ÚLOHA 10: STANOVENÍ KOFEINU V NÁPOJÍCH METODOU HPLC Příprava: 1. Zopakujte si metodiku kapalinové chromatografie po stránce schematické a částečně fyzikálněchemické. 2. Zopakujte si metodu kalibrační křivky a zásady statistického vyhodnocení naměřených výsledků. 3. Připravte si výpočet pro přípravu zásobního roztoku kofeinu o koncentraci 464 µg/ml do odměrné baňky 50ml, včetně postupu přípravy zásobního roztoku. 4. Připravte si výpočty pro přípravu kalibračních roztoků ze zásobního roztoku kofeinu ředěním 5x, 10x, 20x, 40x, 80x a 160x, do vialek o celkovém objemu 1 ml. 5. Zajistěte si na laboratorní cvičení vzorek nápoje obsahující kofein. Podle údajů na obalu nebo podle tabulky v závěru návodu navrhněte u vašeho vzorku potřebné ředění. Úvod : Kofein se vyskytuje v semenech kávovníku arabského (Coffea arabica). Tyto keře jsou pěstovány v Africe, Jižní Americe a v Arábii. Nachází se také v čaji (Camellia sinensis) a kolových ořeších (Cola acuminata), tyto ořechy se využívají při výrobě nápojů kola. V čisté formě se jedná o bílý krystalický prášek. Compound Name (CAS): 1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione CAS Number: 58-08-2, CID: 2519 Sumární vzorec: C 8 H 10 N 4 O 2 Pomůcky: Kapalinový chromatograf Thermo Surveyor automatický dávkovač vzorků Surveyor Autosampler Plus kvartérní pumpy s odplyňovací jednotkou Surveryor MS Pump Plus UV-VIS spektrofotometrický detektor s diodovým polem Surveyor PDA Plus chromatografická kolona Kinetex 2.6 µm C18 100 Å, LC Column 150 x 4.6 mm, Ea analytické váhy minishaker mikropipety + špičky stříkačky + stříkačkové filtry vialky 1,8 ml ultrazvuková lázeň mikrofiltrační zařízení odměrné baňky, běžné laboratorní sklo a vybavení K vyhodnocování výsledků použijte program Xcalibur v 2.5.0 (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)
Chemikálie Deionizovaná voda (H2O) Mr= 18, 0153 g/mol Kofein (C8H10N4O2) Mr= 194,1933 g/mol Methanol pro HPLC (CH3OH) Mr= 32,042 g/mol Vzorek nápoje obsahující kofein Postup práce Příprava zásobního roztoku kofeinu o koncentraci 464 µg/ml : Do 50 ml odměrné suché a čisté baňky připravte zásobní roztok kofeinu o koncentraci 464 µg/ml. K přípravě použijte deionizovanou vodu. Zásobní roztok důkladně promíchejte. Příprava kalibračních roztoků kofeinu: Připravte sérii osmi vialek, včetně zásobního roztoku a deionizované vody. Do ostatních šesti vialek napipetujte pomocí automatické pipety vypočítané množství objemu zásobního roztoku kofeinu a doplňte příslušným objemem destilované vody na celkové množství 1ml. Zásobní roztok se ředí 5x, 10x, 20x, 40x, 80x a 160x. Příprava laboratorního vzorku nápoje U vzorku (po dokonalé homogenizaci) zajistěte odplynění v ultrazvukové lázni a nařeďte v potřebném poměru s deionizovanou vodou. Požadované ředění vzorku proveďte na základě zjištěných údajů na originálním obalu, příp. z tabulky uvedené v závěru návodu. Poté vzorek zfiltrujte přes mikrofiltr a dávkujte do vialky. Podmínky stanovení kapalinovou chromatografií Mobilní fáze: methanol / voda (30 / 70 v/v) Průtok mobilní fáze: 700 µl/min Detekce: 273 nm Objem nástřiku: 10 µl HPLC stanovení Vlastní stanovení proveďte na kapalinovém chromatografu za použití kolony Kinetex 2.6 µm C18 100 Å, LC Column 150 x 4.6 mm, Ea; při laboratorní teplotě, isokratickou elucí mobilní fází o složení methanol/voda (30/70 v/v), při objemové průtokové rychlosti 700 µl/min. Dávkovaný objem vzorku činí 10 µl. Měření opakujte třikrát. Návod na obsluhu kapalinového chromatografu 1. Zapněte hlavní vypínač detektoru, čerpadla a autosampleru 2. Připravte mobilní fázi pro chromatografické stanovení (methanol / voda (30 / 70 )) 3. Spusťte PC, program Xcalibur. Instrument setup 4. Promyjte písty čerpadla
Zvolte: Surveyor LC Pump > Direct Control: Zkontrolujte, zda je v mobilní fázi D odplyněný vodný roztok methanolu 30% obj. Otevřete vypouštěcí ventil na pumpě Zaškrtněte Take pump under control, nastavte flow 0,7 ml/min - Inlet D 100% a začněte promývání pístů pomocí tlačítka. Po 5 minutách promývání, případně při vzrůstu tlaku ukončete pomocí tlačítka. 5. Písty nesmí pracovat na prázdno. Pokud není v kapiláře mobilní fáze, na vypouštěcí ventil připojte stříkačku a v počátku nasávání vytvořte podtlak. Po dokončení čištění zkontrolujte odplynění fáze (zda-li do pumpy vstupuje mobilní fáze bez bublinek plynu). Uzavřete vypouštěcí ventil. 6. Zkontrolujte, zda je v chromatografu použita kolona Kinetex 2.6 µm C18 100 Å, LC Column 150 x 4.6 mm, Ea a zda je správně zapojena (šipky a nápis Flow odpovídá předepsanému směru průtoku). 7. K čištění autosampleru vyberte příkaz v nastavení Autosampleru: Surveyor AS -> Direct Control -> Flush Syringe - zvolte Reservoir FLUSH BOTLE nebo RV1, volume 700µl, flush speed 100µl/s-> apply 8. Připravte sérii vialek s kalibračními roztoky a se zkoumaným vzorkem, vložte do zásobníku a zásobník vložte do přístroje. Pozice v zásobníku jsou číslovány 1-40, zásobník je možné vložit do pozice A-E. Pozice vialek využijete při tvorbě sekvence. 9. Nastavte podmínky měření: Surveyor LC Pump-> Gradient program: 100% mobilní fáze D (30/70 MEOH/H 2 O), čas 10 minut, průtok mobilní fáze 700 µl/min. Surveyor AS ->
10. S pomocí vedoucího cvičení naprogramujte seqvenci analýz a spusťte seqvenci. Dávkovaný objem vzorku nastavte 0,01 ml. Je nutné přesné definování gradientového programu v záložce nastavení čerpadla, případně využití programu vytvořeného vedoucím cvičení. 11. Pumpa pracuje v pracovním režimu 0-5800 PSI (max.400bar), vzrůstající tlak je doprovázen zvukovou signalizací (v případě ucpání se nejprve vymění předkolony a teprve následně se musí vyměnit i kolona). V případě činnosti čerpadla bez mobilní fáze může dojít k poškození těsnění pístu. 12. Po proběhnutí analýz identifikujte píky (retenční čas vzorku) a zjistěte množství analyzovaného vzorku odečtením plochy píků. Plochy píků použijte ke konstrukci kalibrační křivky. 13. Na závěr propláchněte 30% vodným roztokem methanolu 14. Vypněte hlavní vypínače detektoru, autosampleru a čerpadla, vyjměte zásobník s vialkami k likvidaci vzorků. Pozor: Před začátkem práce se seznamte s pravidly bezpečnosti zacházení s organickými rozpouštědly! S organickými rozpouštědly nakládejte dle pokynů vedoucího cvičení. Před každým měřením zkontrolujte množství odpadu v láhvi a mobilní fázi! Zpracování výsledků 1) Proveďte identifikaci složek vzorku porovnáním jejich retenčních časů s retenčními časy standardních látek 2) Statisticky vyhodnoťte výsledky kvantitativních měření Závěr: Formulujte každý samostatně na základě získaných výsledků Tab. Obsah kofeinu v nápojích, potravinách a lékových kombinacích 1 bezkofeinová < 5 mg/150 ml káva pražená 70-120 mg/150 ml instantní 50-70 mg/150 ml Ledový 65-75 mg/150 ml čaj instantní 25-35 mg/150 ml sáčkový 30-50 mg/150 ml Nápoje (mg/360ml) Coca-Cola 45 mg Pepsi-Cola 38 mg 1 GRUNDMANN, Milan, Lékové interakce s kofeinem I, 2001, s.1.
Další údaje o obsahu kofeinu v nápojích naleznete na: www.caffeineinformer.com/caffeine-content-uk-europe-drinks