Albertov Comprehensive Days 2012 Neodolatelná vůně smrti Michal Hoskovec Infochemikálie Ústav organické chemie a biochemie AV ČR www.iocb.eu
Úvod - hrobaříci Mrchožroutovití (Coleoptera: Silphidae; 210 druhů): součást velké skupiny mrchožroutů ( scavengerů ) kteří hrají klíčovou roli v recyklaci mrtvých těl obratlovců v přírodních ekosystémech Čeled Silphidae: dvě podčeledi - Nicrophorinae (hrobaříci) a Silphinae (mrchožrouti) s rozdílným zdroji potravy Hrobaříci největšího rodu Nicrophorus vyhledávají čerstvé mrtvolky obratlovců zdroj potravy pro jejich potomstvo Nicrophorus ve střední Evropě: většinou specializace na mrtvolky malých hlodavců a hmyzožravců (myši, hraboši, myšice, rejsci)
Rod Nicrophorus (68 druhů celosvětově) N. vespilloides N. germanicus N. americanus N. vespillo
Reprodukce a vývoj 1. vyhledání mrtvolky 2. páření 3. přesun mrtvolky na místo vhodné k pohřbu 4. pohřeb - vlastní hloubení pohřební komory a pohřbení - tvarování mrtvolky do tzv. potravní koule - pokrytí potravní koule ochrannými antibakteriálními sekrety 5. kladení vajíček 6. rodičovská péče o larvy
Nalezení zdroje potravy a páření
Vytváření potravní koule
Péče o potomstvo
Nicrophorus navigace ke zdroji potravy úspěšná reprodukce vyžaduje čerstvou a jinými mrchožrouty neobsazenou mrtvolku to závisí kriticky na schopnosti brouka najít mrtvolku co možná nejrychleji po smrti daného zvířete mrtvolka je čerstvý voňavý chlebíček s uherákem a okurčičkou pro velký počet mrchožravých obratlovců (krkavcovití ptáci, jezevci, lišky ) a jejich hmyzí kompetitory hrobařící lokalizují mrtvolky pomocí chemoreceptorů na jejich kyjovitých tykadlech chemické složení TOS (těkavých organických sloučenin) emitovaných čerstvými mrtvolkami nebylo dostatečně popsáno nepřímé znalosti spekulují o roli sirných a dusíkatých TOS
Náš cíl: Identifikace infochemikálií emitovaných čerstvými mrtvolkami drobných obratlovců a lákajících hrobaříky rodu Nicrophorus Cílové druhy nejběžnější dva druhy evropských hrobaříků: Nicrophorus vespillo a Nicrophorus vespilloides
První krok Analýza emise TOS
Odběr vzorků SPME vlákno myš domáci(mus musculus; 10 ks) hraboš (Microtus agrestis; 3 ks) monitoring 24-144 h každou 1 h CAR/PDMS vlákno Supelco expozice vlákna: 15 min start monitoringu: ihned post portem
LECO Pegasus IVD 1. vzorek 2. nástřik 3. 1D kolona (30 m, DB-5) 4. kryomodulátor 5. sekundární GC pec 6. 2D kolona (2 m, BPX-50) 7. transferline 8. iontový zdroj 9. letová trubice a iont. optika 10. detektor 11. řídící počítač
GC GC-TOFMS chromatogram S-TOS uvolňované z mrtvolky Mus musculus zobrazené na specifické hmotnosti 47 (CH 3 S ) Identifikované sloučeniny (via MS spektra standardů & 2D-retenční chování): 1. methanthiol (MeSH) 2. dimethylsulfid (DMS) 3. kontaminace (toluen) 4. methylthioacetát (MeSAc) 5. dimethyldisulfid (DMDS) 6. dimethyltrisulfid (DMTS) 7. dimethytetrasulfid (DMQS) CH 3 SH CH 3 -S-CH 3 CH 3 COSCH 3 CH 3 -SS-CH 3 CH 3 -SSS-CH 3 CH 3 -SSSS-CH 3
TIC 47 Hraboš polní po 48 h (výhoda selektivního zobrazení na iontu 47)
Emise S-TOS myší mrtvolkou Během 144 hodin post mortem (průměr ploch 2D GC GC-TOFMS skvrn z 10 nezávislých analýz*) hodin p.m. MeSH DMS MeSAc DMDS DMTS DMQS 0 0 0 0 0 0 0 1. den 6 * * * * * 0 12 *** ** *** ** * 0 18 **** *** *** *** ** 0 24 **** *** **** **** ** 0 36 **** *** *** **** ** 0 2. den 48 *** **** *** **** ** t 60 *** **** ** **** ** * 3. den 72 *** **** ** **** *** * 4. den 96 *** **** ** ***** *** * 5. den 120 ** *** * ***** *** * 6. den 144 ** *** * ***** *** ** 0 žádná látka, t stopy, * - velmi nízká koncentrace, ** - nízká/střední koncentrace, *** - střední koncentrace, **** - vysoká koncentrace, ***** - velmi vysoká koncentrace
TOS analýza - výsledky zcela čerstvé mrtvolky, stejně jako živá zvířata mají prakticky nulovou emisi přibližně od 30-60 min po smrti začíná emise S-TOS (MeSH, MeSAc, DMS, DMDS, DMTS a u starších mrtvolek také DMQS) celkové množství S-TOS se se stářím mrtvolky zvyšuje zjištěné malé kvantitativní rozdíly emise S-TOS lze přisoudit individuálním rozdílům jednotlivých zdrojů (stáří zvířetem jeho hmotnost, strava či zdravotní stav) DMDS byl sloučeninou s největší abundancí, následován DMS, MeSH, MeSAc, DMTS a DMQS mimo výše uvedené sloučeniny jsme ve velmi starých mrtvolkách (> 3 dny) detekovali stopy jiných S-TOS, např. merkaptooctové kyseliny, methyl thiolpropanoátu, methylethyldisulfidu, 2,4-dithiapentanu, thiopivalové kyseliny a methyl(methylthio)methyldisulfidu kromě S-TOS, jsme v prvních 72 hodinách od smrti hlodavce nezjistili přítomnosr jiných předpokládaných produktů enzymatické/bakteriální degradace proteinů (skatolu, indolu, nižších i vyšších aminů et cetera)
Druhý krok GC-EAD a EAG
Tykadlo hrobaříka rodu Nicrophorus Hrobaříci mají kyjovitá tykadla, jejichž palička je tvořena zvětšenými a zploštělými antenomery pokrytými chemosenzory umožňujícími broukovi detekovat pach rozkládajících se mršin.
GC-EAD Klíčový zdroj informací ve výzkumu infochemikálií u hmyzu injekční port zesilovač FID záznam FID helium (nosný plyn) kapilární kolona pec chromatografu EAD zesilovač tykadlo hmyzu EAD záznam skleněná mikroelektroda naplněná solným roztokem EAD antenální preparace v detailu
SPME & GC-EAD Analýza myší emise a syntetických S-TOS A: FID záznam TOS uvolňujících se z 24 hodin staré mrtvolky myši B: FID záznam směsi Syntetických S-TOS C & D: EAD záznamy of GC-EAD analýz na samčích tykadlech N. vespillo a N. vespilloides Oba druhy vykazují téměř shodné odpovědi
EAG dose-response křivky S-TOS identifikované ve vůni smrti myší mrtvolky (u N. vespillo) 22 Nicrophorus vespillo 20 18 16 MeSH DMS DMDS DMTS MeSAc EAG [mv] 14 12 10 8 6 4 2 0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 corrected dose [nmol/µl] Každý bod reprezentuje nezávislých 5 EAD záznamů. dávky µg/µl jsou přepočteny na nmol/µl a korigovány na různou těkavost sloučenin
EAG dose-response křivky S-TOS identifikované ve vůni smrti myší mrtvolky (u N. vespilloides) 16 Nicrophorus vespilloides 14 12 MeSH DMS DMDS DMTS MeSAc EAG [mv] 10 8 6 4 2 0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 corrected dose [nmol/µl] Každý bod reprezentuje nezávislých 5 EAD záznamů. dávky µg/µl jsou přepočteny na nmol/µl a korigovány na různou těkavost sloučenin
Různé těkavosti S-TOS MeSH DMS DMDS DMTS MTA b.v. [ C] 6 a 37 a 110 a 165-170 a 98 a p sat [kpa; 20 C] 165 a 53.2 a 2.93 a 0.49 b 4.25 b p R [20 C] c 3.10 1.00 5.51 10-2 9.21 10-3 8.00 10-2 a CRC Handbook of Chemistry and Physics & NIST databáze b Stanoveno v naší laboratoři pomocí plynové chromatografie c p R : relativní těkavost (DMS jako standard; p R = p sat (x) /p sat (DMS) ) Testované sloučeniny se výrazně liší v tlacích nasycených par (a tím těkavosti) při pokojové teplotě Při porovnání biologické aktivity musíme s těmito rozdíly počítat
GC-EAD a EAG - výsledky všechny identifikované S-TOS jsou aktivní na tykadlech hrobaříků SPME & GC-EAD analýzy syntetických S-TOS vyvolávají EAD odpovědi při stejných retenčních časech jako látky z mrtvolek identické retenční časy a srovnatelná antenální aktivita přírodních a syntetických sloučenin potvrzují správnost jejich identifikace EAG odpovědi na S-TOS byly získány především z povrchu posledního antenomeru u obou druhů odpovědi z ostatních antenomerů nebyly dostačující pro EAD záznam EAG dose responses křivky prokázaly aktivitu všech testovaných sloučenin oba druhy mají podobnou citlivost k MeSH a DMDS, ale mírně se liší ve vnímání MeSAc, DMS a DMTS vysoké aktivity DMDS a DMTS při středních koncentracích pravděpodobně naznačují jejich význam v chemoinformačním kanálu mrtvolka scavenger
Třetí krok Biologické testy
Y-olfaktometr test s čerstvou myší mrtvolkou Testy s vybranými syntetickými složkami identifikovanými v mrtvolné emisi (DMS, DMDS a DMTS) 272 N. vespilloides a 259 N. vespillo bylo celkem testováno
Experimentalní podmínky olfaktometr: dvě skleněné Y-části (4 cm průměr, 30 cm délka) spojené spolu rameny ramena s kulovým prostorem (7 cm průměr) pro návnadu jsou výměnná pro zamezení kontaminace olfaktometr má vstup v kruhové arénce (35 cm průměr, 15 cm výška) do které jsou vypouštěni brouci testovaná návnada je umístěna náhodně v jednom rameni, druhé zůstává prázdné čištěný zvlhčený vzduch (100 ml/s) proudil do obou ramen, obohacený v prostoru s návnadou čichovým signálem aktivujícím brouky v arénce stimul: 24 h stará mrtvolka myši / 1 µl testované látky uzavřené v mikrovialce (500 µl) s vatou kontaminované častí olfaktometru měněny pro každý pokus Jedinci obou druhů (Nicrophorus vespillo a Nicrophorus vespilloides) byli vypouštěni do arénky po 1 h aklimatizaci v laboratoři
Výsledky biotestů AtraktivitaDMTS, DMDS, DMS a 1 staré myší mrtvolky pro hrobaříky N. vespillo a N. vespilloides stanovená laboratorně v Y-olfaktometru Sloupce znázorňují procento odpovídajících brouků na daný stimul. Čísla ve sloupcích udávají množství brouků v každém testu. 24 h staré mrtvolky myši byly vysoce atraktivní pro oba druhy obecně byly samice obou druhů úspěšnější ve srovnání se samci, ale statisticky významné to bylo pouze u N. vespillo (93.3 % samic a pouze 69.7% samců reagovalo na myší mrtvolku) u N. vespilloides byly rozdíly mezi pohlavímy méně výrazné (84.4% samic a 93.5% samců) u obou druhů vyvolaly syntetické návnady (1 µl DMTS, DMDS a DMS) odpovědi téměř srovnatelné s přírodní návnadou rozdíly mezi nimi nebyly statisticky významné.
Falešná vůně smrti arónovité rostliny (Araceae) emitují stejné S- TOS jako mrtvoly obratlovců a lákají jimi hmyz, především mouchy jako jsou bzučivky (Lucilia sp.) hadovkovité houby (Phallaceae) používají stejný falešný mrtvolný zápach k nalákaní hmyzu (opět much, ale i mrchožroutovitých brouků a chrobáků) atrahovaný hmyz pak zprostředkuje opylení či transport výtrusů Helicodiceros muscivorus vs. bzučivky rodu Lucilia Hadovka smrdutá (Phallus impudicus) vs. masařky rodu Sarcophaga
Kalinová B., Podskalská H., Růžička J., Hoskovec M.: Irresistible bouquet of death how are burying beetles (Coleoptera: Silphidae: Nicrophorus) attracted by carcasses Naturwissenschaften 96: 889-899 (2009) Děkuji za pozornost.