Resyntéza řepky olejky z brukve řepáku a brukve zelné

Miroslav Klíma a kolektiv Resyntéza řepky olejky z brukve řepáku a brukve zelné Certifikovaná metodika Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2018

UPOZORNĚNÍ! Uvedená metodika neprošla dosud oponentním řízením a certifikací a její text není definitivní. Poskytovatel metodiky nenese odpovědnost za její užití. Resyntéza řepky olejky z brukve řepáku a brukve zelné Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného projektu NAZV QJ 1510172 Využití nekonvenčních výchozích materiálů, biotechnologických metod a efektivních postupů v liniovém a hybridním šlechtění ozimé řepky Ing. Miroslav Klíma, Ph.D., Mgr. Alois Hilgert-Delgado, Ph.D. Ing. Tereza Ulvrová, Ing. Pavla Bryxová Mgr. Pavel Vítámvás, Ph.D. RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc. RNDr. Klára Kosová, Ph.D. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Praha, září 2018

Resyntéza řepky olejky z brukve řepáku a brukve olejné Miroslav Klíma a kol. klima@vurv.cz Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha-Ruzyně Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného projektu NAZV QJ 1510172 Využití nekonvenčních výchozích materiálů, biotechnologických metod a efektivních postupů v liniovém a hybridním šlechtění ozimé řepky Oponenty metodiky byli: Ing. Jana Šedivá, Ph.D., Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. Ing. Petr Zehnálek, ÚKZÚZ ZS Hradec nad Svitavou Podíl autorů na vypracování metodiky: Ing. Miroslav Klíma, Ph.D. (55 %), Mgr. Alois Hilgert-Delgado, Ph.D. (10 %), Ing. Tereza Ulvrová (10%), Ing. Pavla Bryxová (10 %), Mgr. Pavel Vítámvás, Ph.D. (5 %), RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc. (5 %), RNDr. Klára Kosová, Ph.D. (5 %) Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2018 (ISBN 978-80-7427-283-7) Foto: Klíma M., Hilgert-Delgado A. Vydáno bez jazykové úpravy UPOZORNĚNÍ! Uvedená metodika neprošla dosud oponentním řízením a certifikací a její text není definitivní. Poskytovatel metodiky nenese odpovědnost za její užití. iii

iv

Obsah I. Cíl metodiky... 7 II. Vlastní popis metodiky... 7 III. Srovnání novosti postupů...13 IV. Popis uplatnění metodiky...13 V. Ekonomické aspekty...13 VI. Seznam použité související literatury...15 VII. Seznam publikací, které předcházely metodice...16 VIII. Přílohy...17 Tabulka 1. Médium MS (Murashige a Skoog 1962)... 17 Tabulka 2. Diferenciační médium DM (Klíma et al. 2004)... 17 Tabulka 3. Regenerační médium RM (Klíma et al. 2004)... 18 Obr. 1. Květenství se šešulemi řepice 11 dní po vzdálené hybridizaci, v den odběru... 19 Obr. 2. Šešule řepice s nezralými vajíčky... 19 Obr. 3. Vajíčka řepice po izolaci na tuhém médiu DM... 20 Obr. 4. Zygotické embryo v časném kotyledonárním stádiu 26 dní po izolaci... 20 Obr. 5. Kotyledonární embryo 33 dní po izolaci... 21 Obr. 6. Embryo 40 dní po izolaci... 21 Obr. 7. Embryo 50 dní po izolaci, na čerstvém DM médiu... 22 Obr. 8. Regenerace prvního pravého listu 55 dní po izolaci... 22 Obr. 9. Počátek regenerace rostliny z embrya 2 měsíce po izolaci, na tuhém médiu RM... 23 Obr. 10. Dobře vyvinutý první pravý list kříženec řepice "Bulharská" a kadeřávek "Frosty" na tuhém RM médiu... 23 Obr. 11. Regenerant křížence řepice "Svalöfs Duro" a kadeřávku "Frosty" 3 měsíce po izolaci (tuhé médium MS)... 24 Obr. 12. Regeneranty po aplikaci kolchicinu, vysázené v nesterilních podmínkách (perlit) v 8cm květnících... 24 Obr. 13. Regenerant resyntetizované řepky ve výsevním substrátu v 12cm květníku (ře-... pice "Brachina" kadeřávek "Kadeřávek zelený")... 25 Obr. 14. Regenerant resyntetizované řepky ve výsevním substrátu v 12cm květníku (ře-... pice "Arktus" kadeřávek "Pentland Brig")... 25 Obr. 15. Regeneranty resyntetizované řepky různého původu ve výsevním substrátu v... 12cm květnících, připravené k jarovizaci... 26 Obr. 16. Porovnání morfologie výchozích komponent a z nich resyntetizovaného genotypu... 26 Obr. 17. Porovnání morfologie listů výchozích komponent a z nich resyntetizovaného genotypu... 27 Obr. 18. Dopěstování regenerantů resyntetizované řepky tvorba poupat... 27 Obr. 19. Kvetoucí resyntetizovaná řepka... 28 Obr. 20. Detail fertilního květu ("Arktus" "Pentland Brig")... 28 Obr. 21. Detail sterilního květu haploidní rostliny se zakrnělými prašníky ("Tokyo Cross" "Vysocké")... 29 5

6

I. Cíl metodiky Cílem předkládané metodiky je zavést do šlechtitelské praxe komplexní a efektivní postup, umožňující tvorbu specifických materiálů řepky olejky pro rozšíření diverzity genofondu, a to vzdálenou hybridizací genotypů brukve řepáku (řepice, vodnice mateřská komponenta) a brukve olejné (kadeřávku, zelí, kapusty a kedlubnu otcovská komponenta) s využitím biotechnologických postupů. II. Vlastní popis metodiky II.1. Úvod Řepka olejka (Brassica napus L.) je tzv. amfidiploidní druh, pocházející ze spontánní interspecifické hybridizace mezi brukví řepákem (řepice, B. rapa) a zelnou brukví (B. oleracea). Intenzivním šlechtěním řepky v posledních dekádách došlo k výraznému zlepšení výnosu semene a dalších agronomických parametrů, což ale zároveň vedlo k zúžení genetické diverzity šlechtitelských materiálů (Girke et al. 2012; Rahman 2013). Šlechtění řepky olejky je v současnosti zaměřeno nejen na tvorbu vysoce výnosných odrůd, ale také na specifické složení mastných kyselin v oleji, na zvýšenou rezistenci vůči významným chorobám a abiotickým stresorům. V důsledku neustálých změn klimatu, projevujících se mj. i častějšími výskyty sucha, přívalovými dešti a atypickým průběhem zimy, nabývá na důležitosti i šlechtění na adaptabilitu ke specifickým půdně-klimatickým podmínkám. Úspěšné šlechtění výkonných odrůd řepky vyžaduje neustálou inovaci šlechtitelských programů. Jedním z nejdůležitějších předpokladů se ukazuje dostatečná genetická variabilita výchozích materiálů. U řepky olejky na rozdíl od jiných významných kulturních plodin nejsou přírodní populace pro rozšíření diverzity k dispozici (Prakash a Hinata 1980). K rozšíření variability genofondu lze využít tzv. resyntézu, kdy nové genotypy vznikají křížením vybraných zástupců řepice a brukve, časnou izolací nezralých zárodků z vyvíjejících se šešulí a jejich dopěstováním v in vitro (Hilgert-Delgado et al. 2015). Bylo prokázáno, že resyntetizované genotypy jsou odlišné od materiálů řepky, vyšlechtěných a pěstovaných v současnosti (Sosnowska et al. 2010), takže mohou sloužit jako zdroj nové variability ve šlechtitelských programech se zaměřením na cytoplazmatickou a jadernou pylovou sterilitu, odolnost k patogenům a toleranci ke stresům (Warwick et al. 2009). Zástupci výchozích komponent řepky (řepice, vodnice, kadeřávek, zelí, kedluben, kapusta apod.) se vyznačují širokou variabilitou z hlediska morfologie i agronomických charakteristik a představují perspektivní zdroj heteróze a dalších znaků (Wu et al. 2014). Využití resyntetizovaných genotypů k přímé tvorbě odrůd řepky olejky není možné zejména z důvodu špatné kvality semene těchto materiálů. Jde především o vysoký obsah glukosinolátů a kyseliny erukové, typický u většiny výchozích komponent resyntézy (Jesske et al. 2013). Požadované vlastnosti lze ale přenést křížením do konvenčních šlechtitelských materiálů (Hilgert-Delgado et al. 2017). 7

II.2. Předpěstování výchozích rostlin Technické vybavení a materiál - Výsevní substrát - Výsevní truhlíky, květináče o průměru 8, 12 cm a kontejnery 19 19 cm - Vícesložkové tekuté hnojivo - Klimatizovaná růstová komora fotoperioda 16 / 8 h, teplota 18 /14 (den / / noc), intenzita osvětlení 84 µmol / m 2 / s - [Skleník fotoperioda 16 / 8 h, teplota 15 25 /10 15 (den / noc), s přisvětlováním (sodíkové výbojky 210 W)] nebo studené pařeniště - [Jarovizační komora fotoperioda 8 /16 h, teplota 2 5, přisvětlování zářivkami] - Lednice teplota 4 5 Doporučený pracovní postup 1,2 a) jařiny (jarní řepice, vodnice, květák, brokolice): výsev do temperovaného a přisvětlovaného skleníku v průběhu ledna, přepichování klíčenců do 8cm květníků, přesázení do 12cm květníků, výsadba do kontejnerů 19 19 cm, přenesení a částečné zapuštění kontejnerů do pařeniště od poloviny dubna při zajištění ochrany proti přízemním mrazíkům b) ozimy k jarovizaci v přirozených podmínkách (kadeřávek, ozimá řepice) kadeřávek: výsev v průběhu června do truhlíků, přesázení do květníků a následně do kontejnerů, jejich úplné zapuštění do substrátu a ponechání na stanovišti během zimního období ozimá řepice: viz kadeřávek, s posunutým termínem výsevu (½ srpna ½ září) c) ozimy k jarovizaci v řízených podmínkách (zelí, kedluben, kapusta) počáteční fáze viz kadeřávek; přenesení kontejnerů s rostlinami do jarovizační komory před nástupem silnějších mrazů (obvykle v průběhu listopadu); vyskladňování z jarovizace od počátku února v závislosti na výv. fázi dalších výchozích rostlin, při zajištění min. délky jar. periody 8 týdnů 1 Přestože lze pro předpěstování nebo jarovizaci využít přirozených podmínek, pro sladění doby kvetení odlišných typů výchozích materiálů a minimalizaci ztrát je důrazně doporučeno výchozí rostliny předpěstovat v podmínkách řízených. 2 Pro zajištění lepší synchronizace kvetení mezi oběma výchozími rodiči je při předpěstování v řízených podmínkách vhodné komponentu s rychlejším přechodem do generativní fáze (obvykle řepice, vodnice) vysévat v několika termínech s odstupem 3 4 týdnů. Další možností regulace u ozimů je prodloužení doby jejich umístění v jarovizaci nad rámec jarovizační periody (maximálně však na 4 5 měsíců po této době obvykle rostliny přechází do generativní fáze i při jarovizační teplotě) 8

II.3. Křížení výchozích rostlin Technické vybavení a materiál - Výchozí rostliny v kontejnerech na počátku kvetení - Klimatizovaná růstová komora (viz kapitola II.2) - Izolační pytle z netkané textilie nebo pergamenu - Izolační sáčky z celofánu - Kancelářské sponky - Kádinka - Výseč hliníkové fólie (alobalu) na zakrytí kádinky - Lihový popisovač - Pomůcky pro opylování v poupěti (nůžky, pinzeta, 70% etanol v mechanickém rozprašovači, popisovací štítky, obyčejná tužka) Pracovní postup - Umístění výchozích rostlin s poupaty do kultivační komory cca 7 dní před začátkem křížení, izolace květenství (nebo celých rostlin) otcovské komponenty před začátkem kvetení 3 - Bezprostředně před křížením odizolování rostliny otcovské komponenty, odběr jednotlivých čerstvých květů do kádinky v pozdních dopoledních nebo časných odpoledních hodinách 4 a zakrytí alobalem, opětovné zaizolování květenství (resp. rostliny) - Přenesení kádinky s květy na místo křížení - U mateřské komponenty odstřihnutí všech květů - Dezinfekce rukou a pomůcek lihem - Otevření poupat mateřské komponenty pinzetou a odstranění prašníků 5 - Přenesení pylu z květů otcovské komponenty na blizny mateřské komponenty - Po opylení izolace květenství sáčkem z celofánu, fixace sáčku kancelářskými sponkami - Označení květenství štítkem (datum křížení, identifikace otcovské komponenty, počet opylených poupat) 3 Při nedostatku místa v kultivační komoře lze zaizolovanou otcovskou komponentu ponechat v neřízených podmínkách (pařeniště, pole, skleník) 4 Jakmile se začíná uvolňovat pyl z prašníků, obvykle mezi 11:00 14:00 5 8 10 poupat z jednoho květenství; postupuje se od nejstaršího poupěte, u kterého se očekává vykvetení následujícího dne; nad posledním kastrovaným poupětem se odstraní několik poupat, nejmladší poupata v terminální části květenství se ponechávají; pro získání dostatečného počtu šešulí je třeba opylit cca 20 30 poupat určité mateřské komponenty (genotypu) 9

II.4. Odběr šešulí a izolace nezralých vajíček (tzv. embryo rescue ) Technické vybavení a materiál - Kádinka - Cestovní chladnička - Nůžky - Lihový popisovač - Laboratorní sklo a pomůcky plynový nebo lihový kahan, kyvety se šroubovacím víčkem (10 20ml) - 70% etanol - 20% roztok SAVO - Sterilní výseče filtračního papíru (průměr cca 10 15 cm) - Sterilní pinzeta, jehla a ostrý skalpel - Sterilní destilovaná voda (vychlazená) - Kultivační médium DM (Tab. 2) v 50ml Erlenmeyerových baňkách, uzavřených alobalem - Parafilm - Flowbox pro práci ve sterilním prostředí - Binokulární lupa - Lednice Pracovní postup - Odstřihnutí šešulí (i se stopkou) z mateřské komponenty 11. den po opylení - Umístění šešulí do kádinky a přenesení do laboratoře v cestovní chladničce - Ve flowboxu sterilizace šešulí v kyvetě 70% etanolem 2 min., následované 20% SAVEM 20 min. 6 - Opláchnutí chlazenou sterilní destilovanou vodou 3 po 5 minutách - Podélné naříznutí šešulí skalpelem na filtračním papíru pod binokulární lupou, šetrné vyjmutí nezralých vajíček a jejich přenesení na povrch kultivačního média 7 6 V případě výskytu kontaminací explantátů je možné prodloužit délku sterilizace až na 40 minut 7 Při nařezávání šešulí a manipulaci s vajíčky je třeba se vyvarovat poškození embryí uvnitř nezralých vajíček 10

II.5. Regenerace resyntetizovaných rostlin Technické vybavení a materiál - Izolovaná vajíčka na kultivačním médiu - Flowbox pro práci ve sterilním prostředí - Lednice - Kultivační místnost I. fotoperioda 16/8 h (den/noc), trubicové zářivky, světelná intenzita 250 µmol/m 2 /s, 25 - Kultivační místnost II. fotoperioda 16/8 h (den/noc), trubicové zářivky, světelná intenzita 250 µmol/m 2 /s; 19 - Plynový nebo lihový kahan - 70% Etanol - Přístrojové vybavení a spotřební materiál pro přípravu kultivačních médií Pracovní postup - Umístění baněk s vajíčky do Kultivační místnosti I. - Subkultivace zelených kotyledonárních embryí od délky 3 mm na čerstvém DM médiu (Tab. 2) - Odříznutí části děložních lístků (1/2 až 2/3) pro podpoření vývoje vrcholového meristému a subkultivace embryí na regenerační médium (RM, Tab. 3) v 90 mm plastových Petriho miskách - Přenesení do Kultivační místnosti II - Subkultivace regenerantů s 1 2 pravými lístky na RM médium v Erlenmeyerových baňkách - Subkultivace regenerantů ve fázi 3 5 pravých lístků na MS médium (Tab. 1) - Namnožení (klonování) rostlin z nodálních segmentů na MS médiu 8 II.6. Zdvojení chromozómové sádky, dopěstování regenerantů do generativní fáze a přemnožení Technické vybavení a materiál - Kultivační místnost I (viz předchozí kapitola) - Skleník - Jarovizační komora - Výsevní substrát nebo perlit, zahradnický substrát - 0,05% vodný roztok kolchicinu (w/v) - Kádinka - Potravinářská fólie 8 Vzhledem k relativně nízké účinnosti zdvojování chromozómové sádky regenerovaných resyntetizovaných rostlin (cca 30 50 %) a vyšším ztrátám při dopěstování je pro zachování určitého resyntetizovaného genotypu doporučováno daný genotyp naklonovat na minimálně 5 (lépe 10) ks a diploidizaci pak realizovat v několika cyklech po 2 3 ks rostlin od genotypu 11

- Previcur - Vícesložkové tekuté hnojivo - Potravinářská fólie - Perforovaná fólie - Izolátory (pytle, sáčky) z netkané textilie, pergamenu nebo celofánu - Květináče o průměru 8 a 12 cm a kontejnery 19 19 cm - Archy filtračního papíru Pracovní postup - Vyjmutí regenerantů z kultivačních nádob a opláchnutí pod vlažnou tekoucí vodou a odstranění zbytků agarového média - Osušení regenerantů na filtračním papíru (zabránit vadnutí rostlin) - Ponoření celých rostlinek do 0,05% roztoku kolchicinu, zakrytí nádoby potravinářskou fólií, umístění do Kultivační místnosti I (viz předchozí kapitola) na 24 hod. - Opláchnutí rostlinek pod mírným proudem vlažné vodovodní vody - Ponoření celých rostlinek do 0,15 % roztoku Previcuru na 20 minut - Vysazení rostlin do květináčů o průměru 8 cm s výsevním substrátem (nebo perlitem 9 ) a zalití roztokem Previcuru - Zakrytí květníků perforovanou fólií na 7 10 dní pro vytvoření vlhkého mikroklima (pozor na přemokření substrátu!) a pěstování ve skleníku do fáze 4 8 pravých listů, přesázení rostlin do 12cm květníků s výsev. substrátem - Jarovizace rostlin (fáze 8 10 pravých listů) v jarovizační komoře 8 týdnů 10 - Vysázení regenerantů do kontejnerů o velikosti 19 19 cm, naplněných zahradnickým substrátem - Umístění vysázených rostlin do vytápěného skleníku s přisvětlováním (v zimních měsících) nebo do venkovních izolátorů - Provádění pravidelné kontroly zdravotního stavu a preventivní ošetření rostlin proti chorobám a škůdcům, přihnojování - Průběžná izolace celých rostlin nebo jednotlivých květenství před počátkem kvetení sáčky z netkané textilie (resp. celofánu nebo pergamenu) - Odstraňování sterilních rostlin (bez prášivého pylu) - U rostlin s neschopností samoopylení v květu (z důvodu autoinkompatibility) ruční opylování v poupěti - Sklizeň semen 11 9 Při použití perlitu je třeba po cca 3 5 dnech rostliny zalít roztokem hnojiva 10 Pouze pokud alespoň jedna z výchozích komponent byla ozimého typu 11 Pokud je dodržena technologická kázeň při křížení výchozích komponent, samoopylené mateřské genotypy se mezi dopěstovanými rostlinami nevyskytují. Spolehlivé odlišení resyntetizovaných genotypů od mateřské komponenty (řepice nebo vodnice) se provádí průtokovou cytometrií nebo karyologickou analýzou. V praxi se využívá především hodnocení rostlin podle morfologie rostliny, kdy resyntetizovaná řepka vykazuje i znaky a/nebo vlastnosti otcovské komponenty 12

III. Srovnání novosti postupů Předkládaná metodika je svého druhu první česky vydanou komplexní prací, zaměřenou na efektivní tvorbu nových genových zdrojů řepky s využitím vzdálené hybridizace a biotechnologických postupů. Pro regeneraci nevyvinutých embryí a dopěstování regenerantů byla použity typy médií DM a RM se specifickým složením, pro účel resyntézy řepky dosud nevyužívané. IV. Popis uplatnění metodiky Metodika je určena především pro pracovníky šlechtitelských a výzkumných pracovišť, kteří ji budou využívat v procesu šlechtění, resp. při výzkumu. Metodika bude uplatněna ve šlechtitelských a výzkumných programech, zaměřených na efektivní produkci resyntetizovaných genotypů řepky olejky, využitelných pro rozšíření diverzity genofondu této olejniny. V. Ekonomické aspekty Zařazením dosud pro tento účel nevyužívaných typů médií a optimalizací postupů izolace a regenerace byla výrazně zvýšena efektivita již publikovaných postupů (o cca 40 60 %). Díky tomu byl podstatně zredukován požadovaný počet opylených poupat, nutný pro získání dostatečného počtu resyntetizovaných embryí a následně i rostlin. Pro požadovaný počet regenerantů tak postačuje udržovat pouze 1 2 rostliny mateřského a jednu rostlinu otcovského genotypu. Optimalizovaný postup vzdálené hybridizace a následné regenerace nevyvinutých zárodků navíc eliminuje výskyt mateřských genotypů v populaci dopěstovaných resyntetizovaných rostlin. Tím dochází k úspoře místa i dalším nákladům, nutných k identifikaci a manipulaci s nežádoucími genotypy. Unikátnost resyntézy řepky spočívá v tom, že lze vytvořit zcela nové genotypy s vlastnostmi, které v současnosti nemusí být k dispozici v dosažitelném genofondu (odrůdy, šlechtitelské materiály, položky genové banky). Může se jednat např. o odolnost k suchu a chorobám, rychlejší růst v podzimním období, specifická kvalita oleje apod. Náklady spojené s aplikací metodiky lze rozdělit do dvou skupin; na fixní náklady, související s pořízením a odpisy kultivačních komor a přístrojového vybavení, koupí nebo pronájmem pozemků, mzdami kmenových pracovníků apod., a na náklady variabilní, jako je např. spotřeba energií, materiálu a úkolových mezd personálu. Nezbytným vybavením jsou specializované kultivační (resp. jarovizační) komory s řízeným světelným a teplotním režimem (250 tis. 1 mil. Kč), laminár- 13

ní box pro práci v aseptickém prostředí (150 300 tis. Kč), autokláv pro přípravu kultivačních médií a sterilizaci nástrojů (70 120 tis. Kč), biologický termostat (30 200 tis.kč), analytické váhy (20 100 tis. Kč), přístroj pro přípravu deionizované vody (20 60 tis. Kč), laboratorní vařič (10 30 tis. Kč), magnetická míchačka (10 20 tis. Kč), předvážky (5 10 tis. Kč), nástroje pro dávkování kapalin (3 5 tis. Kč) a ph metr (2 10 tis. Kč). V případě udržování donorových rostlin v řízených podmínkách, resp. dopěstování a přemnožení rostlin ve skleníku je třeba kalkulovat i pořízení další kultivační komory (300 tis. 1 mil. Kč), resp. skleníku. Předpokládá se, že uživatelé metodiky již mají částečně nebo kompletně vybavenou laboratoř explantátových kultur, potřebné kultivační komory a zaškolený personál. Významnou položkou nákladů variabilních je spotřeba elektrické energie na provoz osvětlovacích těles kultivačních boxů a chlazení na požadovanou teplotu. Na jednu donorovu rostlinu řepky je třeba počítat s příkonem 17 20 W (sodíková výbojka), na rostlinu v in vitro podmínkách 1,5 2,0 W (lineární zářivka). Náklady na chlazení se odvíjejí od způsobu odvodu přebytečného tepla (odsávání, izolace osvětlovacích těles od prostoru s rostlinami apod.). Náklady na přípravu kultivačních médií (250 600 Kč / l média) souvisí s kvalitou (čistotou) výchozích chemikálií a složením jednotlivých typů médií. Výsledné jednotkové náklady na produkci požadovaných rostlinných materiálů výrazně ovlivňují i další faktory, jako je fyziologický stav donorových rostlin v průběhu odběrů, regenerační schopnost použitých genotypů, výskyt kontaminací aj. K dalším významným nákladovým položkám patří i např. výdaje spojené s periodickou údržbou a revizí přístrojového vybavení apod. 14

VI. Seznam použité související literatury Girke A., Schierholt A., Becker H.C. (2012). Extending the rapeseed genepool with resynthesized Brassica napus L. I: Genetic diversity. Genet Resour Crop Ev 59: 1441 1447. Hilgert-Delgado A.A., Endlová L., Rychlá A., Vrbovský V., Klíma M. (2017). Resyntéza řepky olejky, její využití ve šlechtění a rozšíření diverzity genofondu. In: Pazderů, K. (ed.). Osivo a sadba 2017. Česká zemědělská univerzita v Praze, Katedra rostlinné výroby, Praha. pp. 136 142. Hilgert-Delgado A.A., Klíma M., Viehmannová I., Urban M.O., Fernández- Cusimamani E., Vyvadilová M. (2015). An effective method of resynthesized oilseed rape embryo production via ovule culture of different crosses between winter turnip rape and curly kale. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 120: 191 201. Jesske T., Olberg B., Schierholt A., Becker H.C. (2013). Resynthesized lines from domesticated and wild Brassica taxa and their hybrids with B. napus L.: genetic diversity and hybrid yield. Theoretical and Applied Genetics 126: 1053 1065. Klíma M., Vyvadilová M., Kučera V. (2004). Production and utilization of doubled haploids in Brassica oleracea vegetables. Horticultural Science (Prague), 31: 119 123. Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473 497, DOI 10.1111/ j.1399-3054.1962.tb08052.x. Prakash S., Hinata K. (1980). Taxonomy, cytogenetics and origin of crop Brassicas, a review. Opera Botanica 55: 1 57. Rahman H. (2013). Breeding spring canola (Brassica napus L.) by the use of exotic germplasm. Can J Plant Sci 93: 363 373. Sosnowska K., Szała L., Olejnik A., Cegielska-Taras T. (2010). Wstepne badania nad resynteza rzepaku ozimego (Brassica napus L.) preliminary study on resynthesis of winter oilseed rape (Brassica napus L.). Rośtliny oleiste Oilseed Crops Tom XXXI 257 265. Warwick S.I., Francis A., Gugel R.K. (2009). Guide to Wild Germplasm of Brassica and Allied Crops (tribe Brassiceae, Brassicaceae) 3rd Edition. Wu J., Li F., Xu K., Gao G., Chen B., Yan G., Wang N., J. Qiao, J. Li, H. Li et al. (2014). Assessing and broadening genetic diversity of a rapeseed germplasm collection. Breeding Science 64: 321 330. 15

VII. Seznam publikací, které předcházely metodice Hilgert-Delgado A.A., Endlová L., Klíma M. (2016). Embryogenní schopnost a využití technologie dihaploidů u vybraných kříženců resyntetizované řepky s donorem kvality. Úroda 64 (12 věd. př.): 145 48. Hilgert-Delgado A.A., Endlová L., Klíma M., Fernández-Cusimamani E. (2016). Diferenciace profilů mastných kyselin v oleji a dalších parametrů kvality semen kříženců resyntetizovaných a konvenčních řepek. Úroda 64 (12 věd. př.): 141 144. Hilgert-Delgado A.A., Endlová L., Rychlá A., Vrbovský V., Klíma M. (2017). Resyntéza řepky olejky, její využití ve šlechtění a rozšíření diverzity genofondu. In: Pazderů, K. (ed.). Osivo a sadba 2017. Česká zemědělská univerzita v Praze, Katedra rostlinné výroby, Praha. pp. 136 142. Hilgert-Delgado A.A., Klíma M., Viehmannová I., Urban M.O., Cusimamani E., Vyvadilová M. (2015). Efficient resynthesis of oilseed rape (Brassica napus L.) from crosses of winter types B. rapa B. oleracea via simple ovule culture and early hybrid verification. Plant Cell Tissue and Organ Culture 120(1): 191 201. Hilgert-Delgado A.A., Klíma, M., Urban M. (2014). Efektivní resyntéza řepky pomocí techniky ovule culture. Úroda 62 (12 věd. př.): 179-182. Hilgert-Delgado A.A., Vrbovský V., Endlová L., Urban M., Klíma M. (2015). Tvorba nových genotypů a hodnocení vybraných parametrů kvality semene resyntetizované řepky. Úroda 63 (12 věd. př.): 142 145. Hilgert-Delgado A.A., Klíma M., Viehmannová I., Eloy F.C. 2014. Effective Techniques for Resynthesized Rapeseed Production of Contrasting Components via Ovule Culture and Flow Cytometry. Tropentag 2014, Prague, Czech Republic September 17 19, 2014 Dostupné na: http://www. tropentag.de/2014/proceedings/node90.html Rychlá A., Hilgert-Delgado A.A. (2016). Rozšíření genové diverzity v kolekci ozimých řepek. In: Papoušková, L. (ed.). Racionální rozšiřování kolekcí v rámci Národního programu rostlin. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha 6 - Ruzyně. pp. 77 82. 16

VIII. Přílohy Tabulka 1. Médium MS (Murashige a Skoog 1962) Složka Navážka (mg/l) Složka Navážka (mg/l) NH 4 NO 3 1 650,000 FeSO 4 7 H 2 O 27,800 KNO 3 1 900,000 Na 2 EDTA 2 H 2 O 37,300 CaCl 2 2 H 2 O 440,000 kys. nikotinová 0,500 MgSO 4 7 H 2 O 370,000 pyridoxin HCl 0,500 KH 2 PO 4 170,000 thiamin 0,100 KI 0,830 glycin 2,000 H 3 BO 3 6,200 inositol 100,000 MnSO 4 4 H 2 O 22,300 agar 8 000,000 ZnSO 4 7 H 2 O 8,600 sacharóza 30 000,000 Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,250 kasein 1 000,000 CuSO 4 5 H 2 O 0,025 ph 5,8 CoCl 2 6 H 2 O 0,025 Tabulka 2. Diferenciační médium DM (Klíma et al. 2004) Složka Navážka (mg/l) Makroelementy (NH 4 ) SO 2 4 134 KNO 3 3000 NaH 2 PO 4 2 H 2 O 150 MgSO 4 7 H 2 O 500 CaCl 2 2 H 2 O 750 FeNa EDTA 40 Mikroelementy H 3 BO 3 3 MnSO 4 4 H 2 O 10 ZnSO 4 7 H 2 O 2 Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,25 CuSO 4 5 H 2 O 0,025 CoCl 2 6 H 2 O 0,025 Vitamíny Thiamin HCl 10 Pyridoxin HCl 1 Kys. nikotinová 1 Myo inositol 100 Aminokyseliny Glutamin 800 Serin 100 Fytohormony 6 BAP 0,2 IAA 0,2 Sacharóza 20 g Agar 8 g ph 5,8 6,0 17

Tabulka 3. Regenerační médium RM (Klíma et al. 2004) Složka Navážka (mg/l) Makroelementy (NH 4 ) NO 3 1650 KNO 3 1900 KH 2 PO 4 170 MgSO 4 7 H 2 O 370 CaCl 2 2 H 2 O 440 FeNa EDTA 36,7 Mikroelementy H 3 BO 3 6,2 MnSO 4 4 H 2 O 22,3 ZnSO 4 7 H 2 O 8,6 Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,25 CuSO 4 5 H 2 O 0,025 CoCl 2 6 H 2 O 0,025 KI 0,83 Vitamíny Thiamin 0,1 Pyridoxin 0,5 Kys. nikotinová 0,5 Myo inositol 100 Glycin 2 Sacharóza Agar 10 g 10 g ph 5,9 18

Obr. 1. Květenství se šešulemi řepice 11 dní po vzdálené hybridizaci, v den odběru Délka nejstarších šešulí (vč. stopky) cca 30 mm Obr. 2. Šešule řepice s nezralými vajíčky Průměr vajíček 0,9 1,0 mm 19

Obr. 3. Vajíčka řepice po izolaci na tuhém médiu DM Průměr vajíček 0,9 1,0 mm Obr. 4. Zygotické embryo v časném kotyledonárním stádiu 26 dní po izolaci Délka embrya 2 mm 20

Obr. 5. Kotyledonární embryo 33 dní po izolaci Délka embrya cca 2,5 mm Obr. 6. Embryo 40 dní po izolaci Délka embrya cca 3 mm 21

Obr. 7. Embryo 50 dní po izolaci, na čerstvém DM médiu Délka embrya cca 10 mm Obr. 8. Regenerace prvního pravého listu 55 dní po izolaci Průměr embrya cca 8 mm 22

Obr. 9. Počátek regenerace rostliny z embrya 2 měsíce po izolaci, na tuhém médiu RM Délka embrya cca 20 mm Obr. 10. Dobře vyvinutý první pravý list - kříženec řepice "Bulharská" a kadeřávek "Frosty" na tuhém RM médiu Délka embrya cca 20 mm 23

Obr. 11. Regenerant křížence řepice "Svalöfs Duro" a kadeřávku "Frosty" 3 měsíce po izolaci (tuhé médium MS) Průměr dna baňky 90 mm Obr. 12. Regeneranty po aplikaci kolchicinu, vysázené v nesterilních podmínkách (perlit) v 8cm květnících Stáří rostlin 3 měsíce po izolaci 24

Obr. 13. Regenerant resyntetizované řepky ve výsevním substrátu v 12cm květníku (řepice "Brachina" kadeřávek "Kadeřávek zelený") Stáří rostliny 5 měsíců po izolaci Obr. 14. Regenerant resyntetizované řepky ve výsevním substrátu v 12cm květníku (řepice "Arktus" kadeřávek "Pentland Brig") Stáří rostliny 5 měsíců po izolaci 25

Obr. 15. Regeneranty resyntetizované řepky různého původu ve výsevním substrátu v 12cm květnících, připravené k jarovizaci Stáří rostlin 4,5-5 měsíců Obr. 16. Porovnání morfologie výchozích komponent a z nich resyntetizovaného genotypu Vpravo nahoře vodnice (mateřská komponenta), dole červené zelí, vlevo nahoře resyntetizovaný genotyp 26

Obr. 17. Porovnání morfologie listů výchozích komponent a z nich resyntetizovaného genotypu Vlevo řepice "Bulharská" (mateřská komponenta), vpravo kadeřávek "Scarlet" Obr. 18. Dopěstování regenerantů resyntetizované řepky - tvorba poupat Původ: řepice "Arktus" kadeřávek "Pentland Brig" 27

Obr. 19. Kvetoucí resyntetizovaná řepka Původ: bílá vodnice "Tokyo Cross" červené zelí "Vysocké" Obr. 20. Detail fertilního květu ("Arktus" "Pentland Brig") 28

Obr. 21. Detail sterilního květu haploidní rostliny se zakrnělými prašníky ("Tokyo Cross" "Vysocké") 29

Název: Autorský kolektiv: Klíma M. a kol. (2018): Resyntéza řepky olejky z brukve řepáku a brukve zelné Ing. Miroslav Klíma, Ph.D. Mgr. Alois Hilgert-Delgado, Ph.D. Ing. Tereza Ulvrová Ing. Pavla Bryxová Mgr. Pavel Vítámvás, Ph.D. RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc. RNDr. Klára Kosová, Ph.D. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507 Praha 6 Ruzyně 161 06 Vydáno bez jazykové úpravy Metodika byla schválena MZe ČR, osvědčením o certifikaci č. (bude doplněno) Kontakt na autory: klima@vurv.cz ISBN 978-80-7427-283-7 30

Poznámky