trypsin), odstranění dvojmocných iontů (EDTAchelatačně váže Ca 2+, Mg 2+ )
Buňky v suspenzi po trypsinizaci 80% konfluence vhodné k pasážování
Růst buněk Růstová křivka: A - statická fáze (lag fáze): příprava na buněčné dělení B - exponenciální (log) fáze: intenzivní množení buněk do vyčerpání živin C - stacionární fáze (plató): počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů D - fáze odumírání
T (osa x)=čas L (osa y)=počet buněk Růstová křivka
Růst buněk při kultivaci in vitro Snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst počtu buněk) Kontaktní inhibice při dosažení konfluence Před dosažením plató fáze pasážování (naředění na takové množství, aby kultura opět rostla exponenciálně)
Laboratoř TI 3T3 mouse fibroblasts HHDF - Normal human dermal fibrobalsts (Lonza) MG-63 bone cells (ATCC) HUVEC - Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Lonza)
Sterilizace Odstranění mikroorganismů z prostředí, ve kterém se pracuje s buněčnými kulturami Zásadní krok při kontaminaci buněčných kultur: destrukce buněk, pomalý růst, změna chování, přenos kontaminace na další buněčné kultury, Dodržování GLP-přesné a opakovatelné výsledky, minimalizuje biohazard risk
Kontaminace buněčných kultur Bakterie (přidávání antibiotik do kultivačních médií) viditelné v mikroskopu Mykoplasmata intracelulární parazité (nezjistitelné při mikroskopické kontrole), testování na přítomnost mykoplasmat Plísně, kvasinky (přídavek antimykotik) mikroskopie Viry vzácně, obtížná detekce
Opatření při kontaminaci Zpomalení proliferace, změna vlastností buněk Likvidace kultury Asanace laboratoře a inkubátoru Příprava nových kultivačních médií Obnovení kultury ze zmražené zálohy
Uchovávání buněk (kryoprezervace) Možnost dlouhodobého uchovávání v hlubokomrazícím boxu (-80 C) nebo v parách kapalného dusíku (-196 C) Přidání kryoprotektiv (DMSO, glycerol) zabrání poškození krystaly vody při zmražování buněk Záloha při kontaminaci, načasování pokusů
Metabolické testy MTT, MTS, XTT, WST Nepřímá kvantifikace buněk měření jejich metabolické aktivity
Praktické cvičení Práce v čistých prostorech laboratoře TI dodržování striktních pravidel sterilní práce 1. Stanovení počtu buněk pomocí Burkerovy komůrky 2. Pasážování 3T3 fibroblastů 3. Nativní preparát buněk bukální sliznice 4. Kalibrační křivka MTT tesu
Počítání buněk
Čtverec A rozměry 1 mm x 1 mm x 0,1 mm V=0,1 mm 3 Výsledek uváděn jako počet buněk v 1 ml 1 mm 3 =0,001 ml 0,1 mm 3 = 0,0001 ml
Výpočet Průměrný počet buněk ve čtverci A 10,4 buněk 0,0001 ml x buněk 1 ml X= 104000 Výsledek se uvádí jako 1,04x10 5 buněk/1ml!!! Ředění buněčné suspenze!!!
Trypan blue