ABSTAKT Moderní hmotnostně-spektrometrické techniky jsou velice vhodné pro analýzu flavonoidů a jejich komplexů. Vývoj v posledních dvou desetiletích udělal z hmotnostní spektrometrie nejvíce citlivou metodu z hlediska molekulární analýzy flavonoidů. Přináší nám například informace o přesné molekulové hmotnosti nebo o struktuře. Flavonoidy působí jako chelační činidla na různé ionty kovů. Cílem studie bylo zjistit, jaké typy iontů se tvoří v roztoku zinečnatých solí a flavonoidů pomocí hmotnostní spektrometrie spojené s ionizací elektrosprejem. Nejprve jsme zkoumali substruktury flavonoidů resorcin, pyrokatechin a pyron abychom zjistili, jak jednotlivé části flavonoidů interagují se zinečnatými ionty. ABSTRACT Modern mass spectrometry (MS) is very well suited for analysis of flavonoids and their complexes. Progress during the last two decades has made MS the most sensitive method for molecular analysis of flavonoids. MS has a potential to provide information on the exact molecular mass, as well as on the structure. Flavonoids are acting as chelating agents on various metal ions. The goal of this study was to discover, which types of ions are formed in solutions of zinc salts and flavonoids by using mass spectrometry attached with electrospray ionization. First, we have studies substructures of flavonoid - resorcin, pyrokatechin a pyron in order to find out, how individual parts of flavonoid interact with zinc ions. KLÍČVÁ SLVA Hmotnostní spektrometrie Ionizace elektrosprejem Flavonoidy Antioxidanty Mass spectrometry Electrospray ionization Flavonoids Antioxidants 1
SEZNAM ZKRATEK A SYMBLŮ MS hmotnostní spektrometrie CID disociace vyvolaná srážkou ESI ionizace elektrosprejem Epi epikatechin Kat katechin hydrát Que quercetin DB ortho-dihydroxybenzen MDB meta-dihydroxybenzen Pyr pyron MeH methanol 2
SEZNAM BRÁZKŮ br. 1 : Chemická struktura flavonoidu Quercetinu br. 2 : Blokové schéma hmotnostního spektrometru br. 3 : Blokové schéma hmotnostního spektrometru s ESI. br.4: Spektrum rozdělení kolizní energie. Červená křivka reprezentuje závislost intenzity signálu mateřského iontu na potenciálovém rozdílu mezi Q1 a. Černá křivka ukazuje derivaci křivky intenzity. FWHM (full width at half maximum) neboli šířka píku v polovině výšky má hodnotu 1,5 ev a byla určena experimentálně ze tří měření. br.5: Zdrojové spektrum pyronu a síranu zinečnatého v methanolu za měkkých experimentálních podmínek. br.6: CID [ 64 (Pyr-H)(Pyr)] m/z 315 (a) a [ 66 (Pyr-H)(Pyr)] m/z 317 (b). Měřeno při kolizní energii 6 ev a tlaku xenonu v kolizní cele 2 10-4 mbar. br.7: CID [ 64 (Pyr-H)(Pyr)(MeH)] s m/347 (a) a [ 66 (Pyr-H)(Pyr)(MeH)] s m/z 349 (b). Měřeno při kolizní energii 6 ev a tlaku xenonu v kolizní cele 2.10-4 mbar. br.8: CID [ 64 (Pyr-H)(Pyr) 2 ] m/z 441(a) a [ 66 (Pyr-H)(Pyr) 2 ] m/z 443(b). Měřeno při kolizní energii 2 ev a tlaku xenonu v kolizní cele 1 10-4 mbar. br.9: Zdrojové spektrum roztoku síranu zinečnatého, orto-dihydroxybenzenu a vodě. Vložené spektrum ukazuje zastoupení izotopických píků ve zdrojovém spektru a teoretickou simulaci izotopických píků pro komplex [(DB-H)(H 2 ) 3 ] br.10: CID [ 64 (Pyr-H)(H 2 ) 2 ] s m/z 209(a) a [ 66 (Pyr-H)(H 2 ) 2 ] s m/z 211(b). Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 1 10-4 mbar a kolizní energii 18 ev. br.11 : CID [ 64 (DB-H)(DB)] m/z 227(a) a [ 66 (DB-H)(DB)] m/z 229(b). Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 1 10-4 mbar a kolizní energii 5 ev. br.12: Zdrojové spektrum roztoku MDB, síranu zinečnatého a vody měřené za měkkých experimentálních podmínek. br.13: Zdrojové spektrum epikatechinu a síranu zinečnatého v methanolu za měkkých experimentálních podmínek. Neoznačené píky neobsahovaly buď zinek nebo epikatechin, a tudíž jsem je dále neanalyzovala. Ve zvětšeném spektru jsou 3
zobrazené píky odpovídajícím/z 417 a teoretická simulace izotopického rozdělení. Ion o m/z 291 náleží protonovanému epikatechinu. br.14: CID [ 64 (Epi-H)(MeH)] m/z 385 a [ 66 (Epi-H)(MeH)] m/z 387. Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 2 10-4 mbar a kolizní energii 5 ev. br.15: CID [ 64 (Epi-H)(MeH) 2 ] m/z 417 a [ 66 (Epi-H)(MeH) 2 ] m/z 419. Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 4 10-4 mbar a kolizní energii 12 ev. br.16: Zdrojové spektrum quercetinu a síranu zinečnatého v methanolu za měkkých experimentálních podmínek. Neoznačené píky neobsahovaly buď zinek nebo quercetin, a tudíž jsem je dále neanalyzovala. Ve zvětšeném spektru jsou zobrazené píky odpovídajícím/z 429 a teoretická simulace izotopického rozdělení. br.17: CID [ 64 (Que-H)(MeH) 2 ] m/z 429 a [ 66 (Que-H)(MeH) 2 ] m/z 431. Měřeno při kolizní energii 12 ev tlaku xenonu v kolizní cele 4.10-4 mbar br.18: Zdrojové spektrum epikatechinu a síranu zinečnatého v methanolu za měkkých experimentálních podmínek. Neoznačené píky neobsahovaly buď zinek nebo epikatechin, a tudíž jsem je dále neanalyzovala. Ve zvětšeném spektru jsou zobrazené píky odpovídajícím/z 417 a teoretická simulace izotopického rozdělení. br.19: CID [ 64 (Kat-H)(MeH)] m/z 385 a [ 66 (Kat-H)(MeH)] m/z 387. Měření bylo prováděno při kolizní energii 5eV tlaku xenonu v kolizní cele 2.10-4 mbar. br.20: CID [ 64 (Kat-H)(MeH) 2 ] m/z 417 a [ 66 (Que-H)(MeH) 2 ] m/z 419. Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 4 10-4 mbar a kolizní energii 12 ev. 4
1. TERETICKÁ ČÁST : 1.1. FLAVNIDY Flavonoidní látky neboli flavonoidy jsou velice rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů. Z chemického hlediska jsou považovány tyto látky za deriváty benzo-gama-pyronu. Jsou odvozeny od kyslíkaté heterocyklické sloučeniny flavanu, tvořeného dvěma benzenovými kruhy spojenými heterocyklickým pyranem. Flavonoidy jsou významnou součástí antioxidačního systému, zabraňují peroxidaci lipidů, likvidují volné kyslíkové radikály, mohou vázat a inaktivovat některé prooxidační kovové ionty (železo, měď). Antioxidační aktivita flavonoidů je závislá na počtu a poloze hydroxylových skupin v molekule, vliv má i jejich glykosylace. ptimální radikálově likvidační vlastnosti byly nalezeny pro o-dihydroxy strukturu v kruhu B, 2,3 dvojnou vazbu a 4-oxo funkční skupinu v kruhu C a 3 a 5 -H skupiny na kruzích A a C. Tuto strukturu mají právě flavonoly. [1] H H A C H H B H br.1 chemická struktura flavonoidu Quercetinu Rozeznáváme následující základní struktury flavonoidů: katechiny, leukoanthokyanidiny, flavanony, flavononoly, flavony, flavonoly a anthokyanidiny. Jednotlivé deriváty se od sebe liší počtem hydroxylových a methylových skupin nebo počtem dvojných vazeb. [2] 1.1.1. -dihydroxybenzen (pyrokatechin, pyrokatechol) H Vzorec: C 6 H 6 2 Molekulová hmotnost: 110 H Pyrokatechin je bílá krystalická látka bez zápachu dobře rozpustná ve vodě. [3] Vyskytuje se především v ovoci (jablkách) či zelenině (bramborech). rtho-dihydroxybenzen má 5
širokou škálu použití - využívá se hlavně při výrobě pesticidů, jako prekurzor pro výrobu dalších látek, např. parfémů či léčiv nebo k fotografickým účelům. [4] 1.1.2. M-dihydroxybenzen (resorcin, resorcinol) H Vzorec: C 6 H 6 2 Molekulová hmotnost: 110 H Resorcin se vyskytuje ve formě bezbarvých jehliček dobře rozpustných ve vodě, alkoholech či etherech. Je však nerozpustný v chloroformu a sirovodíku. [5] Resorcinol je také používán jako chemický meziprodukt pro syntézu farmaceutických přípravků a jiných organických sloučenin. Používá se především při výrobě barviv a léků nebo jako dezinfekční prostředek. [6] 1.1.3. Pyron ( Maltol, 3-hydroxy-2-methyl-4-pyron) H Vzorec: C 6 H 6 3 Molekulová hmotnost: 126 CH 3 Pyron je přirozeně se vyskytující organická sloučenina, která se primárně používá jako látka zvýrazňující chuť. Vyskytuje se v kůře stromů modřínů, v jehličí nebo v praženém sladu. Je to bílý krystalický prášek rozpustný ve vodě, chloroformu i jiných polárních rozpouštědlech. Maltol má chuť a vůni připomínající karamel, a proto se s oblibou používá jako chuť zvýrazňující látka v potravinářství. [7] 6
1.1.4. Quercetin (3,3,4,5,7- pentahydroxyflavon) H H Vzorec: C 15 H 10 7 Molekulová hmotnost: 126 H H H Quercetin patří mezi nejběžnější flavonoidy. Skládá se ze 3 kruhů a pěti hydroxylových skupin. Je také stavebním prvkem pro další flavonoidy. Vyskytuje se v potravinách ve formě glykosidu- (jako aglykon připojený k molekule cukru). Quercetin nalezneme například v jablkách, čajích, oříškách, květáku či jahodách. Je rozpustný v ledové kyselině octové a methanolu, prakticky nerozpustný ve vodě. Tato látka je významný antioxidant, tzn. má schopnost eliminovat nežádoucí účinky různých radikálů, podobně jako vitamin C. [8] 1.1.5. (-)-Epikatechin (3,3,4,5,7-flavanpentol) H H Vzorec : C 15 H 14 6 Molekulová hmotnost : 290,28 H H H Čistý epikatechin je bílý prášek bez zápachu. Je cis formou katechinu. Patří mezi flavonoly (přesněji flavan-3-oly), které jsou podskupinou flavonoidů. Na třetím uhlíku je substitovaná hydroxylová skupina. Epikatechin se vyskytuje v řadě rostlin, nejvíce v kakau, čaji a hroznovém víně. V lidském těle působí jako silný antioxidant s protizánětlivými a protinádorovými účinky. [9][10] 7
1.1.6. ()-Katechin hydrát (3,3,4,5,7-flavanpentol) H H Vzorec : C 15 H 14 6 Molekulová hmotnost : 290,28 H 2 H H H Katechin je flavonoid, který lze izolovat z různých přírodních zdrojů z čajových listů, hroznů, ze dřeva a kůry stromů Akácií a Mahagonů. Je dobře rozpustný jak ve vodě, tak v methanolu, ledové kyselině octové a acetonu, nerozpustný v benzenu a chloroformu. Katechin je stejně jako epikatechin významný antioxidant, má protinádorové účinky a slouží též jako inhibitor histidin-dekarboxyláz. [11] 1.2. HMTNSTNÍ SPEKTRMETRIE 1.2.1 Princip metody Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně-chemická metoda, která využívá separace urychlených ionizovaných částic ve vakuu, a to podle jejich hmotnosti při jejich průchodu magnetickými nebo elektrickými poli. Umožňuje dále stanovit hodnotu této hmotnosti a udat relativní zastoupení iontů jedné hmotnosti z celkového množství iontů a molekul obsažených ve směsi. Během převádění molekul na ionty vznikají nejen ionty celých molekul (molekulové ionty), ale rovněž ionty určitých fragmentů molekul. Registrací signálu molekul a fragmentů v závislosti na jejich hmotě se získá záznam charakteristický pro danou látkuhmotnostní spektrum, které podává důležité informace o její struktuře. Metoda byla vyvinuta počátkem 20. století a původně byla využívána zvláště ve fyzice a chemii, mj. byly pomocí této metody objeveny stabilní izotopy prvků. Po dlouhou dobu pak hmotnostní spektrometrie byla hlavní metodou analýzy ropných produktů a analýzy těkavých organických látek obecně. V současnosti má hmotnostní spektrometrie široké pole uplatnění prakticky ve všech oblastech chemie. [12] 8
1.2.2. Instrumentace Základní uspořádání je znázorněno na následujícím blokovém schématu [13] : br.2 schéma hmotnostního spektrometru Iontový zdroj : Je zařízení určené k přípravě iontů. Hlavní podmínkou, abychom získali pomocí hmotnostního spektrometru veškeré informace o analyzované látce, je její ionizace. Podle množství dodané energie rozlišujeme dvě ionizační techniky měkkou a tvrdou. U měkké techniky dodáváme ionizované molekule malý energetický přebytek, a tudíž je pravděpodobnost fragmentace nízká. Naproti tomu u tvrdé techniky dochází k vyšší fragmentaci, jelikož je energetický přebytek vysoký. Dále můžeme ionizační techniky dělit podle skupenství, v nichž se látka nachází při ionizaci. Klasická je ionizace v plynné fázi, kdy je analyzovaná látka předem odpařena do vakua. Nutným předpokladem je však její dostatečná těkavost. Pro analýzu netěkavých složek se používá ionizace v kondenzované fázi, kde dochází k tvorbě iontů přímo v kapalné nebo pevné fázi. Mezi nejběžněji používané techniky ionizace patří elektronová ionizace (EI) nebo chemická ionizace (CI). Další typy jsou například desorpce polem (DF), plasmová desorpce (PD), ionizace elektrickým polem či elektrosprejem a MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization ionizace laserem za přítomnosti matrice). Ionizace elektrosprejem (ESI) Je příkladem měkké ionizační techniky. Vzorek rozpuštěný v kapalné fázi prochází kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí.intenzivní pole na konci kapiláry tvoří kónický 9
meniskus (Taylorův kužel), ze kterého se uvolňuje sprej vysoce nabitých kapiček. Následným postupným odpařením rozpouštědla vznikají ionty. Hmotnostní analyzátor : Slouží k rozdělení iontů podle jejich poměru m/z, přičemž kvalitu rozdělení iontů vyjadřuje rozlišovací schopnost. Analyzátor je umístněn za iontovým zdrojem (tzn. neutrální molekuly již byly převedeny na ionty) a před detektorem. Jako analyzátor se používá například iontová past, kvadrupólový analyzátor či analyzátor využívající magnetické pole. Kvadrupólový analyzátor: Princip lze stručně popsat tak, že ion je přiveden do středu osy kvadrupólu a tam vlivem střídavého napětí vloženého na tyče kvadrupólu začne oscilovat. V daný časový okamžik pro určitý poměr U/V (stejnosměrné a střídavé složky napětí) jsou oscilace stabilní pouze pro ion s určitou hodnotou m/z, který projde kvadrupólem a dostane se na detektor. Zbytek iontů je zachycen na tyčích kvadrupólů. Detektor: Je přístroj, na který je směrován proud iontů z hmotnostního analyzátoru. Počet dopadajících iontů je přímo úměrný analogovému signálu. Ten je po digitalizaci převáděn do hmotnostních spekter. Detektory lze dělit do dvou kategorií na detektory určené pro přímé měření, které detekují elektrický proud vznikající dopadem iontů na dynodu, a na násobičové detektory, které využívají násobení elektronů vzniklých po dopadu iontů a poskytují měřitelné signály i pro jednotlivé ionty. První druh detektorů je méně běžný a používá se hlavně pro měření přesného isotopového zastoupení prvků v horninách, druhý typ je součástí takřka všech hmotnostních spektrometrů. Vakuový systém: Nedílnou součástí každého hmotnostního spektrometru je výkonný, obvykle dvoustupňový vakuový systém, umožňující udržet dostatečně nízký tlak za všech provozních podmínek. 10
1.2.3. Fragmentace Možnost detailního poznání procesů fragmentace je do značné míry limitována neznalostí konkrétních struktur vznikajících iontů. bsahuje-li molekulový ion přebytek vnitřní energie, rozpadne se za vzniku iontového fragmentu a neutrální částice. Násobné vazby zvyšují stabilitu molekulového iontu. Míra fragmentace iontů závisí na přebytku energie, který tyto ionty obsahují. Relativní zastoupení iontu ve spektru je dáno rozsahem fragmentace vedoucím k jeho vzniku a také jeho stabilitou. 2. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 2.1. Cíl bakalářské práce Cílem studie je zjistit, jaké typy iontů se tvoří v roztoku zinečnatých solí a flavonoidů pomocí hmotnostní spektrometrie spojené s ionizací elektrosprejem a porovnat stabilitu jednotlivých typů iontů v závislosti na typu flavonoidu. 2.2. Experimentální podmínky: Experimenty byly prováděny na hmotnostním spektrometru Finnigan TSQ 7000, který využívá ionizaci elektrosprejem. Analyzátor má konfiguraci kvadrupól-oktupól-kvadrupól, která umožňuje provádět MS/MS analýzy. Ionty jsou generovány elektrosprejem a přivedeny do analyzátoru vyhřívanou kapilárou s teplotou 300 C. Nastavení napětí na kapiláře a trubkové čočce umožňuje měnit ionizaci buď na měkkou, nebo na tvrdou. Měkká ionizace vytváří větší iontové klastry, tvrdá ionizace naopak podporuje tvorbu menších desolvatovaných iontů. První kvadrupól se používá pro hmotnostní analýzu iontů, nebo pro hmotnostní selekci iontů, které lze dále podrobit zkoumání unimolekulární či bimolekulární reaktivity. ktupól je umístěn v plášti (z důvodu minimalizace difuze kolizního plynu xenonu- do hlavní vakuové komory) a slouží jako kolizní cela. bvyklý tlak v komoře během měření je (3-10) 10-6 mbar a xenonu v kolizní cele (1-2) 10-4 mbar. [15] 11
- reakční směs - - - - - elektrosprejová ionizace ESI - kvadrupól Q1 hmotnostní analýza nebo hmotnostní selekce kolizní cela oktupól kvadrupól Q2 hmotností analýza produktu br. 3 schéma hmotnostního spektrometru Disociace vyvolaná srážkou (CID) vybraných iontů o dané molekulové hmotnosti může být prováděna při různých kolizních energiích daných rozdílem potenciálů mezi Q1 (kvadrupól) a (oktupól) v rozmezí 0-196 V, potenciál Q2 je nastavený na součet potenciálů Q1 a. Rozlišení kinetické energie hmotnostně vybraného monokationtu je obvykle 1,5 ev. Rozlišení a škálu kinetické energie určujeme analýzou brzdného potenciálu. Inflexní bod na vzrůstu intenzity iontu v závislosti na rozdílu potenciálů Q1 a (brzdný potenciál) určuje potenciál oktupólu, který odpovídá nominálně nulové kinetické energii mateřských iontů. Kolizní energie (E lab ) se převede z laboratorní do těžišťové soustavy podle vztahu, kde m je hmota xenonu a M je hmota mateřského iontu. Sledování změn fragmentace v závislosti na kolizní energii vede k podrobnějším rozpadovým diagramům. Pro jednotlivé fragmentace lze určit prahové energie, což poskytuje pojítko k vazebným energiím. Příklad určení škály kolizní energie a šířky rozdělení kinetické energie: Toto měření bylo prováděno s roztokem pyrokatecholu ve vodě. Kvadrupóly Q1 a Q2 byly nastaveny na selekci m/z 201 a byl měněn potenciálový rozdíl mezi Q1 a oktupólem v rozmezí 2 (-20) V. Intenzita zaznamenaného signálu byla zanesena do grafu. Nominální nulovou kinetickou energii definujeme jako inflexní bod na vzrůstu intenzity (oktupólem prochází právě polovina generovaných iontů). Tak bylo zjištěno, že nulové hodnoty kinetické energie iontů je dosaženo při potenciálu -3 V. Graf byl upraven tak, že potenciál byl převeden na energii v ev vzhledem k nulové hodnotě energie. Závislost intenzity signálu na kinetické energii byla zderivována a z derivace byla určena šířka rozdělení kinetické energie (šířka píku v polovině výšky; FWHM = full width at half maximum), která má hodnotu 1,5 ev. 12
br. 4 Spektrum rozdělení kolizní energie. Červená křivka reprezentuje závislost intenzity signálu mateřského iontu na potenciálovém rozdílu mezi Q1 a. Černá křivka ukazuje derivaci křivky intenzity. FWHM (full width at half maximum) neboli šířka píku v polovině výšky má hodnotu 1,5 ev a byla určena experimentálně ze tří měření. 2.3. Příprava vzorků K měření jsme použili roztoky 3-hydroxy-2-methyl-4-pyronu, dihydroxybenzenu, epikatechinu, quercetinu, katechin hydrátu a síranu zinečnatého o molární koncentraci 0,007mmol/l. 13
3. VÝSLEDKY MĚŘENÍ: Komplexy pyronu a zinku: Pomocí ESI/MS jsme analyzovali roztok pyronu (Pyr) se síranem zinečnatým a methanolem. Všechna spektra jsme měřili za měkkých experimentálních podmínek. Na zdrojovém spektru (obr.5) jsou vidět 4 ionty, které obsahují komplexy těchto tří látek [(Pyr-H)(MeH) 2 ], [(Pyr-H)(Pyr)], [(Pyr-H)(Pyr)(MeH)] a [(Pyr-H)(Pyr) 2 ]. Je zřejmé, že pyron tvoří se zinečnatými ionty komplexy stechiometrickém poměru kov:pyron 1:1, popřípadě 1:2 nebo 1:3. br. 5 Zdrojové spektrum pyronu a síranu zinečnatého v methanolu za měkkých experimentálních podmínek. Vložené spektrum ukazuje zastoupení izotopických píků ve zdrojovém spektru, červeně je označena teoretická simulace izotopických píků pro komplex [(Pyr-H)(Pyr)]. Píky s charakteristickým rozložením izotopů byly podrobeny CID analýze s xenonem. K CID analýze byl vybrán vždy pík izotopu zinku 64 a 66 pro kontrolu. 14
br.č. 6 zobrazuje fragmentaci iontů m/z 315 a m/z 317. Fragmentace shodně ukazují na ztrátu nejprve jednoho z pyronů a následně odtržení zinku. Z daných fragmentací lze tudíž usoudit, že struktura mateřského iontu odpovídá [(Pyr-H)(Pyr)]. Fragmentace molekuly s m/z 125 tedy (Pyr-H) je stejná jako u předešlého CID. Schéma fragmentace : H -Pyr - -C m/z 315 m/z 189 m/z 125 m/z 97 br.6 CID [ 64 (Pyr-H)(Pyr)] m/z 315 (a) a [ 66 (Pyr-H)(Pyr)] m/z 317 (b). Měřeno při kolizní energii 6 ev a tlaku xenonu v kolizní cele 2 10-4 mbar. 15
Ionty s m/z 347 a m/z 349 byly podrobeny MS/MS analýze. Ve spektru (obr.7 ) je patrné, že došlo nejprve k eliminaci methanolu a pyronu (nebo naopak) následovanou ztrátou zinku. Ion s m/z 125 odpovídá (Pyr-H). Z dané fragmentace se dá usuzovat, že struktura mateřského iontu nejspíše odpovídá komplexu [(Pyr-H)(Pyr)(MeH)]. Schéma fragmentace : CH 3 H H -CH 3 H H -Pyr - -C m/z 347 m/z 315 m/z 189 m/z 125 m/z 97 br. 7 CID [ 64 (Pyr-H)(Pyr)(MeH)] s m/347 (a) a [ 66 (Pyr-H)(Pyr)(MeH)] s m/z 349 (b). Červené šipky označují ztrátu pyronu, modré vyjadřují methanol. Měřeno při kolizní energii 6 ev a tlaku xenonu v kolizní cele 2.10-4 mbar. Na dalším obrázku (obr.8) jsou zobrazeny fragmentace iontů s m/z 441 a m/z 443. Jak lze vidět, mateřská molekula je s největší pravděpodobností [(Pyr-H)(Pyr) 2 ]. Dá se tak 16
usuzovat, jelikož při fragmentaci dochází k odtržení jedné molekuly pyronu a hned druhé stejné molekuly. Schéma fragmentace: H H -Pyr H -Pyr m/z 441 m/z 315 m/z 189 br.8 CID [ 64 (Pyr-H)(Pyr) 2 ] m/z 441(a) a [ 66 (Pyr-H)(Pyr) 2 ] m/z 443(b). Měřeno při kolizní energii 2 ev a tlaku xenonu v kolizní cele 1 10-4 mbar. Komplexy ortho-dihydroxybenzenu a zinku Roztok obsahující síran zinečnatý, ortho-dihydroxybenzen (DB) a vodu jsme analyzovali za měkkých podmínek, aby při ionizačním procesu nedegradovali ionty přítomné v roztoku. 17
Vodu jsme použili místo methanolu proto, že jsme chtěli mít stejné podmínky pro měření jako u meta-dihydroxybenzenu. U něj nelze použít methanol - je totiž silnější ligand než resorcinol. Strukturu jednotlivých iontů jsme přiřadili na základě MS/MS spekter pro jednotlivé, hmotnostně vybrané ionty. Píky s m/z 117 a 135 sice obsahují zinek, ale neobsahují DB, proto jsme je dále neanalyzovali. Stejně je tomu u ostatních neoznačených píků ve spektru. Ion s m/z 117 náleží [(H)(H 2 ) 2 ], ion s m/z 135 je [(H)(H 2 ) 3 ]. Pík s m/z 111 náleží protonovanému DB. br. 9 Zdrojové spektrum roztoku síranu zinečnatého, ortho-dihydroxybenzenu a vodě. Vložené spektrum ukazuje zastoupení izotopických píků ve zdrojovém spektru a teoretickou simulaci izotopických píků pro komplex [(DB-H)(H 2 ) 3 ] Spektrum č. 10 zobrazuje fragmentaci iontů s m/z 209 a m/z 211 pro kontrolu. Je patrné, že původní ion ztrácí postupně dvě vody. Fragment s m/z 173 odpovídá komplexu DB se zinkem. Neutrální zinek se dále odštěpí od DB. Z něj odpadne postupně karbonyl a C 2 H 2 a zůstane nám ion o m/z 39 odpovídající C 3 H 3. Mateřský ion byl tedy komplex [(DB- H)(H 2 ) 2 ]. Fragmentace izotopického píku je identická. 18
Schéma fragmentace: - -C H -C 2 H 2 C 3 H 3 H H m/z 173 m/z 109 m/z 81 m/z 39 br. 10 CID [ 64 (Pyr-H)(H 2 ) 2 ] s m/z 209 (a) a [ 66 (Pyr-H)(H 2 ) 2 ] s m/z 211 (b). Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 1 10-4 mbar a kolizní energii 18 ev. Zelené šipky vyjadřují ztrátu vody. Ionty s m/z 227 a 229 byly podrobeny MS/MS analýze. Podle očekávání se odštěpí 3 molekuly vody (obr.11). Poté až dojde ke ztrátě zinku. 19
Schéma fragmentace : H 2 H 2-3H 2 - H H 2 H H br.11 CID [ 64 (DB-H)(DB)] m/z 227(a) a [ 66 (DB-H)(DB)] m/z 229(b). Měření bylo prováděno za tlaku xenonu v kolizní cele 1 10-4 mbar a kolizní energii 5 ev. 20