Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra fyzikální chemie Bakalářská práce Studium antioxidačních a pro-oxidačních účinků vybraných látek v biologickém prostředí (Paramecium caudatum) (2011) Vypracoval: Jakub Šesták Obor: Aplikovaná chemie Vedoucí práce: Mgr. Martina Bancířová, Dr.
OBSAH 1. Úvod..7 2. Teoretická část. 8 2.1. Reaktivní formy kyslíku......9 2.1.1. Singletní kyslík...10 2.1.2. Superoxidový anion radikál.. 11 2.1.3. Peroxid vodíku...12 2.1.4. Hydroxylový radikál...12 2.2 Antioxidační ochrana organismu.13 2.2.1. SOD....14 2.2.2. Kataláza. 14 2.2.3. Glutathion..15 2.2.4. Glutathion peroxidáza.. 15 2.3 Trepka velká (Paramecium caudatum). 15 2. 4 Víno 17 2.4.1. Výroba vína. 18 2.4.2. Složení vína. 19 2.4.3. Vitamíny ve víně. 20 3. Experimentální část.22 4. Výsledky a diskuse....25 2
4.1. víno cabernet.32 4.2. víno muscat 37 4.3. víno cabernet sauvignon..42 4.4. víno chardonnay 47 4.5. Celkové srovnání vín..... 54 5. Závěr.....56 6. Summary.. 58 7. Seznam Použité literatury.. 60 3
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora: Jakub Šesták Název práce: Studium antioxidačních a pro-oxidačních účinků vybraných látek v biologickém prostředí (Paramecium caudatum) Typ práce: Bakalářská Pracoviště: Katedra fyzikální chemie Vedoucí práce: Dr. Martina Bancířová Rok obhajoby práce: 2011 Abstrakt: Antioxidanty obsažené ve víně jsou schopny ochránit jednobuněčné organismy, tedy prodloužit jejich dobu života, v přítomnosti reaktivních forem kyslíku vygenerovaných při katalytickém rozkladu peroxidu vodíku. Tento rozklad byl katalyzován postupně pomocí tří katalyzátorů (Fe 3+, Cu 2+, HRP). Testování jsem prováděl na trepkách velkých (Paramecium caudatum). Použita byla 4 moldavská vína. Červená vína obecně mají větší antioxidační účinky než bílá. Jednotlivá vína prodlužovala ovšem trepkám život různě a u některých testovaných koncentrací dokonce bílá vína více než červená. Klíčová slova: Paramecium caudatum, trepka, víno, peroxid vodíku, antioxidanty, katalyzátory, Fentonova reakce, doba života Počet stran: 62 Počet příloh: 0 Jazyk: čeština 4
Bibliographical identification: Author s first name and surname: Jakub Šesták Title: Study of antioxidant and pro-oxidative effects of selected compounds in biological environments (Paramecium caudatum) Department: Department of Physical Chemistry Type of thesis: Bachelor Supervisor: Dr. Martina Bancířová The year of presentation: 2011 Abstract: The antioxidants contained in wine are able to protect single-celled organisms, therefore, to extend their lifetime, in the presence of reactive oxygen species generated during catalytic decomposition of hydrogen peroxide. This degradation was catalyzed successively by three catalysts (Fe 3+, Cu 2+, HRP). Tests carried out on (Paramecium caudatum). Used were the four Moldovan wines. Red wines generally have greater antioxidant properties than white. Individual wines prolong life to paramecium differently but in some concentrations tested even more white wines than red. Keywords: Paramecium caudatum, wine, hydrogen peroxide, antioxidants, catalysts, Fenton reaction, life time Number of pages: 62 Number of appendices: 0 Language: Czech 5
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením Dr. Bancířové a rád bych ji i tímto způsobem poděkoval. Všechny použité prameny jsem uvedl v seznamu literatury. V Olomouci dne. Jakub Šesták 6
1. Úvod Kyslík je nejrozšířenějším prvkem na Zemi. V atmosféře se vyskytuje 21 % plynného kyslíku. Jako vedlejší produkt metabolismu kyslíku vznikají v organismu toxické reaktivní formy kyslíku (RFK). (1) Reaktivní formy kyslíku jsou schopné zaútočit na zdravé buňky v těle a narušují jejich funkce a strukturu. Jsou to látky velmi reaktivní a proto velmi nestabilní. Volné radikály urychlují i proces stárnutí. Celkově jsou brány jako původci asi 50 nemocí, sami je sice nevyvolávají, ale zhoršují jejich stav a projevy. (2) Naštěstí, formování volných radikálů je usměrňováno mnoha prospěšnými prvky a sloučeninami známými jako antioxidanty. Svou činností přispívají k ochraně imunitního systému. Jednotlivé složky antioxidační skupiny se vzájemně podporují při potírání volných radikálů. (3) Antioxidanty mohou, aby zamezily poškození buněk, pomocí zhášení stabilizovat, nebo deaktivovat volné radikály před tím než se jich vytvoří nadměrné množství. Potřeba antioxidantů je tím větší, čím více jsme vystaveni zvýšenému vlivu volných radikálů. Cigaretový kouř, drogy, nemoci i stres mohou podporovat negativní působení volných radikálů na lidské tělo. (4) V mé práci budu zkoumat protektivní účinky vina proti reaktivním formám kyslíku, které byly produkovány při katalytickém rozkladu peroxidu vodíku na jednobuněčném organismu (trepka velká). Trepky velmi rychle reagují na změnu svého prostředí. V přítomnosti volných radikálů umírají. Působení antioxidantů se projeví naopak ve formě prodloužení doby jejich života. Testovat na nich budu peroxid vodíku s Fe 3+, Cu 2+ a HRP katalyzátory (Fentonova reakce [9]), které urychlují rozklad peroxidu vodíku a znatelně tak zkrátí dobu života trepek. K vybraným koncentracím těchto látek budu poté přidávat postupně 4 druhy vína. Přítomnost vína by se měla projevit prodloužením doby života trepek. 7
1. TEORETICKÁ ČÁST 8
2.1. Reaktivní formy kyslíku Kyslík O 2 Je to velmi reaktivní plyn nezbytný pro existenci života na Zemi. Delší vdechování čistého kyslíku může být pro člověka škodlivé. (5) Základní stav O 2 je neobvyklý v tom, že je biradikálem, se dvěma nepárovými elektrony. Obr. 1: molekula kyslíku O O O O Reaktivní formy kyslíku (RFK) je termín který označuje všechny vysoce reaktivní, kyslík obsahující, molekuly včetně volných radikálů. Volné radikály jsou elektricky nabité molekuly, mající volný nepárový elektron v zevním obalu. Vznikají z normální částice ztrátou či přijetím elektronu. Jsou málo stabilní a vysoce reaktivní. Mezi RFK patří hydroxylový radikál OH -, superoxidový anion radikál O.- 2, peroxid vodíku H 2 O 2, singletní kyslík 1 O 2, peroxyl ROO, alkoxyl RO, kyselina chlorná HClO, ozon O 3. Radikálové částice většinou vznikají jen jako přechodné a vysoce nestabilní meziprodukty v průběhu chemických reakcí. Pokud z nějakého důvodu struktura radikálové částice umožňuje její nezávislou existenci, byť třeba po velmi omezenou dobu, jde o volný radikál. (6) 9
Volné radikály tvořící se v organismu působí na tři hlavní cílové struktury v buňce: nenasycené mastné kyseliny v lipidech, proteiny a DNA. U nenasycených mastných kyselin dochází ke ztrátě dvojných vazeb a k tvorbě reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy), což vede ke změněné fluiditě lipidů, ke změně v propustnosti membrán a k významnému vlivu na membránově vázané enzymy. Působením volných radikálů na proteiny dochází k jejich agregaci a síťování, k fragmentaci a štěpení, k modifikaci thiolových skupin a benzenových jader aminokyselin v proteinech a k reakci s hemovým železem. Následkem jsou pak změny v transportu iontů, dochází ke vstupu vápenatých iontů do cytosolu a ke změnám v aktivitě enzymů. Poškození vůči DNA vlivem volných radikálů vede ke štěpení kruhu deoxyribosy, k poškození bazí, ke zlomům nukleotidových řetězců a ke křížové vazbě řetězců. Následkem těchto změn jsou mutace, translační chyby a inhibice proteosyntézy řízené DNA. (7) 2.1.1. Singletní kyslík 1 O 2 Je to energeticky bohatší a vysoce reaktivní forma molekulárního kyslíku, hraje významnou roli v mnoha chemických a biologicky relevantních procesech. Singletní kyslík napadá buněčné struktury a poškozuje je. Vzniká v organismu přenosem energie z excitovaných karbonylových molekul, které vznikají například při rozkladu dioxiethanu nebo při rekombinaci peroxylových radikálů.(8) U látek obsahujících vhodné chromofory dochází účinkem světla k jejich excitaci a absorbovaná energie záření se přenáší na kyslík za vzniku singletového kyslíku 1 O 2. Dalšími možnostmi jeho vzniku jsou reakce chlornanu s peroxidem vodíku (viz rovnice [1]), reakce superoxidového anion radikálu s hydroxylovým radikálem [2], reakce peroxonitritu s peroxidem vodíku [3], reakce ozonu a ozonidů s různými látkami případně dismutace superoxidu na kyslík a peroxid vodíku [4]. V biologických systémech produkují 1 O 2 některé peroxidasy. Velké uplatnění mají také v dnešní době fotosenzitizované reakce (léčení rakoviny, aterosklerózy). (9) 10
H 2 O 2 + NaClO 1 O 2 + H 2 O + NaCl [1] O 2. + OH. 1 O 2 + OH [2] ONOO + H 2 O 2 1 O 2 + H 2 O + NO 2 [3] O 2. + O 2. + 2H + 1 O 2 + H 2 O 2 [4] 2.1.2 Superoxidový anion radikál O 2.- Přibližně 90 % kyslíku spotřebovaných buňkami je spotřebováno mitochondriálním elektronově-transportním systémem. Mitochondrie produkují superoxid (poločas rozpadu 10-5 s) (14) přijetím jednoho elektronu molekuly kyslíku. [rov. 5] Superoxid je pouze mírně reaktivní, a tedy není ani škodlivý. S poločasem života přibližně 2.4 µs. (14) Nebezpečí superoxidu tkví v tom, že z něj mohou vznikat další mnohem škodlivější reaktivní formy kyslíku - peroxid vodíku, hydroxylový radikál, peroxynitrit či kyselina chlorná. Je oxidačním i redukčním činidlem. Nejdůležitější je reakce, při níž redukuje ionty železa či mědi. [rov.6] V živých buňkách existuje superoxid v rovnováze s perhydroxylovým (. O 2 H) radikálem. Ve vodném roztoku rychle zreaguje na peroxid vodíku. [rov.7] V organismu je reakce katalyzována díky přítomnosti superoxiddismutasy.(10) O 2 + e - O 2.- [5] O 2.- + Fe 3+ O 2 + Fe 2+, O 2 - + Cu 2+ O 2 + Cu + [6] O 2.- + 2H + H 2 O 2 + O 2 [7] 11
2.1.3. Peroxid vodíku Je středně reaktivní, velmi bledě modrá kapalina, která vypadá bezbarvá ve zředěném roztoku. S chloridovým aniontem a přítomnností myeloperoxidázy jako katalyzátoru, vzniká HClO a hydroxy-radikál.[8] H 2 O 2 + Cl - HClO + OH. [8] Peroxid vodíku snadno prochází buněčnými membránami, difunduje tedy daleko od místa vzniku nebo aplikace. (11) Pro organismus jsou nebezpečné hlavně reakce peroxidu vodíku s Fe 3+ a Cu 2+ (Fentonova reakce): Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH. + OH - [9] Cu + + H 2 O 2 Cu 2+ + OH. + OH - [10] H 2 O 2 je redukován v organismu katalasou a peroxidasou.(13) [10] 2.1.4. Hydroxylový radikál. OH Hydroxylový radikál útočí na všechny typy biomolekul (lipidy, proteiny, DNA). Na rozdíl od peroxidu vodíku působí jen v místě svého vzniku. Vzniká ionizačním působením vysokoenergetického gama záření na H 2 O.[11] H 2 O OH. + H. [11] 12
V organismu vzniká reakcí superoxidu s peroxidem vodíku. Tato reakce se nazývá Haber-Weissova. Vznikají při ní hydroxylový radikál, hydroxylový aniont a singletní kyslík [12] poločas rozpadu hydroxylového radikálu v těle je 10-9 s. Fenton Haber Weissova reakce H 2 O 2 + O 2. OH - + OH. + 1 O 2 [12] Fe 3+ + O 2. Fe 2+ + O 2 Následuje Fentonova reakce.[9] Při Fentonově reakci vzniká zároveň nejreaktivnější hydroxylový radikál, ale i hydroxylový aniont (ten již ale není nebezpečný). Hydroxylový radikál vzniká i při reakci H 2 O 2, katalyzovaným meyloperoxidázou, s chloridovým aniontem. [8] Peroxylové (ROO ) a alkoxylové radikály (RO ) vznikají při oxidaci nenasycených mastných kyselin (lipoperoxidaci). (5,13) 2.2. Antioxidační ochrana organismu V moderní době dochází často k lokálnímu nebo celkovému proražení antioxidační bariéry, neboť organismus není dostatečně přizpůsoben na velké množství volných radikálů. V organismu by měl být optimální poměr mezi tvorbou volných radikálů a antioxidační ochranou. Porušení rovnováhy mezi tvorbou radikálů a jejich odstranění pomocí antioxidantů se nazývá oxidační stres. Jestliže převáží produkce volných radikálů, dochází k poškození molekul a tkání, ať již přímým působením volných radikálů či dalšími produkty jejich reakcí. (7) Antioxidanty Minimalizují oxidační poškození tím, že brání tvorbě RFK předtím, než mohou reagovat s jinými biomolekulami. Antioxidanty mohou být buď endogenní sloučeniny, vyrobené organismem jako součást jeho obrany před RFK, nebo to mohou být exogenní látky získané z 13
potravy. Endogenní systém zahrnuje jak enzymatické tak neenzymatické antioxidanty.mezi enzymatické patří cytochrom c, superoxiddismutáza, glutathionperoxid asa, katalasa. Neenzymové antioxidanty se dále dělí na membránové (α tokoferol, β karoten, koenzym Q 10) a nemembránové (askorbát, bilirubin, transferin, uráty). K exogenním antioxidantům patří mnoho látek různé velikosti a složitosti. Mezi ty jednodušší řadíme stopové prvky (Se, Zn). K těm složitějším pak patří sloučeniny zvané vitaminy. Nejvýznamnějším exogenním antioxidantem je vitamin C, který je rozpustný ve vodě, dále také kyselina listová, vitamin E, A a další. Ubichinon (koenzym Q) působí jako přenašeč elektronů v dýchacím řetězci a ve spolupráci s tokoferolem (vitamin E) tlumí radikálové reakce. Mezi významné antioxidanty patří látky fenolické povahy. Tyto látky mají mimo antioxidační aktivitu i antimikrobiální schopnosti. (4) 2.2.1. SOD Superoxiddismutáza je základní antioxidační enzym. Je obsažena v téměř každém aerobním organismu. SOD katalyzuje přeměnu superoxidu na peroxid vodíku [12], poskytuje posílení a zajištění toho, že prakticky žádný superoxid se nenachází v buňce. - 2 O 2 + 2 H + H 2 O 2 + O 2 (přítomnost SOD) [12] V mnoha tkáních je peroxid vodíku inaktivován katalázou. 2.2.2. Kataláza Enzym, v jehož přítomnosti se štěpí peroxid vodíku na vodu a kyslík. [13] Chrání buňky před toxickým vlivem vyšší koncentrace peroxidu vodíku, navazuje na účinnost superoxiddismutázy. 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 [13] Při redukci peroxidázou se však současně oxiduje jiný substrát. U člověka je to konkrétně enzym glutathion peroxidáza (GSHPx), urychlující rozklad peroxidu vodíku a současně oxidaci gluthationu (GSH).[14] Aby tento enzym mohl stále 14
plynule likvidovat produkci H2O2, je třeba regenerovat glutathion v redukované formě. K tomu je využita glutathion reduktáza, jež využívá k redukci glutathionu pyridinový koenzym NADPH. [15] 1) H 2 O 2 + 2 GSH 2 H 2 O + GSSG [14] 2) GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + [15] 2.2.3. Glutathion Glutathion je Tripeptid (y-glu-cys-gly) s neobvyklou y-glutamyl peptidickou vazbou, a cystein poskytující thiolovou skupinu. Glutathion vzniká v játrech. Je koenzymem enzymu glutathion peroxidázy, který v těle mění jedovatý a karcinogenně působící peroxid vodíku na neškodnou vodu a molekulární kyslík. Hlavní nejdůležitější reakcí je však tvorba správných disulfidových vazeb v celé řadě bílkovin a peptidových hormonů. Tuto reakci katalyzuje enzym glutathionreduktasa. (12),(26) 2.2.4. Glutathion peroxidáza Důležitým zástupcem peroxidáz mezi enzymy antioxidačního ochranného systému je glutathion peroxidáza (GPx) významná při odstraňování H 2 O 2 a lipidových hydroperoxidů. GPx se vyskytuje ve třech formách, aktivita glutathionperoxidáz přítomných v extracelulární tekutině je podmíněna přítomností selenu (v aktivním centru obsahují aminokyselinu selenocystein), naproti tomu fosfolipidová GPx vázaná v membráně neobsahuje selen a její afinita je vyšší pro peroxidy lipidů než pro H 2 O 2. GPx katalyzuje [14] štěpení peroxidu při současné oxidaci cystein obsahujícího glutathionu (GSH). 2.3. Trepka velká (Paramecium caudatum) Český název trepka jí náleží díky protáhlému tvaru těla připomínajícím obuv. Patří mezi prvoky rodu nálevníků. Prvoci jsou běžnou součástí planktonu v každém rybníku. Trepka žije v organicky znečištěných vodách, má výrazně delší brvy v 15
zadní části buňky. Běžně je přítomna v tzv. senném nálevu (např. ze suchého sena zalitého vodou). Je to živočich, jehož tělo tvoří pouze jediná buňka. Obvykle mívají dvě jádra a alespoň část života mají tělo pokryté brvami. Trepka velká dosahuje velikosti 0,2 mm, někdy dokonce až 1 mm. Tělo má nesouměrné, v zadní části zúžené. Na povrchu trepky je pružná pelikula, buněčná ústa, buněčná řiť a místo aktivní osmoregulace, v němž se vyprazdňují pulsující vakuoly. Živí se řasami, bakteriemi nebo jinými prvoky. Kyslík přijímá celým povrchem těla. Trepka se dělí asi po pěti hodinách. (14,15) Rozmnožují se nepohlavně příčným dělením nebo pohlavně konjugací. Při konjugaci se nálevníci přiloží k sobě buněčnými ústy, makronukleus zanikne a mikronukleus se meiózou dělí na čtyři jádra, tři z nich degenerují a čtvrté se rozdělí na jádro migratorní (funkce samčí) a stacionární (funkce samičí). Migratorní jádra se mezi buňkami vymění a poté splynou s jádrem stacionárním. Vytvoří diploidní jádro, základ mikronukleu. Poté se oba nálevníci rozmnoží dělením. (16) V makronukleu (jádro vegetativní) jsou informace potřebné pro život mimo rozmnožování, tj. pro syntézu vakuol, brv atd., mnohokrát se replikuje. V mikronukleu (jádro generativní) je uložena veškerá DNA. Trepka se neustále a rychle pohybuje pomocí řasinek, které pokrývají celé její tělo. A to dvěma způsoby. Trepky rotují kolem vlastní osy a zároveň se volně pohybují ve výživném roztoku. Při testech toxicity na trepce dojde nejdříve k jejímu zastavení na místě, poté se přestane otáčet a následně umírá.(17) 16
Obr. 2. trepka velká a- řasinky b- pulzující vakuola c- velké jádro (makronukleus) d- pelikula e- potravní vakuola f- trichocysty g- malé jádro (mikronukleus) h- buněčná ústa i- buněčná řiť 2.4. Víno Víno je alkoholický i nealkoholický nápoj typicky vznikající kvašením moštu z plodů révy vinné. Slovo víno pochází z latinského vinum.(18) Původ vína Původ je nejasný. Réva vinná se vyšlechtila pravděpodobně z divokých forem na Blízkém východě, či oblasti středomoří. V každém případě byla rozšířena již ve starověkém Egyptě a Orientě ve 3. tis. př. n.l. Starověkým Řekům bylo známo víno dle zápisů lineárním písmem z doby Krétské a Mykénské kultury již ve 2. tis. př. n.l. Řekové pokládali víno za dar boha Dionýsa. Na našem území se prokazatelně réva vinná pěstovala v době pobytu římských vojáků na Moravě (2.-3.stol.).(19) 17
2.4.1. Výroba vína Surovina pro výrobu vína Základní surovinou pro výrobu vína jsou čerstvé vinné hrozny. Hrozny se sbírají na vinici v našich podmínkách zhruba v období konec srpna (velmi rané odrůdy) až konec listopadu (pozdní odrůdy). Výjimkou je sbírání v zimních měsících za mrazu při výrobě ledového vína. Odrůdy pro výrobu vína můžeme zjednodušeně rozdělit na bílé (pro výrobu bílých vín) a modré (pro výrobu červených vín). Odzrnění Co nejrychleji po sklizni se oddělí třapina od dužniny (bobulí). Tento proces se nazývá odzrnění (kvůli starému označení bobulí jako zrno ). Třapiny jsou odpadem a zpravidla se použijí jako hnojivo ve vinici. Důležité je, aby toto oddělení proběhlo šetrně, aby se nepoškodily pecičky v bobulích, ze kterých by se poté mohly dostávat do vína hořké látky. Takto oddělené bobule (resp. mošt s narušenými bobulemi) se nazývá rmut. Výroba bílých vín U bílých vín se rmut v krátké době listuje. Doba listování od odzrnění se může pohybovat od téměř okamžitě po několik hodin. Většinou se nechá rmut macerovat 3-6 hodin kvůli lepší extrakci aromatických látek, které jsou uloženy ve slupce bobulí. Výroba červených vín Výroba červených vín se od bílých liší tím, že se rmut lisuje až poté, co prokvasí spolu se slupkami. Právě ve slupkách se totiž nachází barviva, které si díky kvašení extrahují do rmutu.(21) 18
2.4.2. Složení vína Víno obsahuje látky, jež jsou původní součástí moštů nebo rmutů. Látky vznikající pří kvašení a látky cizorodé, které se dostávají do vína v průběhu technologického procesu a patří buď k běžným složkám vína, nebo do vína vůbec nepatří. K původním součástem moštů se řadí glycidy, kyseliny, třísloviny, dusíkaté látky, minerální látky, barviva a látky tvořící chuťové a aromatické složky vína. Obsah vinné bobule je z velké části (80-90 procent) tvořen vodou. Alkohol Alkoholu je ve víně asi 9-15 procent, je zastoupen ethanolem (CH 3 CH 2 OH). Velmi malý podíl tvoří methanol, který je nežádoucí a spolu s vyššími alkoholy způsobuje bolest hlavy. Tvoří se při kvašení moštů a rozkladem cukrů kvasinkami na alkohol a kysličník uhličitý. Vyšší obsah alkoholu zajišťuje vyšší stabilitu vína oproti kvasničnému zákalu i různým bakteriálním onemocněním, jako jsou octovatění vína, mléčné kvašení, a další, obsah 10 % obj. alkoholu ve vínech je minimální hranicí zajišťující určitou mikrobiologickou stabilitu vína. Při kvašení vzniká i malé množství glycerolu, který zjemňuje chuť vína a ovlivňuje příznivě i jeho plnost. Barviva Z barviv obsahuje víno zbytky zeleného barviva chlorofylu a příbuzné červené barvivo karotin a žluté xantofyl, obsažené původně ve slupkách bobulí. Tato barviva dodávají bílým vínům různé odstíny zelenkavé až žluté barvy. Červené víno vděčí za svůj vzhled barvivu oecin, který patří z chemického hlediska mezi antokyany. Jsou to glykosidy, které se v kyselém prostředí štěpí na cukr a vlastní složky barviva- antokyany. Červené nebo modré barvivo se nachází ve slupkách bobulí uvnitř plastidů.(20) 19
2.4.3. Vitamíny ve víně Víno obsahuje vitamíny B, P, PP a menší množství vitaminů K a C. Obsah vitaminů, zvláště komplexu vitaminů B je zpravidla v mladých vínech podstatně vyšší, při delším uskladnění vína se jejich obsah snižuje. Obsah vitaminu PP nikotinamidu se v hroznech vyskytuje v množství od 0,88 do 1,25 mg/kg. Jeho obsah vzrůstá při dozrávání hroznů, při přezrávání pak částečně klesá. Obsah vitaminu B6 v moštu se pohybuje od 0,16 do 0,53 mg/l, nepatrně se snižuje v průběhu kvasného procesu a při dozrávání vína může opět narůstat. Vitamin B12 kobalamin má velký význam při léčení různých forem anémie. Dříve se předpokládalo, že tento vitamin není ve víně obsažen. Později bylo mikrobiologickou metodou zjištěno, že ho víno obsahuje 0,05 mg/l. Při kvašení a zrání se jeho obsah zvyšuje na 0,12 a 0,15 mg/l. Kyseliny listové neboli pteroylglutamové, která též velmi příznivě působí při léčení anémie, je ve víně 0,43 mg/l. V hroznech její obsah dosahuje až 3,28 mg/kg. Obsah vitaminu C - kyseliny askorbové je ve víně nízký, protože při zpracování a kvašení moštu se kyselina askorbová oxiduje na kyselinu dehydroaskorbovou. Po skončení kvašení je ve víně asi 5 až 10 mg/l vitaminu C. (23) Fenolické látky Jde o obsáhlou skupinu sloučenin, tvoří asi 85 % flavonoidních látek: quercetin, katechin, také antokyany, zbytek tvoří látky neflavonoidní. Při zpracování hroznů se uvolňují do vína fenoly, působící jako účinné antioxidanty, které brání tvorbě volných radikálů v těle zodpovědné za degeneraci a stárnutí buněk.(25) Z hroznů přecházejí do vína fenolkarbonové kyseliny: gallová, pyrokatechinová, vanilinová, kumarová, kávová a ferulová. Dále pak flavanoidy: katechin, epikatechin, quercetin, kaemforol, a flavandioly.(23) Obsah těchto fenolických látek bývá v bílých vínech 200 až 500 mg na litr a ve vínech červených 800 až 4 000 mg na litr. Červená vína obsahují nejen velké množství polyfenolických látek, ale i široké spektrum jejich různorodosti.(20) 20
a) Quercetin má silné antioxidační účinky. Množství quercetinu v hroznech révy vinné je dáno intenzitou slunečního svitu. Má schopnost rozpouštět krevní sraženiny, má protizánětlivé vlastnosti. b) Katechin spolu s epikatechinem má silné antioxidační účinky. Z celkového množství fenolických látek (od 10 do 250 mg na litr vína) se vyskytuje v největším poměru. c) Resveratrol vzniká ve slupkách bobulí jako ochranná látka (fungicid) v přirozeném boji proti plísním. Jeho obsah ve víně je ovlivněn zvolenou technologií výroby. Nakvášením rmutu dochází k většímu vyluhování, nefiltrovaná vína obsahují větší množství resveratrolu. Obsah resveratrolu se pohybuje od 0,1-8 mg na litr. Resveratrol patří k látkám se silným antioxidačním účinkem, potlačuje špatný LDL cholesterol a zvyšuje podíl dobrého HDL cholesterolu, má protinádorové účinky. Tyto fenolické látky jsou obsaženy i v jiných potravinách (cibule, paprika.), ale řada z nich není rozpustná ve vodě a organismus jej získává složitým způsobem, navíc mohou být zničeny špatným skladováním a následnou přípravou pokrmů. Ve víně jsou tyto látky rozpuštěny v alkoholu a chráněny ostatními přítomnými látkami.(20) a) b) c) 21
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 22
Cílem této práce bude zjistit, zda antioxidanty obsažené ve víně jsou schopny ochránit jednobuněčné organismy, tedy prodloužit jejich dobu života, v přítomnosti reaktivních forem kyslíku vygenerovaných při katalytickém rozkladu peroxidu vodíku. Testovat budu tyto látky na subjektu trepky velké (Paramecium caudatum). Antioxidační účinky vína na trepky budu pozorovat v přítomnosti katalyticky rozloženého peroxidu vodíku. Testovat budu 4 druhy vína: dvě polosladká (cabernet červený, muscat bílý) a dvě suchá (cabernet sauvignon červený, chardonnay suché). Chtěl bych zjistit, jakým způsobem prodlouží, jestli vůbec, v přítomnosti různých koncentracích peroxidu a katalyzátorů jeho rozkladu trepkám život. Kvůli přesnosti a spolehlivosti výsledků bude každé měření provedeno 3 krát. Chemikálie Peroxid vodíku H 2 O 2 (Sigma-Aldrich, 3 %, c= 0,088mol/l), síran mědnatý CuSO 4.5 H 2 O (Sigma Aldrich, 99%, c= 0,5 mol/l ), chlorid železitý FeCl 3. 4H 2 O (Sigma-Aldrich, 99%, c=0,5mol/l), křenová peroxidáza (Sigma-Aldrich, c = 0,01mol/l), vína: cabernet červený polosladký, muscat červený polosladký, cabernet sauvignon červený suchý a chardonnay bílé suché (Všechna vína jsou původem z Moldávie, ročník 2009 s 10,5% alkoholu) Přístroje zpětný projektor QUANTUM 2521 Experimentální postup 1. kultivace trepek velkých Nejprve jsem si musel namnožit patřičné množství trepek. Je důležité získat si čistou kulturu laboratorních trepek (Paramecium caudatum). Dodržovat sterilitu dodávané potravy i přidávané destilované vody. Patřičný získaný druh trepek jsem převedl do 1 l plastové láhve od mléka a zde je zředil v poměru 1:10 destilovanou vodou. 23
Trepky obvykle procházejí čtyřmi fázemi růstu. "Ochablá fáze" nastává, pokud jsou přesunuty do nového kultivačního prostředí. Je to čas, za který si zvyknou na nové růstové podmínky. Produkce enzymů, jež jsou potřebné pro jejich růst v novém prostředí, může trvat pouze několik vteřin, ale i mnoho minut. To je taky důvod proč se nedoporučuje trepky v této fázi používat k experimentům. Během "výkonostní fáze" se trepky začínají množit. Jejich počet se logaritmicky navyšuje. Pro trepky je v této fázi nejvýhodnější tmavé místo úschovy. Při přídavku výživné látky (droždí) se jejich počet rapidně navyšuje. Za několik dní se v teple cca. 25 C vytvoří zákal z namnožených trepek, které jsou dokonce vidět pouhým okem. Mléčný zákal, vzniklý od krmiva se pomalu vyčistí a tak po čase (1 týden) zase trepky nakrmíme. K vypěstování potřebného množství trepek došlo během 7 dní od přídavku krmiva. V průběhu "ustálené fáze" již kultura spotřebuje všechny potřebné živiny a začnou se zde shromažďovat vedlejší produkty metabolismu. Když se tohle stane tak se doba, za kterou se namnoží trepky, značně prodlouží. Poměr nově vzniklých k umírajícím jedincům se srovná. V poslední tzv. "fázi smrti", způsobuje nedostatek důležitých živin a nashromážděných toxických vedlejších produktů metabolismu již smrt trepek. (27) 2. stanovení délky života jedinců Paramecium caudatum Trepky byly pozorovány pod zpětným projektorem na Petriho miskách a jejich hustota byla 20-30 trepek na 1ml.(28) Sledoval jsem reakci trepek na koncentraci peroxidu vodíku. Při každé koncentraci byl měřen čas, do té doby než umřeli všichni jedinci. To se pozná tak, že se přestanou pohybovat, anebo se rozpadnou úplně. Pozoroval jsem tedy trepky do doby, dokud se jejich odumřelá těla neusadila na dně Petriho misky. Při každém měření jsem nejprve přidal víno, poté patřičný katalyzátor a k zahájení reakce jako poslední přídavek vždy H 2 O 2. 24
4. VÝSLEDKY A DISKUSE 25
Nejprve jsem testoval vliv koncentrace samotného peroxidu vodíku na dobu života trepky. Prováděl jsem toto testování, abych mohl porovnat dobu, za kterou usmrtí peroxid vodíku trepky, oproti době, za kterou ji usmrtí v přítomnosti katalyzátorů. Trepky jsem ze zásobní láhve přesunul pomocí pipety, a to vždy 9,9 ml trepek do (10 ml) Petriho misek. Připravil jsem si tedy řadu pracovních roztoků peroxidu vodíku. Každý přídavek peroxidu byl 100 x zředěn, jelikož celkový objem trepek byl 10 ml. Nachystal jsem si tedy roztoky peroxidu s výslednými koncentracemi (8.10-2 2.10-4 mol/l). H 2 O 2 o výsledné koncentraci 8,8.10-2 mol/l přežily trepky po dobu 1 minuty a půl. Postupným ředěním jsem došel až ke koncentraci peroxidu 2.10-4 mol/l, kterou trepky přežily po dobu asi 30 minut. doba života trepek t(s) 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 graf 1. Závislost doby života trepek na koncentraci peroxidu vodíku 26
Testoval jsem vliv přídavku tří různých katalyzátorů na samotné trepky. Prvním katalyzátorem byl chlorid železitý. Ten se v přítomnosti H 2 O 2 podle Fentonovy reakce redukuje na Fe 2+ a peroxid se rozpadá na perhydroxylový radikál. Celkový objem látek i s trepkami byl vždy 10 ml. Při výsledné koncentraci Fe 3+ 1.10-3 mol/l trepky přežily po dobu kolem sedmi minut. Koncentraci o dvě desetinná místa nižší, tedy 1.10-4 mol/l přežily 48 minut. Při 5.10-5 mol/l již trepky bez problému přežily déle než dvě hodiny. Pro další měření jsem tedy použil výslednou koncentraci 5.10-5 mol/l. 4000 3500 doba života trepek t (s) 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 c Fe(III) mol/l graf 2. Závislost doby života trepek na koncentraci Fe 3+ katalyzátoru 27
Graf 3: Druhým katalyzátorem byla Cu 2+ ve formě síranu měďnatého. Ten se v přítomnosti H 2 O 2 podle Fentonovy reakce redukuje na Cu + a peroxid se rozpadá na perhydroxylový radikál. Trepky vydržely při řádově stejných koncentracích jako u železa jen po krátký časový interval. Při testované výsledné koncentraci 5.10-3 mol/l 43 sekund. Dokonce při koncentraci 2.10-6 mol/l přežily trepky po dobu pouhých 10 minut. Při výsledné koncentraci o řád nižší (1.10-7 mo/l) ovšem již trepky vydržely po dobu delší než dvě hodiny, tedy neměla tedy vliv na zkrácení doby života trepek. Pro další měření jsem tedy použil výslednou koncentraci síranu měďnatého 1.10-7 mol/l. Třetím katalyzátorem rozkladu peroxidu vodíku je křenová peroxidáza. Při všech následujících měřeních jsem použil roztok peroxidázy o výsledné koncentraci (1.10-2 g/l). 1600 doba života trepek t (s) 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 c Cu(II) mol/l graf 3. Závislost doby života trepek na koncentraci katalyzátoru Cu 2+ Graf 4: U prvního katalyzátoru (chloridu železitého), jsem testoval tři výsledné koncentrace (1.10-3, 1.10-4, 5.10-5 mol/l) a to proti deseti výsledným koncentracím peroxidu vodíku. (3.10-2 ; 2,5.10-2 ; 2.10-2 ; 1,5.10-2 ; 1.10-2 ; 8,8.10-3 ; 5.10-3 ; 2.10-3 ; 8,8.10-4 ; 2.10-4 mol/l). Podle grafu č.4 měla tedy doba života trepek při zvyšujících se 28
koncentracích peroxidu vodíku s katalyzátory tendenci se snižovat. Koncentrace Fe 3+ 1.10-3 mol/l byla pro trepky již po přídavku peroxidu (2.10-4 mol/l) smrtelná během 3 minut. Pro další měření ji již tedy nevyužiji. Při koncentraci Fe 3+ 5.10-5 mol/l byla v přítomnosti H 2 O 2 o koncentraci 2.10-4 mol/l naměřena doba života trepek o tři minuty kratší než u samotného peroxidu. Nejvýraznější zkrácení doby života bylo u této koncentrace Fe 3+ pozorováno u H 2 O 2 8,8.10-4 mol/l. Z původních 21 minut na 10 minut. U přídavku 3.10-2 mol/l peroxidu k Fe 3+ 5.10-5 mol/l byl čas zkrácen z původních pěti minut na 3 a půl minuty. graf 4. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 v přítomnosti katalyzátoru Fe 3+ o koncentracích (1.10-3, 1.10-4, 5.10-5 mol/l) Graf 5: Pro koncentraci Cu 2+ 1.10-4 mol/l byly doba života trepek velmi krátká od několika desítek sekund pro největší testovanou koncentraci peroxidu vodíku 3.10-2 mol/l až minutu a půl pro nejmenší koncentraci peroxidu 2.10-4 mol/l. Došlo tedy k značnému urychlení smrti trepek, a to u koncentrace peroxidu vodíku 3.10-2 mol/l o 29
celých pět minut. Pro koncentraci peroxidu 2.10-4 mol/l byla doba života zkrácena z půl hodiny na 90 sekund. V přítomnosti 1.10-5 mol/l katalyzátoru Cu 2+ se doba života trepek po přídavku nejsilnějšího peroxidu vodíku (3.10-2 mol/l) zkrátila o 4 minuty a to platí i pro peroxidy 1.10-2 a 8,8.10-3 mol/l. O necelých 7 minut se doba života trepek zkrátí při koncentraci peroxidu vodíku 5.10-3 mol/l. Největší zkrácení doby života trepek mezi nekatalyzovaným a katalyzovaným rozkladem peroxidu vodíku je u koncentrace peroxidu 2.10-4 mol/l jehož rozklad byl katalyzovaný Cu 2+ o koncentraci 1.10-5 mol/l a to z původních 30 minut na 6 minut. Koncentrace Cu 2+ 1.10-6 mol/l zkrátila při nejvyšší koncentraci peroxidu vodíku dobu života trepek o tři minuty, a při dalších klesajících koncentracích zkracovala dobu života přibližně o polovinu. Změna je ovšem u koncentrace H 2 O 2 2.10-3 mol/l. Zde se původní doba zkrátila téměř o 10 minut. U 2.10-4 mol/l peroxidu se doba zkrátila dokonce o 16 minut. Pro výslednou koncentraci Cu 2+ 1.10-7 mol/l se přídavek 0,03 mol/l peroxidu vodíku projevil zkrácením života trepek o necelou minutu oproti samotnému peroxidu. Při stejné koncentraci mědi, ale s peroxidem vodíku (2.10-4 mol/l) se doba života trepek zkrátila dokonce o 8 minut. Největší časový posun doby života byl ovšem u této koncentrace mědi (1.10-7 mol/l) v přítomnosti peroxidu o výsledné koncentraci 0,00088 mol/l, a bylo to o skoro 9 a půl minuty. 30
graf 5. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s katalyzátorem Cu 2+ o koncentracích (1.10-4, 1.10-5, 1.10-6, 1.10-7 mol/l) V grafu 6 je znázorněn vliv posledního katalyzátoru, tedy křenové peroxidázy. Ten se oproti železu a mědi prokázal jako nejméně účinný katalyzátor. Při koncentraci peroxidu 2.10-4 mol/l zkrátila přítomnost tohoto katalyzátoru dobu života trepek jen o 6 sekund. Při koncentraci H 2 O 2 8,8.10-4 mol/l již byla doba života pomocí HRP zkrácena o 4 a půl minuty. O stejný časový úsek byla doba života trepek zkrácena v přítomnosti H 2 O 2 2.10-3 mol/l. Při dále rostoucích koncentracích peroxidu vodíku se čas zkracoval již průměrně jen o jednu a půl až dvě minuty. Například tedy při c H 2 O 2 0,03 mol/l tomu bylo z původních 5 minut na 3 minuty. 31
graf 6. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s katalyzátorem 1.10-2 g/l HRP VÍNO CABERNET Graf 7: Každý jednotlivý druh vína jsem nejprve na trepkách otestoval. Zjišťoval jsem jaké zředění vína je pro trepky toxické a jaké je naopak neškodné. Každé víno jsem tedy několikanásobně ředil. Desetinásobné zředění bylo u všech vín po přídavku pro trepky ihned smrtelné. Při stonásobném zředění vína cabernet již trepky bez problému přežily po dobu necelých 18ti minut. Při 200 násobném zředění již trepky přežily dobu dvou hodin a dále bylo měření ukončeno. Graf 8: Chtěl jsem zjistit, jak dalece má alkohol přítomný ve vínu (10,5%), toxický vliv na dobu života trepek. Pro 200 násobné ředění, které jsem použil u všech vín, jsem zjistil, že alkohol nemá negativní vliv na jejich dobu života, jelikož pouze 30 x zředěný 10,5% ethanol trepky přežily po dobu delší než jednu hodinu. 32
8000 7000 doba života trepek t(s) 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 50 100 150 200 250 ředění vína (x krát) graf 7. Závislost doby života trepek na ředění cabernetu 4000 3500 doba života trepek t(s) 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 5 10 15 20 25 30 35 ředění ethanolu (x krát) graf 8. Závislost doby života trepek na zvyšujícím se ředění ethanolu 33
Graf 9: Zde jsou již znatelně vidět antioxidační účinky vína. Vždy byly pozorovány doby života trepek po přídavku 200 x ředěného vína, katalyzátoru a peroxidu o výsledné koncentraci (2.10-3 ; 5.10-3 ; 8,8.10-3 a 1.10-2 mol/l). Tyto časy byly vždy porovnány s peroxidem vodíku v přítomnosti katalyzátoru o stejných výsledných koncentracích jako ve sloupcích s vínem. Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Fe 3+ s výslednou koncentrací 5.10-5 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného vína cabernetu život trepkám o 9 a půl minuty. Při koncentraci H 2 O 2 5.10-3 mol/l cabernet prodloužil tuto dobu už ale jen o 3 a půl minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l byla tato doba zvýšena díky vínu o 2 a půl minuty. A u koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla doba života trepek prodloužena o minutu a půl. Graf 10: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Fe 3+ s výslednou koncentrací 1.10-4 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného cabenetu život trepkám o téměř 9 minut. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l díky vínu už jen o 3 minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem se doba života trepek prodloužila o 1 a půl minuty.u koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 1 minutu. Graf 11: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Cu 2+ s výslednou koncentrací 1.10-7 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného cabernetu život trepkám o 11 minut. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 2 a půl minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l se doba života trepek prodloužila o 1minutu a 15 sekund.u koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 45 sekund. Graf 12: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Cu 2+ s výslednou koncentrací 1.10-6 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného cabernetu život trepkám o 2 minuty 15 sekund. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila o 1 a půl minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem 34
se doba života trepek prodloužila o pouhých 20 sekund. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena jen o 9 sekund. Graf 13: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí HRP s výslednou koncentrací 1.10-2 g/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného cabernetu život trepkám o 7 a půl minuty. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 2 a 20 sekund. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem se doba života trepek prodloužila o 1 minutu a půl. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 51 sekund. 1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 cabernet+ Fe(III) 5.10-5 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Fe(III) 5.10-5 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 9. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Fe 3+ (5.10-5 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Fe 3+ (5.10-5 mol/l) a cabernetem 35
1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 cabernet+ Fe(III)1.10-4 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Fe(III) 1.10-4 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 10. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Fe 3+ (1.10-4 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Fe 3+ (1.10-4 mol/l) a cabernetem 1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 cabernet+ Cu(II)1.10-7 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Cu(II) 1.10-7 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 11. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-7 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-7 mol/l) a cabernetem 36
1400 1200 1000 doba života trepek t(s) 800 600 400 200 0 cabernet+ Cu(II)1.10-6 M 0,01 0,0088 c H 2 O 2 (mol/l) 0,005 0,002 Cu(II) 1.10-6 M graf 12. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-6 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-6 mol/l) a cabernetem 1400 1200 1000 doba života trepek t(s) 800 600 400 200 0 cabenet + HRP 1.10-2 g/l 0,01 0,0088 c H 2 O 2 (mol/l) 0,005 0,002 HRP 1.10-2 g/l graf 13. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s HRP (1.10-2 g/l) bez vína, H 2 O 2 s HRP (1.10-2 g/l) a cabernetem 37
VÍNO MUSCAT Graf 14: Bílé polosladké víno muscat jsem nejprve ředil opět 10 x. K úhynu trepek došlo během prvních pár sekund po přídavku vína. 20 x krát zředěné víno bylo již pro trepky snesitelnější a přežily v jeho přítomnosti 5 a půl minuty. 30 x krát zředěný muscat se již nejevil pro trepky být tak toxický, ale přesto je zahubil během 21 minut. Přítomnosti 65 x krát zředěného muscatu pro trepky byla již neškodná a přežily ji déle než dvě hodiny, poté jsem měření času ukončil. Jelikož zředění vína 65 x trepkám neškodilo, tak jsem usoudil, že zředění 200 x jim také škodit nebude. 8000 7000 6000 doba života trepek t(s) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 10 20 30 40 50 60 70 ředění vína (x krát) graf 14. Závislost doby života trepek na ředění muscatu Graf 15: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Fe 3+ s výslednou koncentrací 5.10-5 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost bílého vína muscat život trepkám 38
o neuvěřitelných 12 minut. Koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila ovšem jen o 2 minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s muscatem se doba života trepek prodloužila o 36 sekund.u koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 6 sekund. Graf 16: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Fe 3+ s výslednou koncentrací 1.10-4 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost bílého vína muscat život trepkám o 9 minut. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už ovšem jen o 2 minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s muscatem se doba života trepek prodloužila o mizivých 11 sekund podobně jako u koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena jen o 5 sekund. Graf 17: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Cu 2+ s výslednou koncentrací 1.10-7 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost bílého vína muscat život trepkám o 7 a půl minuty. U Koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 3 minuty a 40 sekund. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s muscatem se doba života trepek prodloužila o 2 minutu a 17 sekund. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 20 sekund. Graf 18: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Cu 2+ s výslednou koncentrací 1.10-6 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost bílého vína muscat život trepkám o 3 minuty. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 30 sekund. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s muscatem se doba života trepek prodloužila o 10 sekund. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 5 sekund. Graf 19: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí HRP s výslednou koncentrací 1.10-2 g/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost bílého vína muscat život trepkám skoro o 7 minuty. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 2 minuty a 40 sekund. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s muscatem se doba života trepek prodloužila o 40 sekund.u koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 20 sekund. 39
1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 muscat+ Fe(III) 5.10-5 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Fe(III) 5.10-5 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 15. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Fe 3+ (5.10-5 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Fe 3+ (5.10-5 mol/l) a muscatem 1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 muscat+ Fe(III)1.10-4 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Fe(III) 1.10-4 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 16. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Fe 3+ (1.10-4 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Fe 3+ (1.10-4 mol/l) a muscatem 40
1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 muscat+ Cu(II)1.10-7 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Cu(II) 1.10-7 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 17. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-7 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-7 mol/l) a muscatem 1400 1200 1000 doba života trepek t(s) 800 600 400 200 0 muscat+ Cu(II)1.10-6 M 0,01 0,0088 c H 2 O 2 (mol/l) 0,005 0,002 Cu(II) 1.10-6 M graf 18. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-6 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-6 mol/l) a muscatem 41
1400 1200 1000 doba života trepek t(s) 800 600 400 200 0 muscat + HRP 1.10-2 g/l 0,01 0,0088 c H 2 O 2 (mol/l) 0,005 0,002 HRP 1.10-2 g/l graf 19. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s HRP (1.10-2 g/l) bez vína, H 2 O 2 s HRP (1.10-2 g/l) a muscatem VÍNO CABERNET SAUVIGNON Graf 20: Trepky v přítomnosti cabernetu sauvignon při jeho zředění 17 x přežily pouze po dobu několika vteřin. První znatelná chuť trepek žít se projevila u ředění cabernetu sauvignon 20 x, přežily necelé dvě minuty. U ředění 50 krát trepky stále umíraly v docela krátkém časovém sledu po přidání vína a to za necelých 9 minut. Ředění cabernetu 66 x, u kterého již trepky v přítomnosti muscatu v pohodě přežívaly po dobu delší než dvě hodiny, ovšem všechny trepky umřely za necelých 24 minut. Proto jsem musel ředit dále. 77 x zředěný cabernet sauvignon byl pro trepky smrtelný za 35 minut. Ovšem 100 x krát zředěné víno již trepkám nevadilo a bez problémů toto ředění přežily po dobu delší než dvě hodiny, poté jsem měření času ukončil. 42
doba života trepek t(s) 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 80 100 120 ředění vína (x krát) graf 20. Závislost doby života trepek na ředění cabernetu sauvignon Graf 21: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Fe 3+ s výslednou koncentrací 5.10-5 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného vína cabernetu sauvignon život trepkám o 10 minut. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 5 minut a čtvrt. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem sauvignon se doba života trepek prodloužila o 2 minutu a 16 sekund. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 2 minut a 18 sekund. Zde byly tedy časy u těchto dvou nejsilnějších testovaných koncentrací peroxidu vodíku velmi blízké. Graf 22: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Fe 3+ s výslednou koncentrací 1.10-4 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného vína cabernetu sauvignon život trepkám o 10 minut. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 4 a půl minuty. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l 43
s cabernetem sauvignon se doba života trepek prodloužila o 2 min. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o necelou 1 minutu. Graf 23: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Cu 2+ s výslednou koncentrací 1.10-7 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného vína cabernetu sauvignon život trepkám o 8 a půl minuty. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 4 minuty a čtvrt. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem sauvignon se doba života trepek prodloužila o necelé 2 minuty. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o 1 minutu a půl. Graf 24: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí Cu 2+ s výslednou koncentrací 1.10-6 mol/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného vína cabernetu sauvignon život trepkám o necelé 2 minuty. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 19 sekund. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem sauvignon se doba života trepek prodloužila o 10 sekund. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena pouze o 2 sekundy. Graf 25: Rozklad peroxidu vodíku byl při tomto měření u všech 4 koncentrací peroxidu katalyzován pomocí HRP s výslednou koncentrací 1.10-2 g/l. Při koncentraci H 2 O 2 2.10-3 mol/l prodloužila přítomnost červeného vína cabernetu sauvignon život trepkám o necelých 9 minut. U koncentrace H 2 O 2 5.10-3 mol/l se tato doba díky vínu prodloužila už jen o 3 minuty a 40 selund. Pro koncentraci H 2 O 2 8,8.10-3 mol/l s cabernetem sauvignon se doba života trepek prodloužila o 3 minuty a 15 sekund. U koncentrace H 2 O 2 1.10-2 mol/l byla tato doba prodloužena o necelé 2 minuty. 44
1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 cab.sav.+ Fe(III) 5.10-5 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Fe(III) 5.10-5 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 21. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Fe 3+ (5.10-5 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Fe 3+ (5.10-5 mol/l) a cabernetem sauvignon 1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 cab.sav.+ Fe(III)1.10-4 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Fe(III) 1.10-4 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 22. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Fe 3+ (1.10-4 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Fe 3+ (1.10-4 mol/l) a cabernetem sauvignon 45
1400 1200 1000 800 doba života trepek t(s) 600 400 200 0 cab.sav. + Cu(II)1.10-7 M 0,01 0,0088 0,005 0,002 Cu(II) 1.10-7 M c H 2 O 2 (mol/l) graf 23. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-7 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-7 mol/l) a cabernetem sauvignon 1400 1200 1000 doba života trepek t(s) 800 600 400 200 0 cab.sav.+ Cu(II)1.10-6 M 0,01 0,0088 c H 2 O 2 (mol/l) 0,005 0,002 Cu(II) 1.10-6 M graf 24. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-6 mol/l) bez vína, H 2 O 2 s Cu 2+ (1.10-6 mol/l) a cabernetem sauvignon 46
1400 1200 1000 doba života trepek t(s) 800 600 400 200 0 cab.sav. + HRP 1.10-2 g/l 0,01 0,0088 c H 2 O 2 (mol/l) 0,005 0,002 HRP 1.10-2 g/l graf 25. Závislost doby života trepek na koncentraci H 2 O 2 s HRP (1.10-2 g/l) bez vína, H 2 O 2 s HRP (1.10-2 g/l) a cabernetem sauvignon VÍNO CHARDONNAY Graf 26: Víno chardonnay jsem nejprve ředil 11 x. Toto malé zředění zahubilo trepky v čase 40 sekund. 20 x zředěné chardonnay trepky zahubilo za 9 minut. Ředění 40 x se pro trepky ukázalo být zhoubné po 21 minutách od přídavku vína. 50 x zředěné víno již pro trepky nebylo škodlivé a přežily po dobu delší než 2 hodiny, po této době jsem měření času ukončil. 47