ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Kultivační stanovení: Stanovení kultivovatelných mikroorganismů při 22 C a 36 C Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D. 217 17 5642 Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování: 2015 1
Kultivační stanovení: Stanovení kultivovatelných mikroorganismů při 22 C a 36 C Oblast použití: Stanovení celkového počtu mikroorganismů jsou důležitou informací pro posouzení jakosti vody a její kontrolu. Jednotlivá kvantitativní stanovení se obvykle provádějí s mikroorganismy, které jsou schopné růst a tvořit kolonie na živném agarovém médiu při 22 C a 36 C. Stanovení počtu kolonií je účelné pro posouzení čistoty podzemních vod a účinnosti procesů úpravy vody, jako je koagulace, filtrace a dezinfekce, a indikuje čistotu a neporušenost distribučního systému. Metoda slouží ke stanovení kultivovatelných mikroorganismů v pitné, povrchové, podzemní a bazénové vodě. Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/1 ml, tj. nález jedné kolonie na ploše Petriho misky při očkování 1 ml vzorku. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/1 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek očkování 1 ml vzorku. Pracovní rozsah: Pracovní rozsah je od 0 KTJ/1 ml (dáno požadavkem vyhlášky č. 252/2004 Sb.). Shora pracovní rozsah není omezen, lze použít i menší objem vzorku nebo použít desetinné ředění vzorku. Stanovený ukazatel: Tento postup popisuje metodu pro kvantitativní stanovení kultivovatelných mikroorganismů ve vodě počítáním kolonií vyrostlých na živném agarovém kultivačním médiu po aerobní kultivaci při 22 C a 36 C. Podstata zkoušky: Odměřený objem vzorku nebo příslušného ředění vzorku se v Petriho misce dokonale promíchá s roztopeným specifickým živným kultivačním médiem. Jedna sada misek se kultivuje při teplotě 36 C po dobu 44 h, druhá sada při teplotě 22 C po dobu 68 h. Z celkového počtu kolonií vyrostlých v kultivačním médiu se vypočte počet kolonie tvořících jednotek v 1 ml. Přístroje a pomůcky: Analytické váhy citlivost 0,01 g. Autokláv (121 ± 3) C. Bunsenův kahan. Erlenmayerovy láhve, lahve DURAN 45 se šroubovým uzávěrem. Pipety s možností aplikace objemu 1 ml (popř. 0,1 ml a 0,5 ml dle povahy vzorku a potřeby), jednorázové špičky. 2
Stereolupa. Sterilní plastové Petriho misky o průměru 90 mm. Termostat 36 C ± 2 C a termostat 22 C 2 C. Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku. Agar s kvasničným extraktem (HiMedia M1272). Ředící roztok (fyziologický roztok). Postup zkoušky: Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 C až 25 C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku. Promíchání vzorku: Vzorek se musí dokonale promíchat intenzivním protřepáním, aby se bakterie rovnoměrně rozptýlily v celém objemu vzorku. Volba vhodného objemu vzorku: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku má být volen tak, aby na/v kultivačním médiu v Petriho misce průměru 9 cm vyrostlo nejvýše 30 až 300 kolonií Přímé očkování 1 ml vzorku se používá u vod pitných a u čistých surových vod. Zde se vyhodnocuje i nižší počet než 30 kolonií. Zřeďují se vzorky více znečištěných vod (surových, ze studní). Stupeň zředění se určuje u známých vzorků podle zkušenosti z předcházejících rozborů, u vzorků neznámého složení se připravuje více stupňů ředění. Pro každý stupeň zředění se užívá zřeďování v poměru 1:10. Zřeďování se provádí v lahvičkách obsahujících 9 ml sterilního ředícího roztoku přidáním 1 ml vzorku neředěného nebo již zředěného v nižším stupni. Lahvička se uzavře a promíchá se intenzivním protřepáním. Kultivace: Do předem označených sterilních Petriho misek o průměru 9 cm se pipetuje sterilní pipetou po 1 ml vzorku vody, nejvýše 2 ml. Předpokládá-li se vyšší znečištění vzorku, očkuje se po 1 ml příslušného ředění. Po naočkování se Petriho misky se vzorkem zalijí přibližně 15 ml rozehřátého kultivačního média, temperovaného na (45 ± 3) C. Po zakrytí misek víčkem se médium se vzorkem opatrně, ale důkladně promíchá krouživým pohybem. Pak se obsah nechá ztuhnout. Doba, mezi naočkováním vzorku (nebo jeho zředěním) a přidáním roztopeného média, nesmí překročit 15 min. Očkují se vždy dvě misky paralelně pro stanovení kultivovatelných mikroorganismů (při obou teplotách). Misky se obrátí dnem vzhůru, jedna sada se kultivuje při teplotě 36 ± 2 C po dobu 44 ± 4 h, druhá sada se kultivuje při teplotě 22 ± 2 C po dobu 68 ± 4 h. 3
Vyhodnocení zkoušky: Misky se vyhodnotí ihned po vyjmutí z termostatu. Misky se splývajícím růstem kolonií se vyloučí (viz obr. 1). Kolonie vyrostlé na/v médiu se počítají proti světlu stereolupy (stolní lampy) a tmavému podkladu. Odečtené kolonie se označují na dně misky fixem nebo počítací tužkou. Při paralelním stanovení se počítá průměr. Odečtený počet kolonií se podle stupně zředění přepočte na 1 ml vzorku vody. V nezředěném vzorku se udává celkový počet kolonií i v tom případě, že vyrostlo méně než 30 kolonií na misce. Ve zředěném vzorku se uvádějí výsledky pouze z ředění, kde na miskách vyrostlo 30 až 300 kolonií. Jestliže vyrostlo i v nejvyšším stupni ředění (-n) více než 300 kolonií a stanovení nelze zopakovat, uvádí se do protokolu >300 x 10 n v 1 ml (viz obr. 1). Misky, na nichž došlo v důsledku nesprávné volby zředění k nadměrnému růstu kolonií (nad 300), se označují jako nepočitatelné a nevyhodnocují se. Nevyhodnocují se a jako přerostlé se označují misky, u nichž na větší části plochy nebo na celém povrchu došlo k růstu obřích kolonií některých pohyblivých bakterií (viz obr. 1). Uvádění výsledků: Výsledky se uvádí jako počet KTJ na zpracovaný objem vzorek, např. na 1 ml vzorku. V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit. Počet kolonií po přepočtu na 1 ml vzorku se zaokrouhluje podle toho, v jakém rozsahu se počet kolonií na misce pohyboval, viz tabulka 1. Tabulka 1. Příklad zaokrouhlování počtu kolonií na misce Počet kolonií je: Uvádění výsledku 1 KTJ až 100 KTJ Nezaokrouhluje se. 101 KTJ až 1 000 KTJ Zaokrouhluje se na 10. 1 001 KTJ až 10 000 KTJ Zaokrouhluje se na 100. 10 001 KTJ až 100 000 KTJ Zaokrouhluje se na 1 000. 100 001 KTJ až 1 000 000 KTJ Zaokrouhluje se na 10 000. 4
Obr. 1. Stanovení kultivovatelných mikroorganismů. Horní řada vlevo: miska s koloniemi, které jsou nepočitatelné, je patrný nárůst kolonií více než 300 KTJ, nevyhodnocuje se. Horní řada vpravo: miska s koloniemi, které jsou přerostlé, a tudíž znehodnocují přesnou a správnou kvantifikaci, nevyhodnocuje se. Uprostřed vlevo: miska s koloniemi se splývajícím růstem a přerostlými koloniemi kvasinek, nevyhodnocuje se. Uprostřed vpravo: miska s koloniemi kvasinek a bakterií, zjištěno 240 KTJ/ml. Dolní řada vlevo: miska s přerostlými koloniemi plísní se splývajícím růstem, nevyhodnocuje se. Pro přehlednost vložit písmenka k obrázkům? 5
Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 ČSN EN ISO 6222 Jakost vod Stanovení kultivovatelných mikroorganismů Stanovení počtu kolonií očkováním do živného agarového kultivačního média 6