Hmotnostní detekce v separačních metodách II. - Historie hmotnostní spektrometrie - Základní pojmy - Iontové zdroje - Iontové zdroje pracující za atmosferického tlaku: ESI, nano-esi, APCI, APPI Historie hmotnostní spektrometrie
Historie hmotnostní spektrometrie VYUŽITÍ MS: - historické kořeny ve fyzikálních a chem. studiích o povaze hmoty - polovina 19. století - studium výbojů v plynech vedlo k objevení elektronu a iontů (v plynné fázi) - počátek 20. století konstrukce prvních hmotn. spektrometrů - první polovina 20. století vývoj různých typů analyzátorů - druhá polovina 20. století vývoj různých typů iontových zdrojů - od 50. let 20. století rozvoj GC/MS - od 70. let 20. století rozvoj LC/MS - od 80. let 20. století rozvoj SFC/MS a CE/MS - od 21. století rozvoj ambientních a zobrazovacích technik ve fyzice v chemii 1886: Anodové záření MC230P75 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2017 - německý fyzik Eugen Goldstein (1850-1930) - studoval výboje v plynech - objevil kanálové záření - proud kladně nabitých iontů Katodové záření: emise elektronů z katody ve vakuové trubici (jako v klasické TV) Anodové (kanálové) záření: emise kladně nabitých částic, které vznikají elektronovou ionizací zbytkového plynu (pokud H 2, pak proud protonů)
MC230P75 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2017 Joseph John Thomson 1906, za fyziku - britský experimentální fyzik (1856-1940) - při studiu katodového záření objevil elektron (1897) - prokázal existenci izotopů u stabilních prvků (1913) - vynálezce hmotnostního spektrometru Fotografická deska se stopami izotopů neonu Thomsonova ilustrace zařízení, ve kterém studoval ohyb katodového záření elektrickým polem 1917: Popis elektrospreje MC230P75 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2017 - česko americký fyzik John Zeleny (1872 1951) - studoval vliv elektrického pole na meniskus kapaliny - popsal elektrosprej John Zeleny, Instability of electrified liquid surfaces, Physical Review 10 (1917) 1-6 Zařízení pro studium výboje a el. pole na menisku kapaliny (1914) Fotografie elektrospreje (1917)
1947: Iontový zdroj EI MC230P75 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2017 - Kanadsko-americký fyzik Arthur J. Dempster (1886-1950) - první moderní hmotnostní spektrometr obsahující EI zdroj - objevil izotop uranu 235 U - Americký fyzik Alfred O.C. Nier (1911-1994) - konstrukce EI zdroje, která je dodnes používaná A.O. Nier, A mass spectrometer for isotope and gas analyses, Rev. Sci. Instr. 18 (1947) 398-411 1957: GC/MS MC230P75 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2017 Gohlke, R.S. The use of time-of-flight mass spectrometry and vapor-phase chromatography in the identification of unknown mixtures. in Joint Symposium on Progress in Gas Chromatography;1957. Gohlke, R.S., Time-of-flight mass spectrometry and gas-liquid partition chromatography. Anal. Chem. 31 (1959 ) 535-541. Holmes, J.C. and F.A. Morrell, Oscillographic mass-spectrometric monitoring of gas chromatography, Appl. Spectroscopy 11 (1957) 86-87. FRED MCLAFFERTY A ROLAND GOHLKE Fotografie spektra acetonu z obrazovky osciloskopu GC z roku 1955
1968: Iontový zdroj Elektrosprej - americký chemik Malcolm Dole (1903-1990) - první použití elektrospreje jako iontového zdroje pro MS M. Dole, L. L. Mack, R. L. Hines, R. C. Mobley, L. D. Ferguson and M. B. Alice, Molecular Beams of Macroions, J. Chem. Phys. 49 (1968) 2240. 1973: LC/MS - americký chemik Fred McLafferty (narozen 1923) - přímé zavádění kapaliny do EI zdroje (Direct Liquid Introduction) M.A. Baldwin, F.W. McLafferty, Org Mass Spectrom 7 (1973) 1111-1112 P. Arpino, M.A. Baldwin, F.W. McLafferty, Biol Mass Spectrom 1 (1974) 80-82 Nákres sondy pro kontinuální zavádění kapaliny do iontového EI zdroje Původní schéma (1974)
1982: Iontový zdroj APCI - 70. léta první práce o APCI v GC i LC (americký chemik Evan Horning) - plně funkční LC/APCI s vyhřívaným zmlžovačem (americký chemik Jack Henion, 1982) EVAN C. HORNING JACK D. HENION Schéma zdroje: (1) LC inlet to probe; (2) outlet; (4) zero air carrier gas; (7) vaporization section; (9) corona discharge needle; (10) orifice into vacuum; (11) atmospheric pressure chamber Jack D. Henion, Bruce A. Thomson, Peter H. Dawson, Determination of sulfa drugs in biological fluids by liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry, Anal. Chem. 54 (1982), 451-456 1987: CE/MS - americký chemik Richard D. Smith - spojení SFC/MS (1982) - demonstroval spojení CZE/MS (1987) - vynalezl iontovou nálevku (ion funnel; 2000) Schéma CZE/MS: (A) electrically insulated box; (B) anode and reservoir; (C) fused silica capillary: (D) cathode and electrospray needle; (E) electrospray; (F) focusing ring; (G) nozzle; (H) skimmer; (I) RF only quadrupole; (J) aperture; (K) quadrupole spectrometer; (L) channeltron. J. A. Olivares, N. T. Nguyen, C. R. Yonker, R. D. Smith, On-Line Mass Spectrometric Detection for CZE, Anal. Chem. 59 (1987) 1230-1232.
1989: Elektrosprej biomakromolekul 2002, za chemii - Americký analytický chemik John B. Fenn (1917-2010) - spojení LC/ESI-MS pro biomolekuly The trick was to get the proteins to fly, or as John Fenn himself said, to give "wings to molecular elephants". Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM., Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 246 (1989) 64-71. MS ve spojení se separacemi LC/MS Počet publikací ve Web of Science GC/MS CZE/MS SFC/MS rok
Hmotnostní spektrometrie v Česku VLADIMÍR HANUŠ (1923-2009) 1953: první hmotnostní spektrometr V. Čermák, V. Hanuš, Č. Jech, J. Cabicar V. Čermák, V. Hanuš, M. Pacák, Hmotový spektrometr Ústavu fysikální chemie ČSAV, Slaboproudý Obzor 20 (1959) 603-608 počátek 60-let první 2 komerční MS instrumenty MCH-1303 Ústav fyzikální chemie ČSAV Ústav organické chemie a biochemie AVČR 1969 MS902 (AEI) - ÚOCHB Hmotnostní spektrometrie v Česku České muzeum hmotnostní spektrometrie http://www.ms-museum.org/ ÚOCHB AV ČR Kniha Pól, Volný, Počátky a historie československé hmotnostní spektrometrie. Praha, 2012
Základní pojmy Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry, MS) 1/ Studium hmoty prostřednictvím tvorby iontů v plynné fázi, které jsou charakterizovány jejich hmotností, nábojem, strukturou anebo fyzikálněchemickými vlastnostmi pomocí hmotnostních spektrometrů. (definice IUPAC) 2/ Fyzikálně-chemická metoda určování hmotností atomů a molekul po jejich převedení na kladně nebo záporně nabité ionty.
Hmotnostní spektrometr Přístroj, který ze vzorku vytváří ionty v plynné fázi a zaznamenává jejich hmotnosti (m/z) a intenzity. - univerzální a vysoce selektivní, citlivý detektor umožňující identifikovat analyty na základě jejich hmotnostních spekter. Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua Hmotnostní spektrum - grafické znázornění závislosti intenzinty iontů na jejich poměru hmotnosti ku náboji (m/z). spektrum kontinuální histogram Kontinuální spektrum (profilové): spektrum, jak je zaznamenáno detektorem (umožňuje odečíst šířku píku); A Centroidové spektrum (histogram): spektrum je převedeno na sloupcový graf, poloha (m/z) signálu je odečtena v těžišti píku, intenzita odpovídá ploše nebo výšce píku (přehlednější); B Spektra jsou většinou normalizována, intenzity (osa y) jsou 0-100%.
Ionty, neutrály, radikály Atom uhlíku: skupina IV A 6 protonů 4 valenční elektrony methan CH 4 neutrální molekula (10 p +, 10 e - ) OE + CH 4 + radikál-kation (10 p +, 9 e - ) methylový radikál CH 3 radikál (nenese náboj) (9 p +, 9 e - ) EE + methylový kation CH 3 + kation (9 p +, 8 e - ) Izotopy Izotopy: atomy chemického prvku, které mají stejný počet protonů, ale rozdílný počet neutronů, tedy stejné atomové číslo a rozdílnou atomovou hmotnost. Přírodní směsi izotopů - zastoupení izotopů jednotlivých prvků je (téměř) konstantní. prvky X (monoizotopické): 19 F, 23 Na, 31 P, 127 I X+1: vodík ( 1 H, 2 H), uhlík ( 12 C, 13 C), dusík ( 14 N, 15 N) X+2: chlor ( 35 Cl, 37 Cl), brom ( 79 Br, 81 Br) kyslík ( 16 O, 18 O)
Izotopové klastry víceatomových částic - u víceatomových částic jsou izotopové klastry lineární superpozicí izotopových klastrů všech prvků, které daná částice obsahuje. Ve spektrech pozorujeme tzv. izotopové klastry. Příklad: Cl 2 100 % 35 Cl 35 Cl (70 Da), P = 1.00 x 1.00 = 1.00 64 % 35 Cl 37 Cl (72 Da), P = 1.00 x 0.32 = 0.32 37 Cl 35 Cl (72 Da), P = 0.32 x 1.00 = 0.32 0.64 37 Cl 37 Cl (74 Da), P = 0.32 x 0.32 = 0.10 10 % Izotopové klastry víceatomových částic trichlorcyklohexan C 6 H 9 Cl 3 alkoholdehydrogenáza C 1764 H 2859 N 469 O 516 S 26
Izotopická izomerie a homologie Izotopology: - izotopické homology ionty, které se liší v izotopu jednoho nebo více atomů tvořících daný iont; ionty v izotopovém klastru (izotopology mají jinou hmotnost) Isotopology Příklad: Ionty CH 4 + (m/z 16) a CH 3 D + (m/z 17) v EI spektru methanu Izotopomery: - izotopické izomery ionty se stejnými celkovými počty všech izotopů všech atomů, avšak lišící se jejich polohou (izotopomery mají stejnou hmotnost) Příklad: Ionty CH 3 CH 2 CH 2 D + (m/z 45) a CH 3 CHDCH 3 + (m/z 45) Jednotky hmotnosti v MS hlavní jednotka SI: kilogram kg Kilogram je hmotnost mezinárodního prototypu kilogramu, který je uložen u Mezinárodního úřadu pro váhy a míry v Sévres. vedlejší jednotka SI: atomová hmotnostní jednotka u Atomová hmotnostní jednotka (unitární jednotka) je 1/12 hmotnosti izotopu uhlíku o protonovém čísle Z=6 a nukleonovém čísle A=12. u = 1,660 57.10-27 kg jednotka: dalton Da Obdoba atomové hmotnostní jednotky. Není jednotkou SI. veličina: m/z m/z je bezrozměrná veličina používaná pro popis iontů ve spektru. jednotka: thomson Th Jednotka pro veličinu m/z navržená v roce 1991. 1Th=1u/e=1Da/e.
Hmotnost iontu v MS nominální hmotnost: hmotnost vypočítaná z celočíselných hmotností prvků (př. CO 2 : 12u + 2 x 16u = 44u) monoizotopická hmotnost: hmotnost vypočítaná z přesných hmotnostní prvků (nejvíce zastoupené izotopy). (př. CO 2 : 12.0000u + 2 x 15.9949u = 43.9898u) průměrná hmotnost: vážený průměr hmotností jednotlivých izotopů podle jejich zastoupení (př. CO 2 : 12.01u + 2 x 16.00u = 44.01u) Příklad: inzulín C 257 H 383 N 65 O 77 S 6 Hmotnost iontu v MS bor Příklad: karboran C 2 B 10 H 12, [M-H] -
Rozlišení v MS 10% údolí FWHM Rozlišovací schopnost: - schopnost přístroje oddělit sousední píky. Číselně se vyjadřuje pomocí rozlišení R. Dvě definice rozlišení: Rozlišení 10% údolí: nejmenší rozdíl hmotností mezi stejně vysokými píky u nichž je výška údolí rovna definovanému zlomku výšky píků (např. 10% údolí). Používá se pro sektorové přístroje (konstantní rozlišení pro celý hmotnostní rozsah). Rozlišení FWHM (Full Width at Half Maximum): poměr hmotnosti iontu a šířky jeho píku v polovině výšky FWHM. Používá se pro kvadrupóly, iontové pasti, průletové analyzátory (konstantní šířka píku). Číselně jsou hodnoty rozlišení FWHM zhruba 2x vyšší než u 10% údolí. Rozlišovací schopnost analyzátoru Př.: paclitaxel C 47 H 51 NO 14 (Mw 853.3) nízké rozlišení vysoké rozlišení
Rozlišovací schopnost analyzátoru Maximální rozlišovací schopnost různých typů analyzátorů Průletový analyzátor (oa TOF): R = 60 000 FWHM (Maxis 4G, Bruker) Sektorový analyzátor s dvojí fokusací: R = 80 000 10% údolí (AutoSpec Premier, Waters) High-Field Orbitrap R = 1 000 000 FWHM (m/z 200, Orbitrap Fusion, Thermo) Iontová cyklotronová rezonance (FT-ICR) R = 20 mil. (spec. podmínky); 800 000 FWHM (m/z 400, Solarix XR 7T, full broad band Bruker)] Spektra s velmi vysokým rozlišením Separace izotopů v rámci nominální hmotnosti 855,3319 C 46 13 C H 51 O 14 15 N 855,3357 C 47 H 51 O 13 18 O N 855,3382 C 45 13 C 2 H 51 O 14 N 855,3412 C 46 13 C H 50 2 H O 14 N R = 60 000 R = 600 000
Výpočet elementárního složení ze změřené m/z Každému elementárnímu složení odpovídá jedna unikátní hmotnost ze změřené hodnoty m/z iontu lze dopočítat elementární složení - při nekonečně vysoké přesnosti měření bychom výpočtem získali jediné správné složení - v praxi je třeba počítat s chybou měření Nižší přesnost určení hmotnosti = více možných sumárních vzorců Vyšší hmotnost při stejné přesnosti = více možných sumárních vzorců Porovnávání izotopických klastrů s teoretickým modelem - zvýšení spolehlivosti určení elementárního složení. Výpočet elementárního složení ze změřené m/z tolerance 5 ppm (3 možnosti) tolerance 20 ppm (13 možností)
Fragmentace iontů Ionty vytvořené v iontovém zdroji můžeme podrobit štěpení (fragmentaci), nejčastěji v prostoru hmotnostního analyzátoru. - získání strukturní informace - zlepšení selektivity detekce prekursorový ion produkty (fragmenty) Spektra vyšších stupňů (fragmentační spektra) MS 301 MS/MS 257 283 301 m/z m/z Spektrum MS (MS 1 ) Spektrum iontů vzniklých při ionizaci vzorku v iontovém zdroji (není aplikována žádná fragmentace) Př. MS spektrum (ESI) sloučeniny s hmotností 300 Da - protonovaná molekula, m/z 301 Spektrum MS/MS (MS 2 ) Ionty vzniklé fragmentací iontu prekurzoru. Př. MS/MS spektrum (ESI) sloučeniny s hmotností 300 Da, - fragmentace iontu m/z 301 (rozpadá se na ionty m/z 283 a m/z 257
Tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS, MS n Souhrnný název pro techniky, které umožňují dvou nebo vícestupňovou analýzu iontů. Ion (prekurzor) je nejprve vybrán, podroben fragmentaci a je zaznamenáno produktové spektrum (MS 2 ). Z něj může být vybrán další ion, který je fragmentován a spektrum produktů je opět za znamenáno (MS 3 ), atd. Využití určování struktury, specifiká detekce. tandemová MS v prostoru (dva analyzátory) v čase (jeden analyzátor) Tandemová MS v prostoru ve trojitém kvadrupólu (analyzátor kolizní cela analyzátor) Hmotnostní spektrometr jako detektor CE SFC GCVzorek HPLC Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua
GC, HPLC, CE a TLC s hmotnostním detektorem Funkce rozhraní-iontového zdroje Ionizuje analyty v plynné fázi (GC/MS, elektronová ionizace) Převede analyty do plynné fáze a zároveň je ionizuje (LC/MS, SFC/MS a CZE/MS, ionizace elektrosprejem, chemická ionizace a fotoionizace za atmosferického tlaku) Desorbuje analyty z pevné fáze a ionizuje je (TLC/MS) Spojení GC s hmotnostním detektorem 1957 první spojení GC/MS (Gohlke, Holmes) [první komerční GC/MS 1967] data EI/CI D GC analyzátor Technicky nejjednodušší interface, plynná mobilní fáze se zavádí přímo do iontového zdroje ve vakuu (EI/CI zdroj). Vakuový systém snadno odstraní přebytečnou mobilní fázi. Mezistupeň mezi GC a MS je převodní spojení transferline (vyhřívaná trubice, kudy vede konec GC kolony). Vyšší teplota zabraňuje kondenzaci výševroucích analytů.
Spojení HPLC s hmotnostním detektorem 1973 první spojení HPLC/MS (Baldwin, McLafferty) [první komerční LC/MS 1977] data HPLC API MS D analyzátor Kapalná mobilní fáze se nejčastěji sprejuje do části iontového zdroje, která je při atmosférickém tlaku (tzv. API zdroje, elektrosprej, APCI, APPI). Vakuový systém v další části zdroje odstraní přebytečný plyn vytvořený sprejováním kapalné mobilní fáze. Spojení SFC s hmotnostním detektorem 1982 první spojení SFC/MS (Smith) data SFC API MS D analyzátor regulátor tlaku Kapalná mobilní fáze se po rozdělení toku sprejuje do části iontového zdroje, která je při atmosférickém tlaku (APCI, elektrosprej). Tlak v systému je regulován pro udržení superkritického stavu fáze. Snížením tlaku v API zdroji dojde k tvorbě aerosolu a tím zmlžení mobilní fáze. Zdroj je většinou nutno vyhřívat na vyšší teploty než při spojení s LC.
Spojení CZE s hmotnostním detektorem 1987 první spojení CZE/MS (Smith) data CZE MS D API analyzátor kv kv Kapalná mobilní fáze (velmi nízký průtok) se sprejuje do části iontového zdroje, která je při atmosférickém tlaku (pouze elektrosprej nebo nanoelektrosprej). Problematické je řešení vkládání sprejovacího napětí pro MS tak, aby nedocházelo k vzájemnému ovlivňování se separačním napětím pro CZE. Spojení planárních separačních technik s MS 1995 první spojení TLC/MALDI-MS (Gusev) atmosférický tlak nebo vakuum data proud fotonů, neutrálních částic, iontů, kapaliny + + + + + MS D analyzátor TLC deska TLC deska je po separaci analytů a vysušení rozpouštědla umístěna do iontového zdroje, který může pracovat ve vakuu nebo při ambientním tlaku. Pomocí různých technik jsou analyty desorbovány z povrchu, ionizovány a analyzovány v MS. Jiné techniky jsou založené na extrakci vzorku do kapky rozpouštědla a následné MS analýze, např. pomocí ESI.
Iontové zdroje Iontový zdroj Část hmotnostního spektrometru, ve které jsou generovány ionty v plynné fázi. Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua
Ionizace Proces, během kterého jsou neutrální molekuly, případně ionty v roztoku převedeny na ionty v plynné fázi Příklady ionizací: M + e - -> M + + 2e - (tvorba radikál kationtu v EI) M + e - -> M 2+ +3e - (vznik vícenásobně nabitých iontů v EI) M + h -> M + + e - (tvorba radikál kationtu v APPI) M + [BH] + -> [M+H] + + B (přenos protonu, CI, ESI, APCI) M + B -> [M-H] - + [BH] + (vznik negativně nabitých iontů v CI, ESI, APCI) M + X + -> [M+X] + (elektrofilní adice, kationizace, ESI, MALDI) molekulární ion (M + ) vs. molekulární adukt ([M+H] +, [M+Na] +, [M+NH 4 ] + ) Ionizační techniky Neexistuje univerzální ionizační technika pro všechny molekuly, pro různé typy sloučenin jsou vhodné různé ionizace, které vedou k molekulárním iontům nebo aduktům. ionizace měkká ionizace za sníženého tlaku tvrdá za atmosférického tlaku Rozdělení podle energie tvrdé ionizační techniky vysoce energetická ionizace, molekuly se rozpadají na fragmenty (EI, PB) měkké ionizační techniky málo energetické, vznikají hlavně molekulární adukty, minimální fragmentace (API techniky, MALDI) Rozdělení podle tlaku v iontovém zdroji: ionizace může probíhat za sníženého tlaku (EI, MALDI) nebo za atmosférického tlaku tzv. API techniky, MALDI
Ionizační techniky ESI MALDI APCI: chemická ionizace za atmosférického tlaku molární hmotnost EI APCI APPI APPI: fotoionizace za atmosférického tlaku EI: elektronová ionizace ESI: ionizace elektrosprejem MALDI: ionizace za účasti matrice polarita Ionizační techniky http://masspec.scripps.edu
Iontové zdroje pracující za atmosférického tlaku ESI, nanoesi, APCI, APPI Sprejování mobilní fáze Společným prvkem technik ionizace za atmosférického tlaku je tvorba spreje. elektrickým polem (elektrosprej) sprejování pneumatické, za pomocí plynu vyhříváním kapiláry Vzájemné uspořádání sprejeru a vstupu do hmotnostního spektrometru (kóna, kapilára) ovlivňuje citlivost, velikost matričních efektů i robustnost systému.
Iontová optika iontových zdrojů - maximalizace transportu iontů do analyzátoru / omezení vstupu neutrálních částic - účinná desolvatace / deklasterizace Účinnost přenosu iontů z iontového zdroje do MS zásadním způsobem ovlivňuje citlivost a dynamický rozsah spektrometru Skimmer (clona): kónická elektroda s otvorem, která odděluje oblasti s různým tlakem; vzorkování iontů ve spreji nebo v expanzním prostoru za štěrbinou Vyhřívaná vstupní kapilára: vyhřívaná trubice, která odděluje oblasti s různým tlakem Ztráty při převodu iontů z vyššího tlaku do nižšího v oblasti skimmeru (u ESI může být detekovaný iontový proud až o 3 řády nižší než generovaný). Iontová optika iontových zdrojů Víceotvorová vstupní kapilára - typické průměry vstupních otvorů (kapiláry, clony): 0,2 1,0 mm - při sprejování se ionty mohou tvořit v širší oblasti od středu spreje - vyšší průměry otvorů nevedou ke významnému zvýšení signálu (ztráty kvůli změně laminárního proudění na turbulentní) vstupní element tvořený soustavou 6 kapilár (zvýšení transmise, vyšší nároky na čerpání) Firemní materiály Agilent
Iontová optika iontových zdrojů Iontová nálevka (ion funnel) soustava prstencových elektrod s otvory, jejichž vnitřní průměr se postupně snižuje. Na elektrody se vkládá stejnosměrné a střídavé napětí ionty jsou kolizně ochlazeny, zaostřeny do úzkého svazku a účinně přeneseny dále do MS. Zvýšení citlivosti oproti skimmerům: 10x 30x Shaffer et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1813 1817; Firemní materiály Agilent, Bruker Elektrosprej (ElectroSpray Ionization, ESI) Kapalný vzorek prochází kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí. Intenzivní pole na konci kapiláry tvoří kónický meniskus (Taylorův kužel), ze kterého se uvolňuje sprej vysoce nabitých kapiček. Následným postupným odpařením rozpouštědla vznikají ionty. Foto http://rsl.eng.usf.edu
Tvorba elektrospreje 0 V kv 1 Výchozí stav (kapalina v kapiláře, napětí není vloženo) Vkládání napětí, postupně se zvyšuje intenzita el. pole. Nabité částice (ionty v roztoku) jsou vytahovány z kapiláry, zmenšuje se poloměr zakřivení menisku. kv 2 Při určité intenzitě el. pole (kv 2 >kv 1 ) se zakřivení menisku limitně blíží k nule a tvoří se stabilní Taylorův kužel Z Taylorova kužele se začnou okamžitě vypuzovat jemné nabité kapky, které se vzájemně odpuzují, neboť mají souhlasné náboje (kv 3 kv 2 ). kv 3 Tvorba elektrospreje Rozpouštědlo z malých (mikrometrových) kapiček se rychle odpařuje, roste nábojová hustota na povrchu kapek. Rayleighův limit - stav, kdy jsou odpudivé síly stejné jako povrchové napětí, které drží kapku pohromadě q 8 ( R 3 1/ 2 0 ) q náboj, 0 permitivita vakua, - povrchové napětí, R poloměr kapky
Elektrosprej (ESI) jednoduchý, s velmi širokou oblastí použití, díky tvorbě vícenásobně nabitých iontů umožňuje analyzovat velmi velké molekuly (proteiny apod.) omezená použitelnost pro nepolární MF a nepolární analyty Elektrosprej je vhodný pro: Měkká ionizační technika, tvorba [M+H] +, [M+Na] +, [M-H] - iontů, fragmentace jen v některých případech. polární i iontové látky, peptidy, proteiny, sacharidy, nukleové kyseliny, organometalické i anorganické komplexy průtoky 5 µl/min - 1 ml/min (při >50 µl/min je nutné použít nebulizační/pomocný plyn) Elektrosprej je nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS Elektrosprej ESI zdroj (Waters) ESI zdroj (Thermo)
Elektrosprej N CH 3 Příklad: Analýza léčiv antiepileptikum Midazolam F N N Cl N N OH N F Cl Tvorba molekulárních aduktů [M+H] +, žádná fragmentace. Muchohi et al., J. Chromatogr. B, 821, 2005, 1 Elektrosprej Příklad: Analýza peptidů - bradykinin bradykinin Tvorba molekulárních aduktů [M+H] +, [M+Na] +. Většinou velmi intenzivní signály. Toll et al., J.Chromatogr. A, 1079, 2005, 274.
Elektrosprej Příklad: Analýza proteinů - myoglobin myoglobin 16951 Da, 153 AA Tvorba vícenásobně nabitých molekulárních aduktů [M+H] +, [M+2H] 2+, [M+3H] 3+, [M+4H] 4+, atd. Distribuce nábojových stavů závisí na ph mobilní fáze. Elektrosprej Příklad: Analýza oligonukleotidů Tvorba vícenásobně negativně nabitých molekulárních aduktů [M- H] -, [M-2H] 2-, [M-3H] 3-, [M-4H] 4-, atd. Mohou se vyskytnout výměny protonu za alkalický kov (Na, K).
Nanoelektrosprej (nanosprej) Taylorův kužel Wilm, M. S.; Mann, M. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1994, 136, 167. velmi malá spotřeba vzorku, sprejování z vody bez přítomnosti organických rozpouštědel, vyšší tolerance k solím, možnost spojení s kapilární HPLC experimentální náročnost Nanoelektrosprej - obdoba ESI pracující s průtoky nl/min. Sprejuje se z kapilár o velmi malém průměru (několik m), vkládá se nižší napětí než u ESI (0,5 1,5 kv). Tvoří se menší kapky, které snáze desolvatují. Zvyšuje se účinnost ionizace. Práce s nanoelektrosprejem je experimentálně náročnější, polohu sprejeru je nutno pečlivě optimalizovat. Nanoelektrosprej je vhodný: pro obdobné látky jako ESI, hlavní využití v analýze proteinů a peptidů průtoky 20-500 nl/min 0,5-5 l/min = microesi Nanoelektrosprej je používaný pro kapilární a nano-hplc/ms a CZE/MS. Nanoelektrosprej (nanosprej) sprejovací kapiláry nanoelektrosprej Waters nanoelektrosprej Proxeon
Nanoelektrosprej (nanosprej) Integrace sprejeru, kolony a termostatu do snadno vyměnitelného dílu Zdroj: Thermo Nanoelektrosprej (nanosprej) Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona pro UHPLC, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (keramický materiál) Zdroj: Waters Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (polyimid); sendvičová struktura, čipy na zakázku Zdroj: Agilent
Nanoelektrosprej (nanosprej) Čip = křemíková destička s mikrofabrrikovanými sprejery a integrovanou SD kartou. Automatická změna sprejeru při zablokování. Zdroj: Advion Nanoelektrosprej (nanosprej) Vliv napětí na sprejovací kapiláře na kvalitu spreje: Sprejování 5% kyseliny octové v 30% MeOH, průtok 200 nl/min, 5mm od vstupní kóny 900 V žádný sprej 1000 V oscilace mezi Taylorovým kuželem/kapkami, více kapek než spreje 1100 V - oscilace mezi Taylorovým kuželem/kapkami, 50% sprej 1200 V sprej s kapkami na jeho okraji 1300 V stabilní sprej 1400 V nestabilní sprej 1550 V vícenásobný sprej, pokles signálu
Nanoelektrosprej (nanosprej) Příklad: Analýza inzulínu srovnání ESI a nanoesi v přítomnosti solí ESI nanoesi V přítomnosti sodných kationtů se v případě elektrospreje tvoří vedle [M+4H] 4+ ještě sodné adukty. NanoESI je méně citlivý na přítomnost solí, proto se adukty s Na + netvoří. Schmidt et al., J Am Soc Mass Spectrom. 2003 14(5):492. Nanoelektrosprej (nanosprej) Příklad: Analýza tryptického digestu cytochromu c chromatogram MS spektrum MS/MS spektrum Nejčastější využití nanoesi analýza proteinů po jejich enzymatickém štěpení na peptidy.
Technická řešení ESI: UniSpray uzemněná sprejovací kapilára N 2 N 2 impaktor - nový typ iontového zdroje uvedený na trh v roce 2016 - proud zmlžené kapaliny naráží na kovovou tyč (impaktor), která je umístěna mírně mimo osu. Na tyči vloženo sprejovací napětí několik kv. Díky Coandovu jevu proud kapiček tyč obtéká, dochází k účinné desolvataci a tvorbě malých kapiček F m = 0.05 1 ml/min, optimum ~ 0,4 ml/min vstup do MS Výhody: - účinnější ionizace - ionizace širšího spektra látek (částečná náhrada APCI, APPI) Coandův jev Grafika Waters M. Procházka ESI při nízkých tlacích: subatmosférický tlak ESI ve vakuu? atmosférický tlak vakuum (10 5 10 6 Torr) Atmosférický tlak snižuje rychlost kapiček, zvyšuje hustotu náboje a způsobuje rozšiřování spreje sprejování za nižších tlaků umožňuje účinnější transmisi iontů do analyzátoru příliš nízký tlak způsobuje velmi rychlé odpařování rozpouštědel, zamrzání, nestabilitu spreje; výhodnější je nepříliš nízký (subatmosférický) tlak. Komerčně (zatím) nedostupné. Další aplikace: sprejování iontových kapalin (zanedbatelně těkavé, vysoká el. vodivost) ve vysokém vakuu jako ESI zdroj pro SIMS J. Fluid Mech. 2008, 604, 339; Anal. Chem. 2008, 80, 1800; Anal. Chem. 2010, 82, 9344
ESI při nízkých teplotách: studený sprej (kryosprej) Varianta elektrospreje pracujícího při nízkých teplotách vhodná pro analýzu nestabilních iontů. Sprejer, desolvatační komora i iontová optika zdroje jsou chlazeny (sprejer cca -20 C, desolvatační komora -80 až 15 C). Použití: pro studium struktury iontů v roztoku - organokovových sloučenin, nekovalentních komplexů, komplexů biomolekul, klastrů apod. Yamaguchi K, J. Mass Spectrom. 2003; 38: 473; JEOL Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Horning, E.C., Carroll, D.I., Dzidic, I., Haegele, K.D., Horning, M.G., Stillwell, R.N., J. Chromatogr. 99, 13, 1974. Eluát je rozprašován do vyhřívané komůrky (~400-500 C). Koronový výboj je zdrojem elektronů, které ionizují plyny ve zdroji (zmlžovací plyn N 2, vzduch). Vzniklé ionty kolidují s molekulami rozpouštědla za tvorby sekundárních reakčních iontů (např. (H 2 O) n H + ). Tyto ionty ionizují molekuly analytu (záleží na jejich protonové afinitě).
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Mechanismus tvorby iontů v APCI: kladně nabité ionty: přenos protonu, výměna náboje záporně nabité ionty: ztráta protonu, záchyt elektronu Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI jednoduchá, se širokou oblastí použití, snadné použití s konvenční HPLC (kompatibilita průtoků), vhodná i pro méně polární analyty nevhodná pro termálně nestálé sloučeniny Měkká ionizační technika, tvorba [M+H] +, [M-H] - iontů, adukty se solventem, fragmentace je běžná, ale většinou v malém rozsahu. APCI je vhodná pro: polární i málo polární analyty < 2000 u, průtoky 0,5 2,0 ml/min APCI je druhý nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS.
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI APCI zdroj Varian APCI zdroj Thermo Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: Analýza oxkarbazepinu a jeho metabolitů ve vlasech (forenzní toxikologie) [M+H] + Ve spektrech je molekulární adukt [M+H] + a fragmenty. frg. Kłys et al., J. Chromatogr. B, 825, 38, 2005
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků 150 mm + 300 mm NovaPak C18 J.Cvačka, O. Hovorka, P.Jiroš, J. Kindl, K. Stránský, I. Valterová: J. Chromatogr.A, 1101, 226-237, 2006 E.Kofroňová, J.Cvačka, P.Jiroš, D.Sýkora, I.Valterová: J. Lipid Sci. Technol., 2009, Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků Triacylglycerol OOP [M+NH 4 ] + 876.4 577.4 [M+H] + 603.4 282; FA 18:1 859.5 256; FA 16:0
GC/APCI-MS McEwan and McCay, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16, 1730 1738 (2005). APCI lze použít jako iontový zdroj pro GC. lze použít vyšší průtoky nosného plynu, rychlé přepínání polarit méně univerzální než EI (nelze ionizovat např. uhlovodíky), méně fragmentace, spektra nejsou vhodná pro srovnávání s EI knihovnami Stejně jako u LC/APCI vznikají molekulární adukty [M+H] +. Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI Eluát je rozprašován do vyhřívané komůrky. VUV lampa je zdrojem fotonů (energie ~10 ev), které jsou absorbovány molekulami analytu. Analyt ztrácí elektron a vznikají molekulární ionty M +. Do zdroje se může přivádět dopant s nízkou ionizační energií (toluen, aceton) ke zvýšení koncentrace ionizovaných molekul a tím i ke zvýšení účinnosti ionizace analytu.
Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI detekce látek s velmi nízkou polaritou, velký lineární dynamický rozsah APPI je vhodná pro: látky, které se obtížně ionizují v ESI a APCI (APPI není závislá na acidobazických reakcích v plynné fázi). Energie fotonů je volena tak, aby byla dostatečná pro ionizaci analytů, ale zároveň dostatečně nízká, se neionizoval vzduch a rozpouštědla (voda, MeOH, MeCN). Dochází k přímé ionizaci analytů. průtoky 0,5 2,0 ml/min API metoda, měkká ionizace. Tvorba M +, M -, [M+H] +, [M-H] - iontů, aduktů se solventem. Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI
Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI Příklad: Analýza polycyklických aromatických uhlovodíků Benzo[a]pyren dává v ESI minimální odezvu [M+H] +, v APCI část iontů fragmentuje. Maximální odezvu poskytuje APPI. Hanold et al., Anal.Chem.76, 2842, 2004 Kombinované (duální) iontové zdroje: ESI + APCI - současná detekce v módu ESI a APCI bez nutnosti přepínání zdroje - pro ionizace látek, které mají výrazně jiné citlivosti v ESI a APCI Př. Analýza vitamínů Zdroj: Agilent, Shimadzu
Kombinované (duální) iontové zdroje: APCI + APPI Př. Polycyklické látky - současná ionizace v módu APCI a APPI může zvyšovat celkovou odezvu detektoru Zdroj: Thermo