Hmotnostní detekce v separačních metodách IV. - Hmotnostní analyzátory - Kvadrupólový analyzátor - Iontová past - Orbitální past - Iontová cyklotronová resonance - Tandemová MS a techniky fragmentace iontů Hmotnostní analyzátor Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua
Kvadrupólový analyzátor (Q) http://www.waters.com Kvadrupólový analyzátor Analyzátor tvořen 4 paralelními tyčemi kruhového nebo hyperbolického průřezu, na něž je vkládáno napětí. Vstupující ionty začnou oscilovat. Oscilace jsou stabilní pouze pro ionty s určitým poměrem m/z a jen tyto ionty kvadrupólem projdou. Ostatní jsou zachyceny na tyčích. Skenováním jsou propouštěny postupně všechny ionty z požadovaného rozsahu spektra ( hmotnostní filtr ).
Filtrace iontů Kladně nabitý ion s nízkou m/z: Kladně nabitý ion s vysokou m/z: - reaguje rychle na změny el. pole - reaguje pomalu na změny el. pole 1. Aplikace stejnosměrného napětí na dvojici tyčí: Průchod všech iontů Všechny ionty se vybijí na tyčích, žádný neprojde Filtrace iontů 2. Aplikace stejnosměrného napětí a střídavého napětí na dvojici tyčí: U Střídavé napětí superponované na kladné stejnosměrné napětí ~ t - kladně nabité ionty mají tendenci projít středem - střídavá složka více ovlivní lehčí ionty, které se vybijí na tyčích intenzita Tyto ionty neprojdou Tyto ionty projdou ~ Projdou jen těžší ionty m/z
Filtrace iontů U t Střídavé napětí superponované na záporné stejnosměrné napětí - kladně nabité ionty mají tendenci přiblížit se k tyčím (vybít se) - střídavá složka více ovlivní lehčí ionty, které projdou ~ intenzita Tyto ionty projdou Tyto ionty neprojdou ~ m/z Projdou jen lehčí ionty Filtrace iontů Obě dvojice tyčí zkombinujeme, uvnitř se vytvoří kvadrupólové pole Kvadrupól nastavujeme tak, abychom umožnili průchod pouze úzce vymezené skupině iontů Tyto ionty projdou intenzita Tyto ionty neprojdou Tyto ionty neprojdou Ekvipotenciální křivky elektrického pole kvadrupólu. m/z Skenováním kvadrupólu zaznamenáme hmotnostní spektrum iontů.
Elektrické pole kvadrupólu z y x r 0 Elektrický potenciál uvnitř kvadrupólu (2D pole):, cos Ω 2 Pohyb iontů v kvadrupólovém poli Během letu kvadrupólem v ose z musí mít iont stabilní trajektorii v osách x a y tak, aby nenarazil na kovové tyče; pro každou hodnotu m/z je tedy potřeba zvolit vhodné U DC a V AC (při konstantní frekvenci RF napětí). Stabilitní diagram pro m/z: graf závislosti parametru a (velikost stejnosměrné složky pole) na parametru q (velikost střídavé složky pole). Vymezuje oblasti stabilních trajektorií 4 Ω 2 Ω
Skenování kvadrupólu Grafické znázornění stabilitního diagramu pro 3 ionty (m/z 28, 69 a 219). Při skenování se současně mění a a q tak, aby jejich poměr byl konstantní. Snížením poměru a/q se zvyšuje oblast m/z (iontů), které projdou analyzátorem. Současně se snižuje rozlišení. Při skenu pro jednotkové rozlišení všech m/z se mění a a q tak, aby sledovaly čárkovanou čáru. Každý ion se měří jen velmi krátkou dobu, ve zbylém čase končí na tyčích kvadrupólu. Pozn: Skenování do 1000 u, sken 1s, ion se měří 1/1000 s. Snížení rozsahu = zvýšení citlivosti. Kvadrupólový analyzátor Obecně: Jednoduchý skenující hmotnostní analyzátor, který se používá v základních (levných) GC/MS a LC/MS přístrojích. Má nízké rozlišení a nízkou přesnost určení hmotnosti. Toleruje vyšší tlak v oblasti analyzátoru, používá se i jako fokusační prvek nebo kolizní cela. Typické aplikace: základní analyzátor v běžných GC/MS a nejlevnějších LC/MS Rozlišení: jednotkové (lepší pro hyperbolické tyče) Přesnost určení hmotnosti: 0.1 u (až 5 ppm) Hmotnostní rozsah: 2000 (4000 u) Rychlost skenu: max 5000 u/s
RF-only multipóly (kvadrupóly, hexapóly, oktapóly) Stejnosměrné napětí rovno nule, aplikuje se jen střídavé napětí. Propuští všechny ionty. Využití: iontová optika ( ion guides ), kolizní cely. Efektivní potenciál multipólů kvadrupól Multipóly nižších stupňů (kvadrupól): - vyšší účinnost fokusace iontů - 0 radiální pozice dodekapól Multipóly vyšších stupňů (hexa-, oktapól) snížení negativního efektu prostorového náboje, lepší zpracování divergujícího iontového svazku Iontová past (IT) https://www.physics.drexel.edu/
Iontová past Iontová past je zařízení, které uzavírá ionty v prostoru pomocí elektrických či magnetických polí nebo jejich kombinací. WOLFGANG PAUL 1989 za fyziku Paulova past využívá k zachycení iontů statická a oscilující radiofrekvenční elektrická pole. lineární rf Paulova past (2D) sférická rf Paulova past (3D) Sférická iontová past iontový zdroj vstupní koncová elektroda prstencová elektroda výstupní koncová elektroda detektor Sférická past je tvořena prstencovou elektrodou a dvěma vzájemně propojenými koncovými hyperboloidickými elektrodami (trojrozměrný kvadrupól). Uvnitř pasti je helium (1 mtorr).
Sférická iontová past Mezi elektrody se vkládá vysokofrekvenční (RF) napětí x z y r 0 cos Ω Výsledný elektrický potenciál uvnitř pasti (3D pole):,, cos Ω 2 2 Sférická iontová past Ekvipotenciální plocha v pasti má tvar sedla a dynamicky se mění (rotuje kolem osy z) ionty jsou stabilizovány v minimu x z y doi:10.1103/revmodphys.62.531
Zachycení iontů v pasti Zavádění iontů do pasti ( nástřik ) je umožněno systémem iontové optiky, která funguje jako brána (-V otevřeno, V zavřeno). Délka plnění pasti je řízena tak, aby nedošlo k její přeplnění. Ion zůstane v pasti zachycen, pokud se nachází uvnitř stabilitního diagramu. Jeho oscilace musí být stabilní jak v ose z, tak v rovině x-y. Pohyb iontu v 3D pasti Stabilitní diagram - závislost parametru a (DC) na q (RF) vymezuje oblasti, kde je ion o dané hmotnosti stabilní (zůstane v pasti) nebo nestabilní (zanikne na elektrodách nebo je vypuzen). Zachycení iontů v pasti Přeplnění pasti: Pokud by se do pasti dostalo příliš mnoho iontů, tak by ty vnější stínily pole těm uvnitř a došlo by ke zhoršení rozlišení, snížení signálu a posunu m/z jak zabránit přeplnění pasti? předsken výpočet z předchozího skenu předsken (Thermo) před vlastním skenem se provede velmi krátký předsken, kdy se zjistí počet iontů přicházejících do pasti. Podle toho se upraví doba otevření brány. výpočet z předchozího skenu (Bruker) doba, po kterou je brána otevřena se počítá z množství iontů v předchozím skenu. Helium tlumící a kolizní plyn: Do pasti je kontinuálně zaváděno He. Slouží ke snížení kinetické energie iontů (zvýšení rozlišovací schopnosti a citlivosti) a jako kolizní plyn pro MS n experimenty.
Skenování iontové pasti Na prstencovou elektrodu se aplikuje tzv. fundamentální RF napětí. Frekvence je konstantní, mění se amplituda V. Stejnosměrné napětí se neaplikuje; a z =0). Postupně se zvyšuje amplituda napětí V. Tím roste q z pro všechny ionty až dosáhne limitu stability. Tím je ion vypuzen ve směru osy z (na detektor dopadne 50% iontů). Sférická iontová past Obecně: Poměrně levný analyzátor zadržující ionty vyznačující se vysokou rychlostí skenu a umožňující tandemovou MS (vhodný pro určování struktury). Horší rozlišení, omezený rozsah spektra. Typické aplikace analyzátor pro tandemovou MS, spojení s LC i GC, velmi široké použití, možnost kvantifikace Rozlišení: jednotkové (snížením rychlosti skenu může být zvýšeno) Přesnost určení hmotnosti: 0.1 u Hmotnostní rozsah: 2000 (4000 u) Rychlost skenu: max 5000 u/s
Lineární iontová past (2D past, LIT) Lineární iontová past je v podstatě RF only multipól (kvadrupól), na jehož přední i zadní straně jsou umístěny elektrody na vyšším DC potenciálu. Uvnitř multipólu tak vzniká pole umožňující uchovávat a selektivně vypuzovat ionty. Ionty mohou být vypuzeny axiálně i radiálně. LIT segmentovaný kvadrupól, radiální ejekce iontů Thermo Scientific
Vlastnosti lineárních iontových pastí myoglobin Vysoká kapacita: (až 50x ve srovnání se sférickou pastí) minimalizace problémů s prostorovým nábojem, širší lineární dynamický rozsah Vysoká účinnost plnění a detekce iontů: (možnost dvou detektorů) vyšší citlivost (~ 10-20 x ve srovnání se sférickou pastí) Vyšší rozlišení Iontová cyklotronová rezonance (ICR)
Iontová cyklotronová rezonance ICR cela je umístěna uprostřed velmi silného magnetického pole. Ionty jsou zachyceny v pasti kombinací magnetického pole a elektrického potenciálu vkládaného na záchytné desky. V magnetickém poli se ion začne pohybovat po kruhové trajektorii. Frekvence rotace jsou úměrné m/z a pomocí Fourierovy transformace jsou převedeny na hmotnostní spektrum. Iontová cyklotronová rezonance Nabitá částice o rychlosti v se v magnetickém poli začne pohybovat vlivem magnetické (Lorentzovy) síly po kruhové dráze s poloměrem r: Rychlost iontu v můžeme vyjádřit pomocí úhlové frekvence : Kombinací těchto vztahů a Q = ez získáme cyklotronovou úhlovou frekvenci c : Cyklotronová úhlová frekvence c je nezávislá na počáteční rychlosti iontu. Je funkcí magnetické indukce a m/z.
Funkce ICR cely Při excitaci jsou ionty akcelerovány (rezonančně urychleny na vyšší orbit) pomocí RF v širokém pásmu frekvencí na vyšší orbit. Po vypnutí RF ionty pokračují na stejných frekvencích na drahách s vyšším poloměrem. Detekce je založena na měření indukovaného proudu v detekčních deskách. Získaný záznam se převede Fourierovou transformací na spektrum. Funkce ICR cely Při excitaci jsou ionty akcelerovány (rezonančně urychleny na vyšší orbit) pomocí RF v širokém pásmu frekvencí na vyšší orbit. Po vypnutí RF ionty pokračují na stejných frekvencích na drahách s vyšším poloměrem. Detekce je založena na měření indukovaného proudu v detekčních deskách. Získaný záznam se převede Fourierovou transformací na spektrum.
Zpracování signálu Fourierovou transformací FID free induction decay superpozice frekvencí od všech iontů v ICR cele závislost intenzity na čase. FT převede záznam na závislost intenzity na frekvenci. Frekvence se přepočtou na m/z podle vztahu: Hmotnostní spektrum. 2 Iontová cyklotronová rezonance Vysoké rozlišení v ICR: stejná cyklotronová frekvence pro všechny ionty se stejným m/z. Oscilace iontů v ose z (trapping oscilations) způsobené elektrickým polem (nutné k zachycení iontů v cele) ovlivňují cyklotronovou frekvenci a snižují rozlišení. Odstranění vlivu oscilací v ose z novým způsobem distribuce elektrického potenciálu v cele podstatné zvýšení rozlišení. ParaCell, ESI-Qh-FTICR 7 T magnet Nikolaev et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22, 1125-1133
Iontová cyklotronová rezonance Obecně: ICR FTMS je vyjímečná technika (rozlišení, přesnost určení hmotnosti, nároky na vakuum, cena). Je vhodná k tandemové MS. Typické aplikace spojení s LC, speciální analýzy vyžadující velmi vysoké rozlišení určování struktury, analýza proteinů, ropy, komplexních vzorků Rozlišení: velmi vysoké (> 10 000 000) Přesnost určení hmotnosti: pod 1 ppm Hmotnostní rozsah: > 15 000 u Rychlost skenu: vysoká, milisekundy Orbitální past (OT) Orbitrap
Orbitrap K. H. Kingdon, Phys. Rev. 21, 408, 1923 A. Makarov, Anal. Chem. 72, 1156, 2000 R z φ Orbitrap je elektrostatická iontová past sestávající ze soudkové vnější elektrody a vřetenovité středové elektrody. Kolem a podél středové elektrody oscilují ionty s frekvencí nepřímo úměrnou odmocnině z m/z. Obdobně jako u ICR cely je měřen indukovaný proud. Hmotnostní spektrum se získá po Fourierově transformaci signálu. Orbitrap zavádění iontů Ionty jsou dávkovány pomocí zařízení C-trap, což je zakřivená RF-only iontová past naplněná N 2 (10-3 mbar). Ionty jsou kolizně ochlazeny, stlačeny do úzkého svazku a vypuzeny do orbitrapu (tlak 10-10 mbar).
Orbitrap pohyb iontů v analyzátoru, detekce Po vstupu jsou ionty zachyceny v analyzátoru elektrické pole je přitahuje ke středové elektrodě a zároveň působí odstředivá síla. Ionty se začnou točit kolem elektrody, vytvářejí se kroužky iontů se stejnou hodnotou m/z. Ionty ( kroužky ) se zároveň pohybují podél středové elektrody tam a zpět. Frekvence tohoto pohybu je závislá pouze na hodnotě m/z. Detekce iontů: měří se proud indukovaný na vnějších elektrodách FT Orbitrap Popis elektrostatického pole orbitrapu (quadro-logaritmické) v souřadnicích r,z:v k U ( r, z) z 2 2 r 2 / 2 R ln( r / 2 m R m k zakřivení pole, R m charakteristický poloměr, ) Frekvence oscilací podél osy z je úměrná poměru m/z: z k m / z Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost je nepřímo úměrné odmocnině z m/z a přímo úměrné době měření. Př. m/z 100: R=120 000 m/z 400: R=60 000 m/z 1600: R=30 000
Orbitrap varianty analyzátoru Rozlišovací schopnost orbitrapu závisí na intenzitě elektrického pole čím větší, tím vyšší počet oscilací za jednotku času a tím i vyšší rozlišení orbitrapy standardní orbitrapy high-field orbitrapy Standardní Orbitrap: středová elektroda 3.5 kv, rozlišení 60 000 (m/z 400, 768 ms) High-field Orbitrap: středová elektroda 5 kv, rozlišení 280 000 (m/z 400, 768 ms) Michalski et al., Mol. Cell Proteomics 2012, 3, SI Orbitrap Alexander Makarov Obecně: Orbitrap (fy Thermo) byl uvedený na trh v roce 2005 (nejnovější z analyzátorů). Má dobré rozlišení i přesnost určení hmotnosti, ale nedosahuje stejných parametrů jako ICR cely. Výhodou proti FT-ICR je absence magnetu a tedy výrazně lacinější provoz a snadná údržba. Typické aplikace spojení s LC, analýzy vyžadující vysoké rozlišení, široké možnosti využití, proteomika, malé molekuly. Rozlišení: vysoké (až 450 000) Přesnost určení hmotnosti: pod 2 ppm Hmotnostní rozsah: 4000 u (6000 u) Rychlost skenu: milisekundy
Tandemová hmotnostní spektrometrie Thomson mass spectrometry laboratory - Unicamp Tandemová hmotnostní spektrometrie Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS n ) Metody, při kterých je sledovaný ion vybrán (první MS), fragmentován a produkty sledovány analyzátorem (další MS) MS/MS lze provést pomocí přístrojů obsahujících více než jeden analyzátor (tandemová MS v prostoru) nebo v iontových pastech (tandemová MS v čase). K fragmentaci může dojít: 1/ spontánně (metastabilní ionty); PSD 2/ aktivací iontů (kolizemi s neutrálními částicemi, interakcemi s fotony či elektrony); CID, IRMPD, ECD, ETD Metastabilní ionty Ionty s velkou vnitřní energií, které se nerozpadají ve zdroji, ale až v oblasti hmotnostního analyzátoru.
Metody fragmentace iontů Fragmentace za zdrojem (Post Source Decay, PSD) Fragmentace metastabilních iontů ve vakuovém MALDI-TOF. Prekurzory vytvořené ve zdroji (kinetická energie kev) se během letu v letové trubici rozpadají. Fragmenty mají stejnou rychlost jako prekurzor, ale různou kinetickou energii. V TOFu nemohou být rozlišeny (dopadají na detektor ve stejnou dobu), ale v reflektronu ano. Využívá se korelace mezi kinetickou energií fragmentů a jejich hmotností. Př: Metody fragmentace iontů Disociace vyvolaná srážkou (Collision Induced Dissociation, CID) Nejčastější způsob MS/MS analýzy. Fragmentace iontů založená na jejich srážkách iontů s neutrálními částicemi (He, Ar, N 2 ). Po srážce dochází k rychlému převedení translační energie na energii vibrační a k její rychlé distribuci po všech kovalentních vazbách. Dochází ke štěpení nejslabších vazeb. CID se provádí v kolizní cele (srážkové komoře) Př.: CID v iontové pasti MS MS 2 MS 3
CID MS 2 s trojitým kvadrupólem Skeny trojitého kvadrupólu: Tři kvadrupóly spojeny za sebou, prostřední obsahuje plyn (Ar) a slouží jako kolizní cela, kde je možné ionty fragmentovat Standardní analyzátor pro MS/MS, kvantifikace CID MS n s iontovou pastí Iontové pasti umožňují izolaci iontů, jejich aktivaci, fragmentaci a skenování vzniklých fragmentů na jednom místě (v jednom zařízení) MS n až do~10 stupně pravidlo 30/70 ionty s hmotností 30% hmotnosti prekurzoru a nižší nemohou být v pasti stabilizovány Př. Reserpin Rauwolfia
MS/MS v TOF analyzátorech (TOF/TOF) Dvě odlišná řešení: TOF/TOF s CID kolizní celou TOF/TOF s CID kolizní celou: Po výběru prekurzoru selektorem jsou ionty fragmentovány v kolizní cele (CID). Produkty jsou následně akcelerovány do reflektronu. TOF/TOF s LIFT celou: Nedochází k CID, ale detekují se ionty vzniklé samovolným rozpadem prekurzorů za iontovým zdrojem (postsource decay, PSD). Prekurzory i PSD fragmenty mají stejnou rychlost (vznikly až po urychlení).v LIFT cele jsou ionty urychleny napěťovým pulsem a získají tak různé rychlosti. Dále procházejí reflektronem a jsou detekovány. TOF/TOF s LIFT celou Metody fragmentace iontů Disociace záchytem elektronu (Electron Capture Dissociation, ECD) Fragmentace vícenásobně nabitých iontů po jejich reakci s elektrony. Vícenásobně nabité ionty (vytvořené elektrosprejem) zachycené v ICR cele interagují s nízkoenergetickými (termálními; < 1 ev) elektrony. Tvoří se ionty s lichým počtem elektronů, který díky přebytku energie získaného touto reakcí fragmentují. [M 3H] 3 e - [M 3H] 2 fragmenty Vhodné pro strukturní analýzu peptidů včetně identifikace modifikujících skupin. Tvoří se zejména ionty typu c a z.
Metody fragmentace iontů Disociace přenosem elektronu (Electron Transfer Dissociation, ETD) Fragmentace vícenásobně nabitých iontů po jejich reakci s radikál-anionty. Vícenásobně nabité ionty (vytvořené elektrosprejem) interagují s radikál-anionty s dostatečně nízkou elektronovou afinitou sloužícími jako donor elektronů. Tvoří se ionty s lichým počtem elektronů, které fragmentují obdobně jako v případě ECD. A - [M 3H] 3 A [M 3H] 2 fragmenty ETD lze implementovat na IT nebo Q-TOF. Radikál-anionty se tvoří v CI zdroji. Př. reagentů: fluoranthen anthracen azobenzen 2,2 -bichinolin Metody fragmentace iontů Technické řešení ETD na lineární iontové pasti Thermo Scientific
Metody fragmentace iontů Multifotonová disociace infračerveným zářením (InfraRed MultiPhoton Dissociation, IRMPD) Fragmentace iontů po jejich interakci s fotony infračerveného záření. Paprsek IR laseru vstupuje do prostoru ICR cely nebo iontové pasti. Ionty absorbují energii fotonů a jsou excitovány do vyšších vibračních stavů až dojde k fragmentaci vazeb, obdobně jako u CID. Spektra jsou podobná CID. IRMPD -na iontových pastech není omezení v nízkých oblastech m/z (pod 1/3 m/z prekurzoru) CID Metody fragmentace iontů Fotodisociace ultrafialovým zářením (UltraViolet PhotoDissociation, UVPD) Fragmentace iontů po jejich interakci s fotony ultrafialového záření. Paprsek UV laseru vstupuje do prostoru ICR cely nebo iontové pasti. UV fotony mají vyšší energii než infračervené a po jejich absorpci jsou ionty excitovány do vyšších elektronových stavů. Následná fragmentace vede k bohatším MS/MS spektrům než v případě CID nebo IRMPD. Př.: více strukturních informací při analýze glykanů doi: 10.1039/c3cs60444f
Přístroje pro tandemovou MS - Iontové pasti - Trojité kvadrupóly - Hybridní analyzátory Hybridní hmotnostní spektrometr: přístroj pro tandemovou MS, který kombinuje dva nebo více hmotnostní analyzátory různého typů - např. Q-TOF, IT-OT nebo Q-OT Př.: Orbitrap Elite Hybrid MS (Thermo)