Separační metody v analytické chemii. Kapalinová chromatografie (LC) - princip

Transkript

1 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Kapalinová chromatografie (Liquid chromatography, zkratka LC) je typ separační metody, založené na rozdílné distribuci dělených látek ve směsi mezi dvě různé nemísitelné fáze: kapalnou mobilní a stacionární. Stacionární (nepohyblivá) fáze interaguje se složkami vzorku, který jsou unášeny mobilní (pohyblivou) fází, a proto se při pohybu zadržují. 1

2 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Historie: V roce 2013 uplynulo právě 110 let od významného objevu, kdy Михаил Семëнович Цвет (M. S. Cvet, M. S. Tswett) poprvé rozdělil listová barviva na sloupci uhličitanu vápenatého a následně dal technice její jméno - chromatografie. Až o několik desetiletí později se chromatografické techniky staly předmětem zájmu vědců (J. J. van Deemter, J. C. Giddings, A. I. M. Keulemans) a hlubšího bádání. Za důležité objevy v této oblasti byly dokonce uděleny dvě Nobelovy ceny za chemii (1948 A. W. K. Tiselius; A. J. P. Martin a R. M. Synge). Michail Cvet,

3 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Podle způsobu provedení se může LC dělit: kolonová chromatografie (column chromatography - CC) chromatografie na tenké vrstvě (thin layer chromatography - TLC) chromatografie na papíře (paper chromatography - PC) U TLC a PC se mluví o plošném uspořádání. 3

4 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Kolonová chromatografie (LC) Stacionární fáze je umístěna v koloně, což je vlastně trubka z inertního materiálu (sklo, kov, plast) o relativně malém vnitřním průměru (mm - cm). Stacionární fáze je většinou nějaký sorbent, kterým se kolona plní (za sucha nebo za mokra). Jako sorbenty se používá silikagel, oxid hlinitý, celulosa. Velikost sorbentu se pohybuje v řádu µm. Mobilní fáze (eluent) je rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel a různých aditiv a zajišťuje pohyb dělených látek kolonou. Eluent se pohybuje kolonou pouze gravitační silou. Vzorek se nanáší rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle na počátek kolony. 4

5 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Kolonová chromatografie (LC) 5

6 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) tenkovrstevná chromatografie Stacionární fáze je kapalina zachycená v tenké vrstvě (rozdělovací) a nebo je to tuhý adsorbent, který je součástí tenké vrstvy (adsorpční), mobilní fáze je obvykle směs organických rozpouštědel a malého množství vody a aditiv (cyclohexan, toluen, chloroform, dichlormetan, aceton, ethanol, methanol, voda, amoniak, kyselina octová a jejich směsi). Stacionární fáze jsou naneseny na skleněných deskách nebo hliníkových fóliích. Vzorek se nanáší rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle na start. Chromatogram se vyvíjí v uzavřené chromatografické komoře, která je dobře nasycena parami mobilní fáze. 6

7 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) tenkovrstevná chromatografie 7

8 Kapalinová chromatografie (LC) - princip Chromatografie na papíře (PC) Stacionární fáze je kapalina zachycená na papíře (voda) a mobilní fáze je kapalina, obvykle směs organických rozpouštědel a malého množství vody. Vzorek se nanese ve formě malé kulaté skvrnky na papír a poté se mobilní fáze nechá vzlínat póry papíru. Mobilní fáze unáší dělené látky ze vzorku, které se více či méně zpožďují interakcí (rozpouštění nebo adsorpce) se stacionární fází, a tím se vzájemně dělí. Chromatogram se vyvíjí v uzavřené chromatografické komoře, která je dobře nasycena parami mobilní fáze. 8

9 Kapalinová chromatografie (LC) - HPLC HPLC - High Performance Liquid Chromatography V podstatě se jedná o sloupcové uspořádání chromatografie. Na rozdíl od běžné sloupcové chromatografie je součástí HPLC aparatury výkonné vysokotlaké čerpadlo, které umožňuje průtok mobilní fáze kolonou menších rozměrů, v níž je stacionární fáze vázaná na částice o velikosti pouze několik mikrometrů (2-10 µm). Díky tomuto uspořádání dosahuje HPLC vyšší účinnost separace látek za kratší dobu ve srovnání s klasickou sloupcovou chromatografií. 9

10 Kapalinová chromatografie (LC) - HPLC HPLC - High Performance Liquid Chromatography Separace jednotlivých složek směsi (analytů, solutů) je tedy ovlivněna jak povahou stacionární fáze, tak povahou mobilní fáze. Eluce může být provedena buď mobilní fází o konstantím složení (stejné eluční síle) při použití isokratické eluce nebo mobilní fází o zvyšující se eluční síle při gradientové eluci (složení mobilní fáze je během eluce programově měněno ve prospěch silnější eluční složky). 10

11 Kapalinová chromatografie (LC) - HPLC 11

12 HPLC - instrumentace Blokové schéma HPLC. (1) Zásobníky mobilních fází, (2) odplyňovač, (3) směšovač, (4) vysokotlaké čerpadlo, (5) dávkovač vzorku, (6) chromatografická kolona, (7) detektor, (8) sběrač frakcí, (9) datová stanice. 12

13 HPLC - instrumentace HPLC - High Performance Liquid Chromatography Přestože byla LC objevena v roce 1903, nastal její rozvoj až na přelomu 70. a 80 let minulého století. Důvody: nebyly známy vhodné aparatury, zejména citlivé a univerzální detektory (průtokové cely s objemem 10 µl) nebyly k dispozici bezpulsní čerpadla mobilní fáze pracující za vysokých tlaků (až několik desítek MPa). 13

14 HPLC - instrumentace HPLC - High Performance Liquid Chromatography Používané sorbenty nebyly dostatečně účinné a protože se používal průtok mobilní fáze zprostředkovaný pouze gravitační silou a proces dělení byl velmi pomalý, bylo nutné urychlit výměnné procesy v chromatografické koloně. Urychlení procesu a zvýšení účinnosti se dosáhlo zmenšením rozměrů částic náplně čímž se zkrátily cesty vnitřní a vnější difúze (to současně umožnilo pracovat při větším průtoku mobilní fáze). Tento krok ale vyžadoval zvýšení vstupních tlaků na koloně, proto bylo nutné vyvinout čerpadla, která dokáží pracovat s vysokými tlaky. Proto se HPLC nazývala jak metodou vysokotlakou (high pressure) tak metodou vysokoúčinnou (high performance). Protože HPLC vyžadovala velice drahé přístroje, bývala nazývána také velmi drahou kapalinovou chromatografií (high-priced liquid chromatography). 14

15 HPLC - instrumentace Odplynění mobilní fáze (2). Při změně tlaku na výstupu z chromatografické kolony nebo i v koloně nesmí docházet k uvolnění bublinek rozpuštěných plynů. Problémy zavzdušněné mobilní fáze: nestabilita provozu čerpadel (neopakovatelné retenční časy) špatná opakovatelnost dávkovaného objemu vzorku snížení citlivosti detekce 15

16 HPLC - instrumentace Vysokotlaké čerpadlo (4). Na čerpadla jsou kladené vysoké požadavky: výstupní tlaky na čerpadlech se musí pohybovat v širokém rozmezí 1 až 100 Mpa ( atm) změna průtoku mobilní fáze musí být možná v širokém rozmezí (0,1 až 10,0 ml/min) průtok mobilní fáze musí být přesný (do 1 %) a správný (do 1 %) průtok mobilní fáze musí být bezpulsní a bez monotónních změn materiály použité ke konstrukci čerpadel musí být odolné vůči korozi i při použití agresivních mobilních fází (nerezová ocel, titan, keramika) vnitřní objem čerpadel má být co nejmenší, aby umožnil rychlou výměnu mobilní fáze 16

17 HPLC - instrumentace 17

18 HPLC - instrumentace Dávkování vzorku (5). Dva typy dávkování vzorku: manuální smyčkové dávkovače na principu přepínacích ventilů automatické dávkovače různé konstrukce (tzv. autosamplery). 18

19 HPLC - instrumentace Dávkování vzorku (5). Manuální dávkování 19

20 HPLC - instrumentace Dávkování vzorku (5). Automatické dávkování vzorku Automatické dávkovače jsou spojeny se zásobníkem vzorků, ve kterém jsou umístěny vialky uzavřené pryžovým septem nebo perforovanou zátkou z polypropylenu. Výhody autosampleru: vzorky jsou chráněné před světlem a mohou být chlazeny opakované dávkování vzorku z jedné vialky různé objemy nástřiku 20

21 HPLC - instrumentace Dávkování vzorku (5). 21

22 HPLC - instrumentace Dávkování vzorku (5). 22

23 HPLC - instrumentace Kolona (6). Každá kolona je složena ze dvou částí - vlastní tělo kolony, kterým je v podstatě rovná trubice s hladkým vnitřním povrchem, a koncovka kolony. Koncovka má tři funkce: zajistit těsnost systému v oblasti tlaků používaných v HPLC distribuovat mobilní fázi i analyt vždy rovnoměrně přes celý průřez kolny zadržovat náplň kolony Tělo kolony má za úkol tudíž udržet uvnitř kolony sorbent a proto jsou na konstrukci kolony jsou kladeny určité požadavky: musí být chemicky inertní musí odolávat poměrně vysokým tlakům vnitřní povrch pláště kolony musí být dostatečně hladký 23

24 HPLC - instrumentace Kolona (6). Kolona je naplněna stacionární fází, což je v současné době nejčastěji kapalná stacionární fáze nanesená na nosiči nebo chemicky ukotvené na nosiči (nepolární C30,C18,C8, C4; polární aminopropyl, diol, kyanopropyl) 24

25 HPLC - instrumentace Detektory (7). Detektory jsou v HPLC systému umístěny za chromatografickou kolonou a zaznamenávají rozdíl v signálu mezi průchodem čisté mobilní fáze a mobilní fáze obsahující analyt. Ideální HPLC detektor by měl mít následující vlastnosti: odezva pro všechny analyty univerzálnost (detektory na bázi aerosolu, UV) selektivita (FL, MS) linearita spolehlivost a snadnost použití nedestruktivnost signál nezávislý na složení mobilní fáze (gradientová eluce) signál nezávislý na změně teploty a průtoku kvalitativní informace pro detekované píky (MS) 25

26 HPLC - instrumentace Detektory (7). Využití jednotlivých HPLC detektorů v praxi: závisí na vlastnostech analytu a matrice požadované citlivosti dostupnosti detektoru (cena) cíle analýzy 26

27 HPLC - instrumentace Detektory (7). Šum a drift detektoru Šum (noise) zahrnuje všechny nepravidelné změny signálu detektoru (kolísání odezvy detektoru a je zřejmé, že významně limituje citlivost detektoru). Šum je způsoben změnou elektrického signálu, nestabilitou lampy detektoru, vlastností detekční cely, teplotními fluktuacemi a dalšími faktory. Drift ukazuje dlouhodobou nestabilitu základní linie a je vyjadřován jako průměrný sklon obálky šumu v příslušných jednotkách za hodinu. 27

28 HPLC - instrumentace Detektory (7). Šum a drift detektoru 28

29 Stacionární fáze Stacionární fáze mohou také být rozčleněny podle chromatografického módu, který je použit pro separaci, na: normální reverzní ionexy HILIC HIC gely (fáze pro SEC) Podle jejich chemického složení se dělí na: anorganické oxidy (silikagel, oxid zirkoničitý, hlinitý a titaničitý) chemicky vázané fáze na bázi silikagelu polymerní hybridní stacionární fáze na bázi grafitového uhlíku 29

30 Chromatografické systémy Chromatografické systémy se člení podle typu separací, které probíhají na stacionární fázi na: Systémy s normálními fázemi (NP-HPLC) Systémy s reverzními fázemi (RP-HPLC) Iontově výměnná chromatografie (IEC) Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) Molekulová vylučovací chromatografie (SEC) 30

31 Chromatografické systémy Systémy s normálními fázemi (NP-HPLC) V systému s normálními fázemi (NP - normal phase) jsou pro separaci látek používány polární stacionární fáze (silikagel, oxid hlinitý) a mobilní fáze s nižší polaritou (binární směsi dvou rozpouštědel s odlišnou polaritou např. ethanol hexan) než má stacionární fáze. Retence látek na koloně se zvyšuje s rostoucí polaritou analytů a klesá s rostoucí koncentrací polárního rozpouštědla v mobilní fázi. 31

32 Chromatografické systémy Systémy s reverzními fázemi (RP-HPLC) Při chromatografii na reverzních fázích (RP reversed phase, v češtině termín obrácené fáze) je mobilní fáze polární. Obvykle je to směs vodné složky (voda, zředěné vodné roztoky kyselin či bazí, anebo pufry) s polárními organickými rozpouštědly, která jsou mísitelná s vodou (alkoholy, acetonitril, či méně polární tetrahydrofuran). Stacionární fáze pro separace v reverzním uspořádání mají nepolární charakter (chemicky vázané fáze na bázi silikagelu C18, C8, phenyl). Retence látek na koloně se snižuje s rostoucí polaritou analytů a klesá s rostoucí koncentrací organického rozpouštědla v mobilní fázi (roste s rostoucí polaritou mobilní fáze). 32

33 Chromatografické systémy Systémy s reverzními fázemi (RP-HPLC) Silně polární a iontové látky jsou na nepolárních fázích zadržovány velmi slabě nebo vůbec. Chromatografické chování látek iontové povahy lze snadno ovlivnit volbou ph mobilní fáze. Změnou ph mobilní fáze dochází k potlačení disociace slabých kyselin (ph < 7) či slabých bází (ph > 7). retenční faktor k ph neutrální látky bazické látky kyselé látky rozsah ph pro silikagel rozsah ph pro stabilní sorbenty 33

34 Chromatografické systémy Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) polární stacionární fáze molekula H 2 O mobilní fáze 34

35 Chromatografické systémy Molekulová vylučovací chromatografie (SEC) Proces dělení molekul ve vylučovací, nebo-li gelové chromatografii (gel permeation chromatography = GPC; size exclusion chromatography = SEC), je založen na rozdělování molekul podle jejich velikosti v koloně naplněné pórovitým polymerním gelem. Základní mechanismus separace spočívá v rozdílném pronikání nebo propouštění jednotlivých molekul rozpuštěné látky do pórů částic gelu. 35

36 Chromatografické systémy Iontově výměnná chromatografie (IEC) Iontově výměnná chromatografie (ion exchange chromatography; IEC), neboli chromatografie na měničích iontů (ionexech, iontoměničích), je založena na silných elektrostatických interakcích mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče (stacionární fáze) a opačně nabitými ionty v okolním roztoku. 36

37 HPLC použití v praxi Obecně všude tam, kde se analyzují organické látky. 37