LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Transkript

1 LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ STANOVENÍ POTRAVINOVÝCH ADITIV ( ÉČEK ) POMOCÍ VYSOKOÚČINNÉ CHROMATOGRAFIE VE SPOJENÍ S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (LC-MS) Garant úlohy: Ing. Vojtěch Hrbek 1

2 Základní požadované znalosti pro vstupní test: Základní informace o přídatných látkách (aditivech) Princip a využití kapalinové chromatografie Princip a užití hmotnostní spektrometrie Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři a protipožární ochrany Náplň úlohy: Příprava vzorků pro LC-MS Seznámení s LC-MS instrumentací, měření kalibrace a extraktů vzorků Interpretace naměřených dat Časový snímek cvičení 30 minut Kontrola požadovaných znalostí, diskuse: způsob přípravy vzorků, měření a vyhodnocování naměřených dat 50 minut Příprava jednotlivých vzorků a standardů 120 minut Měření vzorků 30 minut v rámci Seznámení s LC-MS instrumentací měření vzorků 30 minut Vyhodnocení naměřených dat a diskuse výsledků 10 minut Ukončení úlohy + úklid 2

3 Teoretický úvod Aditivní látky Potravinářské aditivní látky, též potravinová aditiva či přídatné látky, jsou definovány jako sloučeniny či jejich směsi, které jsou do potravin záměrně přidávány při výrobě, zpracování, skladování nebo balení za účelem zvýšení kvality potravin z hlediska prodloužení údržnosti, zlepšení vůně, chuti, barvy, textury, výživové hodnoty aj. V současné době je známo přibližně 320 různých aditiv. Rozdělení aditivních látek Z hlediska původu se aditivní látky dělí do tří základních skupin: Přírodní získávány z přírodních materiálů (kyselina askorbová nebo citronová) Synteticky získaná identická s přírodními mají stejnou chemickou strukturu jako přírodní aditivní látky, ale jsou získávány chemickými reakcemi (syntetický β-karoten nebo riboflavin) Syntetická vyráběné chemickými reakcemi a nemají strukturu podobnou přírodním aditivním látkám (azobarviva, cyklamáty) Z hlediska účelu použití se aditivní látky dělí celkem do 26 funkčních skupin: 1. Náhradní sladidla dodávají potravinám sladkou chuť. 2. Barviva upravují barvu potravin 3. Konzervanty - prodlužují dobu údržnosti potraviny 4. Antioxidanty chrání potravinu před zkázou způsobenou oxidací. 5. Nosiče používají se k fyzikální úpravě (rozpouštění, disperze, ředění) přídatné látky nebo látky určené k aromatizaci potravin s cílem usnadnit jejich použití. 6. Kyseliny zvyšují kyselost, dodávají potravině kyselou chuť. 7. Regulátory kyselosti látky měnící nebo řídící kyselost čí alkalitu potraviny. 8. Protispékavé látky zabraňují ulpívání jednotlivých částic vzájemně na sobě. 9. Odpěňovače snižují úroveň pěnění, nebo celkově zabraňují vytváření pěny. 10. Plnidla zvyšují objem potraviny, aniž by zvýšily energetickou hodnotu. 11. Emulgátory umožňují vytvořit jednotnou směs dvou nebo více nemísitelných fází. 12. Tavící soli převádějí bílkoviny obsažené v sýru do dispersní formy a tím pomáhají udržet homogenní rozložení tuků a ostatních složek. 13. Zpevňující látky udržují pletiva ovoce nebo zeleniny v pevném nebo křehkém stavu. 3

4 14. Látky zvýrazňující chuť a vůni zvýrazňují stávající chuť nebo vůni potraviny. 15. Pěnotvorné látky umožňují vytvářet stejnorodé disperze plynné fáze v kapalné nebo tuhé potravině. 16. Želírující látky vytvářejí gel a tím upravují texturu potraviny. 17. Leštící látky po nanesení na povrch potraviny jí dávají lesklý vzhled nebo vytvářejí ochranný povlak. 18. Zvlhčující látky chrání potravinu před vysycháním. 19. Modifikované škroby škroby získané chemickou úpravou jedlých škrobů. 20. Balicí plyny jiné plyny než vzduch užívané při balení potravin. 21. Propelenty jiné plyny než vzduch užívané při vytlačování potraviny z obalu. 22. Kypřící látky látky uvolňující plyny a tí zvětšující objem těsta. 23. Sekvestranty látky vytvářející chemické komplexy s ionty kovů a zlepšující tak kvalitu a stabilitu potravin. 24. Stabilizátory pomáhají udržet fyzikálně-chemický stav potraviny. 25. Zahušťovadla látky zvyšující viskozitu potraviny. 26. Látky zlepšující mouku látky zlepšující pekařské vlastnosti mouky. Barviva Barviva mohou být přidávána buď za účelem úpravy barvy potraviny či obnovení barvy, kterou potravina ztratila během zpracování. K nejznámějším přírodním potravinářským barvivům patří například karamel. Syntetická barviva jsou dále řazena do 8 skupin na základě chemické struktury, z nejznámějších lze uvést azobarviva obsahující charakteristickou N=Nskupinu. Náhradní sladidla Nízkokalorické látky nahrazující hlavně mono- a disacharidy ať z výživových či ekonomických důvodů. K nejznámějším syntetickým sladidlům patří například acesulfam K či aspartam. Mnohdy jsou náhradní sladidla použitá ve směsi, aby vzájemně zamaskovaly svoji charakteristickou chuť. Konzervanty Jedná se o antimikrobiální, konzervační látky používané v ochraně proti nežádoucím mikroorganismům. Mezi nejznámější a často užívané konzervanty patří především benzoová a sorbová kyselina, které v nedisociované formě inhibují řadu kvasinek, plísní a některé bakterie. 4

5 Legislativa Z legislativního hlediska je v současné době použití aditiv regulováno Nařízením ES č. 1333/2008 o potravinách a přídatných látkách a Vyhláškou 4/2008 Sb. kde je každé aditivní látce přiřazen specifický E kód a maximální možný limit použití konkrétních aditiv či směsí aditiv v různých komoditách. Tabulka I: přehled aditiv sledovaných v rámci úlohy LC-MS Funkční skupina Analyt E kód Sumární vzorec Sledovaný typ iontu m/z Struktura tartrazin E 102 C 16H 9N 4Na 3O 9S 2 [M-H] + 469,012 Barviva brilantní modř E 133 C 37H 34N 2Na 2O 9S 3 [M-H] + 749,166 žluť SY E 110 C 16H 10N 2Na 2O 7S 2 [M-H] - 407,001 Acesulfam K E 950 C 4H 4KNO 4S [M-H] - 161,986 Náhradní sladidla Aspartam E 951 C 14H 18N 2O 5 [M-H] + 295,129 Cyklamát E 952 C 6H 11NHSO 3Na [M-H] - 178,054 Sacharin E 954 C 7H 5NO 3S [M-H] - 181,991 Sorbová kyselina E 200 C 6H 8O 2 [M-H] - 111,045 Konzervanty Benzoová kyselina E 210 C 7H 6O 2 [M-H] - 121,029 5

6 Návod laboratorní práce Předmětem této úlohy je analýza aditiv ve vzorcích nápojů a pochutin a srovnání naměřených výsledků s maximální povoleným limitem dle Nařízení ES č. 1333/2008. Princip metody: Vlastní stanovení potravinových aditiv v kapalných vzorcích a extraktech pevných vzorků se provádí s využitím techniky kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí za ionizace elektrosprejem (LC-ESI-MS). Hmotnostním analyzátorem je jednoduchý kvadrupól (Q). Specifické detekce je dosaženo měřením molekulového iontu sledované látky, který je odvozen od molekulové hmotnosti dané látky. Konfirmačním kritériem je shoda retenčních časů iontu sledovaného analytu ve vzorku a standardu. Kvantifikace se provádí metodou kalibrační křivky, srovnáním ploch píků vybraných iontů v MS chromatogramu vzorku a standardu. Úkoly: 1. Příprava testovaných vzorků makových semen (reálných vzorků) k analýze, příprava mobilní fáze 2. Měření vzorků metodou LC-MS 3. Vyhodnocení naměřených dat Chemikálie a standardy: - Zásobní směsný standard sledovaných analytů o koncentraci 50 μg/ml v destilované vodě - Methanol, pro LC-MS LiChrosolv (Merck, Německo) - Octan amonný 99,999 % (Sigma-Aldrich, Německo) - Kyselina mravenčí, p.a. 98 % (Sigma-Aldrich, Německo) - Amoniak, 25% vodný roztok (Lachner, Česká republika) Použité přístroje: - Kapalinový chromatograf Waters Acquity UPLC, Waters (USA) - Hmotnostní spektrometr QDA, Waters (USA) Tabulka II: HPLC podmínky stanovení opiových alkaloidů kolona mobilní fáze objem nastřikovaného vzorku teplota kolony teplota autosampleru Acquity BEH C18 (100 y 2,1 mm; 1,7 µm) A: 5 mm octan amonný B: Metanol 3 l 60 C 10 C 6

7 Tabulka 3: Gradient Čas [min] Průtok A [%] B [%] Křivka [ml.min -1 ] počátek 0, počátek 2 0, , , , ,01 0, , , Pracovní postup: Příprava kalibračních standardů Pro stanovení obsahu sledovaných látek ve vzorcích je třeba připravit řadu kalibračních bodů o koncentracích: 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; 1; 3; 5 mg.l -1. K přípravě kalibračních bodů jsou použity zásobní směsné kalibrační roztoky standardů aditiv o koncentraci 1; 3; 5; 8; 10; 30 a 50 mg.l -1 připravené v deionizované vodě, viz Tabulka I. Tabulka 1: Příprava kalibračních standardů Kalibrační Zásobní Deionizovaná Objem Pipetovat bod standard voda (mg.l -1 ) (ml) (mg.l -1 ) (ml) (ml) ,1 0, ,1 0, ,1 0,9 0, ,1 0,9 0, ,1 0,9 0, ,1 0,9 0, ,1 0,9 Příprava vzorku Při analýze kapalných vzorků se odměří cca 40 ml do plastové kyvety o objemu 50 ml. V případě džusů s dužninou či jiných nápojů obsahujících pevné částice musí být vzorek nejdříve odstředěn na odstředivce při rpm po dobu 5 minut. Vzorek je pomocí roztoku 1% kys. mravenčí či 1% amoniaku upraven na ph ml vzorku je převedeno do 50 ml odměrné baňky a doplněn deionizovanou vodou na objem 50 ml. Získaný neutralizovaný roztok se přefiltruje přes stříkačkový mikrofiltr o porozitě 0,22 μm. Filtrát je následně převeden do skleněné šroubovací vialky či nadále ředěn dle pokynů asistenta pro získání roztoků o koncentraci analytů vhodné pro kalibrační rozsah metody. V případě přípravy pevných vzorků je třeba analyty nejprve extrahovat vhodným postupem dle pokynů asistenta. Vialky s připravenými roztoky se dále analyzují pomocí techniky LC-MS. 7

8 Identifikace a kvantifikace Identifikace analytů se provádí porovnáním retenčního času píku daného analytu v chromatogramu analyzovaného vzorku a kalibračního standardu. Kvantitativní vyhodnocení se provádí odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky a přepočtem na původní vzorek. Výpočet obsahu analytů ve vzorku a vyjádření výsledku Během zpracování dat (výpočtů) je kontrolována linearita kalibrační křivky a rozptyl pomocí regresního koeficientu (R 2 ). Koncentrace jednotlivých analytů je počítána dle rovnice lineární regrese získané sestrojením kalibrační přímky. Výsledek je vyjádřen v jednotkách mg/l. Takto získanou hodnotu je třeba srovnat s limitem uvedeným v Nařízení ES/1333/2008 a posoudit, zda došlo k překročení povoleného limitu pro obsah aditivních látek v daném vzorku. Výstup práce Vyhodnocení naměřených dat Výpočet obsahu potravinových aditiv Srovnání naměřených hodnot s Nařízením ES/1333/2008 Sepsání protokolu Zkušební otázky: 1. Co jsou to potravinová aditiva? 2. Jak lze aditiva dělit dle původu? 3. Uveďte alespoň 5 funkčních skupin aditiv? 4. Popište princip kapalinové chromatografie? 5. Jaký je rozdíl mezi gradientovou a isokratickou elucí? 6. Jak se liší chromatografie na normální fázi a na reverzní fázi? 7. Vysvětlete princip analýzy látek pomocí hmotnostní spektrometrie. 8. Popište princip analyzátoru typu kvadrupól? 9. Jaké jsou základní části hmotnostního spektrometru? 8