Principy vývoje HPLC metod

VÝVOJ HPLC METODY

Principy vývoje HPLC metod 1. Definice problému 2. Experiment s hlavními proměnnými 3. Vyhodnocení 4. Optimalizace 5. Řešení problémů 6. Validace metody HPLC vývoj metody 2 2

Definice problému Jaký je účel? Jaký je cíl metody? Analytický Preparativní Kvantitativní x kvalitativní analýza? Jaké jsou vlastnosti analytu a vzorku? Očekávaná koncentrace ve vzorku? Jsou k dispozici standardy? Je nutné rozdělit všechny složky vzorku? Molekulová hmotnost Náboj pozitivní / negativní Hydrofobicita Affinita - zámek a klíč vazebná místa Rozpustnost & stabilita ph, iontová síla, organická rozpouštědla HPLC vývoj metody 3 3

Analytická x preparativní Analytical Requirements Linearity Precision Accuracy Sensitivity Assay reproducibility Robustness Preparative Requirements Recovery Product purity Capacity Costs Scale up Process throughput Speed HPLC vývoj metody 4 4

Vývoj metody Výběr způsobu separace mapa ph Optimalizace gradientové eluce Spád gradientu Koncentrace mobilní fáze Předmět sledování Zahlcení: šířka a tvar píku HPLC vývoj metody 5 5

Běžné způsoby Reverzní fáze Stacionární fáze hydrofobní, mobilní hydrofilní Kolony: silikagel, polystyrene kovalentně modifikovaný alkylovými řezězci 3-18 C Př. octadecylsilane (ODS) - C18 Mobilní fáze: pufrovaná voda + organická rozpouštědla(propanol CH3CN, CH3OH) gradientová eluce Ion-Exchange (IEC) Ion exchange interakce mezi kationty nebo anioty analytu a stacionární fáze s opačným nábojem Stacionární fáze: polystyren, silikagel modifikovaný funkčními skupinami, např. kvartérní aminy Mobilní fáze: pufry obsahující vzrůstající koncentrace solí (NaCl, MgCl 2, K 3 PO 4, NH 4 SO 4 ) Gradientová eluce HPLC vývoj metody 6 6

Vyhodnocení Rozlišení Stupeň separace mezi analyty a dalšími látkami přítomnými ve směsi Výtěžnost Hmotnostní výtěžnost Aktivitní výtěžnost Kapacita HPLC vývoj metody 7 7

Strategie vývoje metody pro izokratickou a gradientovou eluci při RP HPLC HPLC vývoj metody 8 8

A METHOD-DEVELOPMENT STRATEGY THAT MAXIMIZES COLUMN LIFE: REVERSED-PHASE HPLC OF IONIZABLE COMPOUNDS [START] Basic com poun ds havin g low-p H instability SAMPLE Initia l separ ation [STEP 1] [STEP 1a] Add 2 0 mm TEA o r TEA acet ate Re- adjust p H Ta ilin g pe aks Zorbax SB-C18 or SB-C8 ph 2 (1-3), 2 0-50 mm b uffer T= 30 C (am bient to 80 C, SB-C18 to 90 C) Adjust % ACN for 0.5 < k < 20 Poorly retained basic compounds OR ZORBAX StableBond [STEP 2a] Vary column temp., up to 80 C; Band spacing up to 90 C for Zo rbax SB-C18 p roble ms Band spacing p roble ms Increase or decrease % of organic modifier by 5% (v/v) Band spacing p roble ms Chan ge o rgan ic modifie r (M eoh or THF) Adjust % organic for 0.5 < k < 20 Resta rt at STEP [2] Band spacing p roble ms [STEP 2] [STEP 3] Band spacing p roble ms [STEP 1d] BASIC COMPOUNDS ( Ion Pai ring) Use M eoh or ganic m odifier, 25-50 mm he xane sulfonic a cid, 10 mm p H ³ 3 bu ffer Adjust % Me OH for 0.5 < k < 20 Band spacing pr oblem s [STEP 1c] [STEP 1b] Low ph ph ³3 [STEP 4] Change bonded-phase functionality to Zorbax SB-CN, SB-Pheny l, or SB-C3 Resta rt at STEP [1] Increase or decrease % of or ganic m odifier by 5 %( v/v) Band spacing p roble ms Vary te mpe ratur e within re comm ende d ran ge for bonded phase Band spa cin g pr oblem s [STEP 1e] Přehled vývoje metod: Začni při nízkém ph, postupuj směrem k vyššímu ph ZORBAX Eclipse XDB/Bonus RP OR [STEP 6a] Vary te mpe ratur e within re comm ende d ran ge fo r bonded phase Band spacing p roble ms Band spacing pr oblem s Chan ge o rgan ic modifie r (ACN or THF) Adjust for 0.5 < k < 20 Resta rt at STEP [6] [STEP 5] Zorbax Eclipse XDB-C8 or XDB-C18 ph 7 (6-9), 2 0-50 mm b uffer T= 30 C (am bient to 40 C) Adjust % Me OH for 0.5 < k < 20 Band spacing pr oblem s Increase or decrease % of organic modifier by 5% (v/v) Band spacing pr oblem s Band spacing pr oblem s [STEP 6] [STEP 7] [STEP 8] Chan ge b onde d-ph ase fu nctiona lity to Zorbax Eclipse XDB-Phenyl or Bonus RP Resta rt at STEP [5] Poorly retained acidic co mpo unds [STEP 5d] Increase or decrease % of or ganic m odifier by 5 %( v/v) Poor retention or ba nd spa cing pr oblem s Band spacing p roble ms Chan ge o rgan ic modifie r ( ACN or THF ) Adjust for 0.5 < k < 20 Band spacing pr oblem s [STEP 5c] [STEP 5b] ACIDIC COMPOUNDS (Ion Pairi ng) Use M eoh or ganic m odifier, 25-50 mm te trabu tylamm onium ph ospha te, 10 mm p H ³ 7 bu ffer Adjust % Me OH for 0.5 < k < 20 Vary te mpe ratur e within re comm ende d ran ge for bonded phase Band spa cin g pr oblem s Chan ge o rgan ic modifie r ( ACN or THF ) [STEP 5e] Mid ph ph 7 Band spacing pr oblem s Adjust for 0.5 < k < 20 [STEP 9] ZORBAX Extend-C18 [STEP 10a] Vary te mpe ratur e within re comm ende d ran ge fo r bonded phase Band spacing p roble ms Zorbax Extend-C18 ph 1 0.5 (9-12 ); 5 m M am mon ia, or TEA, or 10-50 mm organic buffer, or borate buffer T= 25 C (am bient to 40 C) Adjust % MeOH for 0.5 < k < 20 Band spacing pr oblem s Chan ge o rgan ic modifie r (ACN or THF) Adjust for 0.5 < k < 20 [STEP 10] Band spacing pr oblem s High ph ph ³9 Band spacing pr oblem s Try different HPLC mode. Call Agilent Technologies Technical Support (800) 227-9770. Adapted and updated by R.D. Ricker, B.A. Bidlingmeyer and J.J. Kirklan d, from J.J. Kirkland, LC/GC, 14 (1996) 486. ph- Rang e fo r O ptimal Co lumn lif e ABBREVIATIO NS Recommended Column 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ACN = acetonitrile HPLC vývoj metody ZO RBAX 9 Stab le Bon d MeOH = methanol ZO RBAX 9 Eclip se XDB TEA = triethylamine ZO RBAX Bon us RP Unique Selectivity TFA = trifluoroacetic acid ZO RBAX Exte nd - C18 Zorbax is a registered trademark of Agilent Technologies. THF = tetrahydrofuran

Základní rozlišení Resolution R 1.5 R = V N 4 Efficiency Avg. = 5.000 Best = 25.000 Length Particle size ( a-1) a Separation a > 1.2 Stationary Mobile phase k' k'+1 Retention 2 < K < 10 % H2O Rovnice pro izokratickou eluci HPLC vývoj metody 10 10

Doporučené cíle vývoje metody Odpovídající rozlišení pro všechny píky, Rs 1.7 Retence prvního píku by měla být minimálně k=1 Doba analýzy kratší než 30 minut, raději 20 minut Robustnost a spolehlivost method Použití pufrované mobilní fáze nejdříve zkusit nízké ph HPLC vývoj metody 11 11

Kvalita separace Kritické rozlišení rozlišení mezi nejhůře separovaným párem píků analyzovaných látek na chromatogramu HPLC vývoj metody 12 12

HPLC vývoj metody 13 13

ph významný parametr pří vývoji metody HPLC vývoj metody 41 41

ph důležitý parametr při vývoji metody Retence ionizovatelných sloučenin je výrazně ovlivněna ph Ionizovatené sloučeniny (kyseliny a báze) mohou být analyty nebo součásti matrice Přesná kontrola ph zlepšuje reprodukovatelnost metody Rozsah ph 1 12 zajišťuje maximální flexibilitu při vývoji metody HPLC vývoj metody 42 42

Základem vývoje metody je změna retence ionizovatelných sloučenin změnou ph Nenabité analyty mají lepší retenci (kyseliny při nízkém ph a báze při vysokém ph) Silanolové skupiny na silikagelu ionizují při středním ph, se vzrůstající retencí bazických analytů (např. možné ion-exchange interakce) Výběr mobilní fáze a typu kolony pro optimalizaci retence a selektivity při vývoji metody HPLC vývoj metody 43 43

Vývoj metody pro základní sloučeniny ve vztahu k ph Region A Logical method development starts at low ph, where the underlying silica silanols on a RP-HPLC column are protonated. This means that basic compounds (of great interest in the pharmaceutical and other industries) do not tail on the underlying silica support because there is no negatively charged silanols. Also at low ph, retention times are short since most basic compounds are charged. Acidic compounds may be in their protonated form and have increased retention. Retention times are usually stable with small changes in ph, producing a robust method Volatile mobile phases, such as formic acid or TFA, are often used at low ph with LC/MS. HPLC vývoj metody 44 44

Vývoj metody pro základní sloučeniny ve vztahu k ph Region B At neutral ph, care must be taken not to develop methods around the pka of the analyte, as this can lead to large changes in retention with small changes in ph The underlying silica surface becomes charged (approximately ph 4-6); thus, these silanols can cause basic compounds to tail These silanols must be covered up by endcapping the column, using additives such as TEA (less desirable) or using polar bonded phases As ph increases, silica dissolution must be prevented by heavily encapping the column This ph region (for the compound s pka) will change with each analyte HPLC vývoj metody 45 45

Vývoj metody pro základní sloučeniny ve vztahu k ph Region C In this region, basic compounds are in their free base form, giving them more retention and different selectivity; thus, complex mixtures of basic compounds may be easier to separate at high ph Retention changes little in this region - thus robust methods can be developed; retention is longer, but this may be the only region where some basic compounds will separate At high ph silica breakdown must be prevented by innovative bonding chemistry and use of the proper silica HPLC vývoj metody 46 46

Proč vyvíjet metodu při nízkém ph? Kyseliny jsou protonované maximální retence Silanolové skupiny jsou protonizované, čímž jsou minimalizovány ion-exchange interakce s bazickými sloučeninami Dobrý tvar píku Reprodukovatelnost v dlouhém období Výborný výběr mobilní fáze HPLC vývoj metody 47 47

ph je hlavním parametrem při výběru stacionární fáze At low ph bonded phase breaks down by hydrolysis of the siloxane bond breakdown is faster at higher temperature breakdown is faster for shorter-chain phases (C3, CN, Phenyl) HPLC vývoj metody 48 48

With Dimethyl-Substituted Phases, Unprotected Siloxane Bonds Are Hydrolyzed at Low ph Shorter chain phases hydrolyze more easily than longer chain phases. For example, R = C18 is more stable than R = C3. HPLC vývoj metody 49 49

Short-Chain, Dimethyl Bonded Phases Are Especially Unstable at Low ph (e.g., ph 2.0) 100 % k' REMAINING 80 60 40 20 0 0 1000 Si-(Me) 2Me COLUMN VOLUMES Si-(Me) 2PrCN Si-(Me) 2nBu 2000 3000 4000 5000 6000 Si-(Me) 2iPr Kirkland, J.J., J.L. Glajch, and R.D. Farlee, Analytical Chemistry (1989), 61, 2. HPLC vývoj metody 50 50

Sterically Protected, Monofunctional Silane Bonding HYDROLYTICALLY UNSTABLE CONVENTIONAL HYDROLYTICALLY STABLE STERICALLY PROTECTED HPLC vývoj metody 51 51

ZORBAX Products Have Unique Chemistry for Extended Column Lifetime at Different ph Ranges Low ph Range StableBond (5 phases: C18, C8, C3, CN, Phenyl) designed for low ph sterically protected silanes non-endcapped highly temperature stable short-chain phases very stable Extremely low LC/MS bleed HPLC vývoj metody 52 52

Method Development Scheme Start at Low ph Add 20 mm TEA STEP 1a Tailing peaks ZORBAX SB-C18 or SB-C8 ph 2 (1-3) 20-50 mm buffer, T = 30 C (ambient 80 C) Adjust %ACN for 0.5 <k < 20 STEP 1 Poorly retained basic compounds STEP 1b STEP 2a Change Temperature Band spacing problems Band spacing problems Change % organic Band spacing problems STEP 2 STEP 3 Ion-Pairing of Basic Compounds Change organic modifier (MeOH or THF) Adjust % organic for 0.5 < k <20 Restart at STEP 2 Band spacing problems STEP 4 Try ZORBAX SB-CN, SB-C3 or SB-Phenyl Restart at STEP 1 HPLC vývoj metody 53 53

Recommended Starting Conditions for RP- HPLC Method Development Approach Separation Variable Column Stationary Phase Dimensions Preferred Initial Choice SB-C18 or SB-C8 4.6 x 75 mm or 4.6 x 150 mm Particle Size 3.5 µm 5 µm Pore Size 80Å: M.W. 4000, 300Å: M.W. 4000 Mobile Phase Solvents A-B % B solvent Variable Water-acetonitrile Buffer 25 mm NaH 2 PO 4, ph 3 Additives i.e. amines and ion-pair reagents Flow Rate or 0.1% TFA or Formic acid TEA, Hexane sulfonate as needed 1-2 ml/min Temperature 30-35 C HPLC vývoj metody 54 54

Choose StableBond at Low ph Superior column lifetime due to patented sterically protecting bonding technology Fully-hydroxylated ultra-pure silica improves peak shape Five different 80Å bonded-phases SB-C18, SB-C8, SB-CN, SB- Phenyl, SB-C3 provide optimum selectivity with exceptional lifetime Four different 300Å bonded-phases for selectivity options with protein and peptide separations HPLC vývoj metody 55 55

Method Development SB-C18 at Low ph Separation of Steroids 1 2 3 Column: Mobile Phase: Flow Rate: Temperature: Detection: Sample: 0 2 4 6 8 10 12 Time (min) 4 ZORBAX Rapid Resolution SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm 50% ACN 50% 20 mm NaH 2 PO 4, ph 2.8 1.0 ml/min RT UV 254 nm 1. Estradiol 2. Ethynylestradiol 3. Dienestrol 4. Norethindrone Method development scheme recommends starting with SB-C18 at low ph, which provides an excellent separation of these steroids and impurities. HPLC vývoj metody 56 56

Method Development SB-C18 at Low ph Separation of Plant Extract Flavones, Flavanones, and Phenolic Esters 1 2 3 4 Column: ZORBAX Rapid Resolution SB-C18 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 22% ACN 78% NaH 2 PO 4, ph 2.5 Flow Rate: 1.0 ml / min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Caffeic acid 2. Impurity 3. Luteolin 5 4. Naringenin 5. Apigenin 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 Time (min) To obtain k=1 for caffeic acid requires 22 minute analysis time HPLC vývoj metody 57 57

Method Development Change Organic Modifier : Separation of Plant Extract Flavones, Flavanones, and Phenolic Esters 1 2 3 4 5 Column: ZORBAX Rapid Resolution SB-C18 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 40% MeOH 60% NaH 2 PO 4, ph 2.5 Flow Rate: 1.0 ml/min Temperature: RT Detection: Sample: UV 254 nm 1. Caffeic acid 2. Impurity 3. Naringenin 4. Luteolin 5. Apigenin 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) 35 Methanol as the organic modifier changes selectivity and increases the analysis time. HPLC vývoj metody 58 58

Method Development Change Bonded-Phase Separation of Plant Extract on SB-CN Flavones, Flavanones, Phenolic Esters Column: ZORBAX Rapid Resolution SB-CN, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: ACN: NaH 2 PO 4, ph 2.5 Flow Rate: 1.0 ml/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Caffeic acid 2. Impurity 3. Luteolin 4. Naringenin 5. Apigenin 22% ACN: 78% Buffer 25% ACN: 75% Buffer 1 1 3 4 3 4 5 5 2 2 0 5 10 15 20 25 Time (min) 0 2 4 6 8 10 12 Time (min) SB-CN with stronger mobile phase reduces analysis time by 50% and maintains retention of k=1 on 1 st peak. HPLC vývoj metody 59 59

SB-CN Optimizes Retention and Resolution Phytoestrogens and Isoflavones Columns: 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 30% ACN: 70% NaH 2 PO 4, ph 2.5 Flow Rate: 1.0 ml/min Temperature: 35 C Sample: 1. Estriol 2. Daidzen 3. Quercetin 4. Genistein 5. Diethylstilbestrol 1 2 SB-C18 SB-CN 5 3 4 2 5 4 1 3 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 Time (min) Time (min) SB-CN reduces analysis time by 50% and increases retention of early eluting peaks. Method development procedure followed to get to this point. HPLC vývoj metody 60 60

Why Develop RP-HPLC Methods at Mid-pH? Compounds of interest are unstable at low ph Improved solubility of analytes at mid ph Increase retention of basic compounds May have better selectivity in the ph range 3 8 HPLC vývoj metody 61 61

ph is a Major Consideration in Bonded Phase Selection At intermediate and high ph bonded phase breaks down by hydrolysis of silica HPLC vývoj metody 62 62

Method Development Scheme Mid ph Range Add 20 mm TEA STEP 5a Tailing peaks ZORBAX Eclipse XDB-C18 or C8 ph 7 (6-9) 20-50 mm buffer, T = 30 C (ambient 60 C) Adjust %ACN for 0.5 <k < 20 STEP 5 Poorly retained acidic compounds STEP 5b STEP 6a Change Temperature Band spacing problems Band spacing problems Change % organic Band spacing problems STEP 6 STEP 7 Ion-Pairing of Acidic Compounds Change organic modifier (MeOH or THF) Adjust % organic for 0.5 < k <20 Restart at STEP 6 Band spacing problems STEP 8 Try ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl or Bonus-RP Restart at STEP 5 HPLC vývoj metody 63 63

Recommended Conditions for Mid-pH Method Development Separation Variable Column Preferred Initial Choice Stationary Phase Eclipse XDB-C18 Dimensions 4.6 x 75 mm or 4.6 x 150 mm Particle Size 3.5 µm 5 µm Mobile Phase Solvents A-B Water-acetonitrile % B solvent Variable Buffer 25 mm Na 2 HPO 4, ph =7 Acetate/acetic acid Additives i.e. amines and ion-pair reagents TEA, tetrabutylammonium as needed Flow Rate 1-2 ml/min Temperature 30-35 C HPLC vývoj metody 64 64

Choose Eclipse XDB for Mid-pH Long lifetime at mid-ph with dense bonding and double endcapping Strong silica for long lifetime Double endcapping provides excellent peak shape Three different bonded-phases (C18, C8, Phenyl) for selectivity optimization HPLC vývoj metody 65 65

Good Resolution with Eclipse XDB-C18 at Mid-pH SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm ph 3 ph 7 10 mm TEA 3 1 1 2 4 2 4 3 0 2 4 6 8 Time (min) 0 2 4 6 8 10 12 14 Time (min) Mobile Phase: 20% Methanol: 80% 20 mm phosphate buffer Flow Rate: 1.0 ml/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Nizatidine 2. Famotidine 3. Cimetidine 4. Pirenzipine Better selectivity and improved retention occur at ph 7. HPLC vývoj metody 66 66

Eclipse XDB Selectivity Options Maximize Retention at ph 7 Columns: 4.6 x 150 mm, 5 µm Mobile Phase: 10% ACN: 90% Na 2 HPO 4, ph 7 Flow Rate: 1.5 ml/min Temperature: 35 C Detection: UV 254 nm Sample: 1. Procainamide 2. n-acetylprocainamide 3. n-propionylprocainamide Eclipse XDB-C18 Eclipse XDB-C8 Eclipse XDB-Phenyl 1 2 1 1 2 1 2 3 3 3 0 5 10 Time (min) 0 5 10 Time (min) 0 5 10 Time (min) Eclipse XDB-Phenyl provides improved retention of these procainamides. HPLC vývoj metody 67 67

Bonus-RP Provides Alternate Selectivity at Mid-pH Polar alkyl-amide bonded-phase for unique selectivity Improves peak shape of basic compounds Triple-endcapped for good lifetime at mid-ph Enhanced low-ph stability (sterically protecting bonding) for alternate selectivity at low ph Compatible with 100% aqueous mobile phases Silica-based Column Packing with Alkyl/amide Stationary Phase O Si NH O Zorbax Rx-SIL Silica Support Surface HPLC vývoj metody 68 68

Why Develop RP-HPLC Methods at High ph? Compounds of interest not soluble at lower ph Compounds of interest not stable at lower ph Increase retention of basic compounds by analyzing them in noncharged form Improve selectivity HPLC vývoj metody 69 69

Silica Based HPLC Columns are Now a High ph Choice New technologies to protect silica from dissolution provide good lifetimes at high ph Superior efficiency of silica-based columns provides high resolution Robust methods can be established using the same parameters as used at low ph HPLC vývoj metody 70 70

Choose Extend-C18 for High ph Patented bidentate C18-C18 bonding for superior high ph stability up to ph 11.5 Improved performance over polymeric columns Excellent peak shape with double endcapping LC/MS at high ph (ammonium hydroxide) with high efficiency C18 C18 Extend-C18 Si Si Bidentate Structure O O Silica support HPLC vývoj metody 71 71

Method Development at High ph STEP 9 ZORBAX Extend-C18 ph 10.5 (9-12) 5 mm ammonia, or TEA, or 10 50 mm organic or borate buffers T = 25 C (ambient 40 C) Adjust MeOH for 0.5 <k < 20 STEP 10a Vary temperature within recommended range for bonded phase Band spacing problems Band spacing problems STEP 10 Change organic modifier (ACN or THF) Adjust for 0.5 < k<20 Band spacing problems Try different HPLC mode HPLC vývoj metody 72 72

Recommended Conditions for High ph Method Development Separation Variable Column Preferred Initial Choice Stationary Phase Extend-C18 Dimensions 4.6 x 75 mm or 4.6 x 150 mm Particle Size 3.5 µm 5 µm Pore Size 80Å: M.W. 4000, 300Å: M.W. 4000 Mobile Phase Solvents A-B Water-methanol % B solvent Variable Buffer 20 mm TEA ph =11 ammonium hydroxide, ph 10 Flow Rate 1-2 ml/min Temperature RT - 30 C HPLC vývoj metody 73 73

Separate Basic Compounds in Their Free Base Form at High ph A Separation of ß-Blocker Drugs with Zorbax Extend-C18 at ph 11.5 C:\DIRECT\DATA1\109222.01R 0.0 to 30.0 min. Low Y=47.258 Span=29.207 1 3 5 1. Pindolol 2. Metoprolol 3. Oxyprenolol 4. Toluene 5. Propranolol Separation of Antidepressants Using Zorbax Extend- C18 at ph 11.5 B Nortriptyline 2 4 N = 14,060 A s = 1.03 N = 11,500 A s = 0.99 Doxepin I Imipramine Amitriptyline Trimipramine 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 0 2 4 6 8 10 12 14 16 min. Column: Flow Rate: Mobile Phase: Flow Rate: Temperature: 40 C Detectoion: UV at 215 nm ZORBAX Extend-C18 4.6 x 150 mm 0.5mL/min. Panel A: 55% Methanol / 45% 50 mm Pyrrolidine Buffer, ph 11.5 Panel B: 75% Methanol / 25% 50 mm Pyrrolidine Buffer, ph 11.5 Panel A: 1.5 ml / min.; Panel B: 1.0 ml/min. HPLC vývoj metody 74 74

Mobile Phase Considerations for LC/ESI-MS of Proteins/Peptides TFA forms ion pair and suppresses signal Several solutions to for a better signal dilute with a different acid post column (the TFA fix ) lower TFA concentration use a different acid as mobile phase use a different ph range and column HPLC vývoj metody 75 75

High ph Increases Retention of Antihistamines Column: ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 µm Mobile Phase: See Below Flow Rate: 1.0 ml/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Maleate 2. Scopolamine 3. Pseudoephedrine 4. Doxylamine 5. Chlorpheniramine 6. Triprolidine 7. Diphenhydramine ph 7 30% 20 mm Na 2 HPO 4 70% MeOH ph 11 30% 20 mm TEA 70% MeOH 1 2,3 4 7 3 4 t R = 8.5 t R = 11.4 7 5 1 5 6 2 6 0 5 0 5 10 Time (min) Time (min) The retention of this sample of basic compounds increases at high ph. HPLC vývoj metody 76 76

Extend-C18 Provides High Efficiency and Good Peak Shape Mobile Phase: 65% 20 mm TEA, ph 11: 35% MeOH Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Pyridoxine 2. Pyridine 3. n-methylbenzylamine 4. Procainamide 5. n-acetylprocainamide Polymeric-Based Column 4.0 x 250 mm, 5 µm Flow Rate: 0.5 ml/min 1 Extend-C18 4.6 x 250 mm, 5 µm Flow Rate: 1.0 ml/min 1 4 2 2 3 5 3 4 5 0 10 20 30 Time (min) 0 5 10 15 20 Time (min) In comparison to polymeric columns, the Extend-C18 has superior efficiency and peak shape HPLC vývoj metody 77 77

Summary of Phase Selection 1. Choose reversed-phase stationary phase based on separation requirements of your analytes and optimum column lifetime. - Low ph, 1-4 (ZORBAX StableBond) - Intermediate ph, 3-8 (ZORBAX Eclipse XDB) - High ph, 7-12 (ZORBAX Extend C18) - Basic compounds, ph 3-8 (ZORBAX Bonus) 2. If possible, always use low ph values since best chromatography for ionizable compounds; if not, use intermediate ph and doubly end capped packing; if insufficient retention, then choose high ph with bidentate packing 3. Choose smallest particle size consistent with efficiency needs; use Type B sol-gel silica 4. Optimize solvent selection and composition, buffer type, buffer concentration, and temperature; add competing base, if needed HPLC vývoj metody 78 78

Recommended Buffer Choices for High ph Buffer pka Effective ph range Pyrrolidine 11.3 10.3 12.3 Triethylamine (TEA) 10.7 9.7 11.7 1-methyl-piperidine 10.3 9.3 11.3 glycine 9.8 8.8 10.8 TRIS 8.1 7.1 9.1 Borate 9.2 8.2 10.2 Ammonia 9.2 8.2 10.2 Diethylamine 10.5 9.5 11.5 HPLC vývoj metody 79 79

Selektivita kolon HPLC vývoj metody 80 80

PROBLÉMY PŘENOSU HPLC METOD A JEJICH VHODNÉ KOREKCE HPLC vývoj metody 86 86

Při přenosu publikované HPLC metody na jiné pracoviště nastávají mnohdy problémy s interpretací separace sledovaných analytů a nastává problém vůbec reprodukovat publikovanou metodu. A původní laboratoř, B další laboratoř HPLC vývoj metody 87 87

Chromatogram A znázorňuje původní publikovanou metodu Chromatogram B - po přenosu metody do jiné laboratoře Je zřejmé, že nedochází k separaci analytů 5,6 - rozlišení RS < 1,5 Existuje několik příčin proč nedochází k dokonalé separaci: a) chromatografický systém není dostatečně ekvilibrovaný b) došlo ke změně chromatografické kolony c) změna chromatografického (HPLC) systému d) změna v chromatografickém postupu Nedostatečnou ekvilibraci chromatografické kolony jako hrubou chybu vyloučíme a dále budeme rozebírat pouze poslední tři možné příčiny HPLC vývoj metody 88 88

1. Změna chromatografické kolony Změnou kolony (jiný výrobce, jiná šarže) zpravidla dojde ke změně: a) účinnosti kolony (počet teoretických pater, n) b) selektivity (retenční poměr, r 12 ) Proto je vhodné při validaci metody určit chromatografické parametry kolony, které vyhovují pro danou chromatografickou separaci: a) účinnost kolony b) selektivitu c) silanolovou aktivitu Testy chromatografických charakteristik stacionární fáze: - kapacita kolony (účinnost) k pentylbenzenu, n pentylbenzenu - hydrofobicita - silanolová aktivita Validace metody na zvolené chromatografické koloně Určení vhodné alternativní chromatografické varianty. Metoda maximální chromatografické variability, která zahrnuje: 1. optimalizaci chromatografických podmínek 2. předvídání použití různých chromatografických kolon 3. výběr podobných kolon HPLC vývoj metody 89 89

1.1 Optimalizace chromatografických podmínek Sledování vlivu teploty a složení mobilní fáze (% organické fáze nebo strmost gradientu) na RS nebo r12 (vícenásobnou regresí se získá RS mapa akceptovatelných rozlišení při daných chromatografických podmínkách) Při změně rozlišení RS - určení chromatografické podmínky, které budou vyhovovat požadovanému rozlišení. Optimalizace chromatografických podmínek a aplikace na dvě stejné kolony různé šarže HPLC vývoj metody 90 90

1.2 Variabilita chromatografických kolon Variabilita chromatografických kolon a určení RS map Obdobně jako u optimalizace chromatografických podmínek se optimalizují chromatografické kolony Pro alternativní kolony a pak dostáváme nejen chromatografické podmínky pro používanou kolonu, ale i pro alternativní chromatografickou kolonu. Určením tzv. RS map a jejich překryvem pro dvě různé kolony získáme ihned přehled, jak bude vypadat separace na alternativní koloně. HPLC vývoj metody 91 91

1.3 Výběr podobných kolon K celkové selektivitě stacionární fáze přispívají: kapacitní faktor k a dále hydrofobicita (H), stérická selektivita (shape selektivity; S), silanolová aktivita (non-ionized silanol acidity nebo také silanol group capacity, A), kolonová basicita (column basicity; B) a iontově-výměnná kapacita (cation-exchange capacity; C). Pro logaritmus kapacitního faktoru pak platí: Kde κ, α, β,δ, jsou příspěvky solutu a H, S, A, B a C jsou příspěvky stacionární fáze a kde je kapacitní faktor daný distribuční konstantou a fázovým poměrem. Příspěvek hydrofobicity H souvisí s nespecifickými interakcemi solutu se stacionární fází (methylenová selektivita α CH2 ), příspěvky silanolové aktivity A a kolonové basicity B souvisí s možností tvorby vodíkových vazeb mezi solutem a zbytkovými silanolovými skupinami silikagelu. Určením selektivity různých chromatografických kolon (Tanakovy a Engelhardtovy testy) tak můžeme získat přehled o podobných kolonách, které je možné použít pak jako alternativní kolony ke koloně používané (validované). HPLC vývoj metody 92 92

2. Změna HPLC systému nebo HPLC procedury Změna HPLC systému vede ve většině případech ke změnám: 1. mrtvého objemu systému (při gradientu mobilní fáze) 2. změna mimokolonových příspěvků k rozšíření chromatografické zóny 2.1 Mrtvý objem systému Změna mrtvého objemu systému (konstrukce pumpy, změna vnitřního průměru kapilár) vede ke změně mrtvého objemu systému, která může mít vliv na strmost gradientu (zpoždění gradientu, které má vliv na separaci kritických analytů). Na separaci má vliv i tvorba gradientu změna tvorby gradientu z nízkotlakého gradientu na vysokotlaký vede ke zpoždění gradientu a to má pak vliv na separaci kritických analytů. 2.2 Mimokolonové příspěvky Mimokolonové příspěvky k rozšíření chromatografické zóny mají vliv na účinnost systému a změna objemu nástřiku, objemu cely detektoru, vnitřního průměru kapilár nebo jejich délky, může mít vliv na účinnost kolony a to vede ke snížení rozlišení kritických analytů. HPLC vývoj metody 93 93

3. Změna v chromatografickém postupu Ke změně v chromatografickém postupu (metody) může dojít: a) ve změně složení mobilní fáze (změna objemové frakce organického rozpouštědla, ph, koncentrace aditiv [pufry, iontové páry]) b) změnou teploty na chromatografické koloně c) změnou gradientu (použití jiného tvorby gradientu, přechod z vysokotlakého gradientu na nízkotlaký a naopak) HPLC vývoj metody 94 94