1. Účel Test toxicity při semichronické expozici vůči okřehku menšímu (Lemna minor L.) Test se používá k testování toxicity roztoků a suspenzí vůči zástupci vyšších vodních rostlin okřehku menšímu (Lemna minor L.). Testuje se, obdobně jako u řas, inhibice růstu podle růstové křivky. Délka expozice je 7 dní. Z tohoto pohledu lze hovořit o toxicitě při semichronické expozici, neboť je zahrnut jak okamžitý účinek při uvedení organismu do testu, tak i dlouhodobé působení, které se projeví v inhibici nárůstu nových generací. 2. Úvod 2.1 Charakteristika testu Rostliny okřehku menšího se nechají růst v různých koncentracích testované látky rozpuštěné ve Steinbergově živném roztoku. Současně se nasadí testovací rostliny do kontrolního živného roztoku bez testované látky. V intervalu 24 hodin se kontroluje a zaznamenává stav rostlin a počet stélek (lístků) 1. Cílem testu je kvantifikovat účinky látky na vegetativní růst okřehku posouzením počtu stélek - rychlosti růstu a alespoň jedné ze tří volitelných charakteristik: velikosti listové plochy, hmotnosti sušiny nebo obsahu chlorofylu. 2.2 Charakteristika organismu Taxonomicky patří Lemna minor L. do oddělení rostlin krytosemenných (Angiospermophyta) kvetoucích, třídy jednoděložných (Monocotyledonopsida), čeledě Lemnaceae. Tato makrofyta jsou do určité míry vítána na obhospodařovaných vodních plochách, protože slouží jako vhodná potrava např. pro ryby a vodní ptactvo. Okřehky porůstají hladinu stojatých vod a jsou nejznámějším zástupcem pleustonického společenstva. Za příhodných podmínek vytvářejí kompaktní porosty, které nepropouštějí světlo, a jejich asimilační kyslík uniká do vzduchu, což vede ke zhoršení jakosti vod pod nimi. Nejznámějším druhem je okřehek menší (Lemna minor L., duckweed, žaburinka menšia). Okřehek menší je drobná vodní rostlina s plochými stélkami, s jemnými kořínky, zdravé kolonie jsou tvořeny 2-5 stélkami. Květy se obyčejně nevyvíjejí. Okřehek roste ve stojatých nebo mírně tekoucích vodách v nížinách až subalpinských polohách. Obr. 1: Okřehek menší (Lemna minor L.) 1 Stélka (anglicky frond ) je botanický výraz pro tělo bezcévných rostlin, tj. řas, mechorostů a kapraďorostů, které není rozlišeno na pravé orgány kořen, stonek, listy. U okřehku má stélka tvar drobného lístku s kořínkem. Z botanického hlediska však u okřehku listy zcela chybí proto se používá pro lístky termín stélka. 1
2.3 Fotosyntetické pigmenty Fotosyntetické pigmenty vyšších rostlin se dělí do dvou skupin, na základě jejich struktury a funkce. Chlorofyly jsou tvořeny porfyrinovým jádrem (tetrapyroly vzájemně spojené metinovými můstky a s komplexně vázaným kationtem Mg 2+ ) a fytolovým řetězcem. Lipofilní fytol určuje celkový lipofilní charakter molekuly chlorofylu a její rozpustnost v nepolárních organických rozpouštědlech. U vyšších rostlin se vždy vyskytují dva typy chlorofylů: chlorofyl a (Chl-a) a chlorofyl b. Obsah těchto pigmentů bývá obvykle v poměru 3:1-4:1, přičemž dominantním je chlorofyl a. Chlorofyly jsou nezbytné pro zachycení slunečního záření a následnou přeměnu energie ve fotosyntéze. Také zelené řasy obsahují chlorofyly a + b. U jiných typů řas se vyskytují ještě chlorofyl c (hnědé řasy), chlorofyl d (ruduchy), u fotosyntetizujících bakterií pak bakteriochlorofyl a. 3. Materiál 3.1 Testovací rostliny Kultura okřehku (Lemna minor L.) 3.2 Kultivační médium podle Steinberga: K přípravě živného roztoku se používá destilovaná voda, okřehek na rozdíl od jiných vodních organismů není významně citlivý vůči mědi, uvolňující se z destilačního zařízení. Ředicí vodou je Steinbergův živný roztok. Zásobní roztoky živin Tab. 1: Složení zásobních roztoků pro kultivaci okřehku Zásobní roztok Chemikálie I KNO3 KH2PO4 K2HPO4 [g/l] 17,50 4,50 0,63 II MgSO4.7H2O 5,00 III Ca(NO3)2.4H2O 14,75 Zásobní roztok Chemikálie [mg/l] IV H3BO3 120,00 V ZnSO4.7H2O 180,00 VI Na2MoO4.2H2O 44,00 VII MnCl2.4H2O 180,00 VIII FeCl3.6H2O Na2-EDTA.2H2O 760,00 1500,00 2
Pro přípravu 1 litru živného roztoku k 900 ml destilované vody přidejte: 20 ml zásobních roztoků I, II a III 1 ml zásobních roztoků IV, V, VI, VII a VIII a doplňte na objem 1000 ml. Zásobní roztoky I-VIII se sterilizují v autoklávu (121 C, 20 min) nebo v tlakovém hrnci (1,5 h). Sterilní roztoky se uchovávají v temnu a chladu. Nejsou-li roztoky sterilní, je třeba připravovat čerstvé vždy jednou za měsíc. Živný roztok pro testování by měl být připraven 1-2 dny před použitím, aby se stabilizovalo ph. V případě potřeby se ph vyrovná na hodnotu 5,5 přídavkem NaOH (1M-NaOH) nebo HCl (1M-HCl). Doporučuje se zkontrolovat ph těsně před použitím roztoku. Životnost kultivačního roztoku je přibližně 6-8 týdnů za předpokladu, že je uskladněn v temnu a chladu. 3.3 Testovaný vzorek a) výluh Výluh upravte dodáním solí tak, aby složení přidaných solí odpovídalo koncentraci solí v kultivačním (kontrolním) mediu. Postupujte podle Tab. 2. Tab. 2: Složení solí v kultivačním roztoku pro okřehek (Zásobní roztok)* Chemikálie I Makrosložky KNO3 KH2PO4 K2HPO4 [mg/l] [µg/l]* 350 90 12,6 II MgSO4.7H2O 100 III Ca(NO3)2.4H2O 295 Mikrosložky IV H3BO3 120 V ZnSO4.7H2O 180 VI Na2MoO4.2H2O 44 VII MnCl2.4H2O 180 VIII FeCl3.6H2O Na2-EDTA.2H2O 456 1500 Pozn*: Vzhledem k velmi nízké koncentraci mikrosložek (roztoky IV VIII), příslušné soli neodvažujte, avšak napipetujte ze zásobních roztoků v odpovídajícím množství dle kap. 3.2. Vytvořte koncentrační řadu výluhu dle zadaných instrukcí. b) chemická látka Připravte koncentrační řadu testované chemické látky podle zadaných instrukcí. Jako ředicí vodu použijte Steinbergovo médium (3.2). 4. Pracovní postup 4.1 Nasazení testu (1. den): 3
Podle bodů 3.3 a instrukcí asistenta vytvořte koncentrační řadu výluhu nebo testované látky, včetně kontrol, ve dvou opakováních. Do 150ml kádinek nalijte vždy 100 ml vzorku nebo kontrolního média. Do testovacích i kontrolních kádinek přeneste pomocí pinzety 3-4stélkové kolonie okřehku tak, aby v každé kádince byl identický celkový počet stélek, nejlépe 12 stélek. Při přenášení rostlin postupujte opatrně, abyste testovací organismy nepoškodili. Pro každou kádinku pořiďte fotografický záznam tak, aby bylo později možné odečíst celkovou plochu stélek v kádince. Na každé fotografii musí být na vodní hladině také plovoucí, voděodolné měřítko. Soubor fotografií opatřete vhodným popisem (jméno skupiny, datum, koncentrace, označení paralely). Kádinky překryjte průhlednou folií a umístěte do kultivačního boxu s kontinuálním osvětlením. Na začátku i konci testu změřte ph všech vzorků i kontrol a zaznamenejte teplotu. Tab. 3: Podmínky testu toxicity vůči okřehku Lemna minor. Testovací organismus: okřehek menší, Lemna minor Barva: zelená Velikost: 0,5 3 cm Typ testu: statický Počet iniciačních stélek v jedné 10-16 koncentraci: Sledovaná odezva: inhibice růstu, symptomy, obsah chlorofylu Podmínky testu: stálá teplota a osvětlení Opakování: 2-3 Objem testované koncentrace: 100 ml ve 150ml kádince Teplota: (24 ± 2) C Doba expozice: 7 dní Osvětlení: 6 500 10 000 lux Chemikálie: výchozí roztok nebo suspenze testované látky, vzorek, standardní živný roztok, destilovaná voda, metanol Pomůcky a zařízení: 150ml kádinky, parafilm, kultivační komora s osvětlením, ph-metr, pipety 4.2 Sledování růstu kolonií (2. - 8. den): Kontrolu testovacích organismů provádějte zjišťováním počtu stélek a sledováním vzhledu kolonií alespoň každé 3 dny, tedy alespoň dvakrát během 7denní expozice a při ukončení testu. Sledujte odumřelou tkáň stélek (bílá nebo rozmočená), tzv. nekrózu a zežloutnutí tkáně, tzv. chlorózu. Zaznamenejte také případný rozpad kolonií na 1-2stélkové kolonie, případně odchylky ve velikosti stélek apod. Získané poznatky využijte při závěrečném zhodnocení výsledků. Kromě počítání stélek pořiďte opět digitální fotografie testovacích rostlin. Fotografie následně použijete pro výpočet celkové listové plochy okřehku. 2 2 Pro zjednodušení se obvykle pro účely laboratoří pořizují fotografie pouze při nasazení a ukončení testu, tj. v čase 0 a 7. den. V takovém případě se z velikosti listové plochy nepočítá růstová křivka a pro výpočet inhibice 4
4.3 Ukončení expozice, extrakce chlorofylu (8. den): Po zjištění počtu stélek vyhodnoťte po ukončení expozice také účinek testovaného vzorku na celkové množství chlorofylu. Rostliny přeneste opatrně pinzetou do 15ml zkumavek a pomocí buničité vaty zbavte přebytečné vody. Poté přelijte biomasu 10 ml metanolu a uzavřete víčky. Krátce protřepejte, stojan se zkumavkami zabalte do alobalu, označte a uložte do lednice. Extrakce probíhá v chladu a temnu, proto pracujte dostatečně rychle a nevystavujte vzorky zbytečně světlu a teplu. Během extrakce vzorky jednou denně protřepejte, abyste zabránili vzniku gradientu a usnadnili extrakci. 4.4 Spektrofotometrie a výpočet obsahu chlorofylu (10. 15. den): Po 2 7 dnech extrakci ukončete a změřte absorbanci vzorků při vlnových délkách 666 nm a 653 nm. Získané hodnoty dosaďte do následujících vzorců: CChl a = 15,65 A666 7,34 A653 CChl b = 27,05 A653 11,21 A666 CChl celk. = CChl a + CChl b Dále je třeba zahrnout ředění vzorku. Výše uvedené vzorce jsou totiž určené pro výpočet koncentrace pigmentů v 1 ml roztoku, přesněji v 1 cm 3 roztoku, a za použití kyvety o délce optické dráhy 1 cm. Úprava vzorců při výpočtu obsahu pigmentů u okřehku: MPigm = V Cpigm ; M Pigm...obsah pigmentu - absolutní množství [µg] V... objem rozpouštědla ve zkumavce [ml] C pigm...koncentrace Chl a nebo Chl b [µg. cm -3 ] Pro každé opakování vypočítejte obsah chlorofylu a a obsah celkového chlorofylu (a+b). 4.5 Měření celkové plochy stélek Pomocí digitální analýzy obrazu - programu NIS-Elements - změřte z pořízených fotografií celkovou plochu stélek okřehku pro každou kádinku a každý den, ve kterém jste rostliny fotografovali. Podrobné instrukce k práci s programem získáte od vyučujícího asistenta. růstu se použijí pouze data ze 7. dne expozice. Velikost plochy na začátku expozice slouží k didaktickým a kontrolním účelům a do konečného výpočtu se nezahrnuje. 5
Do protokolu kromě naměřených dat přiložte také obrazové ukázky z různých fází práce se softwarem: výchozí fotografii vzorku, binární obraz, vyznačenou měřenou plochu s měřítkem. 5. Výpočet a hodnocení inhibice růstu 5.1 Výpočet růstové rychlosti Při stanovení inhibice růstu se vychází z růstové rychlosti. Z údajů o počtu stélek na začátku, v průběhu a na konci expozice vypočítejte růstovou rychlost pro kontrolu a jednotlivé koncentrace testovaného vzorku. Stejným způsobem vypočítejte také růstovou rychlost pro velikost listové plochy. V případě obsahu chlorofylu, kdy je k dispozici pouze údaj na konci testu, růstovou rychlost počítat nelze; k výpočtu inhibice pak slouží absolutní hodnoty obsahu chlorofylu na konci expozice. 5.1.1 Růstová rychlost Vypočítá se růstová rychlost pro každou testovanou koncentraci a kontrolu: µ= ln Nn ln N0 kde t n N 0 je počet stélek (velikost plochy) na počátku testu / období* N n je počet stélek (velikost plochy) na konci testu / období* t n je doba trvání testu / období* Pozn.: * - růstová rychlost se měří ve všech časových obdobích, kdy se hodnotil počet stélek a velikost plochy ve vzorcích. Výsledná růstová rychlost je pak jejich průměrnou hodnotou. 5.2 Výpočet inhibice růstu Ze získaných hodnot vypočítejte inhibici (stimulaci) růstu I i pro každou testovanou koncentraci vzorku a zároveň pro všechny sledované charakteristiky, tj. počtu stélek, celkovou listovou plochu a obsah chlorofylu (chlorofylu a, celkového chlorofylu) podle následujícího vzorce: I i = H K H VZi 100[%] H K kde I i je inhibice měřeného znaku pro danou koncentraci i; je-li I i < 0, jedná se o stimulaci růstu 6
Η Κ je růst. rychlost počtu stélek či celkové listové plochy nebo obsah chlorofylu v kontrole H VZi je rychlost počtu stélek či celkové listové plochy nebo obsah chlorofylu v testované koncentraci vzorku. 5.3 Vyhodnocení testu Cílem testu je stanovit účinky testované látky na vegetativní růst okřehku. Získané hodnoty inhibice (Ii) vyneste graficky jako závislost na logaritmu koncentrace a na základě získaných výsledků rozhodněte, zda je potřeba pokračovat v testování (pokud výsledky vykazují inhibiční účinek pro některý z měřených parametrů, navrhněte design testu pro zisk IC50). 6. Použitá literatura JIRKŮ, J. (2003): Ekotoxikologické zhodnocení skládky Pozďátky. Diplomová práce. VŠCHT Praha. LICHTENTHALER, H.K. (1987): Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Meth. Enzym. 148: 350-382. NÁTR, L. (1998) In: PROCHÁZKA, S., MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., ŠEBÁNEK, J. (eds.): Fyziologie rostlin. Academia, Praha: 124-173. NIS ELEMENTS (2007): AR 2.30 for Windows, Laboratory Imaging, Česká Republika. STEER, J.: Structure and reactions of chlorophyll. http://www.ch.ic.ac.uk/local/projects/steer/chloro.htm SVOBODOVÁ Z., MÁCHOVÁ J., BEKLOVÁ M., CUPÁKOVÁ Š., MINKS J. (2000): Ekotoxikologie, praktická cvičení, část I. Ediční středisko Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. WELLBURN, A.R. (1994): The spectral determination of chlorophyll a and chlorophyll b as well as total carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. J. Plant Physiol. 144: 307313. ISO 20079 (2005): Water quality - Determination of toxic effect of water constituents and waste to duckweed (Lemna minor) - Duckweed growth inhibition test. 7