65. STANOVENÍ INTENZITY RESPIRACE Z MNOŽSTVÍ VYLOUČENÉHO CO 2 úlohy 8.+9. cvičení z Botaniky pro obor ZOO a P/Ú 1/6 Princip : Metoda stanovení intenzity respirace z množství vyloučeného CO 2 je založena na jímání CO 2 v hydroxydu barnatém o známé koncentraci za vzniku uhličitanu barnatého. Množství zbylého hydroxydu barnatého stanovíme titrací kyselinou šťavelovou. Potřeby : naklíčené obilky ječmene (Hordeum sativum L.) (1, 3, 5 a 7 dnů staré), či semena hrachu ( Pisum sativum L.), kukuřice ( Zea mays L.), 4 skleněné promývačky, automatická byreta se zásobní lahví, 10 kádinek 50 ml, filtrační nálevka průměr 15 cm, 2 odměrné válce 100 ml, pětimístný skleněný trubičkový rozvod, 2 odměrky 1 000 ml, 15 % roztok hydroxydu draselného, hydroxyd barnatý p. a., chlorid barnatý, kyselina šťavelová p. a., etanol, 0,01 % alkoholický roztok fenolftaleinu, membránové čerpadlo, gumová hadice, šroubovací tlačky, nůžky, filtrační papír, váhy, sušárna. Příprava roztoku kyselina šťavelové : navážíme 2,8636 g krystalické kyseliny šťavelové p. a. a doplníme v odměrce do 1000 ml destilovanou vodou. Příprava roztoku barnatého : navážíme 7 g hydroxydu barnatého a 1 g chloridu barnatého a doplníme v odměrce do 1000 ml destilovanou vodou. Roztok po rozpuštění rychle přefiltrujeme a uzavřeme zátkou. Provedení : skleněné promývačky spojíme gumovými hadicemi za sebou (obr. č. 21) a připojíme k membránovému čerpadlu či vodní vývěvě, podle čehož se mění pořadí nádobek v promývací aparatuře. 0br. č. 21 : Schéma aparatury pro stanovení intenzity respirace z množství vyloučeného C0 2. Nádobka č. 1 obsahuje roztok KOH, č. 2 - roztok Ba(OH) 2, č. 3 - rostlinný materiál, č. 4 - roztok Ba(OH) 2 Do prvé z každé série promývaček nalijeme 100 ml roztoku hydroxydu draselného. Do druhé 100 ml roztoku hydroxydu barnatého, do třetí vložíme 50 g naklíčených obilek ječmene. Ke skleněnému rozvodu připojíme membránové čerpadlo a asi 2 minuty necháme sérii promývaček promývat vzduchem. Tím odstraníme z pokusných nádob vzdušný kysličník uhličitý a současně si upravíme pomocí šroubovacích tlaček průtok vzduchu tak, aby byl ve všech promývacích nádobách přibližně stejný. Pak nalijeme do 4. promývačky vždy 100 ml roztoku hydroxydu barnatého a ponecháme aparaturou proudit 1 hodinu vzduch. Po této době odebereme ze 4. promývačky 3 x po 10 ml vzorků do kádinek a titrujeme je roztokem kyseliny šťavelové na fenolftalein. Odběr vzorků a titraci provádíme co nejrychleji, aby nedocházelo k velké absorpci vzdušného kysličníku uhličitého. Rozdíl mezi titraci kontrolního vzorku (zásobní roztok hydroxydu barnatého) a vzorku z promývačky č. 4 v mililitrech roztoku kyseliny šťavelové odpovídá miligramům CO 2 absorbovaném v roztoku (1 ml roztoku kyseliny šťavelové = 1 mg CO 2 ). Po přepočtení na celkový objem hydroxydu barnatého v promývačce č. 4 zjistíme celkové množství vydýchaného kysličníku uhličitého daným rostlinným vzorkem. Paralelně odebíráme rostlinný materiál a stanovujeme sušinu vzorku. Výsledky : Výsledné množství vydýchaného CO 2 přepočteme na g sušiny za 60 minut a hodnoty zpracujeme do tabulky. Závěr : Výsledky pokusu znázorníme graficky a zdůvodníme. 1
78. STANOVENÍ ŽIVOTNOSTI SEMEN úlohy 8.+9. cvičení z Botaniky pro obor ZOO a P/Ú 2/6 Princip : Reakce živých a mrtvých částí semene na použité reagencie je rozdílná, což se projeví rozdílem ve zbarvení. Živé části semen redukují bezbarvý roztok 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloridu na karmínově červený formazan. Naproti tomu při použití indigokarmínu (modř) se barví mrtvá pletiva modře. Potřeby : semena hrachu (Pisum sativum L.), obilky kukuřice (Zea mays L.), 1% vodný roztok 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloridu (TTC), 0,2% roztok indigokarmínu, žiletky, Petriho misky. Provedení : Obilky kukuřice (živé i usmrcené) po předchozím 24 hod. máčení rozřízneme žiletkou mediálně na 2 poloviny. Na Petriho misky uložíme vždy po 10 polovinách obilek obou variant a přelijeme roztokem trifenyltetrazoliumchloridu. Na další misce stejným způsobem použijeme roztok indigokarmínu tak, aby poloviny semen byly roztokem důkladně smáčeny. Obdobně postupujeme i u varianty s hrachem. Výsledky : Pokus vyhodnotíme po dvou hodinovém působení roztoků. Závěr : Nakreslíme příklady provedených pokusů s výslednými barevnými reakcemi. 2
108. STANOVENÍ GIBERELINŮ úlohy 8.+9. cvičení z Botaniky pro obor ZOO a P/Ú 3/6 Salátový test : Test na rostlinkách salátů patří k nejpouživanějším, zejména pro důkaz a stanovení giberelinů (GA 3 - kys. giberelová). Poprvé byl popsán FRANKLANDEM a WAREINGEM (1961), u nás byl modifikován KREKULEM a TELTSCHEROVOU (1963) na sortu salátu Stupický kamenáč. Typ a intenzitu osvětlení rostlin při tomto testu specifikoval HRADILÍK (1967), později doporučil pro tento biotest i salát sorty Pražan a Veltruský Král máje. Princip : Salátový test spočívá ve schopnosti giberelinu GA 3 stimulovat dlouživý růst hypokotylů salátu. Tuto stimulaci, která je velmi výrazná, je možno kvantitativně vyjádřit. Potřeby : osivo salátu (Lactuca sativa L.) sorty Stupický kamenáč nebo jiný vhodný, vodní roztok GA 3 v koncentraci 0,01, 0,10, 1,00, 10 mg.l -1. Dělící chromatografická směs chloroform : kys. octová : etylacetát = 60 : 5 : 40. Provedení : Vytříděné nažky salátu sorty Stupický kamenáč se na filtračním papíře předem zvlhčeném dest. vodou vykládají a ponechají klíčit ve tmě při teplotě kolem 20 0 C po dobu 24 hodin. Při kladení nažek na filtrační papír je dobré dodržovat zásadu, aby se nažky vzájemně nedotýkaly a tím neovlivňovaly klíčení. Předklíčené nažky salátu, jejichž radikula vyčnívá z perikarpu asi do délky 2 mm, se vyberou a vyloží po 12 ks do Petriho misky, ve které jsou 2 kotoučky filtračního papíru zvlhčeny 3 ml zkoumaného roztoku GA 3 o známé koncentraci. Takto připravené misky se uloží do skleněných nebo plechových van z části naplněných vodou, které se shora přikryjí skleněnou deskou a vystaví se nepřetržitému zářivkovému osvětlení o intenzitě 1,25 x 10-2 cal.cm 2. min -1 po dobu 72 hodin. Výsledky : Pak se provede měření délek hypokotylů pomocí papírového měřítka a vypočte se průměrná délka hypokotylu pro každou variantu. Tato kontrola je při zpracování výsledků považována za 100 %, varianty se známým obsahem giberelinů se přepočítají rovněž na procenta a tyto hodnoty sestavené do grafu poskytují kalibrační křivku pro GA 3. Při zpracování vzorku čistěného a rozděleného metodou tenkovrstevné chromatografie se postupuje přesně indenticky. Zóna, ve které se nachází giberelin GA 3 se seškrabe do Petriho misky, suspenduje s 3 ml dest. vody a překryje 2 kotoučky filtračního papíru. Pro kontrolu se používá silikagelu z téže zóny o stejné ploše chromatogramu bez vzorku. Obr. č. 35 : Salátový test na stanovení kyseliny giberelové. A - předklíčená nažka salátu, B - rostlina salátu vyrostlá v prostředí bez GA 3, C - rostlina salátu vyrostlá v prostředí s GA 3, X - délka hypokotylu. Závěr : Ze získaných hodnot sestrojíme kalibrační křivku. 3
111.RŮSTOVÉ ÚČINKY GIBERELINU úlohy 8.+9. cvičení z Botaniky pro obor ZOO a P/Ú 4/6 Princip : Giberelin je růstová látka silně podněcující prodlužovací růst. Můžeme to snadno dokázat na máčení bramborových hlíz nebo hrachových semen v jeho roztoku. Klíčky hlíz a epikotyly hrachu rostou zprvu dvojnásobnou i vícenásobnou rychlostí. Také květy třešňových větévek přijímající giberelinový roztok se rozvíjejí podstatně dříve. Giberelin přitom ruší zábranné látky, kterých je nahromaděno velké množství, např. v tvrdkách pleveleného, ale medonosného čistce. Tyto tvrdky teprve po máčení v roztoku giberelinu uspokojivě klíčí. Potřeby : roztok giberelové kyseliny o koncentraci 50 a 100 mg.l -1, větší skleněné nádoby, vegetační nádoby, písek, jemná zemina, dřevěné truhlíky, měřítko, bramborové hlízy (Solanum tuberosum L.), semena hrachu (Pisum sativum L.) nařezané nerozkvetlé větévky třešně, tvrdky čistce ročního (Stachys annua L.). Provedení :a.- Bramborové hlízy zbavené klíčků namočíme na 2 hodiny do roztoku giberelové kyseliny 50 mg.l -1 tak, aby byly hlízy v roztoku celé ponořené. Stejný počet hlíz máčíme souběžně pro kontrolu ve vodě. Po skončeném máčení hlízy vyjmeme a odděleně vyložíme na dřevěné truhlíky. Ponecháme ve skleníku. b.-semena hrachu namočíme na 12 hodin do roztoku kyseliny giberelové a kontrolní semena na touž dobu do vody. Pak děleně vyseje do vegetačních nádob s pískem. Ponecháme ve skleníku a zavlažujeme. c.-v lednu až březnu nařezané větévky třešní dáme do dvou nádob jejich bázemi. Do jedné nalijeme přitom roztok giberelové kyseliny, do druhé vodu. Ponecháme ve skleníku. d.-50 tvrdek čistce namočíme na 24 hodin do roztoku giberelové kyseliny a stejný počet do vody. Pak odděleně vysejeme do dvou vegetačních nádob s jemnou zeminou. Výsledky :a.- Průměrná délka klíčků za 7, 14, 21 a 28 dní po založení pokusu. Zvlášť u pokusných a zvlášť u kontrolních hlíz. b.-průměrná délka epikotylu za 3, 6, 9, 12 a 15 dní po založení pokusu. c.- Zaznamenáváme rozdíly v růstu květních stopek a rozvíjení květu. d.-po 10 a 20 dnech počítáme vyklíčené tvrdky čistce v nádobě pokusné a kontrolní. Plevelné klíční rostlinky odstraňujeme. Závěr: Získané hodnoty zpracujeme graficky. 4
úlohy 8.+9. cvičení z Botaniky pro obor ZOO a P/Ú 5/6 112.RŮSTOVÉ ÚČINKY SYNTETICKÝCH INHIBITORŮ Princip : K syntetickým inhibitorům řadíme předně hydrazid kyseliny maleinové (MH) a kyselinu 2,3,5 - trijodbenzoovou (TIBA). MH působí jako "antigiberelin ", TIBA jako " antiauxin " Již slabé roztoky MH brzdí růst rostlin do délky. Antiauxinový charakter TIBA se projevuje především tím, že tato látka ruší inhibiční vliv auxinu na růst postranních pupenů, čímž rostliny rozvětvuje. Potřeby : Roztok MH 0,05, 0,02, 0,006 %, TIBA pasta 0,5 %, nádoby na máčení semen, vegetační nádoby, písek, měřítko, skalpel, semena hrachu (Pisum sativum L.), klíční rostliny bobu (Faba vulgaris Moench.) ve vegetačních nádobách. Provedení :a.- Po 30 semenech hrachu namočíme na 10 hodin do těchto roztoků MH - 0,006, 0,02, 0,05 % roztok a kontrolu do vody. Pak přeneseme semena odděleně do vegetačních nádob s pískem. Omezeně zavlažujeme. b.-klíční rostliny bobu vyrostlé do délky epikotylu 40 mm ve vegatačních nádobách natřeme z poloviny pod vrcholem kroužkem TIBA pasty. Výsledky : zapíšeme do tabulky č. XIX. Tab. č. XIX: Pracovní tabulka pro zápis hodnocení délky epikotylu hrachu. Délka epikotylu hrachu MH 0,006 MH 0,02 MH 0,05 Voda Za 7 dní Za 14 dní b.- Sledujeme a zaznamenáváme intenzitu rozvětvování rostlin po nátěru pastou TIBA za 7 a 14 dní po aplikaci. 5
úlohy 8.+9. cvičení z Botaniky pro obor ZOO a P/Ú 6/6 116. APIKÁLNÍ DOMINANCE A KORELACE MEZI HYPOGEICKÝMI DĚLOHAMI A KOTYLÁRY HRACHU Princip : Vrcholový (apikální) pupen brzdí růst pupenů v úžlabí děloh (kotylárů) na klíčních rostlinách hrachu. Takto se projevuje jedna ze základních korelací - apikální dominance (AD), jako nadvláda vrcholového pupenu nad postraními. Amputujeme-li vrchol, pomine apikální dominance, a kotyláry v úžlabí obou děloh rostou po určitou dobu přibližně stejně. Že se na této korelaci významně podílí auxin dokážeme, když po seříznutí vrcholu natřeme na pahýl trochu auxinové pasty. Po dobu působení aplikované pasty kotyláry nerostou. Také dělohy hrachu, které při klíčení zůstávají pod zemí a jsou tedy hypogeické, uplatňují v rostlině zábranný účinek. Dokážeme to tak, že po seříznutí vrcholu odstraníme jednu z děloh. Kotylár v úžlabí amputované dělohy roste podstatně rychleji, zatím co v úžlabí ponechané dělohy vůbec nebo velmi málo. V další variantě seřízneme obě dělohy tak, aby z každé zbyla asi třetina, pak roste jeden z obou kotylárů podstatně silněji než druhý. Jak v případě odstranění jedné dělohy, tak i při jedné třetině děloh se rostlina účelně nevyčerpává růstem obou lodyžek, když má omezeny zásobní látky v dělohách, nýbrž umožňuje růst jen jedné lodyžce. Jde tedy o velmi jemnou korelační citlivost. Potřeby : auxinová pasta 0,5% a pasta 0,5% BA, žiletka, skalpel, váhy, klíční rostliny hrachu (Pisum sativum L.) pěstované v kyvetách s vodou. Provedení : Semena hrachu namočíme na 8 hodin do vody, načež je přeneseme radikulou dolů do vlhkých pilin a překryjeme vrstvou asi 3 cm silnou a održujeme v konstantních tepelných i vlhkostních podmínkách ve tmě. Asi za 3 dny, když jsou kořínky klíčních rostlin 5-7 cm dlouhé a epikotyly se dosud nezvětšily, zbavíme dělohy opatrně testy a přeneseme do kyvet naplněných vodou a přikrytých děrovanými víčky s otvory pro kořeny. Kyvety s rostlinami umístíme ve tmě. Když epikotyly vyrostou do délky asi 3 cm, provedeme následující pokusné varianty (v každé po 20-ti rostlinách). Obr. č.38: a.-rostliny ponecháme intaktní b.- rostliny s amputovaným vrcholkem c.-rostliny s amputovaným vrcholkem a aplikací 0,5% auxinové pasty na příčnou řeznou plochu d.- rostliny s amputovaným vrcholkem a jednou dělohou (provádíme opatrně, abychom nepoškodili úžlabní pupen) e.-rostliny s amputovaným vrcholkem a dvěma třetinami obou děloh Pokus držíme ve tmě za konstantních podmínek. Výsledky : V určitých časových intervalech sledujeme jednotlivé varianty experimentů a provádíme pečlivá měření a záznamy do protokolu se zakreslením rostlinky z každé varianty. V závěrečném hodnocení zvážíme u všech variant celé rostliny, oddělené jednotlivé orgány a zjistíme sušinu. Závěr : Výsledky vyhodnotíme. 6