GE OVÁ TERAPIE ZHOUB ÝCH ÁDORŮ

GE OVÁ TERAPIE ZHOUB ÝCH ÁDORŮ Vladimír Vonka Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha I. ÚVOD Genová terapie (GT) je jedním z nejvýznamnějších a současně jedním z vědecky nejnáročnějších vyústění molekulové biologie a genového inženýrství v medicíně. Společně s nastupující buněčnou terapií patří k nejvíce diskutovaným a nejvíce kontroversním směrům současné medicíny. Přes všechny potíže a spory, a přesto, že se dosud nenaplnila velká očekávání, s nimiž se GT spojuje v posledních dvou desítiletích, málokdo pochybuje, že se významným způsobem uplatní v blízké budoucnosti, a že snad dokonce postupně změní tvář medicíny. Je zdrojem nadějí, že se její pomocí podařit zvládnout patologické stavy neléčitelné dostupnými prostředky. Od všech ostatních terapeutických postupů se GT liší tím, že aktivním léčebným principem je sekvence nukleotidů. Bývá definována jako přenos genetického materiálu, který má léčebný účinek, a to buď proto, že buňce přináší nějakou novou funkci, anebo proto, že nějakou vadnou funkci potlačuje. Původní byla představa, že GT sehraje důležitou roli při léčbě monogenních dědičných chorob. I když v této oblasti dosáhla GT v nedávné době pozoruhodného úspěchu ( byť do značné míry zneváženého několika vedlejšími, krajně nežádoucími komplikacemi), vše svědčí pro to, že hlavní doménou GT v příštích několika letech budou získané choroby. To znamená významný posun v prioritách GT a do určité míry i změnu výše uvedené definice. Při GT, jak ji chápeme dnes, už nejde jen o opravu geneticky vadných buněk, ale i o změnu funkce orgánu či reaktivity organismu. Ve výčtu dosažitelných cílů se objevilo i potlačení nepříjemných symptomů nemocí, jako je bolest. Podle současného širšího pojetí zahrnujeme do GT také všechny typy terapeutických vakcín, při jejichž vývoji se uplatnila technologie genového inženýrství. Mezi prostředky GT tak můžeme zařadit celou rodinu terapeutických protinádorových vakcín, ať již se jsou založeny na bakteriálních plasmidech (tzv. DNA vakcíny, viz dále), živých rekombinantních virech či bakteriích, geneticky 1

zmanipulovaných nádorových buňkách či různých typech fúzních proteinů. Do GT zapadá i nový terapeutický směr v onkologii, který spočívá v užití onkolytických virů. Mezi získanými nemocemi, které jsou předmětem zájmu GT jsou jak akutní tak chronické nemoci. Mezi akutními onemocněními jsou to infekční nemoci, septické stavy a různá zánětlivá onemocnění. Více pozornosti se upíná na chronická postižení, v jejichž případě je spektrum použitelných prostředků pestřejší a léčebné strategie lépe propracované. V běhu jsou desítky klinických studií týkajících se nemocí kardiovaskulárních, neurodegenerativních a metabolických. O GT se zajímá i transplantační medicína. Nejvíce pozornosti se ale soustřeďuje na zhoubné nádory.. Více než dvě třetiny klinických studií, které je možné zařadit do oblasti GT, se týkají různých forem zhoubného bujení. Důvodů, proč se onkologie stala hlavní doménou GT, je několik První je zcela triviální: je daleko snadnější buňku zničit, což je cílem terapie nádorů, než ji opravit tak, aby správně fungovala. Za druhé, k disposici je dlouhá řada genetických strategií, jimiž je možné nádorové buňky likvidovat, a to často s vysokou účinností, anebo je pozměnit tak, aby zničily samy sebe. Za třetí, k dosažení žádoucího efektu, tj. k likvidaci nádorové buňky, stačí velmi často jen přechodná exprese vneseného genu. Za čtvrté, jak už zmíněno výše, genové manipulace otevřely cestu k vývoji terapeutických protinádorových vakcín. Za páté, risika spojená s genovými manipulacemi, to je především hrozba nádorové transformace cílových či mimovolně zasažených buněk, jsou u pacientů s maligními nádory zanedbatelná. Za šesté, onkologičtí pacienti jsou častěji než jacíkoli jiní nemocní ochotni podstoupit novou, experimentálni terapii, což souvisí s povahou jejich nemoci a s tím, jak ji prožívají. Hlavní problémy současné GT můžeme rozdělit do tří skupin, na technické, metodické a etické. Dříve než o nich začneme hovořit je třeba vysvětlit několik pojmů, které se v následujícím textu opakovaně objeví. Gen, který se přenáší, se označuje jako transgen. Přenos genu se nazývá transdukce, je-li k němu použitá nahá DNA mluvíme o transfekci. Buňka, kterou se podařilo pozměnit tak, že exprimuje transgen, je buňka transdukovaná. Přenašeče transgenů označujeme jako vektory II. TECHNICKÉ PROBLÉMY Mluvíme-li o technických problémech GT, máme na mysli zpravidla ty, které se týkají vektorů Pro úspěch GT mají vlastnosti vektorů zásadní význam. Volba vektorů rozhoduje o účinnosti transdukce i o vlastnostech transdukovaných buněk, ale i o risicích, která sebou GT přináší. Ideální vektor by měl mít tyto vlastnosti: (i) měl by rychle, snadno a pokud možno specificky pronikat do velkého počtu cílových buněk, (ii) nesmí být toxický 2

pro cílové buňky, (iii) nesmí vyvolat u příjemce nežádoucí vedlejší reakce, (iv) nesmí ohrozit osoby, které přicházejí s příjemcem ve styk, (v) měl by být málo imunogenní, (vi) musí přenášet transgen v transkripčně aktivním stavu, (vi) exprese transgenu v transdukované buňce by měla probíhat po dobu nutnou pro dosažení léčebného efektu. Prozatím nejsou k disposici vektory, které by beze zbytku splňovaly všechny uvedené požadavky. Nedokonalost užívaných vektorů je jednou z hlavních příčin dosavadních malých úspěchů či, chcete-li, neúspěchů GT. Vývoj nových, účinnějších a bezpečnějších vektorů je proto jednou z dominant současného výzkumu v oblasti GT. Existují dva typy vektorů : virové a nevirové. evirové vektory jsou representovány nahou DNA ( ve formě nelinearizovaných či linearizovaných plasmidů), jež je do buněk vpravována fyzikálními a chemickými metodami. Mezi hojně užívané fyzikální postupy patří mikroinjekce, elektroporace (jde přechodné zvýšení prostupnosti buněčné membrány krátkými elektrickými pulsy) a tzv. biobalistika (vstřelování zlatých částic obalených DNA pomocí zařízení označovaného jako genové pistole) Oblíbené jsou i lipofekce, které jsou založeny na kombinaci DNA s kationickými tuky, kalciumfosfátová precipitace, ale i užití složitějších komplexů, ve kterých je DNA spojovaná se složkami, které usnadňují vstup do buňky a zvyšují stabilitu DNA. Nejvhodnější jsou substance, pro které má cílová buňka hojně receptorů (příkladem je transferin). Jindy se komplex připojí k virové partikuli, která svou interakcí s virovými receptory na povrchu buňky usnadňuje vstup do ní. Výhodami nevirových vektorů je, že lze pracovat s vysoce vyčištěnými materiály, a že velikost vnášené DNA není omezena. Ve většině klinických studií byly užity vektory virové. Vytvářejí se spojením transgenu s virovým genetickým materiálem procesem rekombinace. Při tom je zpravidla ztracen či inaktivován virový gen, který je nutný pro jeho replikaci. Rekombinovaný genom je zavzat do virové kapsidy ve zvláštních, k tomuto účelu modifikovaných buněčných kulturách. Ty jsou s to chybějící virovou funkci doplnit a naprodukovat potřebné množství geneticky upraveného, ale další replikace neschopného viru. Virové vektory mají před nevirovými tři velké přednosti. Za prvé, viry jsou samou svou povahou uzpůsobeny k vnášení cizího genetického materiálu do buněk. Na povrchu buněk se nacházejí receptory, které umožní přilnutí virů k povrchu buňky a snadný vstup do ní. Tím se účinnost transdukce podstatně zvyšuje. Za druhé, virové genomy jsou vybaveny regulačními elementy, které cílová buňka snadno rozpozná, což umožňuje expresi transgenů. Za třetí, biologické vlastnosti některých virů (retrovirů, adeno-asociovaných virů (AAV)) umožňují integraci transgenu do buněčného geonomu. To vytváří předpoklady pro trvalou expresi transgenu, která je pro některé účely nutná. Při užití nevirových vektorů dochází 3

k integraci transgenu daleko vzácněji. Virové vektory však mají oproti nevirovým též některé nevýhody. Mezi ně patří, že velikost vnášené DNA je limitována rozměry virové částice. Krom toho příprava virových vektorů je prací náročnou, jež je výsadou pokročilých virologických laboratoří. Další nevýhodou virových vektorů je jejich silná imunogennost. Imunitní reakce organismu mohou výrazně zkrátit dobu exprese a snížit či zamezit účinku opakovaného podání. Intensivně se pracuje na tom, aby se připravily virové částice modifikované tak, aby pozbyly své imunogennosti. Nepříjemnou komplikaci může způsobit ztráta receptoru pro daný virus na povrchu nádorové buňky. Problém se dá řešit tím, že se virová částice spojí s molekulou (například molekulou některého růstového faktoru), pro kterou má buňka na svém povrchu zmnožené receptory, ale znamená to práci navíc. Konečně, biologická risika spojená s virovými vektory jsou daleko vyšší než u vektorů nevirové povahy. Připomeňme, že všechny čtyři nešťastné události, k nímž došlo v minulosti v souvislosti s GT byly způsobeny virovými vektory, navzdory tomu, že při jejich konstrukci byly zbaveny možnosti se množit. Ztráta schopnosti replikovat se v hostiteli je při užití virových vektorů železným pravidlem, ze kterého existují v oblasti GT jen dvě výjimky. Těmi jsou živé rekombinantní viry používané jako terapeutické vakcíny (viz dále) a onkolytické viry, jejíchž účinnost závisí na schopnosti viru množit se selektivně v nádorových buňkách (viz dále). Nejužívanější virové vektory byly odvozeny od retrovirů, adenovirů, adenoasociovaných virů (AAV) a herpetických virů. Každý ze systémů má své výhody a nevýhody. Tak např retroviry, které byly v klinických studií použity nejčastěji, jsou labilní, nelze je snadno připravit ve vysokých titrech, jejich schopnost pojmout cizí genetickou informaci není příliš vysoká, ale zajišťují integraci do buněčného geonomu. Risika spojená s integrací jsou nepochybná. Adenoviry jsou daleko stabilnější, lze je připravit v podstatně vyšších titrech než retrovirové částice, mají vyšší kapacitu pro přijetí cizí DNA a široký tropismus, ale genetický materiál vnesený jejich prostřednictvím do buňky se neintegruje. Navíc velké množství adenovirových částic působí toxicky. AAV lze rovněž připravit ve velkém množství, jsou stabilní, mají široký tropismus a umožňují integraci transgenu do buněčného geonomu. Další výhodou je jejich nepatogennost.skutečnost, že se začleňují do buněčného geonomu, by mohla vést k inserční mutagenese. Velkou nevýhodou jsou malé rozměry částice, které umožňují začlenění jen malého množství genetického materiálu. Z vyjmenovaných virů mají největší kapacitu herpetické viry. Další jejich výhodou je široký tropismus. Nezajišťují však integraci transgenu a existuje risiko rekombinace s divokým virem. 4

III. METODICKÉ (STRATEGICKÉ) PROBLÉMY GT zhoubných nádorů má dva hlavní cíle. Prvým je zabití co největšího množství buněk přímo v nádoru, druhým je vyvolání imunitní protinádorové reakce, která by zajistila likvidaci zbytku nádorů a potlačila vzdálené metastázy, do nichž transgeny nelze vpravit. Pro tyto účely disponuje širokým spektrem postupů. Všechny mají svůj nezpochybnitelný vědecký základ a každý z nich má své výhody a nevýhody. Zaměříme se na ty, které jsou v onkologii používány nejčastěji anebo mají velkou naději na použití v blízké budoucnosti. Mnohé z níže popsaných postupů jsou však v různých modifikacích aplikovatelná i v jiných oborech medicíny. Sluší uvést, že ne všechny, které budeme zmiňovat, už byly použity v klinických studiích. Určitou zvláštností GT zhoubných nádorů je její splývání s vývojem terapeutických protinádorových vakcín. Klasifikace strategií GT nádorů není snadná. Jak z dalšího vyplyne, mezi jednotlivými strategiemi je silné vzájemné propojení a překrytí., a jakékoli rozdělení nemůže být přísně logické, protože chybí jasné fundamentum divisionis. Z didaktického hlediska však vyhovuje rozdělení do pěti základních skupin. Jsou to: přímá modifikace nádorových buněk, modifikace nenádorových buněk, potlačení neoangiogenese, užití onkolytických virů a protinádorové vakcíny vyvíjené pomocí genetických manipulací. Většina postupů založených na přímé modifikaci nádorových buněk, má za cíl nádorovou buňku zničit nebo ji pozměnit tak, aby ztratila maligní fenotyp. Ty vycházejí ze skutečnosti, že nádorová transformace buňky je podmíněna především alterací dvou kategorií genů, které se označují jako onkogeny a geny potlačující růst nádorů (tumour suppressor genes, také se užívá termínu antionkogeny), jejichž produkty regulují růst buňky, buď v positivním (onkogeny) nebo negativním (antionkogeny) smyslu. Cílem léčby je buď vyřadit z akce aktivované onkogeny anebo nahradit nefunkční antionkogeny plně funkčními. Pro tento účel se nabízí hned několika metod. První se označuje jako antisense. Jde o užití sekvence nukleotidů, které se specificky naváží na příslušný aktivovaný onkogen a vytvořením triplexu (s dvouzávitnicovou DNA) zabrání přepisu nechtěné genetické informace. Mohou se též navázat na přepsanou RNA, která ji nese. RNA komponentu vzniklého hybridu RNA-DNA rozruší ribonukleáza H. Tím je znemožněn překlad genetické informace Zvláštní formou antisense je konstrukt, který se označuje jako PNA (protein-nucleic acid). Mohli bychom si ho popsat jako analog DNA, jehož páteř tvoří peptid, na který se připojují base v sledu zaručujícím vazbu na cílové sekvence Výhodou PNA je 5

resistence k nukleázám a vysoká stabilita výše zmíněných triplexů. Výhodou antisense je snadná příprava, nevýhodami nízká stabilita in vivo ( dá se zvýšit náhradou atomů kyslíku atomy síry), toxicita daná nežádoucími vazbami a nestandardnost.- Mechanismy svého působení je velmi blízko antisense užití krátkých sekvencí RNA. Označuje se jako sirna (small interfering RNA). Její molekuly skýtají jednoduchý prostředek k umlčení nežádoucí genetické aktivity. Lze je upravit tak, aby se k jejich přenosu do buňky daly použít virové vektory. Mnozí předpovídají, že se interferující RNA významně uplatní v terapii nádorů.- Dalším prostředkem k vyřazení škodící genetické informace jsou ribozymy. Označují se tak molekuly RNA s vysokým katalytickým potenciálem, které jsou konstruovány tak, aby specificky rozpoznaly a degradovaly cílovou molekulu RNA, a tím zabránily překladu patologické genetické informace. Je jich několik typů a správně užity jsou mohutnými modulátory genové exprese.problémy, s nimiž se setkají, jsou podobné jako u antisense.- Další možná strategie použitelná pro inaktivaci aktivovaných onkogenů se zakládá na genech kódujících protilátky proti aktivovaným onkogenům. Mutace, odpovídající za jejich aktivaci, může totiž resultovat ve vzniku nového epitopu. Vytvoří-li se v buňce protilátky (označují se jako intrabodies), neutralizují přímo na místě aktivované onkogeny. (Geny pro specifické protilátky mají v GT nádorů daleko širší použití. Podrobnější popis a hodnocení by překročilo rámec tohoto stručného výkladu). Dalším přístupem je zavedení funkčních genů potlačujících růst nádorů (antionkogenů) do nádorové buňky Jejich plná funkčnost je s to zvrátit maligní fenotyp nádorové buňky, případně vyvolat její apoptózu. Nejčastěji používaným je gen pro protein p53, který hraje jednu z klíčových rolí při kontrole buněčného růstu a je alterován ve více než polovině lidských nádorů. Krom toho se buňky modifikované jeho vnesením stávají vnímavějšími na radioterapii, která hraje v léčbě nádorů velkou roli. Nefunkčnost proteinu p53 totiž odpovídá za částečnou radioresistenci nádorových buněk. Obnovení funkce genu umožňuje jeho nadprodukci p53, což otevírá cestu k apoptóze. Všech pět zmíněných postupů dobře funguje v systémech tkáňových kultur. Jejich velkou slabinou je skutečnost, že genetický materiál nelze vpravit in vivo do všech buněk nádoru Za takové situace buňky, které nebyly geneticky modifikovány, získávají selekční výhodu a mohou se brzy stát dominantními v nádorové populaci, což se klinicky projeví relapsem nemoci. Více pozornosti se proto věnuje dalším strategiím, u kterých je takový sled událostí méně pravděpodobný. První z nich využívá skutečnosti, že většina či snad dokonce všechny nádory mají své antigeny, jimiž se kvalitatitivně či alespoň kvantitativně odlišují od normálních buněk. Je známo již po dlouhou dobu, že některé cytokiny, (jako například interleukin 2 či 12) a chemokiny (jako 6

je MCP-1), tím, že zvyšují imunitní reakce organismu, vytvářejí podmínky pro odhojení nádorů. Naneštěstí v účinných dávkách jsou při systémovém podání silně toxické. Vpravení genů pro imunostimulační faktory přímo do nádorových buněk umožňuje snadné dosažení účinné lokální koncentrace cytokinů, aniž by došlo k nežádoucím celkovým reakcím. Někteří pro ně proto razí termín molekulová adjuvancia. Léčebný efekt se může projevit i odhojením metastáz, vzhledem ku vzniku systémové imunitní reakce. Pro dosažení takového účinku není zapotřebí, aby byl gen exprimován všemi buňkami, i když lze očekávat, že terapeutický efekt bude tím vyšší, čím více buněk bude geneticky modifikováno.k problému se vrátíme v sekci, která pojednává o genetických protinádorových vakcínách.- Významného terapeutického účinku lze dosáhnout i pomocí tzv. sebevražedných genů (SG). Toto označení si vysloužily geny, často mikrobiálního původu, jejichž produkty jsou s to měnit jinak neškodné látky ve vysoce cytoxické substance. Buňky, do kterých byly SG úspěšně vneseny, zabíjejí v přítomnosti takových látek samy sebe. Odtud pochází název. Je známo několik desítek SG. Prvním, který vstoupil na scénu a je dosud nejužívanějším, je gen pro tymidin-kinásu viru herpes simplex (HSV TK). Jeho produkt se vyznačuje schopností fosforylovat některé analogy purinových nukleosidů, jako jsou aciclovir, ganciclovir či bromovinyl-deoxyuridin (ACV, GCV a BVDU, běžně používané k léčbě nemocí vyvolaných herpetickými viry). Buněčné kinásy takovou schopnost nemají. Tak např. z GCV vytvoří HSV TK v buňce GCV-monofosfát, který je pak buněčnými kinásami postupně přeměněn v GCV-trifosfát. Ten se stává onou toxickou substancí, jež způsobí smrt buňky.(inhibuje buněčnou DNA polymerázu, začlenění do prodlužujícího se řetězce DNA blokuje jeho další růst). Jiným SG, který už byl rovněž použit jak v experimentu tak v klinických studiích, je gen bakterie E.coli kódující cytosin-deaminázu. Ta mění netoxický 5-fluoro-uridin ve vysoce toxický 5-fluoro-uracill. Podobně jako v případě většiny dříve popsaných postupů, ani SG nelze vpravit do všech buněk nádoru. Naštěstí však dochází k jevu, který se označuje jako by-stander effect, a který bychom mohly česky nazvat postranním účinkem. Toxická substance se dostává z geneticky pozměněných buněk do buněk sousedních (děje se tak průnikem mezibuněčnými spoji, tzv gap juntions, či prostřednictvím apoptických měchýřků) a rovněž v nich páše své zkázonosné dílo. Stane se tak, jakmile buňky vstoupí do S-fáze. Při hynutí buněk se kromě nádorových antigenů uvolňují cytokiny, dochází k nekrose části buněk, zánětu a stimulaci imunitního sytému. Častým důsledkem je proto vznik protinádorové imunitní reakce. Pozorného čtenáře asi napadne, že by bylo účelné kombinovat sebevražedné a imunostimulační geny, a tím maximalizovat účinnost genových manipulací. Takové pokusy již byly provedeny. 7

V některých situacích k synergickému efektu skutečně došlo, v jiných se nedostavil. Objasnit, proč se tak děje, se dosud nepodařilo. Rozdíly ve výsledcích souvisejí nejspíš s komplexitou studovaných systémů a s povahou nádorových antigenů, které jsou ve hře. Další postup se opírá o využití virových genů, jejichž produkty se ocitají na povrchu infikovaných či transdukovaných buněk a mají fusogenní schopnosti. Podaří-li se takovým genem transdukovat nádorové buňky, pak jeho produkt (jde zpravidla o glykoprotein) reaguje s receptory na daný virus na povrchu sousedních, geneticky nemodifikovaných buněk. Důsledkem je splývání buněk.. Jedna úspěšně transdukovaná buňka dokáže proměnit v syncytium (soubuní) až 200 sousedních buněk, což je by-stander efekt přibližně 10x až 20x rozsáhlejší než jakého se dosahuje při užití SG. Rozsah hynutí buněk je závislý na hustotě tkáně. K zániku fúzovaných buněk nedochází apoptosou. Chybí morfologické, cytogenetické a biochemické markery, které by pro ni svědčily. Jejich hynutí má za následek zánětlivé změny v prostředí nádoru, což napomáhá vzniku účinné imunitní reakce. Druhá skupina strategií GT nádorů je založena na genetické modifikaci nenádorových buněk. Mohli bychom je proto označit jako nepřímé. V této oblasti lze očekávat rychlý vývoj v příštích několika letech. V nedávné minulosti se totiž podařilo podstatně rozšířit a prohloubit vědomosti o aktivní roli nádorů v imunosupresi, která brání uplatnění protinádorových imunitních reakcí. K událostem, které ji podmiňují, dochází v mikroprostředí nádorů. Důležitou roli hrají jak samy nádorové buňky tak i nenádorové buňky stromatu a infiltrující buňky myeloidního i nemyeloidního původu. Poznatků o produktech, které imunosupresi zprostředkovávají, rychle přibývá. Jak potlačit jejich akceschopnost je v těchto dnech předmětem intensivního bádání a málokdo pochybuje, že v operacích, jichž k tomu bude zapotřebí, zaujmou důležité místo postupy, které patří do výzbroje GT. Na tomto místě zmíníme však pouze ty ze současných strategií, které se osvědčily v nedávné minulosti v experimentálních systémech, a některé z nich už přinesly slibné výsledky i v klinických studiích. Patří mezi ně využití heterologních buněk,geneticky modifikovaných tak, aby produkovaly imunostimulační faktory. Vpraví-li se do nádoru či jeho bezprostředního okolí, vytvoří se dobré podmínky pro vznik protinádorové imnuty, protože se zajistí vysoká lokální koncentrace zvolených cytokínů, těžko dosažitelná při jejich systémovém podání. - Cílem jiného přístupu je zvýšit resistenci k cytostatikům. Jejich toxicita, zvláště pro buňky kostní dřeně, je často limitujícím faktorem při chemoterapii nádorů. Cílovou pro GT je krevní pluripotentní kmenová buňka. Nejčastěji se pracuje s genem 8

pro mnohočetnou resistenci na cytostatika (multidrug resistance gene 1, MDR-1, kóduje pro protein P3, který funguje jako pumpa snižující nitrobuněčnou koncentraci cytostatik). Jiným používaným genem je mutantní gen pro dihydrofolát-reduktázu, jehož produkt je resistentní k účinu metotrexátu a zyvšuje odolnost buněk k jeho toxickému působení, anebo alkyltransferázu, která zajišťuje resistenci k nitrosouree a jejím derivátům. Též výše zmíněné SG, jejichž produkty mají tak destruktivní vliv na buňky, které je exprimují, mají své použití. Krajně nežádoucí komplikací allogenních transplantací je reakce štěpu proti hostiteli (GVHD, graft versus host disease), která může mít pro příjemce transplantátu fatální následky. Je zprostředkována dárcovskými lymfocyty T. Je-li do nich ex vivo vnesen před transplatací SG, například gen pro HSV TK, pak podání příslušné substance, v daném případě GCV, má rychlý léčebný efekt. Popsaný léčebný princip již byl úspěšně využit v klinické praxi. Další skupinu strategií představují ty, jejichž cílem je zábrana neoangiogenese. Pouze nádory do velikosti 2-3 mm 3 jsou pasivně vyživovány difuzí z okolí. Invasivní růst nádorů a metastazování se neobejde bez neoangiogenese. Zábranit jí je proto jedním z hlavnch cílů současného onkologického výzkumu. Vedle rozšiřujícího se spektra antiangiogenetických chemoterapeutik se začínají ve vzrůstající míře uplatňovat i postupy GT. Geny, jejichž produkty do neoangiogenese zasahují, se vnášejí jak do nádorových tak do nenádorových buněk, s cílem narušit v prostředí nádoru poměr mezi faktory, které positivně či negativně regulují neoangiogenesu. Vzhledem k tomu, že konečným cílem jsou endothelie, děli se někdy zásahy na přímé a nepřímé. Mezi nepřímé řadíme ty, které spočívají v genetické modifikaci nádorových buněk, například vnesením genu, jehož produkt brzdí angiogenesu (například endostatin, angiostatin). Stejnému účelu mohou posloužit i antisense reagující s genem pro hlavní angiogenetické faktory ( jako je VEGF, vascular endothelial growth factor ) do nádorových buněk. Mezi přímé zásahy počítáme ty, které potlačují receptory pro pro-angiogenetické faktory na endoteliích. Předpokládá se, že předností antiangiogenetické GT před chemoterapií bude dlouhodobost účinků, ale též nízká toxicita. Dlouhodobé působení angiostatinu či endostatinu je dobře snášeno. Jak už jsme se zmínili, do GT začleňujeme i využití onkolytických virů. Označujeme tak viry, které se výhradně anebo výrazně lépe množí v nádorových než nenádorových buňkách. První pokusy o využití virů k onkolýze spadají do 50. a 60. let minulého století. Nebyly úspěšné a po desítky let byly téměř zapomenuty. Teprve na konci minulého století došlo 9

k oživení zájmu, který podnítily pokroky v poznaní biologie nádorové buňky a replikace virů na molekulové úrovni. Současné koncepce mají proto daleko racionálnější základ než přístupy používané před půl stoletím.výzkum onkolytických virů a prověřování možností jejich využití k léčbě nádorů dnes představuje jeden z rychle se rozvíjejících nových směrů. Onkolytické viry dělíme do dvou skupin, na ty, které se množí preferenčně v nádorových buňkách pro své přirozené vlastnosti, a na ty, které byly připraveny pro tento účel jako mutanty jiných virů. Sensu stricto pouze ony druhé patří do GT a omezíme se jen na ně. Jako první byly využity mutanty viru herpes simplex, které byly zbaveny genů pro TK a ribonukleotid reduktázu. To výrazně sníží jejich schopnost replikovat se v normálních buňkách, ale nezabrání jejich efektivnímu množení v nádorových buňkách, jež jim oba enzymy poskytují v nadbytku.použity byly i jiné mutantní herpetické viry. Mezi nimi hraje prim mutanta zbavená genu pro neurotropismus viru. Na jiném principu se zakládá využití mutant adenovirů. Produkt jednoho z genů (označuje se jako E1B) divokého adenoviru inaktivuje protein p53, o němž jsme již hovořili jako o jednom z nevýznamnějších představitelů produktů antionkogenů. Protein p53 v důsledku své negativní role při buněčném růstu, brzdí buněčné procesy nutné pro replikaci adenovirů v normálních buňkách. Jak už jsme si řekli, ve většině lidských zhoubných nádorů je gen pro p53 nefunkční. Mutanty adenovirů s inaktivovaných genem E1B se nemohou množit v normálních buňkách s plně funkčním p53, ale nic jim nebrání v replikaci v nádorových buňkách s alterovaným p53. V poslední době se zkouší i mutanty virů chřipky, rekombinanty mezi rhino a entroviry, viry spalniček a další. Některé z provedených klinických studií byly částečně úspěšné. Problémem je vysoká imunogennost virů, která znesnadňuje jejich opakované podání. Nedávno se podařilo zvýšit terapeutický efekt onkolytického viru kombinací s cyklofosfamidem. Účinek se přičítá potlačení specifické protivirové imunitní odpovědi. Rychle se rozvíjející oblast GT představují terapeutické genetické vakcíny. Mezi ně patří několik typů experimentálních vakcín Na prvním místě uvádíme vakcíny buněčné. Připravují se z nádorových buněk, které jsou ex vivo modifikovány vnesením genů pro imunostimulační faktory, například pro interleukin 2 či interleukin 12. Tak jak už zmíněno výše, presentace nádorových antigenů v přítomnosti imunostimulačních antigenů by měla zajistit vyvolání či zvýšení reaktivity organismu proti nádorovým antigenům. Protože produkcí imunostimulačních faktorů velmi často buňky ztrácejí onkogenní vlastnosti, bylo by možné podávat buňky živé ( případně ještě s bezpečnostní pojistkou, jakou představuje zavedení SG), ale z etického hlediska takový přístup není v humánní medicíně přípustný. 10

V úvahu přicházejí pouze buňky usmrcené, například zářením. Je poněkud překvapivým pozorováním, že ozářené buňky jsou někdy rozumí se, že dočasně - vyššími producenty imunostimulačních faktorů než buňky živé. Výsledky experimentálních studií ukazují, že podstatně lepších výsledků lze dosáhnout při současném použití genů pro dva imunostimulační faktory. Hledání jejich optimální kombinace je jedním z hlavních směrů současného výzkumu K terapeutickým zásahům lze použít jak autologních tak allogeních nádorových buněk. Použití allogeních buněk má několik nevýhod a několik výhod. Mezi nevýhody patří možnost, že užitá buněčná line nemusí obsahovat potřebný antigen, že přítomné sdílené nádorové antigeny nemusí být rozpoznány pacientovým imunitním systémem, a existuje těžko odhadnutelné risiko, že nad odpovědí k převážně slabým nádorovým antigenům převáží reakce vůči silným cizím antigenům komplexu MHC (major histocompatibility komplex). Nevýhody allogenních vakcín do určité míry vyvažují některé výhody. Největší předností je možnost využití dobře charakterizovaných buněčných linií, které jsou udržovány za standardních laboratorních podmínek. Krom toho odpadá nutnost izolovat od každého pacienta linii nádorových buněk. To není procedura snadná. Je časově náročná a ne vždy se zdaří. Další potenciální výhodou je možnost současného využití několika allogenních linií, které vytvářejí různé imunostimulační faktory. Navíc je pravděpodobné, že v procesu imunizace směsí buněčných linií bude pacientovi nabídnuto několik nádorových antigenů. Za jistých okolností může mít příznivý efekt i přítomnost silných antigenů jaké představují antigeny MHC. Opakovaně se zjistilo, že jejich koexprese s nádorovými antigeny může mít efekt opačný tomu, který jsme zmínili výše, že totiž může podnítit silnou odpověď k jinak málo imunogenním nádorovým antigenům. - Zmíněné příklady ukazují mnohotnost cest, které se nabízejí pro budoucí vývoj protinádorových buněčných vakcín. Velkou výhodou vakcín založených na genově modifikovaných buňkách je, že není nezbytně nutné znát nádorový antigen, a že-- pokud je nádorový antigen znám-- dostávají do hry i další dosud nepoznané nádorové antigeny. - Jiným typem genetických vakcín jsou tzv. D A vakcíny. Jsou založeny na plasmidech., což jsou cirkulární bakteriální genetické elementy. Do nich se vnáší gen pro nádorový antigen ve formě, která zajistí jeho expresi v savčích buňkách. DNA vakcíny se těší v současné době obrovskému zájmu jako vakcíny profylaktické i terapeutické. Jejich přednosti oproti klasickým vakcínám jsou velké. Mezi ně patří: snadnost přípravy a nízké náklady s ní spojené, vysoká stabilita a skutečnost, že proteiny tvořené v transdukovaných buňkách mají přirozenou konformaci Dosavadní zkušenosti ukazují, že DNA vakcíny silně stimulují jak humorální tak buněčnou imunitu. Výhodou je i to, že v případě potřeby se dá gen pro nádorový antigen snadno modifikovat, 11

že se dají připravit kombinované, oligovalentní vakcíny, a že vakcíny se dají zhotovit i proti cílům, v jejichž případě klasický postup přípravy vakcín není možný. Problémem, který se doposud nepodařilo ani objasnit ani vyřešit zůstává výrazně nižší imunogennost DNA vakcín pro primáty ve srovnání s hlodavci či skotem. Nezbytným předpokladem konstrukce DNA vakcín pro léčbu nádorů je dostupnost genu, který kóduje pro nádorový antigen. Vakcíny se vpravují do organismu různými cestami, nám ( a řadě dalších) se nejlépe osvědčuje nitrokožní aplikace. Geny pro nádorové antigeny jsou k disposici například pro nádory virového původu. V nich jsou nádorové antigeny representovány virovými onkoproteiny, které zodpovídají za transformaci buňky a udržení stavu transformace. Virové onkoproteiny jsou velké a dobře definované, takže se dá snadno monitorovat síla a kvalita vyvolaných imunitních reakcí. DNA vakcín už také bylo použito jako anti-idiotypových vakcín pro léčbu lymfomů, ale i pro léčbu nádorů, které tvoří ve zvýšené míře některé přirozené nenádorové proteiny. Takové proteiny se mohou rovněž stát terčem imunních reakcí. Jako u jiných typů vakcín lze účinnost DNA vakcín zvýšit současným podáním genů, jež kódují pro imunostimulační faktory. Buněčné a DNA vakcíny nejsou jedinými, které lze použít jako terapeutické protinádorové vakcíny. Díky novým biotechnologiím se nabízejí další možnosti. Jsou to především rekombinantní viry a bakterie, do nichž byl začleněn gen pro nádorový antigen. Nejčastěji používaným vektorem je virus vaccinie, který po dvě stě let sloužil k prevenci pravých neštovic a umožnil jejich eradikaci. Tento virus má kromě své nízké patogennosti ještě řadu dalších výhod. Je velký a jeho genom obsahuje řadu genů, které nejsou nezbytně nutné pro replikaci viru (označují se jako nesenciální ). Dají se poměrně snadno nahradit geny pro nádorové antigeny, případně dalšími geny, které zvyšují imunogennost produktu nově začleněného genu. Vzhledem k velikosti virového geonomu, je teoreticky možné vpravit do něho až dvacet středně velkých genů, aniž by došlo k ztrátě jeho životaschopnosti. Virus je přístupný i dalším manipulacím, které mohou snížit jeho zbytkovou pathogennost, například vyřazením genů, jejichž produkty působí imunosupresivně. Krom toho práce s virem vakcinie je levná, technicky poměrně snadná a málo nebezpečná. Rekombinantní vakcíny na basi viru vakcinie a některých jiných poxvirů už byly vyzkoušeny v několika klinických studiích. Rekombinanty se ukázaly být učinné jako profylaktické vakcíny, ale jejich vliv na klinický průběh choroby byl prozatím málo významný. Určitě to souvisí s tím, že do podobných studií jsou v prvé etapě prověřování začleněni pacienti s velmi pokročilou chorobou. Očekává se, že při léčbě pacientů s méně rozvinutým onemocněním budou výsledky lepší, a že je dále umocní vyvíjená nová generace rekombinantních vakcín. Jinými virovými vektory vhodnými 12

pro přenos genu pro nádorový antigen jsou adenoviry, AAV, retroviry, alfaviry a další. Dají se použít buď přímo k inokulaci pacienta ale i k stimulaci (infekci) dendritických buněk, jež jsou přirozenými iniciátory imunitní odpovědi. -.Jiným systémem, s nímž se už intensivně pracuje, jsou rostlinné vakcíny. Mezi živočišnými proteiny, které se již podařilo exprimovat v rostlinách jsou i některé nádorové antigeny. Silným stimulem pro vývoj rostlinných vakcín je jejich láce a snadná aplikace Očekává se, že budou nejméně 100x levnější než vakcíny připravované klasickým způsobem, a že alespoň některé bude možné podat perorálně. Hovoří se proto také o jedlých vakcínách. IV. ETICKÉ PROBLÉMY Etické problémy spojené s GT ( ale také s buněčnou terapií) jsou nemalé a jsou jednou z brzd jejího rychlejšího vývoje. Aplikace GT je spojena s risiky, která jsou nezanedbatelná. Zatímco vývoj GT v experimentálních systémech postupuje bez vážnějších zábran a jeho hlavní limitací je dostupnost finančních prostředků, každá klinická studie musí být pečlivě posouzena jak z hlediska bezpečnosti tak z hlediska očekávané účinnosti, a její koncepce musí být v souladu s nejnovějšími poznatky biomedicínských věd. Jak ukazují zkušenosti posledních několika let, opatrnost je na místě. Jak už řečeno, všechny čtyři nešťastné události spojené s GT byly spojeny s virovými vektory. Risik je několik. Patří mezi ně schopnost některých virových vektorů vyvolat zánět, který ve své generalizované formě vyvolal smrt jednoho pacienta po terapeutickém podání vysoké dávky adenovirového vektoru. Dalším risikem je vznik replikačně kompetentních rekombinant, které by se mohly šířit na kontakty léčené osoby. Důsledky takové události nedokáže nikdo bezpečně odhadnout. Zatím k ní však nedošlo, takže můžeme hovořit maximálně o teoretickém risiku. Rovněž by mohla nastat rekombinace mezi virem užitým k onkolýze s divokým virem, který persistuje v organismu nebo jej infikuje v průběhu léčby. Vzhledem k tomu, že viry používané k onkolytické léčbě jsou i ve své divoké formě málo patogenní, zdá se být toto nebezpečí zanedbatelné, nicméně šlo by o jev nežádoucí. Dalším možným risikem je inserční mutagenese. Jak jsme si řekli výše, některé virové vektory (retroviry, AAV) zajišťují integraci transgenu do do genomu hostitelské buňky, což může vést k mutacím genů, které kontrolují buněčné množení. Ve Francii, ve které byla GT použita k léčbě tzv. těžké kombinované imunodeficience (SCID, severe combined immunodeficiency), u tří z 11 úspěšně léčených dětí se objevila v průběhu následujících čtyř let leukémie typu T. Molekulové analýzy ukázaly stejný mechanismus vzniku nemoci. Transgen byl integrován v blízkosti genu, jehož produkt je růstovým faktorem lymfocytů T. Jsou to hlavně tyto 13

události, které zbrzdily využití GT a silně směrují její výzkum k vývoji nových virových vektorů, jež by uvedená risika eliminovala anebo dále významně snížila. Způsobují také částečný odvrat od virových vektorů. Vynakládá se velké úsilí vytvořit novou generaci nevirových vektorů, které by dovedly zajistit vnesení genů do cílových buněk s účinností daleko vyšší než jejich předchůdci v nedávné minulosti. Ve všech zemích, kde se GT provádí anebo se o jejím zkoušení a postupném zavádění uvažuje, existují zákony, které komplex problémů ošetřují. Všechny studie, které se doposud uskutečnily, byly naplánovány a provedeny ve shodě s pravidly, která určovala zákony dané země. To, že přesto došlo k několika neblahým událostem, je jen důkazem toho, že navzdory všem pokrokům je naše porozumění fungování lidského genomu neúplné, a že ne všechny otázky spojené s uplatněním GT mohou být zodpověděny v preklinických studiích. Zásady, podle kterých by se měly řídit všechny klinické studie v oblasti GT, jsou následující: (i) Preparát musí být připraven podle Správné výrobní a laboratorní praxe a jeho bezpečnost a kvalita musí být ověřeny všemi prostředky, které stanoví zákon, a jsou ve shodě s nejnovějšími poznatky lékařských věd. (ii) Pacient musí být pravdivě a podrobně informován o všech možných přínosech i risicích léčby. Při výkladu je nutné respektovat inteligenci a vzdělání pacienta. Jinými slovy, je třeba zaručit, že účast ve studii je výsledkem svobodného rozhodnutí pacienta. (iii) Každá studie se musí řídit pravidly Správné klinické praxe. Členové výzkumné skupiny musí mít zkušenosti z předchozích prověrek nových léků či nových léčebných postupů. Do studie mohou být začleněni pouze pacienti, kteří splňují předem určená kriteria. Protokol, který byl schválen před zahájením studie, musí být přísně dodržován. Každá nepříznivá reakce musí být hlášena dozorčímu orgánu a analyzována všemi dostupnými prostředky. (iv) Dozorčí rada instituce, v jejímž rámci studie probíhá, musí zaručit trvalý dohled nad jejím průběhem. (v) Každá studie by měla být dvojitě slepá. Hodnocení výsledků mohou totiž ohrozit dva faktory. Prvním je zájem výzkumníků na kladném výsledku, který se může i podvědomě promítnout do hodnocení nálezů. Za druhé, výsledek může být ovlivněn placebo efektem, který bývá zvláště výrazný u pacientů v terminální fázi nemoci. (vi) Risika spojená s léčbou by měla být zvláště pečlivě zvažována tam, kde existuje prověřená alternativní léčba. V. ZÁVĚR GT otevřela nové cesty k léčbě mnoha lidských chorob, zvláště pak nabízí nové léčebné postupy v onkologii. V současné době se však stále potýká s problémy, které brání jejímu rozsáhlému využití v medicínské praxi.. Její další rozvoj a rozsáhlé uplatnění závisí 14

především na vývoji nových vektorů, které budou bezpečnější a účinnější než vektory stávající. Pokrok na tomto poli je velmi rychlý, ale cesta k vektoru, který by se přiblížil výše popsanému ideálu, bude ještě dlouhá. Stejně tak důležité je získání dalších informací na molekulové úrovni o pathogenese nádorů a jejich biologii, jež se mění v průběhu jejich růstu, ale i v důsledku jejich léčby jinými prostředky. Sem patří i rozšíření našich vědomostí o funkci jednotlivých složek stromatu nádoru. Pokud jde o protinádorové terapeutické vakcíny, je třeba získat další poznatky o interakcích mezi imunitním systémem a zhoubným bujením. To by se mělo týkat i mechanismů, jimiž nádor uniká kontrole imunitního systému. Základním předpokladem budoucího úspěšného vývoje GT je multidisciplinární přístup. Je čím dále zřejmější, že při léčbě zhoubných nádorů pomocí GT bude optimální její kombinace s již zavedenými léčebnými postupy. Výzkumná práce autora je podporována grantem IGA Ministerstva zdravotnictví ČR číslo R-9075-3, grantem GAČR číslo 301/05/2240 a Ligou proti rakovině. 15