Uplatněná metodika QF 3019 UM 5 - název:

Uplatněná metodika QF 3019 UM 5 - název: Příprava referenčního standardu pro kalibraci infraanalýzy mléka se sníženým obsahem hlavních komponent mléka jako dolními hodnotami kalibračních přímek a s vybalancovanou změnou interferenčního vlivu mléčné matrice Uplatněná metodika a technicko-organizační doporučení, opatření a postupy v systému QA/QC (quality assurance/quality control, zajištění a řízení kvality) k řešení referenčněrutinních systémů analytických laboratoří k testaci kvality syrového mléka a pro zvýšení věrohodnosti výsledků. I) Cíl uplatněné metodiky: Cílem je zajištění a zvýšení věrohodnosti výsledků a provozní jistoty managementu rutinních laboratoří při kontrole složení a kvality mléka pro účely kontroly užitkovosti (individuální vzorky mléka - podpora šlechtění zvířat) a proplácení mléka (bazénové vzorky mléka - zajištění kvality mléčného potravinového řetězce). Náplň uplatněné metodiky: Implementace dosažených výsledků, získaných na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektů NAZV, MZe-ČR, QF 3019 a INGO, MŠMT-ČR, LA 244 a v rámci koordinační a konzultační metodické činnosti Národní referenční laboratoře pro syrové mléko (NRL-SM) Rapotín, do prostředí mlékařských analytických laboratoří Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. Praha. Zdroj uplatněné metodiky: projekt NAZV, MZe-ČR, QF 3019, Výzkum a vývoj zdokonalení nástrojů kontroly kvality analýz základního složení mléka pro hospodářské účely. Zpracovali dne: 19. 3. 2008 Oto Hanuš, Libor Janů, Václava Genčurová, Radoslava Jedelská, Jaroslav Kopecký Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Akreditovaná Zkušební laboratoř č. 1340 Národní referenční laboratoř pro syrové mléko (NRL-SM) Referenční laboratoř pracovní sítě referenčních mléčných laboratoří ICAR-CECALAIT Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od 19. 3. 2008.

II) Příprava referenčního standardu pro kalibraci infraanalýzy mléka se sníženým obsahem hlavních komponent mléka jako dolními hodnotami kalibračních přímek a s vybalancovanou změnou interferenčního vlivu mléčné matrice Struktura uplatněné metodiky: 1) Důvody zpracování metodiky 2) Přiblížení podstaty modifikovaného vzorku mléka 3) Příprava modifikovaného referenčního vzorku mléka 4) Použití modifikovaného referenčního vzorku mléka 5) Shrnutí postupu 6) Tabulka: Složení specifické kompozice 7) Použité literární prameny při ověřování a validaci uplatněné metodiky 1) Důvody zpracování metodiky Výsledky rutinních analýz mléka jsou důležité pro podporu šlechtění mléčného skotu a také pro podporu kvality mléčného potravinového řetězce. Tyto výsledky jsou získávány zpravidla pomocí výkonných nepřímých analytických metod. Nejčastěji různými formami infraanalýzy (mid, near). Věrohodnost výsledků je odvislá od kvality provedených kalibrací nepřímých metod. Pro relevantní kalibraci je nezbytné mít sadu referenčních kalibračních vzorků s potřebným rozsahem hodnot. To se dosahuje různými metodami úpravy vzorků. Úpravy by neměly poškodit přirozenou skladbu vzorku mléka a pozměnit interferenční vlivy základní mléčné matrice, aby kalibrace nebyla poškozena negativními vlivy. Používají se přídavky dané složky, odebrání složky atd.. Pro dosažení nižších hodnot koncentrací složek se používají také přídavky vody nebo některých roztoků. Rutinní automatické analytické přístroje při rozborech mléka a mléčných výrobků pracují na principu infračervené absorpční spektroskopie (filtrová technologie nebo Michelsonův interferometr s Fourierovými transformacemi). Jedná se o nepřímou analytickou metodu a tak přístroje musí být v pravidelných intervalech kalibrovány, a to pomocí příslušných referenčních metod (tuk podle metody Röse-Gottlieba nebo Gerbera, hrubé bílkoviny podle metody Kjeldahla, laktóza podle metody polarimetrické a všechny složky pak podle relevantních norem). Kalibrace se provádějí pomocí sady (v daném případě desíti) referenčních vzorků mléka. Některé referenční vzorky v sadě jsou účelně modifikovány tak, aby koncentrační rozsah stanovovaných mléčných komponent (tuk (T), bílkoviny (B), laktóza (L)) pokrýval předpokládaný reálný obor hodnot prováděných analýz. Požadovaného koncentračního rozpětí se dosahuje mimo jiné tak, že jeden ze sady referenčních vzorků se ředí. Dále rovněž cíleným odběrem bazénového mléka vybraných stád a plemen a také manipulací s mléčným tukem formou odstátí a přídavků). 2) Přiblížení podstaty modifikovaného vzorku mléka Modifikovaný vzorek mléka se záměrně (ředěním) sníženým obsahem T, B a L, jako tvorba spodních hodnot kalibračních přímek nebo křivek, se připraví ředěním mléka roztokem specifické kompozice (SK; Tabulka). Tato se svým složením a celkovým množstvím, po přídavku roztoku do mléka v žádoucím poměru, blíží skutečnému zastoupení použitých látek v mléce. Daným ředěním dojde k požadovanému snížení obsahu jmenovaných mléčných složek. V důsledku toho kroku by se při přípravě kalibračních vzorků se sníženým obsahem základních komponent, kdy se vzorek ředí SK, neměla příliš měnit skladba vzorku z hlediska zastoupení uvedených minerálních látek, močoviny a kyseliny citrónové. Tím by i případné interferenční vlivy uvnitř obyčejného a modifikovaného vzorku mléka měly zůstat přibližně

stejné a neměly by svými případnými odchylkami ovlivňovat správnost a přesnost infraanalýzy. 3) Příprava modifikovaného referenčního vzorku mléka Příprava referenčního vzorku mléka se záměrně sníženým obsahem tuku, bílkovin a laktózy pro kalibraci infraanalýzy je následující: roztok specifické kompozice se připraví podle předpisu v tabulce; mléko se ředí roztokem SK v poměru mléko/roztok 4/1 nebo 5/1. Navážená směs látek musí být za důkladného míchání dokonale rozpuštěna v destilované vodě, než se přileje a zamíchá do mléka. Za normálních okolností běžného bazénového vzorku kravského mléka se po modifikaci obsah tuku pohybuje nejčastěji od 2,5 do 3,2 %, obsah bílkovin od 2,3 do 3,0 % a laktózy od 4,2 do 4,6 %. 4) Použití modifikovaného referenčního vzorku mléka Modifikovaný referenční vzorek mléka se začlení do sady referenčních vzorků určených pro kalibraci infraanalyzátorů (nejčastěji n = 10). Není podmínkou, ale doporučuje se, při předběžné znalosti referenčních výsledků ostatních vzorků sady, začlenit v pořadí modifikovaný vzorek do té části kalibrační přímky (křivky), která má rovněž nižší hodnoty obsahových složek. Tak nebude kalibrace přístrojů zatížena extrémním přechodem složek od vzorku k vzorku a tím extrémní zátěží ve smyslu možné realizace chyby z přenosu. Tím nebude uvedené neinterferovat negativně do kvality prováděné kalibrace. 5) Shrnutí postupu Ředění vzorku mléka SK s minerálními solemi, kyselinou citrónovou a močovinou pro získání modifikovaném vzorku mléka jako spodních hodnot kalibrace infraanalyzátoru pro určení základních složek mléka se použije při přípravě sady referenčních vzorků mléka. Důvody pro aplikaci postupu ředění při přípravě sad referenčních vzorků (pro dosažení relevantních spodních hodnot kalibračních přímek nebo křivek hlavních složek mléka) pro kalibraci infraanalýzy mléka specifickou kompozicí směsi se zastoupení hlavních minerálních a ostatních minoritních nebílkovinných dusíkatých látek a organických kyselin v mléce (s intervencí do kompenzační podpory pufračního systému a pufrační kapacity mléka) jsou v podstatě dva: 1) zamezení, resp. kompenzace odchylky průměrných interferenčních efektů mléčné matrice v rámci multikomponentní simultánní infraanalýzy mléka (pro kombinace ať MIR nebo NEAR principu infraanalýzy, ať při využití transmise nebo reflektance, ať na bázi selektivně filtrové technologie nebo s interferometrem a postupem hodnocení výtěžnosti signálu prostřednictvím Fourierových transformací); 2) zajištění stability pufračního systému a kapacity a rovněž tomu odpovídající údržnosti relevantního referenčního vzorku bez rizika destrukce makromolekulárních složek mléka. 6) Tabulka: Složení specifické kompozice (SK) použité při ředění kalibračního (referenčního) vzorku. Složka Navážka [g/l] NaCl 1,1450 KCl 0,8490 K 2 HPO 4 1,8463 Kyselina citrónová (bezvodá) 1,7000 Močovina 0,3000 7) Použité literární prameny při ověřování a validaci uplatněné metodiky ARDÖ, Y.: Bronopol as a preservative in milk samples. Milchwissenschaft, 34, 1979, 1, 14-16. ARDÖ, Y.: Bronopol as a preservative in milk samples for the determination of cell content

using Fossomatic. Milchwissenschaft, 37, 1982, 3, 139-142. BARBANO, D. M.- CLARK, J. L.: Infrared milk analysis challenges for the future. J. Dairy Sci., 72, 1989, 1627-1636. BARBANO, D. M.- DELLAVALLE, M. E.: Rapid method for determination of milk casein content by infrared analysis. J. Dairy Sci., 70, 1987, 1524-1528. BARBANO, D. M.- LYNCH, J. M.: Crude and protein nitrogen bases for protein measurement and their impact on current testing accuracy. J. Dairy Sci., 75, 1992, 3210-3217. BARBANO, D. M.- LYNCH, J. M.- FLEMING, J. R.: Direct and indirect determination of true protein content of milk by Kjeldahl analysis: collaborative study. Journal of the AOAC, 1991, 281-288. BENDA, P.: Vliv některých konzervačních činidel na přirozenou mikroflóru vzorků mléka. The effect of some preservatives on natural microflora in milk samples. Vet. Med.-Czech, 40, 1995, 11, 359-364. BERLEC, M.- GOLC-TEGER, S.: Determination of nitrogen components content in milk by FTIR spectrometry. 2. Slovenian Congress Milk and Dairy Products Portorož, 1999, PB- 18, 63. BIGGS, D. A.: Milk analysis with the infrared milk analyzer. J. Dairy Sci., 50, 1967, 799-803. BIGGS, D. A.: Infrared milk analyzer. J. Dairy Sci., 55, 1972, 5, 650-651. BIGGS, D. A.: Precision and accuracy of infrared milk analysis. Journal of the AOAC, 55, 1972, 3, 488-497. BIGGS, D. A.: Instrumental infrared estimation of fat, protein, and lactose in milk: collaborative study. Journal of the AOAC, 61, 1978, 5, 1015-1034. BIGGS, D. A.: Performance specifications for infrared milk analysis. Journal of the AOAC, 62, 1979, a, 6, 1211-1214. BIGGS, D. A.: Infrared estimation of fat, protein, and lactose in milk: Evaluation of Multispec instrument. Journal of the AOAC, 62, 1979, b, 6, 1202-1207. BIGGS, D. A.- JOHNSSON, G.- SJAUNJA, L. O.: Analysis of fat, protein, lactose, total solids by infra-red absorption. Bulletin of the International Dairy Federation, Doc. 208, 1987, 21-29. BIGGS, D. A.- SZIJARTO, L. F.- VOORT VAN DE, F. R.: Fresh milk sampling for centralized milk testing. J. Dairy Sci., 67, 1984, 3085-3092. BUCHBERGER, J- KIERMEIER, F.: Über die Eignung von Natriumazid zur Konservierung von Milchproben. Deutsche Molkerei-Zeitung (Kempten Allgäu), F 8, 1975, 192-194. BUCHBERGER, J.- WEISS, G.- KIERMEIER, F.- PROBST, A.: Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei Fett-, Eiweiss- und Lactosebestimmung mit Hilfe der Infrarot-Spektrophotometrie (IRMA II-Gerät). Milchwissenschaft, 26, 1971, 11, 687-693. COLEMAN, D. A.- MOSS, B. R.: Effects of several factors on quantification of fat, protein, and somatic cells in milk. J. Dairy Sci., 72, 1989, 3295-3303. FRANKE, A. A.- DUNKLEY, W. L.- SMITH, N. E.: Influence of feeding protected tallow on accuracy of analyses by infrared milk analyzer. J. Dairy Sci., 60, 1977, 12, 1870-1874. GOULDEN, J. D. S.: Analysis of milk by infrared absorption. J. Dairy Res., 31, 1964, 273-284. GRAPPIN, R. Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis - aplication to calibration procedure and quality control in dairy laboratory. Bulletin of the International Dairy Federation, Doc. 208, IDF Provisional Standard 128, 1987, 3-12. GRAPPIN, R. European network of dairy laboratories. V: Proceedings of an International Analytical Quality Assurance and Good Laboratory Practice in Dairy Laboratories. Sonthofen / Germany, 1992-05-18/20, Brussels 1993, 205-211. GRAPPIN, R.- JEUNET, R.: Conditions d utilisation des méthodes automatiques de dénombrement des cellules du lait: étalonnage et conservation des échantillons de lait. Le Lait, 55, 1975, 650-668.

GRAPPIN, R.- JEUNET, R.: Calibrage des méthodes de dosage de routine des protéines du lait. Revue Laitiere Francaise, 347, 1976, 663-667. GRAPPIN, R.- LEFIER, D.: Reference and routine methods for the measurement of nitrogen fractions in milk and whey. Cheese yelding factors affecting its control, IDF Seminar, Cork, 1993, In Seminar proceedings, 5.1 Measurement of casein and other analytical methods, 1993, 191-203. HANSEN, R.: Multispec et avanceret apparatur til bestemmelse af fedt, protein, maelkesukker torstofindhold m. v. i maelkeprodukter. North European Dairy Journal, 1982, 7, 3-10. HANUŠ, O.- BENDA, P.- GENČUROVÁ, V.: Testování nového konzervačního přípravku vzorků mléka Milkofix pro účely infračervené analýzy základního složení mléka. I. ověření bakteriostatických a baktericidních vlastností a interferenčního vlivu. Tests of Milkofix a new preservative substance for milk samples used for the purposes of an infrarad analysis of basic milk composition. Part I. Checks of bacteriostatic and bactericidal abilities and interferential effect. Veterinární medicína, 1992, 37, 1, 21-31. HANUŠ, O.- GENČUROVÁ, V.- ŽVÁČKOVÁ, I.: Testování nového konzervačního přípravku vzorků mléka Milkofix pro účely infračervené analýzy základního složení mléka. II. ověření konzervačního účinku ve vztahu k infračervené analýze. Tests of Milkofix a new preservative substance for milk samples used for the purposes of an infrarad analysis of basic milk composition. Part II.Checks of preservative effects in relation to the infrared analysis. Veterinární medicína, 1992, 37, 1, 33-43. HANUŠ, O.- GENČUROVÁ, V.- GABRIEL, B.- ŽVÁČKOVÁ, I.: Srovnání účinnosti konzervačního přípravku Milkofix s tradičními konzervačními prostředky pro účely stanovení počtu somatických buněk ve vzorcích mléka fluoro-opto-elektronickou metodou. A comparison of the efficiency of Milkofix preservative substance with traditional preservatives used to determine somatic cell counts in milk samples by a fluoro-opto-electronic method. Veterinární medicína, 1992, 37, 2, 91-99. HANUŠ, O.- GENČUROVÁ, V.- GABRIEL, B.: Vliv stárnutí vzorků na přesnost infračervené analýzy základního složení mléka. The effect of sample aging on the accuracy of an infrared analysis of basic milk composition. Veterinární medicína, 1992, 37, 3, 149-160. HANUŠ, O.- KAŠŠOVICOVÁ, D.: Problematika přesnosti stanovení složek mléka v kontrole užitkovosti skotu pomocí infraanalýzy. Biopharm, 1992, 5-6, 193-199. GENČUROVÁ, V.- HANUŠ, O.- KOPECKÝ, J.: Nový konzervační prostředek vzorků mléka Broad spectrum microtabs v našich laboratořích. Veterinářství, 1993, 43, 12, 463-465. HANUŠ, O.- FICNAR, J.: Kjeltec as a tool for calibration of infrared milk analyzers. In Focus, The Tecator journal of technology for chemical analysis, 1990, 13, 1, 15-17. HANUŠ, O.- GENČUROVÁ, V.- HERING, P.- KLIMEŠ, M.: Quality assurance of protein analyses in the Czech milk recording system. In Focus, 2006, 30, 1, 16-18. HEINRICH, U.: Erfahrungsbericht über den Einsatz der Milko-Scan 104 im Betriebslabor eines grossstädtischen Versorgungsbetriebes. Deutsche Molkerei-Zeitung (München), F 47, 1979, 1670-1673. HILL, A. R.- MAKARCHUK, M. J.- SZIJARTO, L. F.: Comparison of alternative calibration procedures for infra-red milk analyzers. Can. Inst. Sci. Technol. J., 24, 1991, 5, 228-232. KERKHOF MOGOT M. F.- KOOPS, J.- NEETER, R.- SLANGEN, K. J.- HEMERT VAN, H.- KOOYMAN, O.- WOOLDRIK, H.: Routine testing of farm tank milk with the Milko-Scan 203. 1. Calibration procedure and small-scale experiments. Neth. Milk Dairy J., 36, 1982, 115-130. KROGER, M.: Milk sample preservation. J. Dairy Sci., 68, 1985, 783-787. KYLÄ-SIUROLA, A. L.- ANTILA, V.: Der Einfluss der Messwellenlänge auf die Fettgehaltbestimmung der Milch mit Hilfe der IR-Methode. Milchwissenschaft, 36, 1983, 6, 344-346. LORENZ, W.- HOFFER, H.: Testbericht über das halbautomatische Analysengerät Milko-Scan

104. Milchwirtschaftliche Berichte, 62, 1980, 73-80. NG-KWAI-HANG, K. F.- HAYES, J. F.: Effects of potassium dichromate and sample storage time on fat and protein by Milko-Scan and on protein and casein by a modified Pro-Milk Mk II method. J. Dairy Sci., 65, 1982, 1895-1899. NG-KWAI-HANG, K. F.- MOXLEY, J. E.- VOORT VAN DE, F. R.: Factors affecting differences in milk fat test obtained by Babcock, Rose-Gottlieb, and infrared methods and in protein test from infrared milk analysis. J. Dairy Sci., 71, 1988, 290-298. PETTIPHER, G. L.- UBALDINA M. RODRIGUES: A bacteriostatic mixture for milk samples and its effect on bacteriological, cytological and chemical compositional analysis. Journal of Applied Bacteriology, 52, 1982, 259-265. RAPP, M.- MÜNCH, S.: Neuentwicklung von flüssigen Konservierungsmitteln für Milchproben. Deutsche Molkerei-Zeitung, 105, 1984, 1264-1272. RENNER, E.- ÖMEROGLU, S.: Untersuchungen über die automatisierte Fett- und Eiweissgehaltsbestimmung in Milch mit dem Infrarot-Milchanalysator (IRMA). Deutsche Molkerei-Zeitung, 92, 1971, 2079-2123. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. I. Infrared spectrophotometry for analysis of fat, protein and lactose in milk. Acta Agric. Scand., 34, 1984, a, 249-259. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. II. Factors affecting milk analyses by infrared technique under laboratory conditions. Acta Agric. Scand., 34, 1984, b, 260-272. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. III. The effect of different treatments on infrared analyses. Acta Agric. Scand., 34, 1984, c, 273-285. SJAUNJA, L. O.- PHILIPSSON, J.- LUNDSTRÖM, K.- SWENSSON, CH.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. IV. Factors affecting milk analyses in a routine system by automated apparatuses. Acta Agric. Scand., 34, 1984, 286-299. SJAUNJA, L. O.- ANDERSSON, I.: Laboratory experiments with a new infrared (IR) milk analyzer, the Milko-Scan 605. Acta Agric. Scand., 35, 1985, 345-352. SZIJARTO, L. F.- BARNUM, D. A.: Preparation, use and evaluation of standards developed for simultaneous monitoring of Coulter and Fossomatic electronic cell counting instruments in Ontario. Journal of Food Protection, 47, 1984, 3, 227-231. SZIJARTO, L. F.- HARDING, F.- HILL, A. R.- MELICHERCIK, J.: Cooling systems for transport of unpreserved milk samples. J. Dairy Sci., 73, 1990, 2299-2308. THOMASOW, J.: Simultanbestimmung des Fett, und Eiweissgehaltes der Milch durch Messung der Infrarotabsorption mit dem Milko-Scan 300. Milchwissenschaft, 31, 1976, 3, 149-156. THOMASOW, J.- PASCHKE, E.: Bestimmung des Fett-, Eiweiss- und Milchzuckergehaltes. von Milch durch Messung der Infrarotabsorption mit dem Gerät Multispec. Milchwissenschaft, 36, 1981, 65-68. VINES, D. T.- JENNY, B. F.- WRIGHT, R. E.- GRIMES, L. W.: Variation in milk fat, protein and somatic cell count from four dairy herd improvement laboratories. J. Dairy Sci., 69, 1986, 2219-2223. VOORT VAN DE, F. R.: Evaluation of Milkoscan 104 infrared milk analyzer. Journal of the AOAC, 63, 1980, 5, 973-980. VOORT VAN DE, F. R.- KERMASHA, S.- SMITH, J. P.- MILLS, B. L.- NG-KWAI-HANG, K. F.: A study of the stability of record of performance milk samples for infrared milk analysis. J. Dairy Sci., 70, 1987, 1515-1523. WEAVER, J. C.- KROGER, M.- MCCARTHY, R.D.: Distribution of dichromate in preserved milk toward utilization of spent milk samples from centralized testing laboratories. J. Dairy Sci., 60, 1977, 706-709.

III) Předání uplatněné metodiky Příprava referenčního standardu pro kalibraci infraanalýzy mléka se sníženým obsahem hlavních komponent mléka jako dolními hodnotami kalibračních přímek a s vybalancovanou změnou interferenčního vlivu mléčné matrice: vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání laboratoří pro rozbory mléka ČMSCH a.s. Praha v elektronické i písemné formě 19. 3. 2008. Jedná se o nový postup řešení. IV) Závěr - Kontrola uplatnění metodiky: - kontrola aplikace uplatněné metodiky je proveditelná prostřednictvím revize dokladů a dokumentů o prováděných pracovních postupech a výsledcích při kalibracích infraanalyzátorů v laboratořích rozborů mléka v Buštěhradu a v Brně-Tuřanech, tedy na pracovištích klienta ČMSCH a.s. Praha; - uplatněná metodika obsahuje technicko-organizační doporučení, opatření a postupy v systému QA/QC (quality assurance/quality control, zajištění a řízení kvality) k řešení referenčně-rutinních systémů analytických laboratoří k testaci kvality syrového mléka a pro zvýšení věrohodnosti výsledků; - uplatněná metodika byla zpracována v šesti exemplářích a předána v kroužkové vazbě na příslušná pracoviště. Přílohy, dokumenty a doklady: technická řešení a postupy této uplatněné metodiky byly zčásti převzaty z vědecké a odborné literatury a zejména podpořeny výsledky vlastního výzkumu, vývoje a empirických poznatků, které byly publikovány. Datum: 11. 4. 2008 Za zhotovitele: Doc. Dr. Ing. Oto Hanuš Výzkumný stav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín Za uživatele: Ing. Zdeněk Růžička Českomoravská společnost chovatelů, a.s., Praha...... Výsledky řešení metodického problému byly formou vyhodnocení experimentů zpracovány pro dvě publikace v recenzovaném vědeckém a odborném tisku. Přílohy této uplatněné metodiky (Příprava referenčního standardu pro kalibraci infraanalýzy mléka se sníženým obsahem hlavních komponent mléka jako dolními hodnotami kalibračních přímek a s vybalancovanou změnou interferenčního vlivu mléčné matrice) tvoří manuskripty dvou zpracovaných příspěvků pro publikaci s vyhodnocením vlastních dosažených výsledků:

I) Evaluation of the compositionally modified milk reference sample in terms of its suitability for infraanalyse calibration by milk freezing point, osmolality and electrical conductivity measurement O. Hanuš, V. Genčurová, L. Janů, A. Macek, M. Vyletělová Abstract Hanuš, O., Genčurová, V., Janů, L., Macek, A., Vyletělová, M.: Evaluation of the compositionally modified milk reference sample in terms of its suitability for infraanalyse calibration by milk freezing point, osmolality and electrical conductivity measurement. The results of routine milk analyses are important for support of dairy cattle genetical improvement and also for support of milk food chain quality. These results are obtained with help of efficient indirect analytical methods as a rule, mostly by various forms of infraanalyse (mid, near). The result reliability depends on quality of indirect method calibrations. It is important to have the set of reference calibration samples with necessary value range for relevant calibration. This is obtained by various methods of sample preparation. These modifications would not damage the natural composition of milk sample and change the interference effects of basic milk matrix. It is necessary in order to calibration was not damaged by negative effects. The additions or withdrawals of components are commonly used etc.. The additions of water or different solutions are used for achievement of lower values of components. The goal of work was to verify and balance the impacts of dilution for decrease of main component concentrations in milk standard reference sample (which is intended for milk infraanalyse calibration) into milk matrix by manipulation in the sample soluble composition. The original milk samples were diluted (4/1) by distilled water, NaCl solution and specific composition (SC; for balance of disturbance in milk matrix (NaCl 1.145; KCl 0.849; K 2 HPO 4 1.8463; citric acid 1.7; urea 0.3 g/l)) for decrease of main milk component contents (fat, crude protein, lactose). The milk components, milk freezing point (MFP), osmolality (OS) and electrical conductivity (EC) were measured in the all (original as well as modified) milk sample sets and results were statistically compared. The lowest MFP and OS were in original milk -0.5559 C and 274.5 mosmol/kg. The MFP was increased to - 0.4369 C and osmolality decreased to 217.83 mosmol/kg by water addition. The MFP was decreased (-0.4903 C) and returned to original milk value by NaCl solutin addition. By the SC addition the MFP was -0.4788 C. The decrease was less than for NaCl. The ability of other composition elements (K 2 HPO 4, KCl, citric acid and urea) to decrease the MFP is less than for NaCl solution. EC was highest for NaCl set 4.69 ms/cm. EC for SC was 4.48 ms/cm. The difference was significant (P<0.001). The original milk set showed conductivity 4.27 ms/cm. The SC was the nearest to original milk sample in terms of total mineral amount. ECs for both modifications were different (P<0.001) from original sample. The procedure is applicable for balance of interference effects of milk matrix at manipulation with milk components in reference samples for infraanalyse calibration. Next research and experiments are necessary as well. milk, infraanalyse, reference sample, calibration, interference effect, fat, crude protein, lactose, milk freezing point, osmolality, electrical conductivity, sodium chloride, potassium chloride, citric acid, urea

The results of routine milk analyses are important for support of dairy cattle genetical improvement and also for support of milk food chain quality. These results are obtained with help of efficient indirect analytical methods as a rule, mostly by various forms of infraanalyse (mid, near). In the last time the row of authors (Sjaunja, 1984 a, b, c; Sjaunja et al., 1984; Sjaunja and Andersson, 1985; Hanuš et al., 1992, 1995 a, 2002; Tsenkova et al., 2000; Kukačková et al., 2000; Jankovská and Šustová, 2003; Kráčmar et al., 2004; Bijgaart 2006; Broutin, 2006; Šustová et al., 2006, 2007) was interested in calibration procedures of various infraanalyse methods on measurement of various milk components and in sample and result stability at indirect methods of milk analyse. The result reliability depends on quality of indirect method calibrations. It is important to have the set of reference calibration samples with necessary value range for relevant calibration. Is it a variation stretch, which is comparable to most of supposed measurement results. This range is obtained by various methods of sample preparation. These modifications would not damage the natural composition of milk sample and change the interference effects of basic milk matrix. It is necessary in order to calibration was not damaged by negative effects. The additions (milk fat, proteins, urea) or withdrawals (milk fat) of components or mechanic stress of milk sample (free fatty acids) are commonly used etc. (Hanuš et al., 1995 b, 1997, 2003, 2008 a, b; Hering et al., 2008). The additions of water or different solutions are used for achievement of lower values of components. The need scale of modifications in milk reference standard composition for infraanalyse calibration purposes is reached in this ways. Used milk samples for regular calibration of analytical instruments which work on basis of infrared absorption spectrophotometry are not seldom purposely modified in this way to the range of investigated components cover their real field. That is reason why distilled water is added into chosen samples of calibration set because of decrease of fat, protein and lactose contents. Of course, this addition can disturb the whole milk composition (milk matrix) to a certain extent in particular in terms of mineral soluble composition. The mineral matters or salts of some inorganic or organic acids in milk can be considered as agent of interference effects for measurement by infraanalysator (Hanuš et al., 1992). There are at first of all chlorides, natrium, kalium, citric acid, urea, free fatty acids etc. (Kerkhof Mogot et al., 1982; Sjaunja, 1984 c). The dilution of milk by mere distilled water leads to demanded decrease of fat, protein and lactose contents but simultaneously to change of mineral and other soluble matter ratio in relationship to the total milk volume. It can cause the change of interference effects in measured sample and consequently also the error measurement of infraanalyse. Namely the calibrated instrument compensates automatically the mean interference effects on measurement results in current (average) samples. However, it can be different in modified sample. The NaCl solution, which total amount (proposed concentration) was approximately equal to total milk mineralization, was added into diluted milk sample instead of solitary water because of ablation of this possible unfavourable effect. Nevertheless, the solitary NaCl can have different interference effect in comparison to above mentioned whole specific composition (SC; chlorides, natrium, kalium, citric acid and urea). That is reason why the SC, which approaches to final current milk composition as much as possible by both its composition and also concentrations after its addition into milk, was created. It comes to demanded decrease of fat, protein and lactose concentrations by addition of water solution of mentioned SC into milk sample. Nevertheless the other composition (minerals, organic acids) should approach to composition of original milk. In this way the change of interference effects for infraanalysis should be minimal. The hypothesis is the opinion that it is possible to increase the calibration quality of indirect analytical method for reliability of measurement of concrete milk components without negative impact of change of compensationable interference effects in the framework of

method by the targeted and verified modification of milk reference standards in terms of their composition. Therefore the goal of this work was to verify and balance the impacts of dilution for decrease the main component concentrations in milk standard reference sample (which is intended for milk infraanalyse calibration) into milk matrix by manipulation in the soluble composition of cow milk sample. MATERIAL AND METHODS Experimental sample preparation The preparation of reference milk sample with targetly decreased fat, protein and lactose content for calibration of infraanalyse was simulated in the work. The milk dilution was carried out by distilled water, NaCl solution and by solution of other matter composition, which was proposed in this way to approach as much as possible to occurrence of main mineral and other minority non-protein nitrogen matters and organic acids in milk (Tab. I). The additions of water, NaCl solution and SC were selected targetly according to the history of development of calibration sample preparation. The scale of six milk samples was prepared with original fat content from 3.61 to 6.94% (Tab. II). This scale is signed as set 1 (original set). Three next sets were prepared from this original scale in the following way: o set 2 (water): six samples of original set was diluted by distilled water in the ratio milk/water 4/1; o set 3 (NaCl): six samples of original set was diluted by NaCl solution (4 g/l distilled water) in the ratio 4/1; o set 4 (specific composition; SC): six samples of original set was diluted by salt solution (NaCl, KCl, K 2 HPO 4 ), citric acid (anhydride) and urea (Tab. I) in the ratio 4/1. The followed indicators were measured and compared for the characteristic of modified milk samples in terms of mineral composition: milk freezing point; osmolality; conductivity. Used analytical methods The following indicators were investigated in sample sets: somatic cell count (SCC, thousands/ml); fat (F, %); crude protein (CP, %); lactose (L, %); solid non fat (SNF, %); electrical conductivity (EC, ms/cm); milk freezing point (MFP, C); osmolality (OS, mosmol/kg). The SCC was determined by Fossomatic 90 instrument (Foss Electric, Denmark) according to ČSN EN ISO 13366-3. Apparatus was included into proficiency testing with the good results regularly. The extensive combined result uncertainty was ±9.3% for SCC <900 thousands/ml. F, CP, L and SNF indicators were measured by the instrument MilkoScan 133B (Foss Electric, Denmark), which was regularly calibrated according to the reference method results (standard ČSN 57 0536 by the Röse-Gottlieb s method for fat content, Kjeldahl s method for crude protein content and polarimetric and gravimetric methods for lactose and SNF contents, according to standard ČSN 57 0530). The instrument was included into proficiency testing with regularly successful results. The extensive combined result uncertainties (1.96 times the combined uncertainty as standard deviation with probability level 95%) are shown in Tab. VIII. OS was investigated by instrument Roebling osmometer. This was calibrated according to relevant solutions. Further the osmolality values according to relevant recalculation equation of MFP of concentration scale of urea solutions with known molality were calculated. These were signed as osmolality (OS) 2. MFP values were analysed by the top cryoscopic instrument Cryo-Star automatic (Funke- Gerber, Germany). The selected measurement mood was Plateau Search (with parameters: interval = 23 seconds and delta t = 0.4 m C). The instrument was under regular calibration by

the standard NaCl solutions (Funke-Gerber) and included into proficiency testing with successful results regularly. The extensive combined result uncertainty of measurement was ±0.00608 C, it means ±1.18%. Statistical evaluation The average values of individual investigated indicators were calculated for each set and also the differences between values of original set and modified sets (Tab. VI). These values of modified sets (Tab. II, III and IV) were tested by pair t-test against original set of samples (Tab. VI). The difference values of individual sets and original set (Tab. VI) were used for characterization of single sets and their mutual comparison, how influances the added NaCl solution or SC solution the properties of single sample sets. Further the pair t-test was carried out for F, Cp and L contents on SC versus sets 2 and 3. RESULTS AND DISCUSSION Basic comparison of milk indicators of sample sets Characteristic of single sample set composition is shown in Tab. II, III, IV and V. The mutual comparison of measurement results of modified reference samples by MFP, OS and EC determination was used for investigation of importance of total mentioned changes from the original milk matrix. The goal was not to cause the deviations of mentioned measurements by manipulations. It supports the presupposition that also the changes in possible interference effects on infraanalyse could be minimal. As it is known the measurement results of MFP, to it closely related osmolality and EC are closely connected to main mineral and other minorite non-protein nitrogen matters and organic acids (buffer system) in milk (Freeman and Bucy, 1967; Demott, 1969; Eisses and Zee, 1980; Brouwer, 1981; Walstra and Jenness, 1984; Koops et al., 1989; Bauch et al., 1993; Wiedemann et al., 1993; Buchberger, 1990, 1994). The average differences between original set and sets 2 and 3 were statistically insignificant for SCC and log SCC values. The SCC and log SCC difference between original set (1) and set 4 (SC) was statistically significant (P<0.05). The values were statistic significantly different (P<0.001) in EC and OS for other indicators, it means F, CP, L, SNF and MFP. Of course, the above mentioned statistical evaluation shows only the way of manipulation design in milk samples. It was discovered at set 3 (NaCl) that values F, CP and L were statistically different (P<0.001) from set 4 values while in set 2 (water) were statistically different on level P<0.05 for F and L and for CP on level P<0.01 (Tab. VII). The comparison of MFP, OS and EC values as most important characteristics in terms of mineral sample composition between single sets The original sample set showed the lowest values of MFP and OS -0.5559 C and 274.5 mosmol/kg (Tab. VI, Fig. 1, 3). The MFP value was increased to -0.4369 C and OS value was decreased to 217.83 mosmol/kg (Tab. VI, Fig. 1, 3) by addition of distilled water in above mentioned ratio (set 2). The MFP value was decreased again (-0.4903 C) and approached back to value of original sample set by NaCl solution (set 3) addition in this way. However, the original value was not reached because the lactose content in sample was decreased. The L shares MFP depression mostly by 54% in contrast to NaCl which together with other mineral salts share only 30.5% (Walstra and Jenness, 1984). The MFP value was only -0.4788 C in set 4 due to SC addition. The decrease is smaller than in NaCl. It is possible to explain it by fact that NaCl amount in the SC is lower. Instead of this the other salts are present here (Tab. I), citric acid and urea. For comparison the matter amount of delivered NaCl is equal to 68.4 mmol/l in set 3 while in the SC is total amount of mineral salts, citric acid and urea is equal to 55.44 mmol/l. The NaCl matter amount in SC is only 19.6 mmol/l. The ability of other components of composition (K 2 HPO 4, KCl, citric acid and urea) to MFP decrease is less than for alone NaCl. The EC was highest in set 3 (NaCl solution) 4.69 ms/cm (Tab. VI, Fig. 2). The EC for set 4 (SC) was 4.48 ms/cm. The

difference was statistically significant (P<0.001). The original milk set reached EC about 4.27 ms/cm. In total mineral amount point of view the set 4 (SC) was nearest to original milk sample. The values of both modified solutions were statistically different (P<0.001) from original sample. The theoretical calculation of occurrence of fat, protein and lactose in sample diluted by distilled water (set 2) Theoretical values of F, CP and L amounts in set 2 were calculated for possibility to discover the interference effects of added (missing) minerals in the reference milk samples. Calculation was carried out on the basis of known information about composition of original sample set and exact volume (ratio milk/water) of added distilled water into milk samples in set 2. The knowledge of theoretical F, CP and L contents in sample set 2 would unable to discover the inaccuracies in infraanalysator measurement which could be caused by possible changed interference effects. These could be find out by comparison with really measured values and also by comparison with values which were measured in sets 2 and 3 because due to addition of NaCl solution or eventually SC the amounts of F, CP and L are not changed in these sets. It is possible to find out the possible effects of selected minerals, citric acid and urea on measurement accuracy in this way. Contents of F, CP and L in original sample were: 5.35; 3.20 and 4.68% (g/100g). The amount 100 ml of milk presents (at average specific mass 1.030 g/ml) 103 g (average specific mass was derived from literature, because calculation does not depend on its value). It means that 25 ml (24.272 g) of distilled water was added into 100 ml of milk. This number corresponds to water addition in the volume ratio milk/water which is equal to 4/1. Total solution mass was then 128 g. The amounts of investigated components were 5.35 g of F, 3.20 g of CP and 4.68 g of L per 128 g of diluted milk. It means 4.18% of F content, 2.50% of CP and 3.65% of L as the result. The calculated theoretical values were compared with really measured values of F, CP and L contents in other sets (Tab. VI). The calculated values (Tab. VI) are lower than measured values. In the case of F content the theoretical value is 4.18% while for set 2 (water) and set 3 (NaCl) is it 4.35 and 4.34%. The average F content 4.38% which is the value mostly distant from theoretically calculated value was measured in the SC. In the case of CP amount the values are more balanced between single sets. The SC addition shows again the higher value (2.60%) than water (2.58), NaCl (2.58) and theoretical value (2.50%). On the contrary it is for L content where the result of SC measurement (set 4) 3.69% was the nearest to theoretical value (3.65%). The set 2 and 3 showed a little higher values (3.71 and 3.72% respectivelly). However, it is necessary to take also the uncertainties of instrument measurement into the account at result of comparison (Tab. VIII). CONCLUSIONS The measurement results of milk composition by indirect method of infrared spectrophotometry can be influenced due to interference effects. Average intereference effects are automatically compensated by the technical soution of method. These interference effects are caused by mutual interactions of milk components at simultaneous measurement. The changes in the interference effects can be caused by milk components which were manipulated. These effects are known but there are missing the detail information abou their size or dependence on amount of manipulated components. The samples with targetly decreased contents of F, CP and L are prepared also among others at regular calibrations of analytical infrared instruments. These decreases are carried out by dilution of milk sample by water or NaCl solution in exact ratio milk/water (solution). The replacement of distilled water by NaCl solution was made because of purpose to balance in certain way the decrease of mineral matters caused due to sample dilution. The total mineral concentration was

approached to original concentration after mentioned sample treatment but the composition was a little different. The effort about minimalization of interference effect changes and about maximal analytical improvement of method led consequently to the proposal of SC which should correspond to original milk as well as possible. Experiment for measurement of various characteristics and parameters of modified samples afforded information whether the speculation and following steps were correct. In the first part of experiment the measured values of MFP, OS and EC in modified samples were evaluated as the most important group indicators in terms of milk mineral composition. During evaluation the main attention was paied to difference between indicators of original sample (set 1) and modified sample by SC (set 4). Theoretically these procedures should approach mutually by their values as much as possible. As it was shown by MFP and osmolality values the set 2 (milk diluted by NaCl solution) was near to original milk. However, it is possible to explain the fact that NaCl, which was contained in higher amount in set 3 than in set 4, participated on the MFP depression and on OS increase much more than other mineral matters contained in the SC. That is reason why the electrical conductivity is property which is considered as most important indirect indicator of milk mineral composition. EC values measured in set 4 were the nearest to original milk. It was confirmed that proposed SC gets near its composition and properties to composition of original milk in terms of appreciation of soluble composition (main mineral and other minority non protein nitrogen matters and organic acids). The calculation of theoretical cccurrence of F, CP and L was carried out in milk diluted by destilled water (set 2). The knowledge of these values could show of possible interference effects of ratio change of mineral matters, urea and citric acid in comparison to other milk components. Theoretical calculation did not confirm the harmony of calculated values with set 4. On the contrary the set 4 values deviated from theoretical values in the cases of F and CP. However, the differences between compared sets were very small (in order of hundredths of %). Therefore it is necessary to take the uncertainties (UNs) of instrumental measurement into account. UNs were expressionaly higher in comparison with mentioned differences. This fact shows that the procedure for balance of interference effects of milk matrix at manipulation with milk components in reference samples for infraanalyse calibration is applicable. The reasons for application of procedure at reference sample set preparation are two: 1) preclusion of deviation of mean interference effects of milk matrix in the framework of multicomponent simultaneous milk infraanalyse; 2) stability assurance of buffering system and capacity and also shelf-time of relevant reference sample in obtaining of low values of calibration lines or curves. Next research and experiments are still necessary as well. SOUHRN Hodnocení složkově modifikovaného referenčního vzorku mléka ve smyslu jeho vhodnosti pro kalibraci infraanalýzy měřením bodu mrznutí mléka, osmolality a elektrické konduktivity Výsledky rutinních analýz mléka jsou důležité pro podporu šlechtění mléčného skotu a také pro podporu kvality mléčného potravinového řetězce. Tyto výsledky jsou získávány zpravidla pomocí výkonných nepřímých analytických metod. Nejčastěji různými formami infraanalýzy (mid, near). Věrohodnost výsledků je odvislá od kvality provedených kalibrací nepřímých metod. Pro relevantní kalibraci je nezbytné mít sadu referenčních kalibračních vzorků s potřebným rozsahem hodnot. To se dosahuje různými metodami úpravy vzorků. Úpravy by neměly poškodit přirozenou skladbu vzorku mléka a pozměnit interferenční vlivy základní mléčné matrice, aby kalibrace nebyla poškozena negativními vlivy. Používají se přídavky dané složky, odebrání složky atd.. Pro dosažení nižších hodnot koncentrací složek se používají také přídavky vody nebo některých roztoků. Cílem práce bylo ověřit a vyrovnat

dopady ředění pro snížení koncentrace základních složek v mléčném referenčním standardním vzorku, který je určen pro kalibraci infraanalýzy mléka, do mléčné matrice prostřednictvím manipulace v rozpustné kompozici vzorku. Původní vzorky mléka byly pro snížení obsahů základních složek (tuk, hrubé bílkoviny, laktóza) ředěny (4/1) destilovanou vodou, roztokem NaCl a specifickou kompozicí (SK) k vyvážení porušení mléčné matrice (NaCl 1,145; KCl 0,849; K 2 HPO 4 1,8463; kyselina citrónová 1,7; močovina 0,3 g/l). Byly měřeny složky mléka, bod mrznutí mléka (MFP), osmolalita (OS) a elektrická vodivost (EC) všech připravených (původních a modifikovaných) sad vzorků mléka a výsledky byly statisticky porovnány. Nejnižší MFP a OS byly u původního mléka -0,5559 C a 274,5 mosmol/kg. Přídavkem vody se MFP zvýšil na -0,4369 C a osmolalita klesla na 217,83 mosmol/kg. Přídavkem roztoku NaCl se MFP snížil (-0,4903 C) a přiblížil původnímu mléku. Přídavkem SK činil MFP - 0,4788 C. Snížení bylo menší než u NaCl. Schopnost ostatních složek kompozice (K 2 HPO 4, KCl, kyseliny citronové a močoviny) snižovat MFP je menší než u NaCl. EC byla nejvyšší u sady NaCl 4,69 ms/cm. EC u SK byla 4,48 ms/cm. Rozdíl byl významný (P<0,001). Původní sada mléka (1) dosáhla vodivosti 4,27 ms/cm. Z hlediska celkového množství minerálů se původnímu vzorku mléka nejvíce blížila SK. EC obou modifikací byly rozdílné (P<0,001) od původního vzorku. Postup vybalancování interferenčních efektů mléčné matrice při manipulaci s mléčnými složkami v referenčních vzorcích pro kalibraci infraanalýzy je použitelný. Další výzkumy a pokusy jsou však nezbytné. mléko, infraanalýza, referenční vzorek, kalibrace, interferenční vliv, tuk, hrubé bílkoviny, laktóza, bod mrznutí mléka, osmolalita, elektrická vodivost, chlorid sodný, chlorid draselný, kyselina citrónová, močovina ACKNOWLEDGEMENT This work was supported by the research projects MZe-CR, NAZV, QF 3019 and MSMT, INGO, LA 244 and was provided in frame of research activities of NRL-RM in Rapotín. REFERENCES BAUCH, W., HUBER, B., BUCHBERGER, J.: Zum Einfluss einiger Parameter auf die Bestimmung des Gefrierpunktes von Milk mit den Cryostar II LC. Dtsch. Milchwirtsch. Zeit., Lebensmittel und Milchwirtschaft, 114, 5, 1993: 112-114. BIJGAART VAN DEN, H.: New applications of mid-infra-red spectrometry for the analysis of milk and milk products. 2 Free fatty acids. IDF Bulletin, 406, 2006: 22-28. BROUTIN, P. J.: New applications of mid-infra-red spectrometry for the analysis of milk and milk products. 1 Casein. IDF Bulletin, 406, 2006: 2-21. BROUWER, T.: Calculations concerning the determination of the freezing-point depression of milk. Neth. Milk Dairy J., 1981: 35. BUCHBERGER, J.: Ursachen von Überschreitungen des Grenzwertes von 0,515 C beim Gefrierpunkt der Milch. Schule und Beratung, 9-10, IV-8-10, 1990. BUCHBERGER, J.: Zum Gefrierpunkt der Milch: Bewertung und Interpretation. Dtsch. Milchwirtsch. Zeit., 115, 8, 1994: 376-383. DEMOTT, B. J.: Relationship of freezing point of milk to its specific gravity and concentration of lactose and choride. J. Dairy Sci., 52, 6, 1969: 882. EISSES, J., ZEE, B.: The freezing point of autentic cow s milk and farm tank milk in the Netherlands. Neth. Milk Dairy J., 34, 1980: 162-180. FREEMAN, T. R., BUCY, J. L.: Distribution of milk freezing points in authentic herd samples. J. Dairy Sci., 50, 6, 1967: 951. HANUŠ, O., FICNAR, J., KOPECKÝ, J., JEDELSKÁ, R., BERANOVÁ, A., HAVLÍČKOVÁ, K.: A retrospective study of results and evolution of methodical design

for preparation of urea milk calibration standard sets. (In Czech) Výzkum v chovu skotu, 2, 1997: 7-21. HANUŠ, O., FICNAR, J., JEDELSKÁ, R., KOPECKÝ, J., BERANOVÁ, A., GABRIEL, B.: Methodical problems of nitrogen matters determination in cow s milk. (In Czech) Vet. Med.-Czech, 40, 12, 1995 a: 387-396. HANUŠ, O., GENČUROVÁ, V., GABRIEL, B.: The effect of sample aging on the accuracy of an infrared analysis of basic milk composition. (In Czech) Vet. Med.-Czech, 37, 3, 1992: 149-160. HANUŠ, O., HERING, P., MOTYČKA, Z., JEDELSKÁ, R.: Effect of milk samples freezing on practical interpretationability of individual somatic cell counts. (In Czech) Výzkum v chovu skotu, 2, 2002: 9-13. HANUŠ, O., HERING, P., FRELICH, J., JÍLEK, M., GENČUROVÁ, V., JEDELSKÁ, R.: Reliability of milk urea analyse results by various methods in use of artificial milk control samples. Czech J. Anim. Sci., 53, 4, 2008 b: 156-165. HANUŠ, O., JÍLEK, M., FICNAR, J., BERANOVÁ, A., JEDELSKÁ, R., HAVLÍČKOVÁ, K., MÍČOVÁ, Z.: Ways of preparing standards for calibration of indirect methods of determination of urea concentration in milk. (In Czech) Živoč. Výr., 40, 10, 1995 b: 441-451. HANUŠ, O., KLIMEŠ, M., MIHULA, P., KOZÁKOVÁ, A., JEDELSKÁ, R.: Impacts of the sampling of milk and the basic milk treatment on its freezing point and other compositional parameters. (In Czech) Výzkum v chovu skotu, 4, 2003: 10-17. HANUŠ, O., VEGRICHT, J., FRELICH, J., MACEK, A., BJELKA, M., LOUDA, F., JANŮ, L.: Analyse of raw cow milk quality according to free fatty acids contents in the Czech Republic. Czech J. Anim. Sci., 53, 1, 2008 a: 17-30. HERING, P., HANUŠ, O., FRELICH, J., PYTLOUN, J., MACEK, A., JANŮ, L., KOPECKÝ, J.: Relationships between the results of various methods of urea analysis in native and enriched milk. Czech J. Anim. Sci., 53, 2, 2008: 64-76. JANKOVSKÁ, R., ŠUSTOVÁ, K.: Analysis of cow milk by near-infrared spectroscopy. Czech J. Food Sci., 21, 4, 2003: 123-128. KERKHOF MOGOT, M. F., KOOPS, J., NEETER, R., SLANGEN, K. J., HEMERT VAN, H., KOOYMAN, O., WOOLDRIK, H.: Routine testing of farm tank milk with the Milko-Scan 203. 1. Calibration procedure and small-scale experiments. Neth. Milk Dairy J., 36, 1982: 115-130. KOOPS, J., KERKHOF MOGOT, M. F., VAN HEMERT, H.: Routine testing of farm tank milk by infra-red analysis. IV Prediction of the freezing-point depression from infra-red measurements and conductivity. Neth. Milk Dairy J., 43, 1989: 3-16. KRÁČMAR, S., JANKOVSKÁ, R., ŠUSTOVÁ, K., KUCHTÍK, J., ZEMAN, J.: Analysis of amino acid composition of sheep colostrum by near-infrared spectroscopy. Czech J. Anim. Sci., 49, 5, 2004: 177-182. KUKAČKOVÁ, O., ČURDA, L., JINDŘICH, J.: Multivariate calibration of raw cow milk using NIR spectroscopy. Czech J. Food Sci., 18, 1, 2000: 1-4. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. I. Infrared spectrophotometry for analysis of fat, protein and lactose in milk. Acta Agric. Scand., 34, 1984 a: 249-259. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. II. Factors affecting milk analyses by infrared technique under laboratory conditions. Acta Agric. Scand., 34, 1984 b: 260-272. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. III. The effect of different treatments on infrared analyses. Acta Agric. Scand., 34, 1984 c: 273-285. SJAUNJA, L. O., PHILIPSSON, J., LUNDSTRÖM, K., SWENSSON, CH.: Studies on milk

analysis of individual cow milk samples. IV. Factors affecting milk analyses in a routine system by automated apparatuses. Acta Agric. Scand., 34, 1984: 286-299. SJAUNJA, L. O., ANDERSSON, I.: Laboratory experiments with a new infrared (IR) milk analyzer, the Milko-Scan 605. Acta Agric. Scand., 35, 1985: 345-352. ŠUSTOVÁ, K., KUCHTÍK, J., KRÁČMAR, S.: Analysis of ewe s milk by FT near infrared spectroscopy: measurement of samples on Petri dishes in reflectance mode. Acta univ. agric. et silvic. Mendel Brun., 53, 2, 2006: 131-138. ŠUSTOVÁ, K., RŮŽIČKOVÁ, J., KUCHTÍK, J.: Application of FT near spectroscopy for determination of true protein and casein in milk. Czech J. Anim. Sci., 52, 9, 2007: 284-291. TSENKOVA, R., ATANASSOVA, S., ITOH, K., OZAKI, Y., TOYODA, K.: Near infrared spectroscopy for biomonitoring: Cow milk composition measurement in a spectral region from 1,100 to 2,400 nanometers. J. Anim. Sci., 78, 2000: 515-522. WALSTRA, P., JENNESS, R.: Dairy Chemistry and Physics, New York Chichester Brisbane Toronto Singapore, 1984. WIEDEMANN, M., BUCHBERGER, J., KLOSTERMEYER, H.: Ursachen für anomale Gefrierpunkte der Rohmilch. Dtsch. Milchwirtsch. Zeit., 1 und 2. Mitteilung, 114, 1993, 22, 1993: 634-644, 114, 23, 1993: 656-663. Address Doc. Ing. Oto Hanuš, Ph.D., Ing. Václava Genčurová, Ing. Libor Janů, Mgr. Antonín Macek, RNDr. Marcela Vyletělová, Ph.D. Research Institute for Cattle Breeding, Rapotín Výzkumníků 267 788 13 Vikýřovice Czech Republic Phone: +420 583 392 157 Fax: +420 583 392 129 E-mail: oto.hanus@vuchs.cz http://www.vuchs.cz Tab. I Specific composition (SC) used for preparation of reference milk sample set 4. Component Mass [g/l] NaCl 1.1450 KCl 0.8490 K 2 HPO 4 1.8463 Citric acid (anhydride) 1.7000 Urea 0.3000 Tab. II Set 1 (original): characteristic of six samples of original milk set. F CP L SNF SCC log SCC EC MFP OS OS 2 (%) (%) (%) (%) (ths./ml) (ms/cm) ( C) mosmol/kg mosmol/kg 1 3.61 3.19 4.82 8.56 336 2.5263 3.95-0.5280 272 281.5 2 4.49 3.20 4.78 8.53 384 2.5843 3.90-0.5337 271 284.5 3 5.16 3.20 4.71 8.46 594 2.7738 3.90-0.5401 274 287.9 4 5.58 3.21 4.65 8.41 722 2.8585 3.90-0.5509 274 293.6 5 6.34 3.20 4.59 8.34 867 2.9380 3.90-0.5559 276 296.2 6 6.94 3.22 4.50 8.28 1012 3.0052 3.95-0.5610 280 298.9

Tab. III Set 2 (water): characteristic of six milk samples which were diluted by distilled water. F CP L SNF SCC log SCC EC MFP OS OS 2 (%) (%) (%) (%) (ths./ml) (ms/cm) ( C) mosmol/kg mosmol/kg 1 2.97 2.57 3.85 6.96 285 2.4548 3.53-0.4201 218 224.7 2 3.61 2.57 3.79 6.91 455 2.6580 3.45-0.4310 214 230.5 3 4.09 2.58 3.74 6.87 612 2.7868 3.40-0.4346 217 232.4 4 4.73 2.58 3.67 6.79 759 2.8802 3.40-0.4415 220 236.0 5 5.11 2.57 3.63 6.76 924 2.9657 3.40-0.4441 217 237.4 6 5.59 2.60 3.55 6.71 1056 3.0237 3.50-0.4503 221 240.6 Tab. IV Set 3 (NaCl): characteristic of six milk samples which were diluted by NaCl solution. F CP L SNF SCC log SCC EC MFP OS OS 2 (%) (%) (%) (%) (ths./ml) (ms/cm) ( C) mosmol/kg mosmol/kg 1 2.96 2.57 3.86 6.97 275 2.4393 4.40-0.4683 243 250.1 2 3.58 2.57 3.79 6.92 503 2.7016 4.30-0.4828 243 257.7 3 4.10 2.58 3.74 6.87 679 2.8319 4.25-0.4894 242 261.2 4 4.72 2.58 3.69 6.81 873 2.9410 4.25-0.4971 248 265.3 5 5.11 2.58 3.65 6.78 941 2.9736 4.30-0.5010 248 267.3 6 5.56 2.59 3.57 6.71 1047 3.0199 4.35-0.5034 248 268.6 Tab. V Set 4 (SC): characteristic of six milk samples which were diluted by solution of SC (Tab. I). F CP L SNF SCC log SCC EC MFP OS OS 2 (%) (%) (%) (%) (ths./ml) (ms/cm) ( C) mosmol/kg mosmol/kg 1 3.01 2.59 3.82 6.96 312 2.4942 4.20-0.4585 236 244.9 2 3.62 2.59 3.77 6.91 470 2.6721 4.10-0.4715 234 251.8 3 4.15 2.61 3.71 6.87 729 2.8627 4.10-0.4791 237 255.8 4 4.75 2.60 3.65 6.80 910 2.9590 4.08-0.4858 240 259.3 5 5.13 2.60 3.62 6.76 970 2.9868 4.10-0.4859 237 259.4 6 5.60 2.60 3.55 6.70 1097 3.0402 4.10-0.4919 243 262.5 Tab. VII Statistical significance of differences between average values of set 4 (composition) and set 2 (water) and set 3 (NaCl). SS 2 Water 3 NaCl F (%) * *** CP (%) ** *** L (%) * *** Tab. VIII The extensive combined uncertainties (UNs) of measurement results of individual indicators for the Milkoscan 133B apparatus. Component Fat Crude protein Lactose UNs (%) relative ±2.77 ±2.59 ±2.37 UNs % absolute ±0.101 ±0.085 ±0.115

Tab. VI Mean values of individual measured indicators of milk sample sets, the differences modified set original set and significance of differences of original set from modified sets. SS 1 2 3 4 TVDS F (%) 5.35 4.35 4.34 4.38 4.31 CP (%) 3.203 2.58 2.58 2.60 2.58 L (%) 4.675 3.71 3.72 3.69 3.76 SNF (%) 8.43 6.83 6.84 6.83 SCC (ths./ml) 652.5 681.83 719.67 738 log SCC 2.781 2.79 2.8179 2.84 EC (ms/cm) 4.25 3.75 4.69 4.48 MFP ( C) -0.5559-0.4369-0.4903-0.4788 OS (mosmol/kg) 274.5 217.83 245.33 237.83 OS 2 (mosmol/kg) 290.4 240.6 268.6 262.5 modified original F (%) -1.00-1.01-0.97 CP (%) -0.62-0.62-0.60 L (%) -0.97-0.96 -.99 SNF (%) -1.60-1.59-1.60 SCC (ths./ml) 29.33 67.17 85.50 log SCC 0.01 0.04 0.06 EC (ms/cm) -0.50 0.44 0.23 MFP ( C) 0.1190 0.0656 0.0771 OS (mosmol/kg) -56.67-29.17-36.67 OS 2 (mosmol/kg) -49.80-21.80-27.90 pair t-test: original versus modified F (%) *** *** *** CP (%) *** *** *** L (%) *** *** *** SNF (%) *** *** *** SCC (ths./ml) ns ns * log SCC ns ns * EC (ms/cm) *** *** *** MFP ( C) *** *** *** OS (mosmol/kg) *** *** *** OS 2 (mosmol/kg) *** *** *** Statistical significance: ns = P>0.05; * = P<0.05; ** = P<0.01; *** = P<0.001. SS = sample set. TVDS = theoretical values for diluted samples.

1 Milk freezing point (MFP) average values in individual sets of original and modified milk. MFP ( C) 0-0.1-0.2-0.3-0.4-0.5-0.6 1 2 3 4 Sample set There are showed individual sets on the x axis: set 1 (original milk); set 2 (milk diluted by distilled water); set 3 (milk diluted by NaCl solution); set 4 (milk diluted by solution of specific composition (SC) of mineral salts, urea and citric acid (Tab. I)). 2 Electrical conductivity (EC) average values individual sets of original and modified milk. 5 EC (ms/cm) 4 3 2 1 0 1 2 3 4 Sample set

3 Osmolality (OS) average values individual sets of original and modified milk. OS (mosmol/kg) 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 Sample set