Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Studijní program: Biologie. Studijní obor: Biologie

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie Markéta Palovská Fotosystému I: od baktérií k zeleným rostlinám Photosystem I: from bacteria to green plants Bakalářská práce Školitel: RNDr. Dana Holá, Ph.D. Praha, 2013

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, 15.5.2013

Děkuji RNDr. Daně Holé, Ph.D. Za cenné rady, trpělivost a čas, který mi věnovala při psaní této práce. Dále bych chtěla poděkovat svým rodičům a kamarádce Anně Babuské za podporu v těžkých chvílích.

Abstrakt Fotosystémy (PS) typu I jsou charakterizovány tím, že jako koncový akceptor elektronů u nich slouží Fe-S centrum. Tyto komplexy se vyskytují u zástupců 4 skupin prokaryot a všech fotosyntetizujících eukaryot. V práci jsou popsány současné znalosti o struktuře a funkci jejich proteinových podjednotek. U Heliobacteria se nachází nejjednodušší známý PS, který je homodimerní a sestává ze 2 proteinů. U zelených sirných bakterií je PS také homodimerní a sestává ze 4 proteinů včetně membránově vázaného cytochromu. U nově objeveného Candidatus Chloracidobacterium thermophilum je homodimerní PS fungující v aerobních podmínkách. Reakční centrum dobře prozkoumaného PS I u sinic je stejně jako v případě eukaryotického PS I heterodimerní. Tento PS je složen z 12 proteinů a za nízkého ozáření se seskupuje do trimerů. U zelených rostlin je tvorba trimeru zcela potlačena a PS I (alespoň 15 proteinů) je adaptován na vazbu mnoha membránových proteinů sloužících jako vnější světlosběrné antény. Určité odlišnosti ve stavbě PS I se vyskytují u skupin Rhodophyta a Glaukophyta. O evolučním původu PS I existuje mnoho hypotéz. Poslední společný předek všech PS sdílel pravděpodobně vlastnosti typů I i II. V práci je diskutován účel a způsob vzniku heterodimeru PS I. Detailní objasnění struktury PS I u prokaryotických organismů a různých skupin fotosyntetizujících eukaryotických organismů by mohlo přispět k lepšímu pochopení jeho evoluční historie. Klíčová slova Evoluce, fotosystém I, heliobakterie, chloroplasty, proteinové podjednotky, reakční centrum, sinice, struktura, zelené sirné bakterie

Abstract Type I Photosystems (PS) are characterized by a Fe-S cluster that serves as the terminal electron acceptor. They are present in 4 prokaryotic groups and all photosynthetic eukaryotes. This work summarizes the knowledge on the structure and function of PS I subunits. The simplest PS (homodimeric; only 2 subunits) is present in Heliobacteria. PS of green sulphur bacteria is also homodimeric and consists of 4 proteins including a membrane-bound cytochrome. The homodimeric PS of Candidatus Chloracidobacterium thermophilum is functional in aerobic conditions. The reaction center of the well-characterized PS I of Cyanobacteria has a heterodimeric structure; the same applies for the eukaryotic PS I. Cyanobacterial PS consists of 12 proteins and forms trimers under low light conditions. The trimer formation is completely suppressed in green plants. Their PS I (at least 15 proteins) is adapted to bind light-harvesting membrane proteins. The PS I of Glaukophyta and Rhodophyta is slightly different from green plants. Various hypotheses about the evolutionary origin of PS I exist. The last common ancestor of all PSs probably shared features of both Type I and Type II. The purpose and the origin of a PS I heterodimer is also discussed in this work. A further understanding of PS I evolutionary history would be helped by a detailed dissection of its structure in prokaryotic organisms and various groups of eukaryotic photosynthetic organisms. Key words Evolution, chloroplasts, cyanobacteria, green sulphur bacteria, heliobacteria, Photosystem I, protein subunits, reaction center, structure

Obsah Seznam použitých zkratek...2 1. Úvod...3 2. Struktura fotosystému I...3 2.1 Obecný popis reakčního centra typu I...3 2.2 Heliobakterie...4 2.3 Zelené sirné bakterie...6 2.4 Candidatus Chloracidobacterium thermophilum...9 2.5 Sinice...11 2.6 Zelené rostliny...18 2.7 Glaukofyta...21 2.8 Ruduchy...21 3. Evoluce fotosystému I...24 3.1 První fotosystém a raná evoluce...24 3.2 Vznik heterodimeru reakčního centra PS I...28 3.3 Původ a evoluce eukaryotického PS I...28 4. Závěr...29 5. Seznam použité literatury...30

Seznam použitých zkratek Zkratky použité výhradně v popiscích k obrázkům a tabulkám zde nejsou uvedeny a jsou vysvětleny přímo u příslušných obrázků/tabulek. Často používané zkratky jsou navíc vysvětleny i při prvním výskytu v textu. BChl bakteriochlorofyl CbpC protein vázající karotenoidy (carotenoid binding protein) u Candidatus Chloracidobacterium thermophilum ESR, EPR elektronová spinová (paramagnetická) rezonance FMO Fenna-Matthews-Olson protein (považuje se většinou za součást světlosběrné antény u zelených sirných bakterií) FNR ferredoxin/nadp-reduktáza Chl chlorofyl IsiA protein vnitřní světlosběrné antény sinic, jehož exprese je regulovaná v závislosti na množství železa (iron stress inducible) LHC komplex vnitřní fotosyntetické světlosběrné antény v chloroplastech řas a zelených rostlin (light harvesting complex) MQ menachinon NADH nikotinamidadenindinukleotid (redukovaná forma) Pcb protein vnitřní světlosběrné antény prochlorofyt (prochlorophyte chlorophyll b binding) PhQ fylochinon PS fotosystém Psa označení pro podjednotky fotosystému I sinic a chloroplastů Psc označení pro podjednotky fotosystému I zelených sirných bakterií Psh označení pro podjednotky fotosystému I heliobakterií RC reakční centrum TMH transmembránová α-šroubovice (transmembrane helix) FA, FB, FX Fe-S centra sloužící jako akceptory elektronů ve fotosystému I 2

1. Úvod Všechny fotosyntetické organismy, jejichž fotosyntéza je založena na chlorofylu (Chl), konvertují energii slunečního záření na energii chemickou (oxidaci přenašečů elektronů s nízkým elektrickým potenciálem a redukci přenašečů elektronů s vysokým elektrickým potenciálem) pomocí membránových proteinových komplexů zvaných fotosystémy (PS). Podle chemické povahy koncových akceptorů elektronů jsou PS děleny na základní dva typy. U typu I přenos elektronů končí na Fe-S centrech, u typu II na chinonových přenašečích. Heliobakterie, zelené sirné bakterie a nedávno objevený Candidatus Chloracidobacterium termophilum obsahují PS typu I, zelené nesirné bakterie a purpurové bakterie obsahují PS typu II, a sinice a chloroplasty řas a zelených rostlin obsahují oba typy. Tato práce má za cíl stručně popsat současné poznatky o složení a struktuře reakčních center (RC) PS typu I (se zaměřením na jejich proteinové podjednotky) a o předpokládané evoluční historii těchto komplexů, pojednané z funkčního hlediska. 2. Struktura fotosystému I 2.1 Obecný popis reakčního centra typu I Jádro všech známých PS typu I tvoří dimer integrálního membránového proteinu s jedenácti transmembránovými α-šroubovicemi (TMH). U prokaryotických fotosyntetických organismů s jedním PS je to homodimer, u sinic a chloroplastů heterodimer. Protein lze rozdělit na dvě víceméně samostatné domény. Pět C-koncových TMH tvoří vlastní jádro - obklopuje elektrontransportní řetězec. Šest N-koncových TMH koordinuje větší množství Chl nebo bakteriochlorofylu (BChl) a slouží jako vnitřní světlosběrná anténa. Na základě strukturní podobnosti se soudí, že tyto domény odpovídají samostatným proteinům v RC typu II (Sadekar, 2006). Okolo tohoto velkého dimeru se váže větší či menší (nebo žádné u heliobakterií) množství menších proteinů vázajících další molekuly Chl nebo BChl, které mají funkci rozšířit světlosběrné antény, kotvit vnější světlosběrné antény, zprostředkovat přenos energie z vnějších světlosběrných antén nebo mezi PS (u sinic). Na stromální/intracelulární straně membrány se na základní dimer váže další protein/proteiny nesoucí dvě Fe-S centra fungující na konci elektrontransportního řetězce. Primární donor elektronů do fotosyntetického elektron-transportního řetězce tvoří pár Chl nebo BChl v centru PS. Primární donor je tradičně označován písmenem P a číslem vyjadřujícím jeho absorbční maximum (tj. P#). Každý z Chl nebo BChl je koordinován jednou z proteinových podjednotek hlavního dimeru. Na tento pár je sváděna excitační energie záření z mnoha molekul Chl (nebo BChl) vnitřních světlosběrných antén a případných vnějších 3

anténových systémů. Excitační energie u páru Chl (nebo BChl) vede k separaci náboje a tzv. vysokoenergetický elektron je z primárního donoru přenesen na primární akceptor. Primárním akceptorem (označován obvykle A nebo A0) je Chl nebo jeho derivát. V PS se vyskytuje ve dvou kopiích a tím vytváří začátek dvou větví přenosu elektronů. U PS II je jedna větev upřednostňována, u PS I nic takového potvrzeno nebylo (Müller et al., 2010). Z primárního akceptoru putuje elektron po potenciálovém spádu na další přenašeče (A 0, A1), čímž dochází k stabilizaci separace náboje. U sinic a chloroplastů jsou tyto přenašeče dobře prozkoumány. Jsou odvozeny od Chl nebo chinonu a tvoří dvě větve přenosu elektronů (viz dále). U skupin organismů s homodimerním PS panují spory o účasti některých přenašečů a funkčnosti obou možných větví elektronového transportu (viz dále). Dvě větve přenosu elektronů se u všech organismů s PS typu I spojují na meziproteinovém [4Fe-4S] centru FX. Toto centrum se nachází v ose souměrnosti ústředního homo/heterodimeru blízko jeho stromální strany a je koordinováno dvěma cysteiny z každého proteinu. FX předává elektrony dvěma následujícím [4Fe-4S] centrům FA a FB. Uspořádání a rozdíl hladin potenciálů těchto center se liší u homodimerních a heterodimerních PS I. U homodimerních PS I je možné jednotlivá Fe-S centra redukovat samostatně (viz dále). Oxidovaný primární donor P#+ je u většiny organismů přímo redukován rozpustnými či v membráně kotvenými přenašeči elektronů. Pouze v případě zelených sirných bakterií je protein, skrze nějž jsou elektrony PS dodávány, přímo součástí PS. Kromě anténových Chl/BChl a kofaktorů účastnících se přenosu elektronů se v PS vyskytují další kofaktory. Karotenoidy přebírají přebytečnou excitační energii z Chl/BChl, u kterých by mohlo nahromaděním excitační energie dojít ke vzniku tripletového stavu a následné tvorbě volných radikálů. Karotenoidy mají nižší hladiny excitační energie, k tomuto jevu u nich nedochází a exitační energie je uvolňována pouze ve formě tepla (Siefermann-Harms, 1987). Další minoritní kofaktory jako lipidy nebo vápenatý ion se účastní na tvorbě a udržení struktury PS (viz dále). 2.2 Heliobakterie Heliobakterie z kmene Firmicutes jsou jediné fotosyntetizující grampozitivní bakterie. Jsou striktně anaerobní (kyslík neprodukují a nesnášejí) a heterotrofní (uhlík přijímají ve formě pyruvátu). V jejich membráně je přítomen jediný PS, který na extracelulární straně membrány přebírá elektrony z cytochromu c553 a předává je na cytosolické straně ferredoxinu (Sattley a Blankenship, 2010). 4

PS heliobakterií je zatím nejjednodušší známý. Neobsahuje žádné vnější světlosběrné antény. Sestává z pouhých dvou proteinů PshA a PshBI (dříve nazývaný PshB) nebo PshBII. PshA (47 67 kda) je integrální membránový protein, s jedenácti TMH a s N-koncem mířícím dovnitř buňky, jehož terciální struktura je pouze odhadována (Collins et al., 2010). Homodimer PshA tvoří RC, koordinuje primární donor elektronu, kterým je pár BChl g' (132epimer BChl g; Collins et al., 2010) označovaný P798 (nebo P800), dále primární akceptor elektronu hydroxychl a, a 35-40 anténových BChl g (Oh-oka, 2007). Podle Sarrou et al. (2012) je anténových BChl g 16-18, zatímco Heinnickel et al. (2006) uvádí počet molekul anténových BChl g jako 20-22, takže je zřejmé, že tuto otázku bude ještě třeba dále vyjasnit. BChl g je unikátní pigment přítomný pouze u heliobakterií. Struktura BChl g je hybridem mezi Chl a a BChl b. BChl g je derivátem Chl a a je na něj snadno převoditelný. Ke konverzi BChl g na Chl/ feofytin a dochází při současném vystavení RC kyslíku a ozáření (Sarrou et al., 2012). PshA dále váže menachinon, jehož úloha v elektron-transportním řetězci je zatím předmětem diskuzí, a meziproteinové [4Fe-4S] centrum F X, které je koncovým akceptorem elektronů na tomto proteinu. Přítomnost menachinonu v RC vedla k myšlence, že by mohl analogicky k fylochinonu v PS I přenášet elektrony z primárního akceptoru na Fe-S centrum F X (Brettel et al., 1998). Proti tomu ale svědčí mnohá experimentální data. K nejpřesvědčivějším patří fakt, že extrakce menachinonu diethyléterem z membrán nevedla k změnám reakční kinetiky přenosu elektronů PS (Kleinherenbrink et al., 1993). Redukce menachinonu za oxidace P800+ byla spektroskopicky zaznamenána (Miyamoto et al., 2008), ale jiní autoři (Sarrou et al., 2012) nebyli schopni tento pokus zopakovat místo semichinonu jim vznikal radikál SO 2-, jehož spektrografické vlastnosti jsou semichinonu velmi podobné. Kromě toho je menachinon k RC vázán poměrně slabě (obsazenost každého vazebného místa je odhadována na 80 %, Sarrou et al., 2012). To vede k otázkám, zda redukovaný menachinon nevycestovává a nevytváří fyziologicky významný pool. Touto svou vlastností by se RC heliobakterií přibližoval vlastnostem RC typu II. Podle Sarrou et al. (2012) je ale v membráně přítomno celkem čtyři až pět chinonů na každé RC, z čehož přibližně dva jsou na RC vázány. V membráně jsou i další proteiny vázající chinony (NADH-hydrogenáza, fumarátreduktáza, cytochrom b6f komplex) což ponechává velmi málo možností pro existenci volného rozpuštěného menachinonu. Přítomnost Fe-S centra FX v RC nejdříve naznačoval pouze FX-vazebný motiv (FPCxGPxxGGTC) v sekvenci PshA analogický k PS I. ESR spektroskopická detekce byla ztížena podobností a tedy překryvem se signály pro FA a FB (Miyamoto et al., 2006). Zvláštní vlastností FX heliobakterií je jeho základní spinový stav S=3/2 na rozdíl od sinic a chloroplastů, kde S=1/2 (Heinnickel et al., 2006). V blízkém okolí F X jsou pozitivně nabité aminokyselinové 5

zbytky PshA. Tento náboj napomáhá stabilizaci redukovaného FX- (Sarrou et al., 2012). FX redukuje [4Fe-4S] centra FA a FB přítomná v proteinu PshBI nebo alternativním proteinu PshBII. Podle nedávné studie mohou být elektrony z F X ale přenášeny nejen na uvedené dvoucentrové ferredoxiny, ale i na flavodoxin (Romberger a Golbeck, 2012). Před několika lety (Heinnickel et al., 2005; 2007) byl izolován protein o velikosti cca 8 kda, obsahující dvě koncová Fe-S centra, který byl nazván PshB (dnes je označován jako PshBI, Romberger et al., 2010). Klíčové pro jeho izolaci bylo zjištění, že protein disociuje z membrán při zvýšené iontové síle roztoku. Tento slabý způsob vazby je velmi odlišný od proteinu nesoucího koncová Fe-S centra u sinic a zelených rostlin (PsaC), který disociuje až za vysokých koncentrací chaotropních činidel a zničení Fe-S center (Heinnickel a Golbeck, 2007). PshB má negativně nabitou část, která při kontaktu překrývá pozitivní náboj PshA (Sarrou et al., 2012). Hlavní vazebnou silou mezi těmito proteiny jsou tedy pravděpodobně elektrostatické interakce, které jsou přítomností solí snadno narušeny. Nedávno byl prozkoumán druhý protein, jehož gen je kódovaný ve stejném operonu. Tento protein také nese dvě Fe-S centra a alternativně se váže k dimeru PshA (Romberger et al., 2010). PshB byl přejmenován na PshBI a nový protein byl nazván PshBII. Oba tyto proteiny jsou členy velké rodiny malých dvoucentrových bakteriálních ferredoxinů, obsahujících dva motivy CxxCxxCxxxCP, kde první tři cysteiny prvního motivu a poslední cystein druhého motivu koordinují vždy jedno Fe-S centrum (Romberger a Golbeck, 2010). Důvod, proč heliobakterie ve svém genomu kódují dva proteiny PshB, zatím není jasný. Přítomnost těchto genů ve stejném operonu značně snižuje pravděpodobnost jejich samostatné regulace. Je možné, že proteiny zprostředkují přenos elektronů na různé akceptory. FA a FB jsou koncová Fe-S centra v heliobakteriálním RC. Původní pořadí jejich názvů založené na EPR spektroskopických vlastností odpovídá opačnému pořadí jejich redukčních potenciálů a jejich názvy možná budou vyměněny (Romberger a Golbeck, 2010). V RC heliobakterií je přítomen pouze jeden karotenoid (Sarrou et al., 2012). To je velmi zvláštní vzhledem k předpokládané absolutní symetrii. Vzhledem ke známé struktuře ostatních PS není příliš myslitelné, že by se karotenoid nacházel v centrální ose RC. Možné vysvětlení, podle kterého má tento karotenoid dvě vazebná místa a je ještě labilnější než menachinon, se nezdá příliš pravděpodobné (Sarrou et al., 2012). Na vysvětlení bude třeba počkat až do definitivního rozluštění struktury RC heliobakterií. 2.3 Zelené sirné bakterie Zelené sirné bakterie z kmene Chlorobi jsou fotoautotrofní striktně anaerobní 6

gramnegativní bakterie, které oxidují redukované sloučeniny síry. V jejich cytoplasmě se nachází chlorosomy (obrovské světlosběrné anténové komplexy) spojené skrze tzv. FennaMatthews-Olson (FMO) proteiny s RC PS ve vnitřní membráně (Hauska et al., 2001; Remigy et al., 2002). PS zelených sirných bakterií přijímá elektrony od dvou nezávislých donorů: menachinol:cytochrom c oxidoreduktázy a cytochromu c554 (Tsukatani et al., 2008). Akceptorem elektronů je ferredoxin. RC PS u zelených sirných bakterií se skládá ze čtyř proteinů PscA až PscD (Obr. 1). Někteří autoři (Hirano et al., 2010) považují FMO protein za součást RC PS, jiní ne (Hauska et al., 2001; Tsukatani et al., 2004). Protože je výskyt FMO výlučně spjat s výskytem chlorosomu, rozhodla jsem se tento protein do popisu RC PS zelených sirných bakterií nezařadit. Obr. 1. Schématické znázornění podjednotek reakčního centra fotosystému zelených sirných bakterií (PscA-PscD), základních kofaktorů (primární donor elektronů = P840, primární akceptor elektronu = A0, sekundární akceptory elektronů = A1 a Fe-S centra Fx, FA, FB, sekundární donor elektronu = hemová skupina vázaná na PscC) a drah přenosu elektronů (šipky). FCC favocytochrom, Fd ferredoxin, FMO Fenna-Matthews-Olson protein, SQR sulfidchinonreduktáza. bl hem b s nízkým a bh s vysokým potenciálem, MQ menachinon. Qi vazebné místo pro chinon na vstupu a Qo na výstupu v cytochromu b (Cyt b). Převzato a upraveno podle Hauska et al. (2001). 7

PscA (82 kda) tvoří centrální homodimer, který obdobně jako u ostatních PS obklopuje elektron-transportní řetězec a tvoří vnitřní světlosběrné antény. PscA váže šestnáct BChl a a čtyři Chl a, z čehož primární donor P840 tvoří pár BChl a a primární akceptor A0 tvoří monomerní Chl a esterifikovaný na 2-6 fytadienol (Hauska et al., 2001; Remigy et al., 2002). Dále je přítomen menachinon, který se pravděpodobně neuplatňuje v přímém přenosu elektronů, a Fe-S centrum FX. Toto FX se podobně jako u heliobakterií nachází ve směsi základních spinových stavů S=3/2 a S=1/2 (Jagannathan a Golbeck, 2008). Protein PscB (23 kda) je dvoucentrový ferredoxin nesoucí Fe-S centra F A a FB. Jeho vazba k RC je pevnější než vazba PshBI/PshBII u heliobakterií a o poznání slabší než vazba ekvivalentní podjednotky PsaC v PS I, protože k disociaci stačí vyšší koncentrace solí. Centra FA a FB podobně jako u heliobakterií lze samostatně redukovat (Jagannathan a Golbeck, 2008). Oproti funkčně analogickému PsaC v PS I obsahuje protein PscB unikátní N-koncové prodloužení s vysokým obsahem prolinových, lysinových a alaninových zbytků. N-koncové prodloužení je méně konzervované napříč různými druhy zelených sirných bakterií než zbytek proteinu (identita proteinu bez N-koncové extenze >95% vs identita celého proteinu >80%) (Figueras et al., 2002). Protein PscC (23 kda) nazývaný také cytochrom c(z) či cytochrom c551, je považován za jediný donor elektronu pro P840. Vyskytuje se ve dvou kopiích na každé RC. Sestává z Nkoncové transmembránové domény se třemi TMH a C-koncové hydrofilní domény na periplasmatické straně membrány, obsahující jedinou hemovou skupinu (Higuchi et al., 2009). Sekvencí a rozmístěním vazebných míst pro hem se C-koncová doména nepodobá ostatním známým cytochromům a do objasnění krystalografické struktury (Hirano et al., 2010) byla řazena do své vlastní třídy cytochromů. Skládá se do čtyř α-šroubovic podobně jako proteiny řazené do třídy I cytochromů c a je pravděpodobně kyvadlově pohyblivá, protože přenos elektronů na P840 je závislý na viskozitě média (Oh-Oka et al., 1997). Protein PscD (17 kda) neobsahuje žádné kofaktory. Není transmembránový a nachází se na cytoplasmatické straně RC v kontaktu s proteinem FMO, jejž kotví a natáčí, čímž upravuje přenos excitační energie z chlorosomů. Nízká, ale významná podobnost primární sekvence PscD s podjednotkou PsaD PS sinic (Obr. 2) naznačuje jejich příbuznost. Oba tyto proteiny (PscD a PsaD) se nachází na stejné straně membrány a pomáhají v kotvení externích proteinů (Tsukatani et al., 2004). 8

Obr 2. Modelování strukturní homologie PscD z Chlorobium tepidum a PsaD ze Synechococcus elongatus. Předpokládaná struktura PscD je reprezentována zelenou barvou, struktury PsaC světle růžovou a PsaD tmavě růžovou barvou. Převzato a upraveno podle Tsukatani et al. (2004). 2.4 Candidatus Chloracidobacterium thermophilum Před několika lety byl v yellowstonských pramenech Octopus a Mushroom objeven díky metasekvenování nový fotosyntetizující druh bakterií Candidatus Chloracidobacterium thermophilum patřící do kmene Acidobacteria (Bryant et al., 2007). Tento druh obsahuje homodimerní PS typu I, přestože v přírodě roste ve společnosti sinic a přes den je vystaven vysokým koncentracím kyslíku. Izolace kultury a kultivace v teplotách 50-66 C vedla k potvrzení jeho fotoheterotrofního způsobu života. V jeho genomu/plasmidu byl nalezen operon 5'-pscA-pscB-fmoA-3' (Obr. 3, názvosloví proteinů viz zelené sirné bakterie) obklopený především acidobakteriálními geny a několika geny pro syntézu BChl a karotenoidů. V genomu se nevyskytují geny pro PscC ani PscD (Garcia Costas et al., 2012; Tsukatani et al., 2012). Ve studii Tsukatani et al. (2012) byla provedena izolace RC PS tohoto organismu. Izolát sestává ze dvou proteinů PscA a CbpC (carotenoid binding protein C). Donorem elektronů pro P840+ je pravděpodobně nějaký cytochrom nevázaný na membránu, protože rozpustná fáze izolátu pomohla zpět redukovat ozařovaná izolovaná RC (Tsukatani et al., 2012). PscA (99 kda 110 kda) tvoří u tohoto organismu centrální homodimer. Jeho gen kóduje protein skládající se z 865 aminokyselin, který je větší než ostatní proteiny RC typu I především díky cca 165-aminokyselinové inzerci v periplasmatické smyčce mezi VII. a VIII. TMH (Obr. 3; Bryant et al., 2007). Protein PscA koordinuje primární donor P840 a další kofaktory. Na jedno RC jsou vázány molekuly pigmentů BChl a, Chl a a Zn-BChl a v poměru 12,8 : 8 : 2 (Tsukatani et al., 2012). Tyto pigmenty by teoreticky mohly všechny být vázány podjednotkou PscA, která 9

ve své odvozené aminokyselinové sekvenci zahrnuje 22 histidinových zbytků, potenciálních ligandů BChl. Naproti tomu CbpC možná také váže nějaké Chl a (Tsukatani et al., 2012). Cab. thermophilum je první nalezená fototrofní bakterie, která syntetizuje jak Mg-BChl a tak Zn-Bchl a. Funkce Zn-Bchl a není známá. Absorbční maximum primárního donoru se pohybuje okolo vlnové délky 840 nm velmi podobně jako u zelených sirných bakterií, a proto není pravděpodobné, že by tento speciální pár tvořil Zn-Bchl a (Tsukatani et al., 2012). Není to však ani vyloučené. Protein CbpC (22 kda) kódovaný genem cbpc zjevně váže karotenoidy. V RC komplexu je přibližně 34 molekul karotenoidů. Je nepravděpodobné, že to vše váže jediný protein CbpC a v komplexu RC tedy je pravděpodobně přítomno více těchto podjednotek. Celý komplex RC má molekulovou hmotnost okolo 480 kda; za předpokladu, že dimer PscA zabírá 220 kda, je na doplnění tedy potřeba 11.8 CbpC podjednotek. Na základě této stechiometrie by na jeden CbpC protein mělo být navázáno 2,8 karotenoidů. Další experimenty z této studie prokázaly, že protein CbpC zajištuje fotostabilitu RC v přítomnosti kyslíku (Tsukatani et al., 2012). PscB (~19 kda) stejně jako PscB u zelených sirných bakterií je o poznání větší než PshB heliobakterií především díky druhé doméně na N-konci, jejíž funkce je zatím neznámá (Romberger a Golbeck, 2010). Obr. 3. A Fylogenetický strom porovnávající proteinové sekvence odpovídajících centrálních podjednotek PsaA, PsaB, PscA a PsaH u různých organismů. B Uspořádání genů psca, pscb a fmoa v genomu Chloracidobacterium thermophilum. C Předpokládané uspořádání transmembránových α-šroubovic proteinu PscA u Cab. thermophilum. Převzato a upraveno podle Bryant et al. (2007). 10

Zastoupení a základní vlastnosti jednotlivých podjednotek RC PS typu I u heliobakterií a zelených sirných bakterií shrnuje Tab. 1. Tab. 1. Zastoupení a základní vlastnosti jednotlivých podjednotek reakčního centra fotosystému typu I u heliobakterií a zelených sirných bakterií (uvedeny jsou i odpovídající podjednotky v reakčních centrech fotosystému I sinic či chloroplastů zelených rostlin). P# primární donor elektronů, 1, 2 počet podjednotek na jedno reakční centrum. Heliobakterie Zelené sirné bakterie Sinice/chloroplasty Funkce PshA (47 67 kda kda, 2 ) PshBI a PshBII (~8 kda, 1 ) Není (funkci nahrazuje cytochromový přenašeč) Není PscA (82 kda, 2 ) PsaA a PsaB PscB (23kDa, 1 ) PsaC Součást centrálního dimeru Nese Fe-S centra FA a FB PscC (23kDa, 2 ) Není (funkci nahrazuje Donor pro P#+ cytochromový přenašeč) PsaD Kotvení proteinů na stromální/cytoplasmatické straně 2.5 PscD (17kDa, 2 ) Sinice Předkové dnešních sinic (Cyanobacteria) jsou považováni za první organismy s oxygenní fotosyntézou a původce atmosferických změn před 2,4 miliardami let (Buick, 2008; Blankenship, 2010). Jsou to jediné prokaryotické organismy, u nichž jsou přítomny oba PS (I i II), a to spřažené v jediné kaskádě elektron-transportního řetězce. Jako vnější světlosběrné antény pro oba PS slouží velké cytoplasmatické komplexy pigmentů a proteinů, fykobilisomy. PS I sinic katalyzuje přenos elektronů z plastocyaninu (proteinu obsahujícího měďnatý ion) na lumenální straně membrány na ferredoxin na stromální straně membrány. Sinice mohou také užít jako alternativní nebo jediný donor elektronů cytochrom c6 (Fromme a Grotjohann, 2006). U Nostoc sp. PCC 7119 byl nalezen další pravděpodobný donor elektronů pro PS I, protein příbuzný rostlinému proteinu cytochromu c6a (cytochrome c6-like protein), který přijímá elektrony z neznámého zdroje (Reyes-Sosa et al., 2011). Při nedostatku železa může být akceptorem elektronů flavodoxin místo ferredoxinu (Fromme a Grotjohann, 2006). Struktura PS I sinic je již dlouho známá díky krystalografické studii autorů Jordan et al. (2001), která byla provedena na Thermosynechococcus elongatus. Jsou k dispozici také velmi dobrá funkčně orientovaná shrnutí této struktury (Grotjohann a Fromme, 2005; Fromme a Grotjohann, 2006). Z analýzy PS I u této sinice vychází také většina níže uvedeného popisu jednotlivých podjednotek PS I. PS I se v membráně sinic nachází buď v trimerní (při slabé ozářenosti) nebo monomerní 11

(při silné ozářenosti) formě. Kanonický trimer se nachází u termofilního T. elongatus (Jordan et al., 2001), trimer i monomer u mezofilního Synechocystis sp. PCC 6803 (Kruip et al., 1997). Zatím první výjimkou z trimerní/monomerní organizace je PS I Anabaena sp. PCC 7120, který se vyskytuje pouze v dimerní nebo tetramerní formě (Watanabe et al., 2011) stejně jako PS I u zástupce glaukofyt Cyanophora paradoxa (viz dále). PS I sinic se skládá z dvanácti proteinů. PsaA a PsaB tvoří centrální heterodimer. PsaC váže koncová Fe-S centra a spolu s PsaD a PsaE zajišťuje vazbu akceptoru elektronů. PsaL, PsaI a PsaM tvoří vnější podjednotky monomeru a zajišťují přechod excitační energie mezi monomery v trimeru. PsaF, PsaJ, PsaK a PsaX leží na styku PS s membránou. Monomerní jednotka dále obsahuje nekovalentně vázané kofaktory: 96 Chl, 22 karotenoidů, 3 [4Fe-4S] centra, 2 fylochinony a 4 lipidy (fosfatidylglycerol a monogalaktosyldiglycerol), což činí 30 % celkové hmotnosti a kofaktory zastávají také důležitou strukturní funkci (Fromme a Grotjohann, 2006). Podjednotky centrálního heterodimeru PsaA (84,8 kda) a PsaB (83 kda) mají podobnou aminokyselinovou sekvenci i trojrozměrnou strukturu (Obr. 4). Obě obsahují jedenáct TMH, které jsou rozděleny do N-koncové domény (šest α-šroubovic A-a až A-f pro PsaA, B-a až B-f pro PsaB) a C-koncové domény (pět α-šroubovic A-g až A-k pro PsaA, B-g až B-k pro PsaB). C-koncové domény tvoří dva půlkruhy uzavírající kofaktory elektron-transportního řetězce. Tuto centrální strukturu obklopuje téměř válcovitá oblast vyplněná velkým množstvím molekul Chl a a karotenoidů, která je přemostěna α-šroubovicemi A/B-e a A/B-f. Tato oblast odděluje centrální strukturu od TMH vnitřní světlosběrné antény a ostatních integrálních proteinů PS (Jordan et al., 2001). N-koncová doména je uspořádána do charakteristické struktury trimeru dimerů TMH. Toto uspořádání bylo kdysi jedním z prvních argumentů pro homologii PSI a PSII (Fromme a Grotjohann, 2006). Lumenální povrch PS je převážně tvořen smyčkami propojujícími TMH podjednotek PsaA a PsaB. Aminokyselinová sekvence těchto smyček obsahuje segmenty, které nejsou konzervované mezi PsaA a PsaB. Smyčky tvoří několik krátkých α-šroubovic a β-listů a chrání kofaktory uvnitř PS před stykem s vodní fází. Prohlubeň poblíž osy pseudo-c2-symetrie je vazebným místem pro přenašeče elektronů cytochrom c6 nebo plastocyanin (Obr. 5). Dno prohlubně je tvořeno α-šroubovicemi smyček A-ij a B-ij, ve kterých se nachází dva konzervované tryptofanové zbytky PsaA-W655 a PsaB-W631 (Jordan et al., 2001). Jejich indolové skupiny hydrofobně interagují s cytochromem c6 či plastocyaninem, čímž zajišťují vysokou afinitu a specifitu vazby s těmito přenašeči (Sommer et al., 2004). 12

Obr. 4. Pohled na trimer fotosystému I u Thermosynechococcus elongatus ze stromální strany membrány. Stromální podjednotky nejsou zobrazeny. Jednotlivé strukturní elementy jsou zobrazeny ve všech třech monomerech (I, II a III). V monomeru I je zobrazeno uspořádání transmembránových α-šroubovic (válce) s označením podjednotek. Velká písmena v názvech transmembránových α-šroubovic PsaA (modrá barva) a PsaB (červená barva) nejsou zobrazena. Šest α-šroubovic v mimomembránovém prostoru je znázorněno spirálami. V monomeru II jsou viditelné vnitřní membránové podjednotky. Kromě transmembránových α-šroubovic jsou zobrazeny i stromální a lumenální smyčky. V monomeru III lze vidět kompletní sadu kofaktorů společně s transmembránovými α-šroubovicemi: chinony a chlorofyly elektron-transportního řetězce tmavomodře, Fe-S centra žlutooranžově, chlorofyly anténového systému žlutě, karotenoidy černě, lipidy tyrkysově. Převzato z Jordan et al. (2001). Smyčky mezi TMH na stromálním povrchu PsaA a PsaB částečně tvoří styčnou plochu s PsaC, PsaD a PsaE. Tyto podjednotky jsou blízce svázané, uspořádané do tvaru půlměsíce, s PsaD umístěným nejblíže středu trimeru PS I, PsaC uprostřed a PsaE nejdále. Obklopují část PsaA, které je pravděpodobným místem vazby ferredoxinu (Obr. 6) (Jordan et al., 2001). Studium mutantních organismů s delecemi genů kodujících podjednotky PsaC, PsaD a PsaE ukázalo, že přítomnost podjednotky PsaC je nezbytná pro vazbu podjednotek PsaD a PsaE k PS a pro navázání PsaE je třeba přítomnost obou podjednotek PsaC i PsaD (Ishikita et al., 2006; Jagannathan a Golbeck, 2009a). 13

Obr. 5. Struktura vazebného místa plastocyaninu nebo cytochromu c6 na lumenální straně PS I Thermosynechococcus elongatus.. Zobrazeny jsou dva tryptofanové zbytky (W631 a W655), které jsou nezbytné pro tuto vazbu, a α-šroubovice podjednotek PsaA a psab (g-k). Převzato z Fromme a Grotjohann (2006). Obr. 6. Struktura stromálních podjednotek PS I Thermosynechococcus elongatus s koncovými Fe-S centry FA a FB. A boční pohled, B pohled ze stromální strany. Převzato a upraveno podle Fromme a Grotjohann (2006). Podjednotka PsaC (8,9 kda) koordinuje koncová [4Fe-4S] centra F A a FB. Protein vykazuje osovou pseudosouměrnost podobnou bakteriálním ferredoxinům, od nichž se liší inzercí deseti aminokyselin ve smyčce spojující vazebné motivy pro Fe-S centra (CxxCxxCxxxCP) a prodlouženími N a C konců o dvě (N-konec) a čtrnáct (C-konec) aminokyselin (Jordan et al., 2001). Inzerce vystupuje ze struktury jakožto velká smyčka a 14

pravděpodobně funguje při kotvení ferredoxinu či flavodoxinu. Tuto smyčku PsaC nesdílí s analogickými podjednotkami PshB a PscB u anaerobních bakterií a její přítomnost částečně vysvětluje pevnější vazbu PsaC k jádru PS I (Collins et al., 2010). Dlouhý C-konec PsaC interaguje s podjednotkami PsaA, PsaB a PsaD a je nezbytný pro správné zapojení PsaC do komplexu PS I (Jagannathan a Golbeck, 2009b). Jeho absence může vést k opačnému (o 180 otočenému) zapojení PsaC u části fotosystémů (Jagannathan et al., 2010). PsaC je navázán na heterodimer PsaA/PsaB rozsáhlou sítí vodíkových a iontových vazeb. Studium organismů s mutovaným PsaC neschopným některých těchto vazeb ukázalo kromě snížené míry přenosu elektronů vysokou náchylnost Fe-S center FA a FB k degradaci molekulovým kyslíkem (Jagannathan a Golbeck, 2009b). Mimořádně pevná vazba PsaC na heterodimer PsaA/PsaB podpořená podjednotkami PsaD a PsaE je tedy pravděpodobně evoluční adaptací znemožňující přístup kyslíku k těmto Fe-S centrům. Podjednotku PsaD (15,3 kda) tvoří čtyři antiparalelní β-listy, kde smyčka spojující třetí a čtvrtý list obsahuje α-šroubovici následovanou dalším β-listem. Segment na C konci, který začíná histidinem D95 a končí histidinem D123, je připojen množstvím vodíkových můstků k stranám PsaC a PsaE, čímž pomáhá umisťovat a stabilizovat tyto podjednotky. Mimo tuto funkci je podjednotka PsaD také aktivně zapojena ve vazbě ferredoxinu (Jordan et al., 2001; Grotjohann a Fromme, 2005). Podjednotka PsaE (8 kda) tvoří kompaktní strukturu sestávající z β-barelu pěti antiparalelních vláken. Pohyblivá smyčka spojující β-listy c a d zaujímá jinou konformaci v roztoku a při vazbě na dimer PsaA/PsaB (Jordan et al., 2001). S PsaC a PsaD interaguje PsaE celkem slabě. Funkce PsaE mohou zřejmě být různé: přímo se účastní kotvení ferredoxinu a hraje roli v cyklickém transportu elektronů. Osm C-koncových zbytků je potřeba k přesnému upnutí PsaC k jádru PS I. Několik mutací PsaE má dramatický efekt na vazbu ferredoxinu. Mutanti bez PsaE jsou schopni fotoautotrofně růst pouze pokud navýší množství ferredoxinu (Fromme a Grotjohann, 2006). PsaL (16,3 kda) je první a nejdůležitější ze tří podjednotek zprostředkovávajících styk monomerů PS I mezi sebou. Nachází se poblíž osy trimeru, je nezbytná pro trimerizaci a zprostředkovává většinu kontaktů mezi monomery. Obsahuje tři TMH (L-d, L-e, L-g) z nichž se L-d a L-e účastní na hydrofobní interakci mezi monomery. Také koordinuje tři anténové Chl a, které možná zprostředkují přenos excitační energie mezi monomery. N-koncová smyčka nacházející se na stromální straně vytváří tři krátké β-listy a jednu α-šroubovici tvořící kontakty s PsaA a PsaD. Součástí trimeru je ion Ca 2+, který se ztrácí z PS při rozpadu na monomery. Je umístěn na kontaktu monomerů a je koordinován asparaginovými zbytky postranních řetězců 15

PsaL a PsaA (Fromme a Grotjohann, 2006). Podjednotka PsaI (4,3 kda) se také nachází v trimerizační doméně, a to mezi podjednotkami PsaL a PsaM. Obsahuje jednu TMH. Interaguje s karotenoidy, sousedním monomerem a PsaM a PsaL proteiny, které stabilizuje (Fromme a Grotjohann, 2006). Podjednotka PsaM (3,4 kda) je nejmenším proteinem v PS I sinic. Nachází se v blízkosti PsaI a PsaB. Hydrofobně interaguje s karotenoidem, čímž pomáhá trimerizaci PS I, a koordinuje jednu molekulu Chl a, která se možná účastní v přenosu excitační energie mezi monomery PS I. Postranní skupiny tohoto proteinu se nepodílejí na přímých kontaktech mezi monomery (Fromme a Grotjohann, 2006). Podjednotka PsaF (17,6 kda) leží na opačné straně PS I, naproti trimerizační doméně. Vykazuje neobvyklou topologii a přestože je integrálním membránovým proteinem, je během sestavování PS I dopravována nejprve do lumen tylakoidu. Obsahuje tři domény. N-koncovou lumenální doménu tvoří dvě α-šroubovice F-c a F-d orientované paralelně s membránou. Tato doména, na rozdíl od ekvivalentního proteinu u PS I zelených rostlin, který se účastní kotvení cytochromu c6, má pouze funkci stabilizace lumenální strany. Transmembránovou doménu tvoří plně transmembránová α-šroubovice (F-f), která je následována hydrofilní α-šroubovicí (F-g), a dvě krátké α-šroubovice (F-h, F-i), které se ve tvaru V zanořují do membrány do třetiny její hloubky. C-koncová stromální doména se nachází mezi PsaA a PsaE a dotýká se také PsaB. Protein PsaF sice přímo nekoordinuje žádné molekuly Chl, hydrofobně ale interaguje jak s Chl, tak s karotenoidy. Jeho funkcí je pravděpodobně ochrana Chl a karotenoidů před lipidovou fází membrány. Také interaguje s proteiny vnějších světlosběrných antén IsiA a fykobilisomy. Mutanti postrádající PsaF a PsaJ vykazují oxidativní poškození (Jeanjean et al., 2003). Podjednotka PsaJ (4,8 kda) je také naproti trimerizační doméně v kontaktu s PsaF, který stabilizuje. Obsahuje jednu TMH s N-koncem ve stromatu. Koordinuje tři molekuly Chl, stabilizuje shluky pigmentů. Sehrává pravděpodobně roli v přenosu excitační energie z vnějších světlosběrných antén IsiA na jádro PS I (Fromme a Grotjohann, 2006). Podjednotka PsaK (9,5 kda) obsahuje dvě TMH. Interaguje pouze s jedinou podjednotkou PsaA a její kontakt s jádrem PS I je nejméně stabilní. PsaK koordinuje dvě molekuly Chl, hydrofobně interaguje s karotenoidy a možná interaguje s proteinem IsiA při nedostatku železa (Fromme a Grotjohann, 2006). Podjednotka PsaX (4,8 kda) se nachází blízko PsaF. Obsahuje jednu TMH. Koordinuje jednu molekulu Chl a hydrofobně interaguje s karotenoidy a jedním lipidem. Tento výlučně sinicový protein byl nalezen u Thermosynechococcus vulcanus, Anabaena variabilis a T. 16

elongatus. V genomech T. elongatus a Synechocystis sp. PCC 6803 pro něj nebyl nalezen gen. Není jasné, jestli není PsaX přítomen pouze u termofilních sinic jakožto stabilizátor PS I ve vyšších teplotách (Fromme a Grotjohann, 2006). U sinice Gleobacter violaceus vykazuje PS I několik neobvyklých vlastností. G. violaceus je podle analýzy 16S rrna velmi starou a hluboce divergentní sinicí. Jako taková je důležitým svědkem rané evoluce sinic a vzniku oxygenní fotosyntézy. Je to jediná sinice neobsahující vnitřní tylakoidní membrány. Místo nich má zelenou plasmatickou membránu nesoucí jak fotosyntetický aparát, tak dýchací elektron-transportní řetězcec. Vyznačuje se také pro sinice neobvyklým lipidickým složením této membrány. Kromě monomerní a trimerní formy zaujímá PS I u G. violaceus na elektronmikroskopických snímcích uspořádání do tvaru T a další neznámé uspořádání. Podle spektroskopických dat obsahuje PS I přibližně 150 molekul Chl oproti obvyklým přibližně 90 u běžných sinic. Zajímavé je, že na elektron-mikroskopických snímcích mají trimery PS I u tohoto druhu stejnou velikost jako trimery ostatních sinic. Zatím se neví, zda to znamená ještě větší koncentraci Chl v PS I, nebo přítomnost vnitřních membránových anténových systémů obsahujících nadbytečné Chl a podobných těm v chloroplastech zelených rostlin (Mangels et al., 2002). Podjednotky PsaI, PsaJ, PsaK a PsaX u G. violaceus chybí. Součástí PS I u tohoto druhu je ale nová podjednotka PsaZ, která má pravděpodobně stabilizující funkci a možná nahrazuje funkci těchto podjednotek. Menší počet podjednotek může být ancestrální vlastností PS I sinic, nebo G. violaceus tyto podjednotky sekundárně ztratil. Podjednotka PsaB obsahuje u G. violaceus C-koncové prodloužení, které vykazuje významnou podobnost s peptidoglykanvazebnými doménami některých eubakterií (Inoue et al., 2004). Další rozdíl je v tom, že sekundárním akceptorem elektronů není u tohoto druhu fylochinon, ale menachinon (Mimuro et al., 2005). Výjimečný PS I se nalézá u sinice Acarychloris marina. Tento organismus obsahuje pouhé dvě molekuly Chl a na jeden PS. Majoritním pigmentem je Chl d, který nahrazuje Chl a, a to i ve funkci primárního donoru (resp. chemicky přesněji primární donor P740 sestává z jednoho Chl d a jednoho Chl d' - epimeru Chl d; Tomo et al., 2011). Chl a v buňkách slouží jako přímý prekurzor Chl d (Schliep et al., 2010). A. marina se vyskytuje v prostředí s filtrovaným spektrem slunečního záření bohatým na vlnové délky větší než 700 nm. Tato sinice tedy díky Chl d (který má absorpční maximum při větší vlnové délce než Chl a) může zachytit dlouhovlnné záření v oblasti 700-740 nm a převést ho na chemickou energii (Björn et al., 2009). 17

2.6 Zelené rostliny Po objevení se eukaryotických organismů před zhruba 1,8 miliardami let došlo zřejmě někdy mezi starohorní érou a raným kambriem k pohlcení fotosyntetizující sinice eukaryotickou buňkou. Z této sinice se pak vyvinuly dnešní chloroplasty zelených rostlin. Fotosyntetický aparát zelených rostlin se od sinic příliš neliší (Amunts a Nelson, 2008). Přechod rostlin na souš způsobil změny především v druhu a použití světlosběrných antén. Zelené rostliny nemají velké, nad membránu vystupující fykobilisomy umožňující sinicím zachytit fotony v temnotě vodního sloupce. Na jejich PS I se váží menší membránové komplexy světlosběrných antén LHC I a při tzv. stavových přechodech mohou být tyto světlosběrné antény rozšířeny o některé LHC II proteiny (běžněji asociované s PS II) (Amunts et al., 2007). Malé membránové antény rostlinám umožňují těsné vrstvení mnoha tylakoidních membrán, kterými je postupně pohlcováno světlo o mnohonásobně vyšších intenzitách na povrchu souše (Björn et al., 2009). PS I zelených rostlin přenáší elektrony z plastocyaninu v lumen tylakoidů na ferredoxin na stromální straně membrány (Nelson a Ben-Shem, 2006; Schöttler et al., 2011). RC se skládá z nejméně patnácti proteinů, z nichž deset se velmi podobá co do struktury i sekvence sinicovým proteinům PS I (Amunts et al., 2010). Informace o struktuře PS I rostlin se během let zpřesňovaly a počet jeho známých podjednotek narůstal se zvyšujícím se rozlišením krystalografických studií: 4,4 Å v práci Ben-Shem et al. (2003), 3,4 Å v práci Amunts et al. (2007) a 3,3 Å v práci Amunts et al. (2010). Model této struktury a vzájemné interakce mezi jednotlivými podjednotkami jsou znázorněny na Obr. 7. Mutační studie na Arabidopsis thaliana shrnuté v článku Jensen et al. (2007) podaly řadu informací o funkci a struktuře jednotlivých podjednotek. Z analýzy PS I u této rostliny vychází také většina níže uvedeného popisu. PS I se v membráně zelených rostlin vyskytuje pouze v monomerní formě. Výsledky elektroforetických analýz sice naznačovaly přítomnost dimerů a trimerů, ale elektronová mikroskopie ukázala, že tvorba těchto vícemerů je nespecifická a slabá (Kouril et al., 2005). Podjednotky PsaA (83,2 kda) a PsaB (82,5 kda) tvořící centrální homodimer se výrazně neliší od homologických podjednotek u sinic, a to jak v sekundární či terciální struktuře, tak i v aminokyselinové sekvenci (Sadekar, 2006; Yu et al., 2008). Stupeň sekvenční homologie různých druhů rostlin s vybranou sinicí Synechocystis sp. PCC 6803 se pohybuje okolo 80 %. Stejně tak podjednotka PsaC (8,9 kda) je vysoce konzervovaná (stupeň sekvenční homologie cca 90 %) (Yu et al., 2008). Podjednotky PsaD (17,9/17,7 kda) a PsaE (10,4/10,5 kda) sice vykazují nižší stupeň sekvenční homologie (po řadě cca 65 % a 47 %), ale strukturní nebo funkční odlišnosti nejsou v literatuře zmiňovány (Yu et al., 2008). 18

Obr. 7. Pohled na fotosystém I zelených rostlin ze stromální strany membrány (nahoře vpravo) a schématické znázornění vzájemných interakcí mezi jednotlivými proteinovými podjednotkami (vlevo). Plocha každého kruhu odpovídá ploše povrchu příslušné podjednotky. Psa jednotlivé podjednotky fotosystému I, Lhca proteiny komplexu vnější světlosběrné antény. Převzato z Amunts et al. (2010). Podjednotka PsaF (17,3 kda) se od své obdoby u sinic liší prodloužením N-koncové části, která se skládá do motivu šroubovice-smyčka-šroubovice a zasahuje do vazebného místa plastocyaninu. To má za následek zlepšení vazby plastocyaninu k PS I a přenos elektronů z něj je díky tomu dvakrát rychlejší (Nelson a Ben-Shem, 2006). Podjednotka PsaG (11,0 kda) obsahuje dvě TMH. Nachází se u PsaB proti podjednotce PsaK (je s ní souměrná podle centrální osy PS), s níž je příbuzná (stupeň sekvenční podobnosti 30 %, Jensen et al., 2007). Gen pro PsaG pravděpodobně vznikl duplikací genu pro PsaK během evoluční cesty mezi sinicemi a zelenými rostlinami (Kjaerulff et al., 1993; Nelson a Ben-Shem, 2006). Funkcí PsaG je především kotvení LHC I (Jensen et al., 2007). Mutantní rostliny A. thaliana postrádající PsaG mají méně stabilní PS I, který vykazuje vyšší afinitu k plastocyaninu (Zygadlo et al., 2005). Podjednotka PsaH (10/11 kda) obsahuje jednu TMH. Svou strukturou překrývá část PsaL a znemožňuje trimerizaci PS (Nelson a Ben-Shem, 2006), také se účastní kotvení LHC II při stavových přechodech (Jensen et al., 2007). Transformované rostliny postrádající PsaH 19

obsahují méně stabilní PS I, který vykazuje pouze 61% schopnost redukce NADP + (Naver et al., 1999). Podjednotka PsaI (4,1 kda) je kódovaná plastidovým genomem, a proto byla problémem při mutagenních studiích prováděných na A. thaliana. Obsahuje jednu TMH a váže dvě molekuly Chl. Je umístěna na okraji PSI, u spodku výčnělku tvořeného PsaL a PsaH, který se účastní vazby LHC II při stavových přechodech, ale je příliš daleko od vazebného místa LHC II na to, aby byla přímo jeho součástí. Místo toho by PsaI mohl celkově stabilizovat PsaH a PsaL. Tato možná funkce by byla srovnatelná s funkcí PsaI u sinic, kde tato podjednotka stabilizuje PsaL a PsaM. Mutant tabáku s chybějícím PsaI je ale plně schopen stavových přechodů a funkce PsaI tudíž zůstává neznámá (Schöttler et al., 2011). Podjednotka PsaJ (5,0 kda) je také kódovaná plastidovým genomem. Protein PsaJ obsahuje jednu TMH v kontaktu s PsaF a je potřebný pro správné sbalení jeho N-konce, čímž ovlivňuje vazbu plastocyaninu k PS I. PsaJ také ovlivňuje stabilitu PS I. Mutanti tabáku s chybějícím genem psaj progressivně ztrácí PS I v mladých i starých listech a PS I bez PsaJ je přístupnější proteázám (Schöttler et al., 2011). Podjednotka PsaK (8,5 kda) obsahuje dvě TMH, spojené pozitivně nabitou smyčkou na stromální straně membrány. Nachází se relativně blíže k PsaL než ve struktuře PS I sinic (Amunts et al., 2010). Podjednotka PsaL (18,0 kda) je podobná svému protějšku u sinic, ale na rozdíl od něj postrádá vyčnívající C-konec, který je u sinic nezbytný pro tvorbu trimeru PS (Ben-Shem et al., 2004). Podjednotka PsaN (9,7 kda) neprochází membránou. Nachází se na lumenální straně PS I, kde pomáhá v kotvení plastocyaninu (Jensen et al., 2007), ačkoli není jasné, zda plastocyanin váže přímo, nebo absence PsaN vede k narušení konformace PsaF (Schöttler et al., 2011). Podjednotka PsaO (10,1 kda) je tvořena dvěma TMH spojenými lumenální smyčkou sestávající z 29 aminokyselinových zbytků. Oba stromální konce sestávají z asi osmi aminokyselinových zbytků. Podjednotka je umístěna pravděpodobně poblíž PsaH a PsaL (Knoetzel et al., 2002; Jensen et al., 2007). Podjednotka PsaP (14 kda) byla poprvé popsána v práci Khrouchtchova et al. (2005). PsaP je fosfoprotein, což by mohlo znamenat regulační funkci, ale míra fosforylace této podjednotky se při stavových přechodech nemění. Tato podjednotka nebyla rozpoznána ve výše zmíněných krystalografických studiích. Ve studii Amunts et al. (2010) byl ve PS rozpoznán nový polypeptid PsaR obsahující 20

jednu TMH, který nemá žádný přímý kontakt s PsaA/PsaB heterodimerem a podle strukturních informací není schopen vazby k PS I bez přítomnosti PsaK. V pozdějších článcích tento polypeptid není zmiňován (Nelson, 2011; Schöttler et al., 2011). 2.7 Glaukofyta Cyanely, chloroplasty glaukofyt, vykazují některé primitivní znaky jako např. peptidoglykanovou stěnu. Jako vnější světlosběrné antény slouží glakofytům fykobylisomy podobně jako u ruduch, ale nemají žádné membránové přídatné antény. Mají glaukofyta primitivní i PS I? Strukturu PS u druhu Cyanophora paradoxa studoval Koike et al. (2000) metodou Nkoncového sekvenování proteinů. Identifikovány byly proteiny PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, PsaI, PsaJ, PsaL a PsaM. Jejich velikosti a lokalizace genů (jaderná vs plastidová) jsou shrnuty v Tab. 2. Sekvence PsaA a PsaK nebyla dosud získána. PsaD protein je u C. paradoxa a zelených rostlin kódovaný v jádře, kdežto u ostatních řas v chloroplastovém genomu. Tento protein je u C. paradoxa podobnější PsaD u zelených rostlin než u sinic a ostatních řas. Má s nimi společné prodloužení N-konce o 20 aminokyselin. Hypotéza, že jde o sekvenci směřující tento protein do chloroplastu není příliš pravděpodobná, protože PsaL protein, který je u C. paradoxa kódovaný také v jádře, tuto sekvenci nemá. Díky tomu PS C. paradoxa vykazuje chimérické vlastnosti mezi zelenou a červenou linií plastidů. PsaF (18 kda) u tohoto organismu obsahuje vnitřní prodloužení, které je typické pro PsaF podjednotku v PS I chloroplastů ostatních eukaryot. Nejvyšší homologie podjednotky PsaL u C. paradoxa byla nalezena se Synechococus elongatus a dalšími sinicemi, nejnižší homologie s vyššími rostlinami. Protože není k dispozici celá aminokyselinová sekvence tohoto proteinu, není jasné, jestli je nebo není přítomen vnitřní segment specifický pro vyšší rostliny, který zabraňuje trimerizaci. Podle Watanabe et al. (2011) tvoří tyto PS I dimery a tetramery. 2.8 Ruduchy Některé odlišnosti ve struktuře PS I byly zjištěny také u ruduch (kmen Rhodophyta). Studium genomu termofilní acidofilní ruduchy Galdieria sulphuraria, která obsahuje možná evolučně mnohem starší PS I než je PS I zelených řas a rostlin, prokázalo přítomnost genů podjednotek PsaA, PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, PsaI, PsaJ, PsaK a PsaL, a naznačilo přítomnost genů specificky rostlinných podjednotek PsaN a PsaO (identifikovány s nižší sekvenční homologií) (Vanselow et al., 2009). Gen pro PsaX (který je specifický pro termofilní 21

sinice) nebyl nalezen. V plastidovém genomu tohoto organismu se nachází gen pro PsaM jako u ostatních ruduch. Sekvence centrálních podjednotek byly porovnány s sekvencemi u T. elongatus a hrachu a ukázalo se, že struktura vypadá jako struktura předpokládaného společného předka PS I na pomezí sinic a zelených rostlin (Obr. 8). Některé podjednotky mají strukturu obsahující strukturní elementy z obou linií. U ruduchy Cyanidium caldarium bylo pomocí elektronové mikroskopie a jednočásticové obrazové analýzy zjištěno, že PS I se vyskytuje jako monomer s různým množstvím anténových podjednotek, a to i přesto, že u tohoto druhu a dalších ruduch není přítomna podjednotka PsaH, která u rostlin zabraňuje trimerizaci (Gardian et al., 2007). PsaL, podjednotka, která je u sinic zodpovědná za trimerizaci PS, postrádá u ruduch krátkou šroubovici a vazebné místo pro Ca 2+ nutné pro trimerizaci, PS se tedy vyskytuje jako monomer. Sekvenční homologie PsaL k rostlinnému PsaL je nízká, chybí konzervované místo vazby PsaH podjednotky. Místa vazby světlosběrné antény LHC I nejsou mezi ruduchami a zelenými rostlinami konzervována (Vanselow et al., 2009). Obr. 8. Schematické znázornění struktury podjednotek PsaA a PsaB u ruduchy Galdieria sulphuraria ve srovnání se strukturou těchto podjednotek u sinice Thermosynechococcus elongatus a hrachu (Pisum sativum). Části specifické pro sinice jsou znázorněny červeně, části specifické pro zelené rostliny zeleně, aminokyseliny společné oběma skupinám žlutě, úseky bez sekvenční homologie bíle. Převzato a upraveno podle Vanselow et al. (2009). 22

Zastoupení a základní vlastnosti jednotlivých podjednotek RC PS typu I u modelových zástupců organismů s oxygenním typem fotosyntézy, tj. sinic, glaukofyt, ruduch a zelených rostlin, popsaných podrobně v předchozích odstavcích, shrnuje Tab. 2. Tab. 2. Zastoupení a základní vlastnosti jednotlivých podjednotek reakčního centra fotosystému I u sinice Thermosynechococcus elongatus, zástupce skupiny glaukofyt Cyanophora paradoxa, ruduchy Galdieria sulphuraria a modelové zelené rostliny Arabidopsis thaliana. aa počet aminokyselinových zbytků, ct gen umístěn v plastidovém genomu, LHC komplex světlosběrné antény, n gen umístěn v jaderném genomu, ORF otevřený čtecí rámec, PS fotosystém. U podjednotek kódovaných jadernými geny je uvedena velikost prekurzoru. Podjednotka Velikost podjednotky / umístění genu / poznámky T. elongatus C. paradoxa G. sulphuraria A. thaliana PsaA 769 aa 752 aa / ct 770 aa / ct PsaB 741 aa 737 aa / ct 734 aa / ct PsaC 81 aa 81 aa / ct 81 aa / ct PsaD 139 aa 220 aa / n 141 aa / ct PsaE 76 aa 70 aa / ct 65 aa / ct PsaF 164 aa 186 aa / ct 189 aa / ct PsaG PsaH Není Není Není Není Není Není PsaI PsaJ 38 aa 41 aa 35 aa / ct 40 aa / ct 36 aa / ct 42 aa / ct PsaK PsaL 93 aa 155 aa PsaM 31 aa Není Počet aa neznámý, pouze izolován protein (11,5 kda) 31 aa / ct 68 aa / ct 141 aa / ct / chybí α-šroubovice způsobující trimerizaci 29 aa / ct PsaN Není Není 134 aa / n PsaO PsaX Není 39 aa / specifická pro termofilní sinice Není Není 167 aa / n Není Funkce 750 aa / ct Součást centrálního dimeru 734 aa / ct Součást centrálního dimeru 81 aa / ct Nese Fe-S centra FA a FB 204-208 aa / n / Vazba PsaC, vazba dva geny mobilního akceptoru elektronu 143-145 aa / n / Vazba PsaC, vazba dva geny mobilního akceptoru elektronu 221 aa / n U Pisum sativum účast na vazbě plastocyaninu. 160 aa / n vazba LHC I 145 aa / n Brání trimerizaci PS I, vazba LHC II 37 aa / ct Styk monomerů u sinic 44 aa / ct Správné sbalení PsaF, stabilizace PS I 130 aa / n Interakce s LHC I 219 aa / n Trimerizace PS I u sinic Není / nalezen Styk monomerů u sinic ORF u játrovek 171 aa / n Interakce s plastocyaninem 140 aa / n Není Stabilizace PS ve vyšších teplotách 23

3. Evoluce fotosystému I 3.1 První fotosystém a raná evoluce Jednou ze základních otázek, kterou si lze položit při zkoumání evoluce PS I, je samotný vznik a podoba prvního PS. Časově je tento vznik velmi těžké určit. Nárůst kyslíku v atmosféře před 2,4 miliardami let naznačuje, že již tehdy existovala oxygenní fotosyntéza. Uhlovodíkové biomarkery v 2,5 miliard let starých kerogenových břidlicích, stejně jako 2,7 miliard let staré stromatolity naznačují vznik tohoto metabolismu v ještě starší době, podobně jako spornější uhlovodíkové biomarkery v kerogenových břidlicích starých 3,2 miliard let, a 3,8 miliard let staré metasedimenty (Buick, 2008). Doba vzniku oxygenní fotosyntézy ale vypovídá jen málo o čase vzniku prvního PS stejně jako datování existence enzymu ribulózo-1,5- bisfosfátkarboxygenázy/oxygenázy do doby před 3,5-3,8 miliardami let (Olson a Blankenship, 2004). Fotosyntetická barviva jako taková se pravděpodobně původně vyvinula jako obrana před nebezpečným zářením. Volný Chl v excitovaném stavu může přecházet do tripletového stavu, což je nebezpečné, neboť to může vést k tvorbě volných kyslíkových radikálů, proto se zdá logickým evolučním řešením Chl obalit proteiny. Separace náboje a jeho přenos tedy mohly být původně jen bezpečnostním opatřením odvádějícím excitační energii z Chl, až později využitým jako zdroj energie (Blankenship, 2010). Podle Granickovy hypotézy biosyntéza Chl odráží jeho evoluci. Tato hypotéza s drobnými úpravami zůstává stále aktuální (Olson a Blankenship, 2004; Blankenship, 2010). Biosyntéza Chl se skládá ze sedmnácti kroků, z nichž první část je společná s biosyntézou hemu. U anoxygenních organismů je citlivá na přítomnost kyslíku, u oxygenních byly některé enzymy vyměněny a kyslík je při ní spotřebováván (Olson a Blankenship, 2004). Jak vypadal první PS? Byl zcela jistě homodimerní a měl pravděpodobně vlastnosti slučující vlastnosti obou dnešních typů PS. Někdy je pro něj navrhován název typ 1,5. Nejjednodušší dnes známý PS PS heliobakterií se svou schopností přenášet elektrony na FeS centra i chinonové přenašeče je mu možná z funkčního hlediska nejblíže (Nelson, 2011). Existují dvě hlavní hypotézy zabývající se evolučním původem vnitřní světlosběrné antény ve vztahu k RC PS (Zhang et al., 2007). Podle jedné byl ancestrální PS tvořen jedním velkým proteinem s jedenácti TMH podobně jako dnešní PS typu I. Druhá hypotéza je inspirovaná spíše stavbou PS typu II. V těchto PS jsou přítomny dva proteiny, které funkčně, evolučně i strukturně odpovídají dvěma doménám proteinů PshA/PscA/PsaA/PsaB. Druhá hypotéza předpokládá, že ancestrální fotosystém byl tvořen malým proteinem s pěti TMH, na který byly vázány kofaktory elektron transportního řetězce, a k tomuto proteinu se později přidal 24

protein vnitřní světlosběrné antény s šesti TMH (Obr. 9). Podle Zhang et al. (2007) by geny pro podjednotky vnějších světlosběrných antén isia a pcb mohly být klíčové pro odlišení těchto dvou hypotéz. Produkty těchto genů obsahují šest TMH a jsou příbuzné proteinům/doménám vnitřních světlosběrných antén RC. Pokud by měla platit druhá hypotéza, geny isia a pcb by měly původ v předku první světlosběrné antény a projevilo by se to na topologii fylogenetického stromu těchto genů. To však zmiňovaní autoři nezjistili a přiklánějí se tedy spíše k první hypotéze. Prezentované výsledky je však možné vysvětlit i jiným, v uvedeném článku nezmiňovaným způsobem: gen isia mohl divergovat z genů pro hlavní podjednotku PS II podle mého názoru by bylo logičtější, že by vznikl z genu pro protein, který je na funkci světlosběrné anteny už adaptován, než z genu pro protein, který má pouze potenciál stát se světlosběrnou anténou. Takové vysvětlení by ovšem o podobě ancestrálního fotosystému nic nevypovídalo. Obr. 9. Dvě hypotézy (A, B) evoluce reakčních center (RC) a vnitřních světlosběrných antén (LH) fotosystémů (PS) I a II. CP43 a CP47 proteiny vnitřních světlosběrných antén PS II, Helio heliobakterie, Chlorobium zástupce zelených sirných bakterií, IsiA/Pcb proteiny vnitřních světlosběrných antén sinic/prochlorofyt, S/NS sirné / nesirné bakterie, TMH transmembránová α-šroubovice. Převzato a upraveno podle Zhang et al. (2007). Fotosyntetizující bakterie jsou po fylogenetickém stromu rozesety na značně vzdálených místech. Důvodem by mohl být masivní horizontální genový přenos genů spojující rané organismy do velkého genového poolu. Je pak snazší mluvit o evoluci systémů spíše než o 25

evoluci jednotlivých linií (Blankenship, 2010). Je zajímavé, že geny pro podjednotky PS I (stejně jako pro podjednotky PS II) byly nalezeny v genomech virů (cyanofágů) napadajících sinice rodů Synechococcus a Prochlorococcus. Jde jmenovitě o podjednotky psaa, psab, psac, psad, psae, psak a unikátní fúzní gen psaj-psaf. Fágy posílením exprese těchto genů pravděpodobně zvyšují fitness svých hostitelů a získávají energii pro svou replikaci (Sharon et al., 2009). PS kodovaný fágy se vyznačuje značně sníženou komplexitou, což je pravděpodobně důsledek selekčních tlaků spojených s virovou replikací. Virový PS se nezapojuje do složitých buněčných regulačních drah (Mazor et al., 2012). Otázkou je také, zda předek PS I sinic byl podobnější PS heliobakterií či zelených sirných bakterií. Některé studie naznačují evoluční blízkost heliobakterií a sinic (Obr. 10). Snadná převoditelnost BChl g na Chl a tuto hypotézu podporuje (Ohashi et al., 2010). Heliobakterie Sinice Zelené sirné bakterie Obr. 10. Jedna z možných hypotéz evolučních vztahů PS I. Příbuznost podložená podobností sekvencí proteinových podjednotek je vyznačena silnou čarou šipek. Na obrázku jsou schématicky znázorněna reakční centra fotosystémů (obdélníky), kofaktory elektrontransportního řetězce a hlavní složky vnitřní světlosběrné antény. A. marina sinice Acaryochloris marina, C. caldarium ruducha Cyanidium caldarium, C. gracilis rozsivka Chaetoceros gracilis, G. violaceus sinice Gloebacter violaceus, (B)Chl (bakterio)chlorofyl, MQ menachinon, PhQ fylochinon, Fe-S koncové akceptory elektronů = Fe-S centra. Převzato a upraveno podle Ohashi et al. (2010). Jak se dostaly dva typy PS do sinic, není stále jasné. Mohlo dojít k fúzi organismů, které původně měly jeden nebo druhý typ PS. Druhou možností je, že organismy, které dnes mají pouze jeden typ PS, měly původně oba typy a během evoluce u nich došlo k sekundární ztrátě jednoho z nich (Obr. 11; Olson a Blankenship, 2004; Hohmann-Marriott a Blankenship, 2011). 26

Obr. 11. Dvě hypotézy evoluce společného výskytu reakčních center (RC) fotosystémů I a II u sinic a plastidů zelených rostlin a řas původně společný výskyt obou typů RC a posléze ztráta jednoho z nich u různých skupin anoxygenních fotosyntetických bakterií (A), nebo fúze dvou organismů, které původně měly pouze jeden typ RC (B). OEC komplex produkující kyslík (součást fotosystému II). Převzato a upraveno podle Hohmann-Marriott a Blankenship (2011). 27